KR101097953B1 - 항동결 단백질을 이용하여 난자를 동결보존하는 방법 - Google Patents

항동결 단백질을 이용하여 난자를 동결보존하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동결 보존액(평형용액, 동결용액)에 각각 항동결 단백질을 첨가하여 난자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 난자의 동결보존 방법은 난자의 손상을 최소화하여 난자의 동결 및 해동 후의 생존율을 높이고 수정률 및 배반포 발달률을 증진시킬 수 있다.

Description

항동결 단백질을 이용하여 난자를 동결보존하는 방법 {Method of Oocyte Cryopreservation Using Antifreeze Protein}
본 발명은 동결 보존액에 각각 항동결 단백질을 첨가하여 난자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
난자 동결 보관법은 시험관아기 시술 시 다량의 난자가 나온 경우나 시술 당일 정액 채취가 실패한 경우 또는 암환자에서 가임력 보존의 일환으로 또는 자궁내막증 등의 가임력 상실이 우려되는 상황에서 가임력을 보존할 수 있는 매우 매력적인 방법이다. 난자 동결법으로는 완만 동결법(slow freezing)과 유리화 동결법(vitrification method)이 이용된다.
동결 보존제 및 첨가물로는 프로판디올(Propanediol (PROH)), 글리콜(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol (EG)), dimethyl-sufoxide (DMSO) 등의 투과성 동결보존제 (Ali and Sheton, 1993; Kasai, 1997; Wright et al., 2004)와 수크로즈(sucrose), 트레할로스(threhalose), 피콜(Ficoll), 덱스트란(dextran), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리에틸렌 글리콜polyethylene glyconl) (Leibo and Oda, 1992; Naitana et al., 1997; Ohboshi et al., 1997; Shaw et al., 1997; Kuleshova et al., 2001; Asada et al., 2002) 등의 비투과성 동결보조제의 혼합용액이 초급성 유리화 동결법의 동결보조제로 사용되고 있다. 그 중 EG가 낮은 분자량과 적은 독성으로 가장 많이 사용되고 있는 동결 보조제이나(Chian et al., 2004), 한편으로는 두 가지 이상의 동결 보조제를 혼합하여 사용하는 것이 더 효과적이라는 보고도 있다 (Vajta et al., 1998).
배아의 경우에는 동결-해동하여 불임시술에 일반적으로 시행된다. 반면에 난자의 경우 큰 크기와 그에 따른 많은 수분 포함량이 있어 동결 시 손상을 받는다는 점에서 성공률이 낮다고 보고되고 있다. 또한 성숙난자인 경우 감수분열 방추사의 변형을 초래하는 손상을 받아 난할능이나 배반포 발달율을 저해시키는 결과를 나타내었다(Carrol et al., 1993; Lane et al., 1999; Hong et al., 1999, Shaw et al., 2000;). 이와 같이 동결방법에 대한 많은 연구에도 불구하고 난자의 동결 손상을 최소화할 만한 개선에 있어서는 이렇다 할 진전을 이루지는 못했다.
이에, 본 발명자들은 난자의 동결 시 방추사의 손상, 난자의 막에 대한 손상, 난자 내 미세세포구조의 손상 등을 최소화하여, 해동 후의 생존율을 높이고 수정률, 배반포 발달률을 증진시킬 수 있는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 항동결 단백질을 첨가한 동결 보존액을 이용하여, 난자의 동결 시 난자의 손상을 최소화함으로써 난자의 생존율, 수정률 및 배반포 발달률을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 5 내지 50부피%의 혈청, 10 내지 20부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 10 내지 20부피%의 프로필렌 글리콜 및 100 내지 3000ng/ml의 항동결 단백질(antifreeze protein)을 혼합하여 동결보존용 조성물을 제조한 후, 상기 조성물로 목적하는 세포를 현탁시키고 동결시키는 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.
