CN113383767A - 一种冻存液在干细胞冻存中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冻存液在干细胞冻存中的应用。每100mL冷冻保存液溶液中含有：仿生控冰材料0.1‑50g，DMSO 0.1‑15mL，血清0.1‑30mL，缓冲液余量。本发明的冷冻保存液以氨基酸类或聚乙烯醇等仿生控冰材料为主要成分，DMSO含量低，毒性小，成分明确，能达与现有冷冻保存液同等甚至更高的细胞存活率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞、组织或器官冷冻保存。

Description

一种冻存液在干细胞冻存中的应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种冻存液在干细胞冻存中的应用。

背景技术

冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。干细胞由于其对组织细胞损伤的修复、替代损伤细胞以及刺激机体自身细胞的再生功能被广泛用于临床治疗和再生医学。例如，对新生胎儿的人脐带间充质干细胞由于其免疫原性低，细胞含量多、增殖能力强等有点，具有广阔的临床应用前景；对人脐带间充质干细胞的冷冻保存为其在临床的广泛应用提供可能。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。干细胞，例如间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，可广泛用于干细胞移植、自身免疫性疾病或者基因治疗载体等方面。目前干细胞的冻存试剂通常由包括冷冻保护剂、干细胞生长培养基等组分组成，实现支持细胞并可以减少冰晶形成的目的。但是，生长培养基容易导致干细胞盲目分化，影响干细胞复苏后的定向分化潜能。

发明内容

本发明提供一种冷冻保存液，每100mL溶液中含有：仿生控冰材料0.1-50g，DMSO0.1-15mL，血清0.1-30mL，缓冲液余量。

根据本发明，所述冷冻保存液不含多元醇和糖。

根据本发明，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇或者氨基酸类仿生控冰材料中的至少一种。

根据本发明，每100mL所述冷冻保存液含有聚乙烯醇的量优选0.1-6g。

根据本发明，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15％-65％，具体地例如40％-60％、53％-55％。优选无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％的PVA。

根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。

根据本发明，所述PVA可选自水解度大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。

根据本发明，所述氨基酸类仿生控冰材料选自氨基酸或者聚氨基酸、或者肽类化合物的一种或两种以上。

作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸类仿生控冰材料可以为含有亲冰基团和亲水基团的氨基酸、或者含有亲冰基团的氨基酸和含有亲水基团的氨基酸组成的聚氨基酸或者肽类化合物。

所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、羧酸基(-COOH)、或酰胺基(-CONH₂)等中的至少一种；

所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH₂),苯基(-C₆H₅)，或吡咯烷基(-C₄H₈N)的至少一种。

示例性地，所述氨基酸类仿生控冰材料选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中的一或两种，或者由上述氨基酸组成的聚氨基酸；例如所述氨基酸类仿生控冰材料为精氨酸与苏氨酸的组合。

作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸类仿生控冰材料为聚氨基酸(聚合度≥2)，优选聚合度为2～40(如聚合度为6、8、15、20等)，所述聚氨基酸为氨基酸均聚物，例如为聚-L-脯氨酸、聚-L-精氨酸等中的一种或两种以上的组合。

在本发明的实施方案中，所述肽类化合物由亲冰性氨基酸，如：苏氨酸(L-Thr)、谷氨酰胺(L-Gln)、天冬氨酸(L-Asn)等，与其他亲水性氨基酸或葡萄糖内酯(GDL)或其他糖类反应得到，所述其他亲水性氨基酸可选自精氨酸、脯氨酸、丙氨酸等。

所述肽类化合物为两个以上的氨基酸单元形成的肽类，如：2-8个氨基酸单元，具体地可以为2个、3个、4个、5个氨基酸单元；每个氨基酸单元不同。所述肽类化合物中亲冰氨基酸与其他亲水氨基酸的排列方式没有特别的限定，可采用本领域已知的氨基酸连接基团或化学键连接，例如亲冰氨基酸和亲水氨基酸可以单个间次排列，也可以多个亲冰氨基酸或者多个亲水氨基酸相连，形成亲冰氨基酸片段或亲水氨基酸片段，再分别与亲水氨基酸(或片段)、亲冰氨基酸(或片段)连接。

在本发明的实施方案中，所述肽类化合物为多肽，例如L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT)，L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的至少一种。所述多肽可以经本领域已知的多肽合成方法制备，例如由固相合成法制备多肽。

在另一实施方案中，所述肽类化合物为糖肽衍生物，例如是葡萄糖内酯或其他糖类与氨基酸合成的糖肽衍生物，例如GDL-L-Thr、GDL-L-Ser、GDL-L-Val。可根据本领域已知的糖类与氨基酸的反应方法制备所述糖肽衍生物，例如固相合成或者使糖类和氨基酸在有机溶剂中反应。

