JP7157050B2 - 細胞生存率を維持するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第62/404,170号(2016年10月4日出願)および第62/405,447号(2016年10月7日出願)の優先権を主張する。この出願はまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2017年10月4日出願の「Compositions and Methods for Cell Cryopreservation」と題された国際出願PCT/CN2017にも関連する。
本細胞安定化培地は、ゼラチンおよび/またはゼラチン誘導体を含む場合がある。本明細書で使用されるとき、用語「ゼラチン」はゼラチンまたはゼラチン誘導体を指す場合がある。本細胞安定化培地には、任意のゼラチンまたはゼラチン誘導体を使用することができる。
本細胞安定化培地は、任意の適切なポリペプチドを含み得る。ある実施形態では、細胞安定化培地は、ポリペプチド成分と液体成分とを含む。
本細胞安定化培地には、任意のアルブミンまたはアルブミン誘導体を使用することができる。
ある実施形態では、本細胞安定化培地はヒドロゲルである。ある実施形態では、本細胞安定化培地は、温度変化に応答して流動状態(液体状態)からゲル状態への遷移を受ける熱可逆性ヒドロゲルである。ある実施形態では、本細胞安定化培地は、相転移温度以上で自由流動性または液相にあり、相転移温度未満でゲル相(固相、非流動相)にある。米国特許第6,231,881号および第6,730,315号。
ある実施形態では、細胞安定化培地は、糖類、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど)、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、血清、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、および二価陽イオンキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその塩、タンパク質、塩、ホルムアミド、メトキシル化化合物、および/またはポリマー(例えばポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール)、またはそれらの組み合わせをさらに含む。ある実施形態では、細胞安定化培地は、グリシン、グリセロール、スクロース、グルコース、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
糖類には、単糖類および二糖類などのオリゴ糖、多糖類などが含まれる。糖類には糖が含まれる。
本細胞安定化培地は、1つまたは複数のアミノ酸を含んでも含まなくてもよい。
他の実施形態では、細胞安定化培地は、1つまたは複数のビタミンをさらに含む。ビタミンの非限定的な例には、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシンHCl、チアミンHCl、およびリボフラビンが含まれる。
ある実施形態では、本細胞安定化培地は、無機塩および/または有機塩を含む1つまたは複数の塩をさらに含む。無機塩の非限定的な例には、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびリン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、重炭酸カリウム、一リン酸カリウム、およびそれらの組み合わせが含まれる。
ある実施形態では、生体材(細胞、組織、器官)は、本細胞安定化培地との混合の前または最中に、凍結保存(凍結保存状態)から解凍される(または解凍された)。
本組成物および方法は細胞生存率を維持する。
用語「生体材」は、細胞、細胞凝集体、組織、器官、体液、ウイルス粒子、およびリポソーム(天然または合成)などの任意の他の膜状実体を意味する。
本開示はまた、本細胞安定化培地(本明細書に記載のように固体または液体形態で)または本組成物を含むキットを提供する。そのようなキットは、細胞安定化培地または本組成物を含む1つまたは複数の容器を含み得る。一実施形態では、キットは細胞安定化培地または本組成物(生体材を含んでも含まなくてもよい)を含む。一実施形態では、キットは本細胞安定化培地で処理するための生体材を含む。
実験番号1
ゼラチンはGelita(ゼラチンはウシの皮から調製した;バッチ番号L600217)から入手した。15.7重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地は、DMEM中でゼラチンを溶解することによって調製した。
表1に示すように、ゼラチンを含む細胞安定化培地中の細胞は、2時間または4時間、30℃または37℃でインキュベートされた後、それらの生存率を維持した。言い換えれば、30℃または37℃で2時間または4時間インキュベートした後、細胞の生存率は時間0でのそれらの生存率と同様であった。対照的に、DMEMと混合した細胞の生存率は、30℃または37℃で2時間または4時間インキュベートした後、約48%(2時間)または56%(4時間)減少した。この実験は、ゼラチンを含有する細胞安定化培地の保護影響を確認している。
ゼラチンはGELITA(Lot.L600217)から入手した。ゼラチンを水に溶解することにより、15.7重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはGELITA(Lot.L600217)から入手した。ゼラチンを水に溶解することにより、15.7重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはNippi(ゼラチンはウシ、ブタおよび/または魚などの供給源から調製した;ロット番号S150806)から入手した。ゼラチンを水に溶解することにより、10重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはNippi(Lot.S150806)から入手した。ゼラチンを水に溶解することにより、10重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはNippi(Lot.S150806)から入手した。ゼラチンを水に溶解することによって、5重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはNippi(Lot.S150806)から入手した。ゼラチンを水に溶解することによって、6重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはNippi(Lot.S150806)から入手した。ゼラチンを水に溶解することによって、7.5重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはGELITA(Lot.L600217)から入手した。ゼラチンを水に溶解することによって、15.7重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
ゼラチンはGELITA(Lot.L600217)から入手した。ゼラチンを水に溶解することによって、15.7重量%のゼラチンを含有する細胞安定化培地を調製した。
実験条件を表11に示す。
(1)5倍希釈:20μLの細胞を80μLのDMEMと混合した(細胞は5倍希釈)。解凍後細胞の数を数えた。
(2)12.5倍希釈:20μLの細胞を230μLのDMEMと混合した(細胞は12.5倍希釈)。解凍後細胞の数を数えた。
(1)5倍希釈、37°C:200μLの細胞および800μLの細胞安定化培地(ゼラチン溶液)を1.5mLのエッペンドルフチューブに加え、混合した。細胞生存率を時間0(T0)で分析した。残りの試験試料を37℃の水浴中でインキュベートした。細胞生存率を次の時点で再度分析した:2時間(T2)、4時間(T4)および8時間(T8)。
