CN111066776A

CN111066776A - 一种卵子冷冻保护剂及其应用

Info

Publication number: CN111066776A
Application number: CN201911104575.7A
Authority: CN
Inventors: 平锋锋; 吕蓓; 吴伟燕; 李琴; 王春娥
Original assignee: Wuxi Peoples Hospital
Current assignee: Wuxi Peoples Hospital
Priority date: 2019-11-09
Filing date: 2019-11-09
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明公开了一种卵子冷冻保护剂及其应用。本发明的卵子冷冻保护剂使用现有医用级材料配比而成，无热源，无化工物添加。方便使用，无需洗涤等程序。并且，使用本发明的保护液可在2℃～37℃的条件下维持细胞活性可达到72小时，卵细胞存活率可达到90％以上。使用本发明的卵子冷冻保护剂无需重筛选培养，无需洗涤，可直接按临床或动物实验要求需要并应用。

Description

一种卵子冷冻保护剂及其应用

技术领域

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种卵子冷冻保护剂及其应用。

背景技术

随着现代观念的转变，越来越多的女性选择在合适的年龄冷冻卵子。但是冷冻卵子并非像广告宣传的那样轻松，对技术和设备的要求很高。

常见的冷冻卵子方法有两种：一为程序化冷冻，即按照设定的程序逐步降温和冷冻，最后置于液氮中保存；另一种为快速的玻璃化冷冻，卵子在冷冻保护剂里进行预处理后，用极快的速度直接将其置于零下196℃的液氮中冷冻保存。由于玻璃化冷冻对卵子的伤害较小，目前更常用。

由于卵子体积大、所含水分多等特点，冷冻过程中易形成冰晶，对卵子产生损伤，所以冻融后的卵子受精率不高。因此需要加入冷冻保护剂以减少该过程对卵子的损伤。冷冻保护剂有渗透性保护剂和非渗透性保护剂，如甘油、丙二醇、乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖、果糖和葡萄糖等。将渗透性保护剂和非渗透性保护剂搭配使用比较常见。

CN201510077424.2公开了一种人类卵母细胞冷冻保护剂，该保护剂以海藻糖作为非渗透性保护剂以卵子冷冻培养基冻融人类卵子。

CN201710555278.9公开了一种卵母细胞非渗透性保护剂皱缩法序贯玻璃化冷冻液及使用方法，所述序贯玻璃化冷冻液包括皱缩液、平衡液和玻璃化液，所述皱缩液为使细胞脱水的非渗透性保护剂，优选蔗糖和/或海藻糖。

CN201810610844.6公开了一种玻璃化冷冻液及其制备方法，包括平衡液和冷冻液；所述平衡液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；所述冷冻液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖和蔗糖溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。

但是，市场公开的冷冻保护剂仍然存在保护效果不佳的问题，体现在冻融后的卵子活力降低，受精率不高；以及不同人员操作下的不稳定性，重复率差。有研究报道，卵子冷冻获得的临床妊娠率仅为2.4％(95/4000)，婴儿出生率仅为1.9％(76/4000)。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种卵子冷冻保护剂及其应用，其能够有效地降低冷冻过程对卵子活力的影响，并且重复率高，操作稳定性好，从而提高辅助生殖技术的成功率。

实现本发明目的技术方案是：

本发明目的之一是提供一种卵子冷冻保护剂，所述卵子冷冻保护剂包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述保护剂中含有黄原胶和甘氨酸；具体是将黄原胶和甘氨酸加入到卵子冷冻液和卵子解冻液中。

作为优选方案，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.05～1.0mol/L，甘氨酸的浓度为0.1～0.8mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.05～0.5mol/L，甘氨酸的浓度为0.2～1.0mol/L。

再进一步优选的，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.1～0.8mol/L，甘氨酸的浓度为0.2～0.6mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.1～0.4mol/L，甘氨酸的浓度为0.4～0.8mol/L。

再进一步优选的，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.45mol/L，甘氨酸的浓度为0.4mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.25mol/L，甘氨酸的浓度为0.6mol/L。