상기 세포를 동결보존하는 방법에 있어서, 세포를 동결시키기 이전에 세포의 수분을 제거하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 5 내지 50부피%의 혈청, 5 내지 10부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 5 내지 10부피%의 프로필렌 글리콜 및 100 내지 3000ng/ml의 항동결 단백질(antifreeze protein)을 첨가한 동결보존용 조성물로 목적하는 세포를 추가로 현탁하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 구체예에서, 5 내지 50부피%의 혈청, 10 내지 20부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 10 내지 20부피%의 프로필렌 글리콜 및 100 내지 3000ng/ml의 항동결 단백질(antifreeze protein)을 혼합하여 동결보존용 조성물을 제조한 후, 상기 조성물로 목적하는 세포를 현탁시키고 동결보존한 후 세포를 해동시켜서 세포의 배반포발달율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구체예에서, 5 내지 50부피%의 혈청, 5 내지 20부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 5 내지 20부피%의 프로필렌 글리콜 및 40 내지 55 부피%의 완충액을 함유하는 조성물에 100 내지 3000ng/ml의 항동결 단백질(antifreeze protein)이 첨가된 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구체예에서, 완충액에 혈청을 첨가하여 5 내지 50부피%의 혈청 용액을 제조하고, 상기 혈청 용액에 5 내지 30부피%의 에틸렌 글리콜(EG) 및 프로필렌 글리콜을 첨가하고, 100 내지 3000ng/ml의 항동결 단백질(antifreeze protein)을 첨가하여 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 항동결 단백질은 400-600ng/ml의 농도인 것을 특징으로 할 수 있고, antifreeze protein type Ⅲ 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin) 및 합성대체혈청(SSS, synthetic substitute serum)으로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 20부피%의 소태아혈청인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 동결보존용 조성물은 수크로즈(sucrose)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포"는 생식체(gamete) 즉, 정자 또는 난자의 선조체(progentors)를 의미하며, 이에 한정하지 않지만, 예를 들어 원식생식세포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 및 생식선줄기세포(germline stem cell)를 포함한다. 본 발명에서, 상기 세포는 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, “항동결 단백질”은 영하의 온도에서 식물 또는 동물이 동결되는 것을 방지하는 기능을 가지는 단백질을 의미하며, 통상 극지방 해양어류의 체내 또는 추운 지방의 식물에서 발견된다. 또한, 이에 한정하지 않지만, 예를 들어, 항동결 단백질은 Type 1,2,3를 포함한다.
본 발명에 따른 난자의 동결보존 방법은 난자의 손상을 최소화하여 난자의 동결 및 해동 후의 생존율을 높이고 수정률 및 배반포 발달률을 증진시킬 수 있다.
도 1은 항동결 단백질의 함량에 따른 체내 성숙 난자의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 2는 항동결 단백질의 함량에 따른 체내 성숙 난자의 배반포 발생률을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
항동결 단백질의 첨가에 의한 난자의 동결보존
난자를 기본배지인 HEPES-buffered TCM-199 (Gibco)상의 20부피%의 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum) 용액으로 5분간 현탁시킨 후 난자를 분리하였다, 분리한 난자를 기본배지 17ml에 7.5부피%의 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 1.5ml 및 7.5부피%의 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 1.5ml를 함유하는 20ml의 평형용액 (ES)을 만든 후 700μl의 평형용액으로 난자를 5분간 현탁시켰다. 그 후 다시 난자를 분리하고, 이를 기본배지 14ml에 15부피%의 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 3ml, 15부피%의 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 3ml 및 0.5M 수크로즈(3.424g/20ml)를 함유하는 동결용액(VS)을 만든 후 700μl의 동결용액으로 난자를 1분 이내로 현탁시켰다. 상기 동결용액(VS) 상의 5~6개의 난자를 CryoTop(Kitazato, Japan)을 이용하여 그 위에 올리고, 수분을 제거한 다음 바로 직접 액체질소 내로 침지하여 질소 탱크 안에 보관하였다. 이때, 평형용액(ES)와 동결용액(VS)에 항동결단백질(AntiFreeze Protein type III)을 각각 500ng/ml의 농도로 첨가하여 첨가하지 않은 대조군과의 발달률을 관찰하였다. 난자는 생쥐의 것을 사용하여 실험하였다.
