CN111789102B

CN111789102B - 一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用

Info

Publication number: CN111789102B
Application number: CN201910282415.5A
Authority: CN
Inventors: 严杰; 乔杰; 闫丽盈; 李蓉; 王健君; 金晟琳
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Peking University Third Hospital
Current assignee: Institute of Chemistry CAS; Peking University Third Hospital
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN111789102A

Abstract

本发明公开了一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用，所述解冻液包括：仿生控冰材料0.1‑50g、水溶性糖0‑1.0mol L‑1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料；所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团或分子，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团或分子。本发明采用具有亲冰和亲水特性的仿生控冰材料制备的解冻液及解冻试剂，能有效控制冰晶生长，显著改善复苏过程中温度变化对于细胞或组织的损害；且生物相容性好，不含动物血清，毒性小，相比于传统含有血清的解冻液，降低了保质期短、带入寄生性生物污染物质等风险，更有利于维持细胞或组织的传代稳定性。且本发明成分简单，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用。

背景技术

冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为冷冻。在解冻过程中，需要注意防止冰晶、冷休克、溶质效应、破碎损伤、重结晶、渗透性休克等冷冻融解损伤，基于提高胚胎、卵母细胞复苏存活率的考虑，通常冷冻融解方案为：采用快速复温的方法，将高渗透压的囊胚或卵母细胞置于含有一定浓度梯度的冷冻保护剂的培养液中，从而使得细胞内外的渗透压差距逐渐减小，减缓细胞体积的变化速度，避免解冻过程中造成的胚胎损伤。目前临床广泛使用的大多采用解冻液为含0.33M蔗糖的基础液，稀释液为含0.2M蔗糖的基础液，洗涤液即为基础液的三步法解冻操作。但上述解冻液在复温过程中不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。除此之外，目前解冻液因使用成分不明确且易变质的血清，导致解冻液存在保质期短、可带入寄生性生物污染物质等问题。

发明内容

为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用。

本发明通过以下技术方案实现:

一种解冻液，每100mL含有仿生控冰材料0.1-50g、水溶性糖0-1.0mol L^-1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料。

根据本发明，所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲水基团可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、羧酸基(-COOH)、酰胺基(-CONH₂)中的至少一种，或，选自例如脯氨酸(L-Pro),精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys)，葡萄糖酸内酯(GDL)，糖类等化合物分子或其分子片段。

根据本发明，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH₂),苯基(-C₆H₅)，吡咯烷基(-C₄H₈N)，或，选自例如谷氨酰胺(L-Gln),苏氨酸(L-Thr),天冬氨酸(L-Asn)，苯环(C₆H₆)，吡咯烷(C₄H₉N)等化合物分子或其分子片段。

根据本发明的，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇(PVA)、氨基酸、多肽、聚氨基酸中的至少一种或两种以上的组合。

根据本发明的解冻液，所述氨基酸可以选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺酸、天冬氨酸、甘氨酸等中的一种或两种以上的组合；所述短多肽或聚氨基酸为上述氨基酸中的一种或两种以上组成。

示例性地，所述多肽为L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT),L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的一种或两种以上。

根据本发明，所述仿生控冰材料含量为1.0-50g、2.0-20g、5.0-10g；在一个实施方案中，所述仿生控冰材料含量为3g、4g、5g、10g、25g、30g。

作为本发明的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括PVA 1.0-6.0g。

作为本发明的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括氨基酸1.0-40g。示例性地，所述氨基酸为精氨酸与苏氨酸组合而成，例如含有精氨酸1.0-20g、1.0-10g、1.0-5g，含有苏氨酸1.0-10g、1.0-5.0g、1.0-2.5g。

作为本发明的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括聚氨基酸0.1-8.0g，例如1-5.0g。示例性地，所述氨基酸为聚-L-脯氨酸和/或聚-L-精氨酸。

作为本发明的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括多肽1.0-50g；例如1.0-25g、1.0-13g、2.0-10g、1.0-5.0g、。

作为本发明的一个实施方案，所述仿生控冰材料是PVA与上述氨基酸、多肽、和/或聚氨基酸的组合。

根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0mol L^-1，例如0.1-0.8mol L^-1，0.2-0.6mol L^-1；具体地，例如0.25mol L^-1，0.5mol L^-1，1.0mol L^-1。

