CN114451400A - 含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有该多肽的冷冻保存液及其在干细胞冷冻保存中的应用。其中，所述多肽是LEA蛋白的功能区，在水溶液中具有良好的生物相容性好，是理想的控冰材料。含有上述多肽的冷冻保存液用于冷冻保存干细胞具有较高的存活率，仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当。

Description

含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。
背景技术
冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。现代医疗的发展经历了化学药、生物药，并已向细胞药迈进。然而(离体)体外培养的细胞会经历复制性的衰老和死亡。因此，“细胞”成为货架上即取即用的药物，首先要解决的就是存储问题。作为目前唯一有望实现“细胞”长期存储和远程运输的技术，冷冻保存已成为细胞治疗不可或缺的技术支撑。通常，在细胞冷冻保存过程中，需要添加冷冻保存试剂以使细胞免受冰冻伤害。因此，冷冻保存试剂是决定冷冻保存能否成功的关键物质基础。
目前最常用的冷冻保存试剂为玻璃化冻存试剂，其中含有大量的强水合作用的小分子如二甲基亚砜(DMSO≥10％)，DMSO的添加可以抑制冷冻保存过程中冰晶的形成(细胞内外的液体均成玻璃化状态而避免冰晶的生成)。然而，DMSO具有细胞毒性，酶毒性等导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的生物安全性甚至功能表达。
发明内容
为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供含有LEA蛋白保守结构域，以下简称“LEA蛋白功能区的多肽”，和含有该类多肽的冷冻保存液，以及这些多肽和含有该多肽的冷冻保存液的应用，特别是在干细胞冷冻保存中的应用。
本发明通过如下技术方案实现:
本发明提供了一种多肽，其特征在于，包含LEA蛋白功能区的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。优选地，所述多肽是LEA蛋白功能区。
根据本发明，所述多肽选自下述a)至c)中的至少一组：
a)具有表1中所示的氨基酸序列；
b)由表1中所示的氨基酸序列的多肽两端缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的且具有a)所述多肽的功能的衍生多肽；或
c)与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性高于90％。
根据本发明，优选地，所述c)中，所述与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性在90-99％之间，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
根据本发明，优选地，所述多肽的氨基酸序列如表1中所示的多肽。
根据本发明，更优选地，所述多肽的氨基酸序列如表2中所示的多肽。
本发明还提供了一种多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：
(a)编码具有表1中所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或
(c)与(a)或(b)有至少70％同源性的多核苷酸。
根据本发明，所述c)中，与(a)或(b)的多核苷酸相比，同源性在70-99％之间，例如70％，71％，72％，75％，78％，80％，81％，82％，85％，88％，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
根据本发明，优选地，所述多核苷酸包含编码具有表1中所示氨基酸序列的多核苷酸。
根据本发明，更优选地，所述多核苷酸编码如表1中所示的多肽。
根据本发明，更优选地，所述多核苷酸编码如表2中所示的多肽。
本发明还提供了上述多肽的制备方法，可以采用本领域已知的多肽合成方法合成，例如采用固相合成法合成。
本发明还提供上述多肽在细胞、组织或器官的冷冻保存中的应用。
根据本发明的应用，所述多肽可以和其他控冰材料组合使用，所述其他控冰材料为氨基酸单体、聚氨基酸、糖类等中的至少一种。
本发明还提供一种冷冻保存液，其含有上述多肽。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1-50g所述多肽。优选含有0.1-20g所述多肽，还优选0.2-10g所述多肽，更优选含有0.5-8g所述多肽，还更优选含有1-5g所述多肽。
根据本发明的冷冻保存液，还进一步包括氨基酸单体、聚氨基酸、糖类或者DMSO、多元醇中的一种或两种以上。
根据本发明，所述氨基酸单体可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种或两种以上。优选地，所述氨基酸单体为脯氨酸，更优选地，所述氨基酸单体为L-Pro。
根据本发明，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种的均聚物或两种以上氨基酸的共聚物。优选地，所述聚氨基酸为聚脯氨酸8。更优选地，所述聚氨基酸为L-Pro8(即聚合度为8的聚脯氨酸)。
根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数为2-6的多元醇，例如碳原子数为2-5的多元醇，优选碳原子数2-3的二元醇、和/或三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种；优选乙二醇。
根据本发明的冷冻保存液，所述糖类是多羟基醛、多羟基酮以及能水解而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物，可分为单糖、二糖和多糖等。按其水溶解特点不同,可分为非水溶性糖类或水溶性糖类，例如单糖、二糖或多糖。优选地，所述糖类为水溶性糖。更优选地，所述糖类为葡萄糖和蔗糖。
