KR102391629B1

KR102391629B1 - 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법

Info

Publication number: KR102391629B1
Application number: KR1020210150574A
Authority: KR
Inventors: 심태진; 김지훈; 홍인기; 김종필; 이유진; 이경민; 정정일; 김문정
Original assignee: 주식회사 프롬바이오
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2022-04-28

Abstract

본 발명은, 해동 후 세포 생존율이 높고 세포 특성이 유지되는 효과를 가지고, 소 등의 동물 유래 또는 인간 유래의 혈청 또는 혈청 유래 성분을 사용하지 않고도 우수한 동결 보존 효과를 가지는, 동결 보존제로서 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물과 이 조성물을 이용한 세포 동결 보존 방법을 개시한다.

Description

펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법{Composition for cryopreservation of cells using pectin and alanine and the cryopreservation using the same}

본 발명은 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법에 관한 것이다.

자가, 동종, 이종 유래의 살아있는 세포를 세포치료제 등으로 이용하기 위해서는 지방, 골수, 제대혈, 말초혈 등 조직으로부터 세포를 분리하여 체외에서 배양, 증식하고 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하게 되는데, 이러한 세포치료제는 생존기간이 짧은 살아있는 세포를 원료로 한다. 이러한 세포를 보존하기 위해 장기간에 걸쳐 계대배양할 수 있는데, 이럴 경우 유전적인 변이에 의해 세포 특성이 변화할 수 있고, 오염으로 인한 세포 손실의 위험성이 있다. 따라서 이러한 유전적 변이와 오염에 따른 세포 손실을 최소화하고 세포 특성을 안정적으로 유지하기 위한 보존 방법이 필요하다.

특히 줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로서, 미분화 상태를 유지하며 무한 증식할 수 있는 자가 재생능(self-renewal)과, 일정 조건이 주어질 경우 신체 내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 다분화 능(differentiation to specific tissue)을 가지기 때문에 세포치료제로 퇴행성 질환이나 외상에 의해 손상된 조직 등의 치료에 이용될 수 있어 의학적 활용도가 매우 높다고 알려져 있다. 이러한 줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위해서는 세포 생존율이나 미분화성을 보장하는 세포 동결 보존 방법의 확립이 필수적이다.

세포의 동결 보존 방법은 완만 동결법과 급속 동결법으로 구별되는데, 완만 동결법은 세포를 액체 질소와 함께 1분에 1~2℃ 정도로 온도를 완만하게 내려 -196℃ 정도의 극히 낮은 온도에서 보존하는 방법으로, 세포 동결이나 해동에 따른 세포막이나 세포질 단백질의 변성을 방지하기 위하여, 글리세롤, DMSO(dimethyl sulphoxide), 케라틴이나 젤라틴 가수분해물, 아세트아미드, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 동물이나 인간 유래 혈청이나 혈청 알부민 등의 동결 보존제(cryoprotectant)가 사용된다. 이러한 완만한 냉각과 동결 보존제 사용에 의해 세포 내부와 외부의 얼음 결정의 생성이 저해되어 세포 손상을 막을 수 있다.

급속 동결법(즉 유리화 동결법)은 급속 동결에 의해 세포 내부와 외부의 얼음 결정 생성을 억제하여 동결하는 방법으로, DMSO, 아세트아미드, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등의 동결 보존제가 사용된다. 급속 동결법에 의하여 마우스 초기 배아의 동결 보존이나, 완만 동결법으로는 동결 보존이 어려웠던 소 배아나 돼지 배아의 동결 보존이 가능해졌다.

그러나 동결 보존제로 사용되어 온 글리세롤은 동결과 해동 과정에서 완충 기능이 완전하지 않아 종종 세포 손상을 일으키는 문제점이 있고, DMSO는 고가이고 또 세포의 형질을 변화시킬 가능성을 가지고 있다. 또 우태아혈청(FBS: fetal bovine serum) 등의 동물 유래 혈청이나 인간 유래 혈청(human serum) 등은 바이러스, 프리온 등의 감염을 일으킬 수 있고 면역반응을 유발할 수 있는 위험성이 있으며, 이러한 이유로 인체 투여를 위한 세포치료제 등의 보존에는 적합하지 않은 문제가 있다.

따라서 세포의 보존 효과가 우수하면서도, 동결과 해동에 의한 세포 손상을 최소화할 수 있는 동결 보존제의 개발이 여전히 요구된다고 할 수 있다.

본 발명은 펙틴과 알라닌의 동결 보존제로서의 효과를 개시한다.

본 발명의 목적은 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 펙틴과 알라닌이 인간 지방 유래 줄기세포에 대해 세포독성이 없고, 동결 보존제로 펙틴과 알라닌을 함유한 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) 보존액을 이용하여 지방 유래 줄기세포를 동결시키고 3일간 동결보존 후 해동시켜 세포 생존율을 살펴봤을 때 기존 동결 보존제인 10 w/v% DMSO와 90 w/v% FBS를 사용한 대조군과 동등한 수준의 세포 생존율을 보였으며, 해동 후 배양한 후에도 기존 동결 보존제를 사용한 대조군과 같은 수준의 밀도로 부착, 배양되었을 뿐만 아니라, 줄기세포의 전분화능 표지 유전자로 알려진 Sox2, Oct4, c-myc, Klf4, Nanog의 발현량을 측정하였을 때와 지방 유래 줄기세포의 특이적 표지 유전자로 알려진 CD73. CD90, CD105의 발현량을 측정하였을 때에도, 동결 보존제를 사용하지 않은 대조군이나 기존 동결 보존제를 사용한 대조군과 같은 수준임을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물은 펙틴과 알라닌을 포함함을 특징으로 한다.