항동결 단백질을 500ng/ml 첨가한 동결 보존제를 이용하여 체내 성숙 난자(In - vivo matured MII oocyte)의 생존률, 수정률, 배반포 발달률을 확인한 결과, 항동결 단백질을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 생존률, 수정률, 배반포 발달률 모두에 있어서 유의하게 상승하는 것을 확인하였다. 이는 항동결 단백질을 첨가함으로써 난자의 동결보존 시 방추사와 세포구조에 손상을 최소화할 수 있고, 결국 본 발명의 동결 보존액 조성이 효과가 있음을 나타낸다(표 1).
　 대조군 (%) AFP 처리 (%) P
시작 체내 성숙 난자
(Initiated MII)		 194 223 　
생존 난자
(Surviving after vitrification-warming)		 164 (84.54%) 211 (94.62%) 0.001
수정후 난할
(Cleaved after insemination)		 132 (80.49%) 200 (94.79%) *<0.01
배반포 발달
(Blastocyst(per cleaved))		 113 (85.61%) 188 (94.00%) 0.01
배반포 발달
(Blastocyst (per survived))		 113 (68.90%) 188 (89.10%) *<0.01
또한, 항동결 단백질을 500ng/ml 첨가한 동결 보존제를 이용하여 미성숙 난자의 생존율, 수정률, 배반포 발달률을 확인한 결과, 체내 성숙된 MII난자보다 생존률이 유의하게 좋은 것을 확인하였다. 대조군과 실험군 사이의 생존율 차이는 통계적으로 유의한 차이를 보이며 실험군이 효과가 있음을 나타낸다(대조군: 91.67%, 실험군: 100%). 두 군간의 성숙률은 차이가 없었으며 이는 미성숙 난자 해동 후 배양조건 또한 좋은 상태를 나타낸 것으로 보인다. 인공 수정 후 난자의 수정률(난할율)은 대조군에서 매우 유의하게 좋은 결과를 나타낸다(대조군: 66.67%, 실험군: 95.65%). 이는 초기 동결 시 수정에 관계된 난자 내 구조를 잘 보호한 것으로 추정된다. 배반포 발달은 수정된 난자 대비 비율을 산출했을 때는 두 군간에 차이가 없다고 보이나 초기 미성숙 난자 대비 배반포 발달률을 비교하면 유의하게 실험군이 높은 비율을 보인다(표 2).
　 대조군 (%) AFP 처리 (%) P
유리화 군
(vitrification groups)		 GV stage control GV stage AFP 500ng/ml 　
시작
(Initiated CEOs)		 60 60 　
생존
(Surviving CEOs
after vitrification)		 55 (91.67%) 60 (100%) *0.002
성숙 난자
(Matured oocyte (IVM rate))		 45 (81.82%) 46 (76.67%) NS
수정 후 난할
(Cleaved after insemination
(per matured))		 30 (66.67%) 44 (95.65%) *<0.01
배반포 발달
(Blastocyst (BR per cleaced, per initiated CEOs))		 21(70.00%), 21(35.00%) 35 (79.55%), 35(58.33%) NS
*0.01
항동결 단백질의 중량비에 따른 난자의 동결보존
항동결 단백질의 중량비를 각각 100ng/ml, 500ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 및 30/ml 으로 달리 첨가하여, 항동결 단백질의 중량비에 따른 체내 성숙 난자(In - vivo matured MII oocyte)의 생존률, 수정률, 배반포 발달률을 비교하였다. 항동결 단백질의 중량비 차이를 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 항동결 단백질을 500ng/ml 첨가하였을 때, 난자의 생존률, 성숙률, 수정률(난할률), 배반포 발달률 모두에서 매우 유의하게 좋은 결과를 나타내었다(도 1, 도 2). 이로부터, 첨가되는 항동결 단백질의 특정 중량비는 난자의 동결보존에 있어서 난자의 생존률, 성숙률, 수정률, 배반포 발달률을 결정짓는 중요한 요소임을 확인하였다.