根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述氨基酸类仿生控冰材料含量为0.5-50g，优选1.0-35g，例如，当所述氨基酸类仿生控冰材料为氨基酸时，其含量可以为5.0-35g，优选为15-25g；当所述氨基酸类仿生控冰材料为聚氨基酸时，其含量可以为0.5-9.0g，优选为1.0-5.0g。

根据本发明，所述缓冲液可选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液或本领域已知的其他细胞培养缓冲液中的至少一种。

根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物，例如十二烷基磺酸钠，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。

根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述DMSO含量为0.1-15mL，优选DMSO含量为1.0-10mL，更优选为1-7.5mL，例如1.5-5mL。

根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL。

根据本发明，所述冷冻保存液的pH为6.5-7.6，例如为6.9-7.2。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL计，含有如下组分：

氨基酸 0.5-50g

DMSO 0.1-10mL

血清 0.1-30mL

缓冲液 余量。

优选：所述冷冻保存液以每100mL计，含有如下组分：

L-Arg 2.0-20g

L-Thr 1.0-10g

DMSO 0.1-10mL

血清 5.0-20mL

DPBS 余量。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：

聚氨基酸 0.5-9.0g

DMSO 0.1-10mL

血清 5.0-20mL

缓冲液 余量。

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：

聚-L-脯氨酸或聚-L-精氨酸 1.0-8.0g

DMSO 0.1-10mL

血清 5.0-20mL

DPBS 余量。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

PVA 1.0-5.0g

DMSO 0.1-10mL

血清 0.1-20mL

缓冲液 余量。

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

PVA 1.0-4.0g

DMSO 4-10mL

血清 10-20mL

DPBS 余量。

本发明还提供上述冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述仿生控冰材料溶解于部分缓冲液，调节pH后形成溶液1；

(2)将DMSO溶解于一部分缓冲液，制得溶液2；

(3)待溶液1和溶液2冷却至室温后混合，调节pH并用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。

根据本发明的制备方法，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。

根据本发明的制备方法，所述仿生控冰材料为聚乙烯醇时，采用水浴加热并进行搅拌；例如水浴温度为65-85℃、70-80℃；所述搅拌为机械搅拌例如磁力搅拌。

本发明还提供所述冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。所述干细胞的冷冻保存可以采用本领域已知的任何干细胞冷冻方法，在一个实施方案中，包括将带有干细胞的冷冻液加入冻存管内，置于异丙醇冻存盒中，进行冷冻。在另一实施方案中，采用上述冷冻保存液用微滴法进行干细胞冷冻保存。

根据本发明的实施方案，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，例如全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、各类间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞。

本发明中“冻存”和“冷冻保存”具有相同含义，可互换使用，指通过低温对某种物质或者细胞、组织、器官进行保存，使其保持其本来的理化和/或生物活性、生理生化功能。

有益效果

本发明提供的冷冻保存液以聚乙烯醇或者氨基酸类仿生控冰材料为主要控冰成分，来源广泛，生物相容性好，所制备的冷冻保存试剂可以不加细胞培养基，成分确定且组成简单，可以保持更高的细胞存活率。本发明的冷冻保存液组成原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类干细胞的冷冻保存。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中采用聚-L-脯氨酸聚合度为8或15，分子量为795或1475；聚-L-精氨酸聚合度为8或15，分子量为1267或2361。

本发明实施例中存活率为2-3次重复实验的存活率平均值。

实施例

1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液

冷冻保存液A:总体积100mL，将2.0g的聚-L-精氨酸超声溶解于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1；将10mL的DMSO溶解于20mL的DPBS中，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混匀，调节pH至7.0，并用DPBS定容补齐余量至总体积的85％，15mL的血清单独存放，在冷冻保存液使用前加入。

冷冻保存液B：总体积100mL，将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，待PVA全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为10mL的DMSO溶解于25mL的DPBS中，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积的85％，15mL血清单独存放待保存液使用时添加。

对比例：

冷冻保存液1#：每1mL中含有10％(v/v)的DMSO，15％(v/v)的胎牛血清，余量为α-MEM培养基。

应用例：

采用上述实施例及对比例的冷冻保存液按表1中的方案分别进行人脐带间充质干细胞的冷冻保存。

300μL冻存管冷冻保存人脐带间充质干细胞：

本发明所用人脐带干细胞冷冻保存方法具体为：将培养皿上的人脐带间充质干细胞用25％胰酶消化2-3分钟后，放入等体积培养液(10％FBS+a-MEM培养基)，轻柔吹打至干细胞全部脱落，1000r离心5分钟，弃上清，将300μL冷冻液加入离心管内，轻柔吹打使干细胞团分散，将带有干细胞的冷冻液加入2ml冻存管内，置于异丙醇冻存盒中，放入-80摄氏度冰箱内，24小时后解冻，台盼蓝染色察看其存活率(参见表1)。