一种解冻试剂，包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV，所述解冻液I-IV具有如上所述解冻液的组成。

根据本发明的解冻试剂，所述解冻液II中仿生抗冻材料的含量为解冻液I中的50％-100％，所述解冻液III中仿生抗冻材料的含量为解冻液II中的50％-100％。

根据本发明的解冻试剂，所述解冻液I-IV中，含有PVA 1.0-6.0g；优选地，所述解冻液I-IV中，PVA浓度相同。

根据本发明的解冻试剂，所述解冻液II中水溶性糖浓度为解冻液I中的50％-100％，所述解冻液III中水溶性糖浓度为解冻液II中的50％-100％，所述解冻液IV中，水溶性糖浓度为0。

作为本发明解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有氨基酸1.0-50g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖1.0mol L^-1，缓冲液余量；

所述解冻液II以每100mL计，含有氨基酸1.0-25g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.5molL^-1，缓冲液余量；

所述解冻液III以每100mL计，含有氨基酸1.0-12.5g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.25mol L^-1，缓冲液余量；

所述解冻液IV以每100mL计，含有氨基酸0-6.25g，PVA 1.0-5.0g，缓冲液余量。

作为本发明解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，水溶性糖1.0mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液II以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.5mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液III以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.25mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液IV以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，余量缓冲液。

作为本发明解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有聚氨基酸0.1-9.0g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖1.0mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液II以每100mL计，含有聚氨基酸0.1-4.5g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.5mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液III以每100mL计，含有聚氨基酸0.1-2.3g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.25mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液IV以每100mL计，含有聚氨基酸0-1.2g，PVA 1.0-5.0g，余量缓冲液。

作为本发明解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有短多肽1.0-50g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖1.0mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液II以每100mL计，含有多肽1.0-25g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.50molL^-1，余量缓冲液；

所述解冻液III以每100mL计，含有多肽1.0-12.5g，PVA 1.0-5.0g，水溶性糖0.25mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液IV以每100mL计，含有多肽0-6.25g，PVA 1.0-5.0g，余量缓冲液。

根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖；优选蔗糖。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。

根据本发明，所述缓冲液可选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液中的至少一种。

根据本发明，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15％-65％，具体地例如40％-60％、53％-55％。优选无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％的PVA。

根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。

根据本发明，所述PVA可选自水解度大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。

本发明的解冻液可采用本领域的已知方法配制，例如：

将仿生抗冻材料分别溶解于一部分缓冲液中，调节pH，将水溶性糖溶解于一部分缓冲液中，冷却至室温后将两种溶液混合。

一种冷冻保存细胞或组织的解冻方法，包括如下步骤：

将冷冻的细胞或组织放入37℃所述解冻液I中复苏3-5分钟，然后常温下依次放入所述解冻液II、解冻液III、解冻液IV中各3-5分钟。

上述解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用。

根据本发明的应用，包括从液氮中快速取出冷冻的卵母细胞或胚胎放入37℃解冻液Ⅰ中3-5分钟，后常温下依次放入解冻液Ⅱ、解冻液Ⅲ、解冻液Ⅳ中各3-5分钟。

本发明还提供上述解冻液或解冻试剂液在制备卵母细胞或胚胎冻存中使用的冷冻试剂中的用途。

有益效果

本发明采用具有亲冰和亲水特性的仿生控冰材料制备的解冻液及解冻试剂，能有效控制冰晶生长，显著改善复苏过程中温度变化对于细胞或组织的损害；用于卵母细胞和胚胎解冻时，能达到优于现有商品化解冻液的存活率。且本发明的解冻液生物相容性好，不含动物血清，毒性小，相比于传统含有血清的解冻液，降低了保质期短、易带入寄生性生物污染物质等风险，更有利于维持细胞或组织的传代稳定性。且本发明成分简单，成本低廉，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中采用的PVA为间同规整度为50％-55％，分子量为13-23kDa，水解度98％。

本发明实施例中冷冻液中采用聚-L-脯氨酸聚合度为15，分子量为1475。平衡液中聚-L-脯氨酸聚合度为8，分子量为795。

本发明实施例中存活率为3-12次重复实验的存活率平均值。

本发明实施例中采用如下冷冻平衡液和冷冻保存液：

冷冻保存液A：总体积100mL，将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

冷冻平衡液a：总体积100mL，将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于50mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL乙二醇，混匀，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