　 대조군 (%) AFP 100ng/ml AFP 　
500 ng / ml 　 		AFP 　
1μg/ ml 　 		AFP 　
10μg/ ml 		AFP
30μg/ ml
시작 성숙 난자
(Initiated MII) 		43　 41　 49　 35　 33　 27　
생존 난자
(Surviving after vitrification-warming) 		36
(83.72%)　		 34
(82.93%) 		47
(95.92%) 		32
(91.43%)　		 30
(90.91%) 		24 (88.89%)
수정 후 난할
(Cleaved after insemination) 		29 (80.56%) 28
(82.35%) 		46
(97.87%) 		28
(87.50%)　		 21
(70.00%) 		16 (66.67%)
배반포 발달
(Blastocyst (per cleaved)) 		23 (79.31%) 22
(78.57%) 		44
(95.65%) 		25 (89.29%) 17
(80.95%) 		10 (62.50%)
배반포 발달
(Blastocyst (per survived)) 		23　
(69.89%)　		 22
(64.71%)　		 44
(93.62%) 		25 (78.13%) 17　
(56.67%)　		 10　
(41.67%)　
항동결 단백질의 첨가에 의한 방추사 형성 및 염색체 분리
항동결 단백질을 500ng/ml 첨가한 체내 성숙 난자의 유리화 이후의 방추사 형성 및 염색체 분리를 관찰한 결과, 정상을 유지하는 난자의 수가 증가하였음을 확인하였다(표 4).
정상 방추사 상태와 비정상 상태는 다음과 같이 구분하였다. 정상적인 방추사는 핵이 적도판에 일자로 배열되어 있으며 핵을 중심으로 방추모양으로 대칭을 이루는 모양이다. 비정상 방추사는 핵이 소실되었거나 일자로 배열되지 않고 산개하는 모양을 보이는 경우와 방추사의 일부가 소실, 혹은 뒤엉켜서 뭉쳐있는 모양을 말한다. 정상 상태의 등급 구별은 다음과 같다. 1등급 정상상태는 모양이 동결 전 난자와 비교했을 때 거의 유사하거나 유사한 상태를 말한다. 2등급 정상상태는 핵의 배열과 방추사의 대칭이 비교적 정상이나 아주 약간의 방추사가 소실되었거나 핵의 배열이 완전하게 고르지 않은 경우를 말한다. 실험 결과, 대조군과 비교했을 때 실험군에서 방추사의 정상 상태가 유의하게 좋아졌음을 확인하였으며, 1등급 정상상태의 난자도 유의하게 실험군에서 증가하였다.
　 대조군 (%) AFP 500 ng / ml (%) P　
Treatment　 In vivo-matured In vivo-matured 　
난자의 수 102　 108　 　
전체 정상 상태
(total normal status) 		73 (71.67) 92 (85.19) 0.016*
정상 상태 (등급 1) 50 (49.02) 77 (71.29) 0.001*
정상 상태 (등급 2) 23 (22.55) 15 (13.89) 0.103
비정상 상태
(Abnormal status) 		29 (28.43) 16 (14.81) 0.016*
항동결 단백질의 첨가에 의한 세포막 보전
항동결 단백질을 500ng/ml 첨가한 체내 성숙 난자의 유리화 이후의 세포막 보전 효과를 관찰하였다. 그 결과, 항동결 단백질을 첨가한 경우에, 대조군에 비하여 세포막이 손상되지 않은 난자의 수가 증가하였음을 확인하였다(표 5).
항동결 단백질의 첨가에 따른 세포막 보전 효과를 확인한 실험 결과, 살아있는 세포는 녹색형광을 발색하고, 죽거나 막에 손상을 받은 난자는 붉은색을 발색하였다. 살아있되 손상을 받은 난자의 경우는 녹색형광과 붉은색 형광을 동시에 나타내었다. 본 실시예의 결과로는 대조군과 비교했을 때 세포막이 손상되지 않고 살아있는 난자의 비율은 실험군에서 유의하게 높게 나타났다. 생존하였으나 세포막에 손상을 받은 난자의 경우는 실험군에서 통계적으로 유의하게 낮게 나타났다. 하지만 형태학적으로는 정상이나 염색을 통해 죽은 난자의 선별에서는 두 군간의 통계적인 유의성은 나타나지 않았다.