本发明中通常的卵子冷冻液和卵子解冻液可以是公知的组合，例如可以使用背景技术所列文献公开的物质组合。

作为优选方案，所述卵子冷冻液还包括以下组分：二甲基亚砜、乙二醇、蔗糖、血清蛋白、磷酸盐缓冲液；所述卵子解冻液还包括以下组分：蔗糖、血清蛋白、磷酸盐缓冲液。

再进一步优选的，所述卵子冷冻液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：5～10v/v％二甲基亚砜、15～20v/v％乙二醇、0.4-1.0mol/L蔗糖、10w/v～20w/v血清蛋白、0.05～1.0mol/L黄原胶，0.1～0.8mol/L甘氨酸；所述卵子解冻液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：0.4-1.0mol/L蔗糖、10w/v～20w/v血清蛋白、0.05～0.5mol/L黄原胶、0.2～1.0mol/L甘氨酸。

在本发明优选实施方案中，所述卵子冷冻液中各组分浓度分别为：

6v/v％二甲基亚砜、18v/v％乙二醇、0.5mol/L蔗糖、15w/v血清蛋白、0.45mol/L黄原胶、0.4mol/L甘氨酸；

所述卵子解冻液中各组分浓度分别为：

0.5mol/L蔗糖、15w/v血清蛋白、0.25mol/L黄原胶、0.6mol/L甘氨酸。

作为优选方案，所述卵子冷冻保护剂还包括卵子平衡液，所述卵子平衡液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：15～20v/v％乙二醇、10w/v～20w/v血清蛋白。

本发明目的之二是提供一种卵子冷冻保护剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)配置基础溶液磷酸盐缓冲液：所述磷酸盐缓冲液为pH为5.0磷酸盐缓冲液，具体选自磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液中的一种或多种；

(2)在所述的磷酸盐缓冲液中加入乙二醇、再加入血清蛋白混合均匀，对所述混合溶液进行定容和除菌处理，即得卵子平衡液；

(3)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入二甲基亚砜和乙二醇，混合均匀，再加入血清蛋白、黄原胶、甘氨酸，混合均匀，对所述混合溶液进行定容和除菌处理，即得卵子冷冻液；

(4)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入血清蛋白、黄原胶、甘氨酸，混合均匀，对所述混合溶液进行定容和除菌处理，即得卵子解冻液。

本发明目的之三是提供一种卵子的冷冻保存方法，将卵母细胞先置于所述卵子平衡液中，放置10-15min后，再置于所述卵子冷冻液2-5分钟，之后放入液氮中保存，解冻之前放入卵子解冻液2-5分钟。

本发明目的之四是提供一种卵子冷冻保护剂的应用。

原理说明：

本发明涉及的卵子冷冻保护剂属于玻璃化冷冻是应用高浓度的冷冻保护剂溶液在快速降温过程中，由液态直接变为及其粘稠的、无结构的玻璃态，细胞内外均形成无结构的玻璃态。玻璃态物质质点不规则排列，能始终保持水分子和离子分布，使跨膜物质浓度和渗透压差别不大，克服了冰晶形成引发的机械损伤和溶液损伤。玻璃化冷冻减少了细胞的冷冻损伤，提高胚胎冷冻效率，即细胞的复苏率。与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻无需长时间的预平衡及逐步降温过程，仅数分钟即可完成，无需昂贵的程序降温仪，耗液氮量少，又因其有效避免了细胞内外冰晶形成对胚胎的机械损伤，在解冻后能获得更多的卵裂球完全存活或卵裂球。

本发明具有如下有益效果：

(1)黄原胶是由糖类经黄单胞杆菌发醉，产生的胞外微生物多糖。由于它的大分子特殊结构和胶体特性，而具有多种功能，可作为乳化剂、稳定剂、凝胶增稠剂、浸润剂、膜成型剂；传统卵子的冷冻相对于精子冷冻而言要难，卵子的体积大，使得表面积/体积比低，从而使得细胞内冰晶形成的几率增加，本发明将特定比例的黄原胶加入到卵子冷冻液和卵子解冻液中，增加了液体的粘滞度，使得冰核和冰晶形成的机会越小。