表1人脐带间充质干细胞冷冻保存存活率

编号	冷冻保存液	存活率
			应用实例1	A	76.5％
应用实例2	B	78.0％
			对比实例1	冷冻液1#	76.4％

由表1的数据可以看出，本发明的冷冻保存液不需要加入干细胞培养基，避免了成分复杂的培养基引入，仅加入仿生控冰材料和少量的DMSO，进行人脐带间充质干细胞冷冻保存时，干细胞存活率可达80％左右，表明其具有和现有的加入培养基的冻存液相当的有效性，并且成分更加简单可控，具有广泛的应用前景。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述冷冻保存液每100mL溶液中含有：仿生控冰材料0.1-50g，DMSO 0.1-15mL，血清0.1-30mL，缓冲液余量。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇或者氨基酸类仿生控冰材料中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，每100mL所述冷冻保存液含有聚乙烯醇的量优选0.1-6g；

优选，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15％-65％；优选无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45％-65％的PVA；

优选，所述PVA选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa；

优选，所述PVA可选自水解度大于80％的PVA，例如水解度为80％-99％。

4.根据权利要求2所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述氨基酸类仿生控冰材料选自氨基酸或者聚氨基酸、肽类化合物的一种或两种以上；

优选，所述氨基酸类仿生控冰材料为含有亲冰基团和亲水基团的氨基酸、或者含有亲冰基团的氨基酸和含有亲水基团的氨基酸组成的聚氨基酸；

优选，所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、羧酸基(-COOH)、或酰胺基(-CONH₂)等中的至少一种；

优选，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH₂),苯基(-C₆H₅)，或吡咯烷基(-C₄H₈N)的至少一种；

优选，所述氨基酸类仿生控冰材料选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中的一或两种，或者由上述氨基酸组成的聚氨基酸；例如所述氨基酸类仿生控冰材料为精氨酸与苏氨酸的组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述氨基酸类仿生控冰材料为聚氨基酸(聚合度≥2)，优选聚合度为2～40(如聚合度为6、8、15、20等)，例如为聚-L-脯氨酸、聚-L-精氨酸等中的一种或两种以上的组合；

优选，所述肽类化合物为两个以上的氨基酸单元形成的肽类，如：2-8个氨基酸单元，具体地可以为2个、3个、4个、5个氨基酸单元；每个氨基酸单元不同；例如所述肽类化合物由亲冰性氨基酸，如：苏氨酸(L-Thr)、谷氨酰胺(L-Gln)、天冬氨酸(L-Asn)等与其他亲水性氨基酸或葡萄糖内酯(GDL)或其他糖类反应得到，所述其他亲水性氨基酸可选自精氨酸、脯氨酸、丙氨酸等；

优选，所述肽类化合物为多肽，例如L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT)，L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的至少一种；

优选，所述肽类化合物为糖肽衍生物，例如为葡萄糖内酯或其他糖类与氨基酸合成的糖肽衍生物，例如GDL-L-Thr、GDL-L-Ser、GDL-L-Val。

6.根据权利要求1-5任一项所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，每100mL冷冻保存液中所述氨基酸类仿生控冰材料含量为0.5-50g；

优选，所述缓冲液选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液或其他细胞培养缓冲液中的至少一种；

优选，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物例如十二烷基磺酸钠，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白；

优选，每100mL冷冻保存液中所述DMSO含量为0.1-15mL，优选DMSO含量为1.0-10mL；

优选，每100mL冷冻保存液中所述血清含量为5.0-20mL；

优选，所述冷冻保存液的pH为6.5-7.6。

7.根据权利要求1-6任一项所述的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述冷冻保存液为如下任一组成：以每100mL计，含有如下组分：

优选：所述冷冻保存液以每100mL计，含有如下组分：

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：

优选，所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，包括如下组分：

8.权利要求1-7任一项所述冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述冷冻保存液的制备方法包括如下步骤：

(1)将所述仿生控冰材料溶解于部分缓冲液，调节pH后形成溶液1；

(2)将DMSO溶解于一部分缓冲液，制得溶液2；

(3)待溶液1和溶液2冷却至室温后混合，调节pH并用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。

9.根据权利要求1-8所述冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，所述冷冻保存液的制备过程中血清在所述冷冻保存液使用时添加；

所述仿生控冰材料为聚乙烯醇时，采用温浴加热并进行搅拌，例如水浴或油浴；例如水浴温度为65-85℃、70-80℃；所述搅拌为机械搅拌例如磁力搅拌。

10.权利要求1-9任一项所述冷冻保存液在干细胞冻存中的应用，包括将带有干细胞的冷冻液加入冻存管内，置于异丙醇冻存盒中，进行冷冻。