　 대조군 (%) AFP 500 ng / ml (%) P　
난자의 수 105　 112　 　
생존 난자
(손상되지 않음) 		84(80.00) 102(91.07) p=0.02*
생존 난자 (손상됨) 9(8.57) 2(1.79) p=0.023*
죽은 난자 12(11.43) 8(7.14) p=0.275

Claims (28)

14 부피%의 혈청, 15 부피%의 에틸렌 글리콜(EG) 및 15 부피%의 프로필렌 글리콜이 되도록 혼합한 다음, 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질을 첨가하여 동결보존용 조성물을 제조한 후, 상기 조성물로 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포를, 현탁시키고 동결시키는 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법.
제 1항에 있어서,
세포를 동결시키기 이전에, 세포의 수분을 제거하는 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법.
제 1항에 있어서,
17 부피%의 혈청, 7.5 부피%의 에틸렌 글리콜(EG) 및 7.5 부피%의 프로필렌 글리콜이 되도록 혼합한 다음, 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질을 첨가하여 동결보존용 조성물을 제조한 후, 상기 조성물로 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포를, 추가로 현탁하는 단계를 포함하는 세포를 동결보존하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항동결 단백질은 400-600ng/ml의 농도가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항동결 단백질은 antifreeze protein type Ⅲ 인 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin) 및 합성대체혈청(SSS, synthetic substitute serum)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 세포를 동결보존하는 방법.
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제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 동결보존용 조성물은 수크로즈(sucrose)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포를 동결보존하는 방법.
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14 부피%의 혈청, 15 부피%의 에틸렌 글리콜(EG) 및 15 부피%의 프로필렌 글리콜이 되도록 혼합한 다음, 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질을 첨가하여 동결보존용 조성물을 제조한 후, 상기 조성물로 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포를 현탁시키고 동결보존한 후 세포를 해동시켜서 세포의 배반포 발달율을 증가시키는 방법.
14 부피%의 혈청, 15 부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 15 부피%의 프로필렌 글리콜 및 56 부피%의 완충액을 함유하는 조성물에 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질이 첨가된 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포의 동결보존용 조성물.
17 부피%의 혈청, 7.5 부피%의 에틸렌 글리콜(EG), 7.5 부피%의 프로필렌 글리콜 및 68 부피%의 완충액을 함유하는 조성물에 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질이 첨가된 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포의 동결보존용 조성물.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,
상기 항동결 단백질은 antifreeze protein type Ⅲ 인 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존용 조성물.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,
상기 혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin) 및 합성대체혈청(SSS, synthetic substitute serum)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 세포의 동결보존용 조성물.
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제 13항 또는 제 14항에 있어서,
상기 완충액은 수크로즈(sucrose)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존용 조성물.
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14 부피%의 혈청, 15 부피%의 에틸렌 글리콜(EG) 및 15 부피%의 프로필렌 글리콜이 되도록 혼합한 다음, 항동결 단백질(antifreeze protein)의 농도가 100 내지 3000ng/ml가 되도록 항동결 단백질을 첨가하여 인간 난자, 인간 수정란 및 난소조직으로 구성된 군에서 선택되는 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법.
제 21항에 있어서,
상기 항동결 단백질은 400-600ng/ml의 농도인 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법.
제 21항에 있어서,
상기 항동결 단백질은 antifreeze protein type Ⅲ 인 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법.
제 21항에 있어서,
상기 혈청은 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin) 및 합성대체혈청(SSS, synthetic substitute serum)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법.
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제 21항에 있어서,
상기 동결보존용 조성물은 수크로즈(sucrose)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 동결보존용 조성물을 제조하는 방법.
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