(2)同时本发明也考察了黄原胶投料比例，黄原胶的使用量会直接影响卵子冷冻液、卵子解冻液的黏度，最终影响血清蛋白在微孔滤膜表面的扩散速度，从而影响测试结果。

(3)此外，本发明在卵子冷冻液和卵子解冻液中进一步添加氨基酸组分，调节液体的渗透压，通过实验筛选了甘氨酸作为最优的氨基酸组分，并进一步考察其添加浓度，以维持卵子的形状，保证其优良的性能；同时，黄原胶的加入进一步提高了甘氨酸的稳定性和细腻度。

(4)本发明的卵子冷冻保护剂使用现有医用级材料配比而成，无热源，无化工物添加。方便使用，无需洗涤等程序。并且，使用本发明的保护液可在2℃～37℃的条件下维持细胞活性可达到72小时，卵细胞存活率可达到90％以上。使用本发明的卵子冷冻保护剂无需重筛选培养，无需洗涤，可直接按临床或动物实验要求需要并应用。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例

一种卵子冷冻保护剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(2)在所述的磷酸盐缓冲液中加入乙二醇、再加入血清蛋白混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子平衡液；所述卵子平衡液中各组分浓度如表1所示。

表1卵子平衡液的各组分浓度

编号	乙二醇	血清蛋白
			1	15v/v％	10w/v
2	16v/v％	12w/v
			3	17v/v％	18w/v
4	20v/v％	20w/v
			5	18v/v％	15w/v

(3)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入二甲基亚砜和乙二醇，混合均匀，再加入血清蛋白、黄原胶、甘氨酸，混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子冷冻液；所述卵子冷冻液中各组分浓度如表2所示。

表2卵子冷冻液中各组分浓度

编号

二甲基亚砜

乙二醇

蔗糖

血清蛋白

黄原胶

甘氨酸

1

5v/v％

15v/v％

0.4mol/L

10w/v

0.05mol/L

0.1mol/L

2

7v/v％

16v/v％

0.6mol/L

12w/v

0.1mol/L

0.2mol/L

3

8v/v％

17v/v％

0.8mol/L

18w/v

0.5mol/L

0.6mol/L

4

10v/v％

20v/v％

1mol/L

20w/v

1mol/L

0.8mol/L

5

6v/v％

18v/v％

0.5mol/L

15w/v

0.45mol/L

0.4mol/L

(4)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入血清蛋白、黄原胶、甘氨酸，混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子解冻液。所述卵子解冻液中各组分浓度如表3所示。

表3卵子解冻液中各组分浓度

编号	蔗糖	血清蛋白	黄原胶	甘氨酸
					1	0.4mol/L	10w/v	0.05mol/L	0.2mol/L
2	0.6mol/L	12w/v	0.1mol/L	0.4mol/L
					3	0.8mol/L	18w/v	0.4mol/L	0.8mol/L
4	1mol/L	20w/v	0.5mol/L	1mol/L
					5	0.5mol/L	15w/v	0.25mol/L	0.6mol/L

本实施例中制备的卵子冷冻保护剂外观质量清透，无明显杂质，纯度高。本发明所述的卵子来源，没有特别限定。具体来源可以是牛、猪、马、山羊、绵羊、人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠。优选是人卵子。

对比例1

采用实施例的制备方法，在所述卵子冷冻液、卵子解冻液中不添加黄原胶和甘氨酸组分，制得常规卵子冷冻保护剂。具体方法如下：

(2)在所述的磷酸盐缓冲液中加入乙二醇、再加入血清蛋白混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子平衡液；所述卵子平衡液中各组分浓度为乙二醇18v/v％，血清蛋白15w/v。