冷冻保存液B：总体积100mL，将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；将1.5g的聚-L-脯氨酸超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将3种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

冷冻平衡液b：总体积100mL，将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于40mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL的乙二醇，混匀，调节pH值并定容补齐余量至总体积100mL，备用。

冷冻保存液C：总体积100mL，每1mL中含有10％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。

冷冻平衡液c：总体积100mL，每1mL中含有7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS。

实施例1

解冻液Ⅰ每100mL含有如下组分

解冻液Ⅱ每100mL含有如下组分

物质	含量
		PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
		DPBS(V)	余量

解冻液Ⅲ每100mL含有如下组分

物质	含量
		PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
蔗糖(g)	0.25
		DPBS(V)	余量

解冻液Ⅳ每100mL含有如下组分

物质	含量
		PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
DPBS(V)	余量

实施例2

解冻液Ⅰ每100mL含有如下组分

解冻液Ⅱ每100mL含有如下组分

物质	含量
		聚-L-脯氨酸/(mg mL<sup>-1</sup>)	5.0
PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
		蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.5
DPBS(V)	余量

解冻液Ⅲ每100mL含有如下组分

物质	含量
		聚-L-脯氨酸/(mg mL<sup>-1</sup>)	2.5
PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
		蔗糖(mol L<sup>-1</sup>)	0.25
DPBS(V)	余量

解冻液Ⅳ每100mL含有如下组分

物质	含量
		PVA(mg mL<sup>-1</sup>)	20
DPBS(V)	余量

对比例1：

解冻液Ⅰ：含有1.0mol L^-1蔗糖,20％的血清，余量为DPBS；

解冻液Ⅱ：含有0.5mol L^-1蔗糖,20％的血清，余量为DPBS；

解冻液Ⅲ：含有0.25mol L^-1蔗糖,20％的血清，余量为DPBS；

解冻液Ⅳ：含有0mol L^-1蔗糖,20％的血清，余量为DPBS。

应用例1冷冻卵母细胞的解冻

本发明所用卵母细胞冷冻保存方法具体为卵母细胞先置于冷冻平衡液中平衡5分钟，然后置于上述冷冻保存液中平衡45秒，将已在冷冻保存液中平衡的卵母细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存。

采用上述实施例1、2中的配方和对比例1所制备的解冻用试剂对冻存的小鼠的卵母细胞进行解冻，卵母细胞解冻方法具体为从液氮中快速取出卵母细胞放入37℃解冻液Ⅰ中3分钟，后常温下依次放入解冻液Ⅱ、解冻液Ⅲ、解冻液Ⅳ中各3分钟，然后将卵母细胞放入培养基中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养2小时，观察卵母细胞存活率(表1)。

应用例2冷冻小鼠胚胎的解冻

本发明所用小鼠胚胎冷冻保存方法具体为小鼠胚胎先置于冷冻平衡液中平衡8分钟，然后置于上述配方所制备的冷冻保存液50秒，将已在冷冻保存液中平衡的胚胎放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存。

采用上述实施例1、2中的配方和对比例1所制备的解冻用试剂对冷冻的小鼠胚胎进行解冻，胚胎解冻方法具体为从液氮中快速取出胚胎放入37℃解冻液Ⅰ中3至5分钟，后常温下依次放入解冻液Ⅱ、解冻液Ⅲ、解冻液Ⅳ中各3分钟，然后将胚胎放入培养基中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养2小时，观察胚胎存活率(表2)。

表1本发明解冻液解冻小鼠卵母细胞的存活率

表2本发明解冻液解冻小鼠胚胎的存活率

编号	平衡液	冷冻液	解冻液	胚胎总数	2小时后存活率％
						对比实例4	c	C	对比例1	39	82.0
应用实例4	b	B	实施例2	39	97.4
						应用实例5	a	A	实施例1	37	97.1