(2)12.5倍希釈、37℃:200μLの細胞および2300μLのゼラチン溶液を、15mL遠心管に入れて混合した。細胞生存率を時間0(T 0)で分析した。残りの試験試料を37℃の水浴中でインキュベートした。細胞生存率を以下の時点で分析した:時点:2時間(T2)、4時間(T4)および8時間(T8)。
結果は、DMEMと比較して、1重量%、3重量%または17重量%のゼラチンを含む細胞安定化培地とインキュベートしたとき、解凍後細胞生存率がより高いことを示している。25°Cまたは37°Cで、細胞安定化培地で5倍希釈した細胞は、細胞安定化培地で12.5倍に希釈した細胞と比較してより高く長い生存率を示した。
表18および図1~9は、実施例1および実施例2の実験番号1~10(「実験1」~「実験10」)のデータに基づいて、細胞生存率に対して作用するゼラチン濃度の影響を示す。
材料
ADAM AccuchipとADAM SolutionはNanoEnTekから入手した。DMEMおよびウシ胎児血清(FBS)はGibcoから入手した。ウシ血清アルブミンはSigmaから入手した。
・ 溶液A(「溶液A」):DMEM
・ 溶液B(「溶液B」):DMEM中にゼラチン10重量%
・ 溶液C(「溶液C」):DMEM中にアルブミン5重量%
・ 溶液D(「溶液D」):DMEM中にアルブミン10重量%
・ 溶液E(「溶液E」):DMEM中にアルブミン15.7重量%
・ 溶液F(「溶液F」):FBS
項目1 細胞生存率を維持するための方法であって、1つまたは複数の細胞を細胞安定化培地と混合して混合物を形成するステップを含み、前記細胞安定化培地は、細胞安定化培地の総重量に基づいて約5重量%~約15.7重量%のゼラチンを含む、方法。
項目2 前記細胞安定化培地が、約5重量%~約7.5重量%のゼラチンを含む、項目1に記載の方法。
項目3 前記細胞安定化培地が、約10重量%~約15.7重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目4 前記混合物が、前記混合物の総重量に基づいて、約0.8重量%~約15.7重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目5 前記混合物が、約2.4重量%~約7重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目6 前記混合物が、約9.3重量%~約14.6重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目7 前記1つまたは複数の細胞が、前記混合ステップの前に細胞懸濁液中にある、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目8 前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が、約6.25~約12.5の範囲である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目9 前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が約~約10の範囲である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目10 前記細胞が、約7.5×105細胞/ml~約7.5×107細胞/mlの範囲の濃度で、前記細胞懸濁液中に存在する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目11 前記混合ステップの前に、前記1つまたは複数の細胞が凍結保存状態から解凍された凍結保存組成物中にある、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目12 前記凍結保存状態が、約-70°C~-200°Cの範囲の温度である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目13 前記細胞が、少なくとも70%の解凍後生存率を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目14 前記細胞が、少なくとも80%の解凍後生存率を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目15 前記凍結保存組成物が、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および/またはポリエチレングリコール(PEG)を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目16 前記混合ステップの前に、約25°C~約37°Cの範囲の温度で、前記細胞安定化培地を配置することをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目17 ゼラチンが、約100キロダルトン(kD)~約200kDの範囲の重量平均分子量を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目18 ゼラチンが変性コラーゲンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目19 前記細胞安定化培地が、約190~約325の範囲のブルーム値を有する熱可逆性ヒドロゲルである、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目20 前記細胞が哺乳動物細胞である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目21 前記細胞がヒト、ブタ、イヌ、ウマまたはウシの細胞である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目22 前記細胞が腫瘍細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目23 前記細胞が線維芽細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目24 前記細胞が幹細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目25 前記細胞が、約105細胞/ml~約107細胞/mlの範囲の濃度で混合物中に存在する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目26 前記細胞安定化培地は、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物質、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目27 細胞生存率を維持するための方法であって、1つまたは複数の細胞を細胞安定化培地と混合して混合物を形成するステップを含み、前記混合物は約0.8重量%~約15.7重量%のゼラチンを含む、方法。