根据本发明，所述水溶性糖类可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、水溶性纤维素(例如羟丙基甲基纤维素等)、聚蔗糖；优选蔗糖、葡萄糖、羟丙基甲基纤维素。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
根据本发明的冷冻保存液，还可以含有缓冲液。
根据本发明，所述缓冲液可选自DPBS或hepes-buffered缓冲液、或其他细胞培养基缓冲液中的至少一种。
根据本发明的冷冻保存液，还可以含有血清。
根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其类似物，例如十二烷基磺酸钠(SDS)；针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1-50g所述多肽，0-9.0g的氨基酸或聚氨基酸，0-15mL的DMSO，5.0-45mL的多元醇，0.1-1.0mol L-1的水溶性糖，0-30mL的血清，余量为缓冲液。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1-20g所述多肽，优选0.2-10g所述多肽，更优选含有0.5-8g所述多肽，还更优选含有1-5g所述多肽。
根据本发明的冷冻保存液，含有氨基酸或聚氨基酸。优选地，以每100mL计，所述的氨基酸或聚氨基酸为0.1-8g；更优选地，为0.5-6g；或为0.8-5g，还更优选1-4g，或者2-3g。
根据本发明的冷冻保存液，优选不含有DMSO，但可以含有DMSO。以每100mL计，所述DMSO为不高于15mL，优选不高于10mL；更优选不高于7.5mL，还可以不高于5mL，或者不高于2.5mL。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有5.0-45mL的多元醇。或者为6-40mL的多元醇，还可以为8-30mL的多元醇；例如为10-25mL的多元醇，或10-15mL的多元醇，或15-20mL的多元醇。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，0.1-1.0mol L-1的水溶性糖。例如可以为0.2-0.8mol L-1的水溶性糖；0.3-0.7mol L-1的水溶性糖或0.5-0.6mol L-1的水溶性糖。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，0-30mL的血清。优选的方案可以不使用血清。但也可以使用血清。血清的用量可以为2-25mL，或者5-20mL，或10-15mL。
作为本发明的具体实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有1.0g的所述多肽，10-15mL的乙二醇，0.5mol L-1蔗糖，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.5g所述多肽，0.8-1.0g的L-Pro，10mL的乙二醇，0.5mol L-1的蔗糖，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.5g所述多肽，0.8-1.0g的L-Pro8，10mL的乙二醇，0.5mol L-1的蔗糖，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.5g所述多肽，1.0g的葡萄糖，10mL的乙二醇，0.5mol L-1的蔗糖，余量为缓冲液。
本发明还提供了上述冷冻保存液的制备方法，包括将所述多肽溶解于缓冲液中，冷却到室温后调节pH，将其他组分溶解于另外的缓冲液中，冷却后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，任选地在使用时加入血清。
根据本发明的制备方法，包括如下步骤：
(1)将多肽溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
(2)将水溶性糖溶解于一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液2；
(3)任选地，将氨基酸/或糖类溶解于另一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，制得溶液3；
(4)待溶液1、溶液2、和任选地溶液3冷却至室温后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。
本发明还提供一种冻存方法，所述冻存方法使用上述冷冻保存液对不同类型的细胞进行冻存。
优选地，所述冻存方法包括以下步骤：将待冻存的细胞置于上述冷冻保存液中平衡一段时间而后置于液氮环境中冷冻保存。
更优选地，所述冷冻保存可采用慢速降温和快速降温两种方法。所述慢速降温包括将细胞(组织)冻存液混合物置于室温环境中平衡10-30min，放入程序降温盒或程序降温仪中，以1℃/min的程序进行缓慢降温，待温度降至-80℃时转入液氮中长期保存。所述快速降温包括将细胞(组织)置于冻存液中5-15min，迅速置于液氮中，使细胞在短时间内降温至-196℃。
优选地，所述冻存方法还包括解冻：将已冻存的细胞、组织从液氮环境中取出，快速放入37℃水浴中解冻。将已解冻的细胞、组织使用培养基或PBS洗涤，尽快转移至合适的培养环境中。
本发明还提供上述冷冻保存液用于各类细胞、组织和器官的冷冻保存的应用。
根据本发明的应用和冷冻保存，所述细胞、组织和器官为任何适于冷冻保存的细胞、组织和器官。其中，所述细胞包括人或动物的如下细胞：干细胞、工程细胞、细胞系、体细胞、生殖细胞、血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等；包括人或动物的如下组织：皮肤组织、结缔组织、脂肪组织、神经组织、心脏组织、胰岛组织、卵巢组织、睾丸组织、胎盘组织、脐带组织。
根据本发明，所述工程细胞是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。