(3)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入二甲基亚砜和乙二醇，混合均匀，再加入血清蛋白，混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子冷冻液；所述卵子冷冻液中各组分浓度为：二甲基亚砜6v/v％，乙二醇18v/v％，蔗糖0.5mol/L，血清蛋白15w/v。

(4)使用磷酸盐缓冲液溶解蔗糖，在所述蔗糖溶液中加入血清蛋白，混合均匀，对所述混合溶液进行定容然后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，即得卵子解冻液；所述卵子解冻液中各组分浓度为：蔗糖0.5mol/L，血清蛋白15w/v。

本发明采用小鼠卵子作为实验对象进行相关检测，选取6批卵母细胞(每批次50个)分别置于实施例(编号1～5)和对比例1制备的冷冻保护剂中进行冷冻试验，分别先置于所述卵子平衡液中，放置10-15min后，再置于所述卵子冷冻液2-5分钟，之后放入液氮中完成玻璃化冻结，再置于冷冻支架上转移至液氮罐内长期保存，解冻之前放入所述卵子解冻液2-5分钟。

检测卵母细胞冷冻状况并对冷冻过的细胞解冻检测活性，结果显示：细胞冷冻损坏率为0.7％，冷冻细胞失水率为8.5％，细胞外观饱满，无明显褶皱，一周后卵母细胞解冻后存活率为90.3％。相比于传统冷冻保护剂存活率有了明显提升。如表4所示。

表4存活率对比结果

Claims

1.一种卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻保护剂包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述保护剂中含有黄原胶和甘氨酸；具体是将黄原胶和甘氨酸加入到卵子冷冻液和卵子解冻液中。

2.根据权利要求1所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.05～1.0mol/L，甘氨酸的浓度为0.1～0.8mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.05～0.5mol/L，甘氨酸的浓度为0.2～1.0mol/L。

3.据权利要求2所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.1～0.8mol/L，甘氨酸的浓度为0.2～0.6mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.1～0.4mol/L，甘氨酸的浓度为0.4～0.8mol/L。

4.据权利要求3所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液中黄原胶的浓度为0.45mol/L，甘氨酸的浓度为0.4mol/L；卵子解冻液中黄原胶的浓度为0.25mol/L，甘氨酸的浓度为0.6mol/L。

5.根据权利要求1～4任一所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液还包括以下组分：二甲基亚砜、乙二醇、蔗糖、血清蛋白、磷酸盐缓冲液；所述卵子解冻液还包括以下组分：蔗糖、血清蛋白、磷酸盐缓冲液。

6.据权利要求5所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：5～10v/v％二甲基亚砜、15～20v/v％乙二醇、0.4-1.0mol/L蔗糖、10w/v～20w/v血清蛋白、0.05～1.0mol/L黄原胶，0.1～0.8mol/L甘氨酸；所述卵子解冻液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：0.4-1.0mol/L蔗糖、10w/v～20w/v血清蛋白、0.05～0.5mol/L黄原胶、0.2～1.0mol/L甘氨酸。

7.据权利要求6所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻液中各组分浓度分别为：6v/v％二甲基亚砜、18v/v％乙二醇、0.5mol/L蔗糖、15w/v血清蛋白、0.45mol/L黄原胶、0.4mol/L甘氨酸；所述卵子解冻液中各组分浓度分别为：0.5mol/L蔗糖、15w/v血清蛋白、0.25mol/L黄原胶、0.6mol/L甘氨酸。

8.据权利要求6或7任一所述的卵子冷冻保护剂，其特征在于，所述卵子冷冻保护剂还包括卵子平衡液，所述卵子平衡液以磷酸盐缓冲液为基础溶液，各组分浓度分别为：15～20v/v％乙二醇、10w/v～20w/v血清蛋白。

9.一种权利要求8所述卵子冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

10.一种卵子的冷冻保存方法，其特征在于，将卵母细胞先置于所述平衡液中，放置10-15min后，再置于所述卵子冷冻液2-5分钟，之后放入液氮中保存，解冻之前放入卵子解冻液2-5分钟。