由表1和表2数据可以看出，本发明解冻试剂解冻卵母细胞存活率均达到94％以上，可高达98.6％，解冻胚胎存活率达97％以上，远高于对比例1(商业化解冻液)的卵母细胞和胚胎解冻存活率，表明该解冻试剂优于常规玻璃化解冻液解冻卵母细胞和胚胎的有效性。而且本发明的解冻试剂不加入血清，减少了寄生性生物污染物质等风险，更有利于维持细胞或组织的传代稳定性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用，其特征在于：每100mL解冻液含有仿生控冰材料0.1-50 g、水溶性糖 0-1.0 mol L^-1、缓冲液余量；

所述仿生控冰材料为PVA，或再进一步包含氨基酸、多肽、聚氨基酸中的至少一种或两种以上的组合；

所述PVA选自无规PVA；所述PVA的间同规整度为45%-65 %；所述PVA选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA；所述PVA水解度为80%-99%。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PVA水解度选自82-87%、87%-89%、89%-99%或98%-99%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺酸、天冬氨酸、甘氨酸中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽选自L-Thr-L-Arg、L-Thr-L-Pro、L-Arg-L-Thr、L-Pro-L-Thr、L-Thr-L-Arg-L-Thr、L-Thr-L-Pro-L-Thr、L-Ala-L-Ala-L-Thr或L-Thr-L-Cys-L-Thr中的一种或两种以上。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料含量为1.0-40g。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料包括PVA 1.0-6.0 g。

7.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料包括氨基酸1.0-40 g，所述氨基酸为精氨酸与苏氨酸组合而成。

8.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料包括聚氨基酸0.1-8.0 g。

9.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料包括多肽1.0-40 g。

10.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料是PVA与所述氨基酸、多肽、和/或聚氨基酸的组合。

11.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，每100 mL解冻液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0 mol L^-1。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖选自非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述水溶性糖选自蔗糖、海藻糖。

14.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述缓冲液选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液中的至少一种。

15.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，将冷冻的卵母细胞或胚胎放入37℃解冻液I中复苏3-5分钟，然后常温下依次放入解冻液II、解冻液III、解冻液IV中各3-5分钟；所述解冻液I-IV具有如权利要求1-4任一项所述解冻液的组成。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述解冻液II中仿生控冰材料的含量为解冻液I中的 50%-100%，所述解冻液III中仿生控冰材料的含量为解冻液II中的 50%-100%。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述解冻液I-IV中，含有PVA 1.0-6.0g。

18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述解冻液I-IV中，PVA浓度相同。

19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述解冻液II中水溶性糖浓度为解冻液I中的50%-100%，所述解冻液III中水溶性糖浓度为解冻液II中的50%-100%，所述解冻液IV中，水溶性糖浓度为 0。

20.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述解冻液I以每100 mL计，含有氨基酸、或者多肽中的至少一种1.0-50 g，PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖 1.0 mol L^-1，缓冲液余量，所述仿生控冰材料的总和不超过50g；

所述解冻液II以每100 mL计，含有氨基酸、或者多肽中的至少一种1.0-25 g，PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖 0.5 mol L^-1，缓冲液余量；

所述解冻液III以每100 mL计，含有氨基酸、或者多肽中的至少一种1.0-12.5g，PVA1.0-5.0 g，水溶性糖0.25 mol L^-1，缓冲液余量；

所述解冻液IV以每100 mL计，含有氨基酸、或者多肽中的至少一种 0-6.25 g，PVA1.0-5.0 g，缓冲液余量。

21.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述解冻液I以每100 mL计，含有PVA1.0-5.0 g，水溶性糖 1.0 mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液II以每100 mL计，含有PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖0.5 mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液III以每100 mL计，含有PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖0.25 mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液IV以每100 mL计，含有PVA 1.0-5.0 g，余量缓冲液。

22.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述解冻液I以每100 mL计，含有聚氨基酸0.1-8.0 g，PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖 1.0 mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液II以每100 mL计，含有聚氨基酸 0.1-4.0 g，PVA 1.0-5.0 g，水溶性糖0.5mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液III以每100 mL计，含有聚氨基酸 0.1-2.0 g，PVA 1.0-5.0 g ，水溶性糖0.25 mol L^-1，余量缓冲液；

所述解冻液IV以每100 mL计，含有聚氨基酸 0-1.0 g，PVA 1.0-5.0 g，余量缓冲液。