根据本发明，所述细胞系是指初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。包括细胞系的生存期有限的有限细胞系和已获无限繁殖能力能持续生存的连续细胞系或无限细胞系。
根据本发明，优选地，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。包括但不限于胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞。
根据本发明，优选地，所述干细胞为人骨髓间充质干细胞来源于人骨髓，可依据已知的临床应用方法，从人类骨髓中分离得到。
根据本发明，优选地，所述工程细胞可选为中国仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary)。
根据本发明，优选地，所述细胞系为牛肾细胞(MDBK)。
根据本发明，优选地，所述细胞系为人急性T淋巴细胞白血病细胞(E6-1细胞)。
根据本发明，优选地，所述冷冻保存液用于干细胞冷冻保存，示例性用于人骨髓间充质干细胞的冷冻保存。
示例性的，例如用于工程细胞、细胞系的冷冻保存。
有益效果
本发明的发明人发现LEA蛋白的功能区，并进一步的实验明确了其有对各类细胞、组织或器官有冷冻保护的作用，基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液干细胞、工程细胞、细胞系等多种细胞的有效性，与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异)，甚至超过商品化冻存试剂的存活率。LEA蛋白具有优秀的生物相容性，对人类、动物细胞无毒性，能保护细胞免遭逆境造成的细胞损伤，并起到稳定细胞膜的作用。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 LEA蛋白功能区多肽
表2 LEA蛋白功能区
标号 氨基酸序列 名称 分子量(D)
LS 1-1 RAEQLGHEGYQEMGQKGGQ LEA1-F 2103.27
LS 2-1 EKKGIMDKIKEKLPG LEA2-K 1714.11
LS 2-2 SSSSSEDD LEA2-S 812.7
LS 2-3 RTDEYGNPVH LEA2-γ 1187.24
本发明通过固相合成，以表2中的LEA蛋白功能区为例，进行进一步研究。
实施例2 LEA蛋白功能区多肽冷冻间充质干细胞
1.材料：
间充质干细胞：购自北京博泰斯生物技术有限公司；
商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液：购自北京百草泰克生物科技有限公司。
2.方法
(1)冷冻保存液和对比例的制备
冷冻保存液1(1ea1-F)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
Figure BDA0003471729220000081
Figure BDA0003471729220000091
冻保存液2(lea2-K)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
Lea2-K(g) 1.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液3(lea2-S)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
Lea2-S(g) 1.0
乙二醇(mL) 10
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液4(lea2-Y)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
Figure BDA0003471729220000092
Figure BDA0003471729220000101
冷冻保存液的制备：将1.0g的功能区多肽，磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，待全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于40mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
对比例：冷冻保存液1#：商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液。
(2)用上述冷冻保存液和对比例配方保存间充质干细胞
细胞冻存：
将10cm培养皿中的干细胞用0.25％胰酶37℃消化1min，当细胞分散成单细胞、部分脱离培养皿后，加入4倍体积完全培养基(a-MEM+10％FBS)中和，吹打至细胞完全脱离培养皿后，将其转移到15mL的离心管中，并于1200rpm下离心5min。弃上清，使用1mL DPBS将MSC细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测。每个离心管中冻存细胞数量为5*105个。按细胞数量将细胞悬液转移至冻存管中(约200μL)，分别加入待测冷冻保护液至总体积为400μL。吹打混匀，将冻存管放入程序降温盒内，并于-80℃的冰箱内冷冻过夜。次日取出冻存管，转入液氮罐中。
解冻干细胞：
将上述冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞(MSC)从液氮罐中取出，立刻投入37℃水浴中，并在水浴中摇动，使细胞在1min内快速解冻。然后将解冻后的细胞悬液加入4倍体积完全培养基(a-MEM+10％FBS)中，随后转移到15mL离心管中，并于1200rpm下离心5min。弃上清，使用500μL的PBS将细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测(存活率＝活细胞数/总细胞数*100)。之后将细胞接种至96孔板中，每个孔接种10000个细胞(每种浓度的冷冻保护剂冷冻保存的人骨髓来源的间充质干细胞样品平行接种6组)；并做一个正常传代、没有经历冻存复苏的新鲜细胞组。
3.结果和结论
表3冷冻保存间充质干细胞存活率
编号 冷冻保存液 存活率％
Lea1-F 冷冻保存液1 85.6