項目28 前記混合物が、約2.4重量%~約7重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目29 前記混合物が、約9.3重量%~約14.6重量%のゼラチンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目30 前記1つまたは複数の細胞が、前記混合ステップの前に細胞懸濁液中にある、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目31 前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が、約6.25~約12.5の範囲である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目32前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が約~約10の範囲である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目33 前記細胞が、約7.5×105細胞/ml~約7.5×107細胞/mlの範囲の濃度で、前記細胞懸濁液中に存在する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目34 前記混合ステップの前に、前記1つまたは複数の細胞が凍結保存状態から解凍された凍結保存組成物中にある、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目35 前記細胞が、少なくとも70%の解凍後生存率を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目36 前記凍結保存組成物が、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および/またはポリエチレングリコール(PEG)を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目37 前記混合ステップの前に、約25°C~約37°Cの範囲の温度で、前記細胞安定化培地を配置することをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目38 ゼラチンが、約100キロダルトン(kD)~約200kDの範囲の重量平均分子量を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目39 ゼラチンが変性コラーゲンを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目40 前記細胞が哺乳動物細胞である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目41 前記細胞がヒト、ブタ、イヌ、ウマまたはウシの細胞である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目42 前記細胞が腫瘍細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目43 前記細胞が線維芽細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目44 前記細胞が幹細胞を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
項目45 1つまたは複数の細胞と、約0.8重量%~約15.7重量%のゼラチンとを含む組成物。
項目46 約2.4重量%~約7重量%のゼラチンを含む、項目45に記載の組成物。
項目47 約9.3重量%~約14.6重量%のゼラチンを含む、項目45~46のいずれかに記載の組成物。
項目48 前記1つまたは複数の細胞が凍結保存状態から解凍されている、項目45~47のいずれかに記載の組成物。
項目49 前記細胞が、少なくとも70%の解凍後生存率を有する、項目45~48のいずれかに記載の組成物。
項目50 ゼラチンが、約100キロダルトン(kD)~約200kDの範囲の重量平均分子量を有する、項目45~49のいずれかに記載の組成物。
項目51 ゼラチンが変性コラーゲンを含む、項目45~50のいずれかに記載の組成物。
項目52 前記細胞が哺乳動物細胞である、項目45~51のいずれかに記載の組成物。
項目53 前記細胞がヒト、ブタ、イヌ、ウマまたはウシの細胞である、項目45~52のいずれかに記載の組成物。
項目54 前記細胞が腫瘍細胞を含む、項目45~53のいずれかに記載の組成物。
項目55 前記細胞が線維芽細胞を含む、項目45~54のいずれかに記載の組成物。
項目56 前記細胞が幹細胞を含む、項目45~55のいずれかに記載の組成物。
項目57 項目45~56のいずれかに記載の組成物を含むキット。
Claims (20)
- 細胞生存率を維持するための方法であって、
1つまたは複数の細胞を含む解凍された凍結保存組成物を含む細胞懸濁液を、細胞安定化培地と混合して混合物を形成するステップを含み、
ここで前記細胞安定化培地は、前記細胞懸濁液と混合するときに液体状態の熱可逆性ヒドロゲルであり、前記混合物の総重量に基づいて、0.8重量%~15.7重量%のゼラチンを含み、
前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が3.0~12.5であり、
少なくとも8時間までの間、前記細胞が少なくとも70%の解凍後生存率を有する、方法。 - 前記混合物が、2.4重量%~7重量%のゼラチンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記混合物が、9.3重量%~14.6重量%のゼラチンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が、6.25~12.5の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞安定化培地対前記細胞懸濁液の体積比が、5~10の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、7.5×105細胞/ml~7.5×107細胞/mlの範囲の濃度で前記細胞懸濁液中にある、請求項1に記載の方法。
- 前記凍結保存状態が、-70°C~-200°Cの範囲の温度である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、少なくとも80%の解凍後生存率を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記凍結保存組成物が、グリセロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および/またはポリエチレングリコール(PEG)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記混合ステップの前に、25°C~37°Cの範囲の温度で、細胞安定化培地を配置することをさらに含む、請求項1に記載の方法
- 前記ゼラチンが、100キロダルトン(kD)~200kDの範囲の重量平均分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ゼラチンが変性コラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞安定化培地が、190~325の範囲のブルーム値を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト、ブタ、イヌ、ウマまたはウシの細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、腫瘍細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、線維芽細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、105細胞/ml~107細胞/mlの範囲の濃度で混合物中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞安定化培地は、アミノ酸、サイトカイン、脂質、成長因子、抗生物質、抗真菌剤、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の方法。
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