Lea2-K 冷冻保存液2 81.8
Lea2-S 冷冻保存液3 82.1
Lea2-Y 冷冻保存液4 80.1
对比实例 冷冻保存液1# 85.4
根据表3的结果可以看出，本发明的冷冻保存液进行人脐带间充质干细胞冷冻保存时，即使不使用DMSO干细胞存活率也可达80％以上，甚至在完全不添加DMSO和血清时，存活率也可达到85.6％，达到现有冷冻试剂的存活率水平，表明基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异)。
实施例3 LEA蛋白功能区多肽与控冰材料复配使用
1.材料：
间充质干细胞；购自北京博泰斯生物技术有限公司；
商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液：购自购自北京百草泰克生物科技有限公司。
2.方法
(1)冷冻保存液和对比例的制备
冷冻保存液5(lea1-F)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
lea1F(g) 0.5
乙二醇(mL) 10
L-Pro(g) 1.0
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
制备方法：将0.5g的功能区多肽全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；1.0g的L-Pro和17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于50mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
冻保存液6(lea2-K)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
LEA2K(g) 0.5
乙二醇(mL) 10
L-Pro 8 0.8
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
制备方法：将0.5g的功能区多肽全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；0.8g的聚脯氨酸8(L-Pro8)和17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5molL-1)超声溶解于50mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
冷冻保存液7(lea2-S)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
lea2S(g) 0.5
乙二醇(mL) 10
葡萄糖(g) 1.0
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
将0.5g的功能区多肽全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；1.0g的葡萄糖和17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于50mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
冷冻保存液8(lea2-Y)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
Figure BDA0003471729220000131
Figure BDA0003471729220000141
将0.5g的功能区多肽全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；1.0g的葡萄糖和17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于50mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
对比例：冷冻保存液1#：商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液。
(2)用上述冷冻保存液和对比例配方保存间充质干细胞
详细的细胞冻存和解冻干细胞详见实施例2的方法。
3.结果和结论
表4冷冻保存间充质干细胞存活率
Figure BDA0003471729220000142
Figure BDA0003471729220000151
根据表4的结果可以看出，本发明以LEA功能区多肽为主要成分制备的冷冻保存液用于冷冻保存干细胞具有较高的存活率，表明基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异),LEA功能区多肽与L-Pro复配甚至超过商品化冻存试剂的存活率(P<0.05)。
由此可见，本发明以LEA功能区多肽为主要成分制备的冷冻保存液用于干细胞的冷冻保存，可达到良好的细胞存活率和生物活性，并且LEA功能区多肽与其他控冰材料可以复配使用，其中LEA功能区多肽与L-Pro复配使用冷冻保存的干细胞存活率最高。
实施例4 LEA蛋白功能区多肽在工程细胞冻存中的应用
1.材料
中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)：购自北纳创联生物科技有限公司；
商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液：购自北京百草泰克生物科技有限公司。
2.方法
(1)冷冻保存液和对比例的制备
冷冻保存液9(lea1-F)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
Figure BDA0003471729220000152
Figure BDA0003471729220000161
冻保存液10(lea2-K)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
Lea2-K(g) 1.0
乙二醇(mL) 15
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液11(lea2-S)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
物质 含量
Lea2-S(g) 1.0
乙二醇(mL) 15
蔗糖(mol L<sup>-1</sup>) 0.5
DPBS(mL) 余量
冷冻保存液12(lea2-Y)：
按以下配方配制冷冻保存液，每100mL中含有如下组分：
Figure BDA0003471729220000162
Figure BDA0003471729220000171
冷冻保存液的制备：将1.0g的功能区多肽磁力搅拌溶于30mL的DPBS中，待全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于40mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入15mL的乙二醇为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH值并定容补齐余量至总体积。
对比例：冷冻保存液1#：商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液。
(2)用上述冷冻保存液和对比例配方保存中国仓鼠卵巢细胞
细胞冻存：
用移液管轻轻吹打T75培养瓶中中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，使其分离成单个细胞，并将其转移到15mL的离心管中，于离心机1400rpm下离心5min。弃上清，使用3mL DPBS将CHO细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测。每支冻存管中加入250μL待测冷冻保存液，一定量的DPBS(250μL－细胞悬液量)和细胞数量为5×105个的细胞悬液量(约140μL)，总体积为500μL，吹打混匀，将冻存管放入程序降温盒内，并于-80℃的冰箱内冷冻7小时后取出冻存管，转入液氮罐中。
细胞复苏：
将上述冷冻保存的CHO细胞从液氮罐中取出，立刻投入37℃水浴中，并在水浴中摇动，使细胞在3min内快速解冻。然后取出解冻后的细胞悬液使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测(存活率＝活细胞数/总细胞数*100)。
3.结果和结论
表5中国仓鼠卵巢细胞冷冻保存存活率
编号 冷冻保存液 存活率％
冷冻保存液9 77.1
冷冻保存液10 78.2
冷冻保存液11 76.8
冷冻保存液12 82.2
对比实例 冷冻保存液1# 78.7
根据表5的结果可以看出，本发明以LEA功能区多肽为主要成分制备的冷冻保存液用于冷冻保存工程细胞具有较高的存活率，表明基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻工程细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异)，甚至超过商品化冻存试剂的存活率。
实施例5 LEA蛋白功能区多肽对于牛肾细胞的冻存
1.材料
牛肾细胞(MDBK)细胞：购自上海信裕生物科技有限公司。
商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液：购自北京百草泰克生物科技有限公司。
2.方法
(1)冷冻保存液和对比例的制备
冷冻保存液1-4的组成配比和制备方法，详细同实施例2中的记载。
(2)用上述冷冻保存液和对比例配方保存MDBK细胞
具体操作方法为：将T75培养瓶中的MDBK细胞用0.25％胰酶37℃消化3min，当细胞分散成单细胞、部分脱离培养皿后，加入2倍体积完全培养基(DMEM+10％FBS)中和，吹打至细胞完全脱离培养皿后，将其转移到15mL的离心管中，并于1400rpm下离心5min。弃上清，使用5mL DPBS将MDBK细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测。每个离心管中冻存细胞数量为5*105个。按细胞数量将细胞悬液转移至冻存管中(约200μL)，分别加入待测冷冻保护液至总体积为400μL。吹打混匀，将冻存管放入程序降温盒内，并于-80℃的冰箱内冷冻7h后取出冻存管，转入液氮罐中。
解冻细胞：
将上述冷冻保存的MDBK从液氮罐中取出，立刻投入37℃水浴中，并在水浴中摇动，使细胞在3min内快速解冻。然后将解冻后的细胞悬液取出100μL进行细胞计数和细胞存活率检测。剩下400μL加入2.5倍体积完全培养基(DMEM+10％FBS)中，随后转移到1.5mL离心管中，并于1400rpm下离心5min。弃上清，使用400μL的PBS将细胞重悬。使用细胞计数仪进行细胞计数和细胞存活率检测(存活率＝活细胞数/细胞总数)。
3.结果和结论
表6冷冻保存牛肾细胞存活率
Figure BDA0003471729220000191
Figure BDA0003471729220000201
根据表6的结果可以看出，本发明以LEA功能区多肽为主要成分制备的冷冻保存液用于冷冻保存细胞系牛肾细胞具有较高的存活率，表明基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻细胞系牛肾细胞的有效性，且冷冻保存液3与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异)。
实施例6 LEA蛋白功能区多肽对于人急性T淋巴细胞白血病细胞的冻存
1.材料
人急性T淋巴细胞白血病细胞(E6-1细胞)：购自武汉普诺赛生物科技有限公司；
商品化含有10％DMSO的玻璃化冻存液：购自北京百草泰克生物科技有限公司。
2.方法
(1)冷冻保存液的制备：
冷冻保存液1-4组成配比和制备方法，详细同实施例2中的记载。
(2)用上述冷冻保存液和对比例配方保存人急性T淋巴细胞
本发明所用人急性T淋巴细胞冷冻保存方法具体为与CHO冷冻方法一样，参见实施例4的方法。
3.结果和结论
表7冷冻保存人急性T淋巴细胞白血病细胞存活率
Figure BDA0003471729220000202
Figure BDA0003471729220000211
根据表7的结果可以看出，本发明以LEA功能区多肽为主要成分制备的冷冻保存液用于冷冻保存人急性T淋巴细胞具有较高的存活率，表明基于LEA的蛋白功能区的冷冻保存试剂不仅能达到常规冷冻液人急性T淋巴细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当(无统计学差异)，甚至超过商品化冻存试剂的存活率。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液含有多肽。其中，所述多肽是包含LEA蛋白功能区的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。优选地，所述多肽是LEA蛋白功能区。
2.如权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液含有的多肽选自下述a)至c)中的至少一组：
a)具有表1中所示的氨基酸序列；
b)由表1中所示的氨基酸序列的多肽两端缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的且具有a)所述多肽的功能的衍生多肽；或
c)与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性高于90％。
优选地，所述c)中，所述与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性在90-99％之间，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
优选地，所述多肽的氨基酸序列如表1中所示的多肽。
更优选地，所述多肽的氨基酸序列如表2中所示的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，以每100mL冷冻保存液体积计，含有0.1-50g所述多肽。
优选地，所述冷冻保存液含有0.1-20g所述多肽。还优选，所述冷冻保存液含有0.2-10g所述多肽。更优选，所述冷冻保存液含有0.5-8g所述多肽。还更优选，所述冷冻保存液含有1-5g所述多肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液还含有仿生控冰材料0-50g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0mol L-1，血清0-30mL，余量为缓冲液。
5.根据权利要求4所述的冷冻保存液在工程细胞和/或细胞系冷冻保存中的应用，其特征在于，所述多元醇为碳原子数为2-5的多元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种；
优选，所述水溶性糖为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、水溶性纤维素、聚蔗糖；优选地，蔗糖、葡萄糖、羟丙基甲基纤维素。
优选，所述缓冲液选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液或其他细胞培养基缓冲液中的至少一种；
优选，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物，例如十二烷基磺酸钠SDS；针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料为氨基酸单体、聚氨基酸或糖类的一种或两种以上，所述控冰材料的含量为0.01-50g；
优选地，所述氨基酸单体选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸中的一种或两种以上；优选地，所述氨基酸单体为脯氨酸，更优选地，所述氨基酸单体为L-Pro。
优选地，所述聚氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种的均聚物或两种以上氨基酸的共聚物；优选地，所述聚氨基酸为聚脯氨酸8。更优选地，所述聚氨基酸为L-Pro8(即聚合度为8的聚脯氨酸)。
优选地，所述糖类为葡萄糖。
7.根据权利要求4-6任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述多元醇含量为6.0-28mL；
优选，所述血清含量为0；
优选，所述水溶性糖含量为0.2-0.5mol L-1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.5g所述多肽，1.0g的葡萄糖，10mL的乙二醇，0.5mol L-1的蔗糖，余量为缓冲液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，所述冷冻保存液由如下方法制备得到：包括将所述多肽溶解于缓冲液中，冷却到室温后调节pH，将其他组分溶解于另外的缓冲液中，冷却后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，任选地在使用时加入血清，
优选地，包括如下步骤：
(1)将多肽溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1；
(2)将水溶性糖溶解于一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液2；
(3)任选地，将氨基酸单体和/或糖类溶解于另一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，制得溶液3；
(4)待溶液1、溶液2、和任选地溶液3冷却至室温后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，所述干细胞包括全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，例如胚胎干细胞、各类间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞。
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