펙틴(pectin)은 쌍자엽 식물의 세포벽 구성성분으로 겔화제, 증점제, 안정제, 유화제 등으로서 식품 분야에 널리 이용되어 온 물질로서, 갈락투론산(galacturonic acid) 단위가 α-1, 4 결합으로 연결된 기본 구조가 주요 부분을 이루며 200,000~400,000의 분자량을 갖는다. 펙틴은 일반적으로 메틸화 정도(Degree of Methylation, DM)에 따라서 고메톡시 펙틴(DM>50)과 저메톡시 펙틴(DM<50)으로 분류되는데, 식물 재료로부터 고온 산성 조건하에서 추출되는 펙틴의 다수는 고메톡시 펙틴이고, 저메톡시 펙틴은 산, 알칼리, 효소, 암모니아 등을 더 사용하여 탈메틸화시켜 얻는다. 본 발명에서 펙틴은 그것이 얻어지는 식물 재료나, 분자량의 크기(바람직하게는 100 내지 300g/mol)나, 메틸화 정도에 상관없이 임의의 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)일 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 펙틴과 알라닌은 충분한 동결보존 효과(즉 해동 후의 세포 생존율 향상, 세포 특성 유지 효과)를 나타내기 위하여 펙틴 1 내지 30μM, 알라닌 3 내지 90μM , 특히 펙틴 5 내지 15μM, 알라닌 20 내지 40μM의 범위로 포함될 수 있다.

본 발명의 동결 보존용 조성물은 보존액을 포함할 수 있다.

보존액은 세포 배양 배지이거나, 완충액이거나 등장액일 수 있다.

세포 배양 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 미량원소를 포함한다.

탄소원은 바람직하게는 단당류, 이당류 등이 사용될 수 있다. 구체적으로 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 또는 이들의 1종 이상의 혼합물이 사용될 수 있다.

질소원은 질소원으로서는 통상적으로 무기 질소 화합물, 유기 질소 화합물 또는 이들 화합물들을 포함하는 복합 화합물일 수 있다. 예컨대 무기 질소 화합물로서는 암모니아, 암모늄염(예컨대, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트, 암모늄 니트레이트 등), 니트레이트 등을 들 수 있고, 유기 질소 화합물로서는 우레아, 아미노산 등을 들 수 있다.

미량원소로서는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철, 인, 황 등을 포함하며 이들 미량원소는 염 화합물 형태로 배지에 첨가될 수 있다.

세포 배양 배지는 또한 비타민, 생장인자 등을 추가 포함할 수 있으며, 특히 무혈청 배지의 사용을 위해서는 혈청 대체 물질 예컨대 인슐린, 트렌스페린(transferrin), 셀레늄(selenium)을 포함할 수도 있다.

이러한 세포배양용 배지는 직접 제조하여 사용하거나 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되는 배지는 예컨대, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지 등일 수 있다.

보존액은 완충액일 수도 있는데, 완충액은 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 히스티딘, 트리스 등을 완충제로 포함하는 생리 식염수(saline solution)일 수 있다. 특히 인산 완충 생리 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS), 트리스 완충 생리 식염수(Tris Buffered Saline, TBS), HEPES 완충 생리 식염수(HEPES Buffered Saline), DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) 등일 수 있다.

보존액은 또한 염화나트륨, 염화칼륨, 붕산, 붕산나트륨, 만니톨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌, 글리콜, 말토스, 자당, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 트리할로즈, 포도당 등을 등장화제로 포함하는 등장액일 수도 있다. 이러한 등장액은 링거액, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액, 5% 글루코스 수용액일 수 있으며, 직접 제조하여 사용하거나 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 동결 보존용 조성물은 기존 공지된 동결 보존제 예컨대 글리세롤, 케라틴이나 젤라틴 가수분해물, 아세트아미드, DMSO, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 세리신, 이소말토올리고당 등을 추가로 포함할 수도 있고, 또한 EDTA, EGTA, 구연산, 살리실레이트 등의 킬레이트제, 용해 보조제, 보존제, 산화 방지제, 프롤린, 글루타민 등의 아미노산을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물에서, 동결 보존제인 펙틴과 알라닌은 우태아혈청(FBS)을 사용한 경우에 비해 세포 생존율이나 줄기세포의 전분화능 등에 있어 동등한 수준의 효과를 가진다는 점에서, 소 등의 동물 유래 또는 인간 유래의 혈청 또는 혈청 유래 성분(예컨대 알부민)을 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 동결 보존용 조성물은 임의의 동물세포, 특히 포유동물세포의 동결 보존을 위하여 사용될 수 있다.

이러한 동물세포는 먼저 줄기세포일 수 있다. 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 말초혈액을 포함하는 혈액이나 조직의 기저에서 기원되는 줄기세포일 수 있다. 줄기세포는 특히 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)일 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 자가 재생능(self-renewal)을 가지고 피부,연골,뼈 등 다양한 계열의 세포로 분화가 가능할 뿐만 아니라 골수 유래 줄기세포나 제대혈 유래 줄기세포에 비해 채취하기가 쉽고 대량 배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 세포치료제서의 활용도가 높다.

줄기세포는 자가재생능과 분화능을 갖는 것이면, 그 종류 및 유래는 특별한 제한이 없다. 예컨대 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 줄기세포의 분리, 배양, 증식 방법이나 배아줄기세포이 제조 방법은 당업계에 다양한 방법이 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Curr Opin Chem Eng. 2013, 2(1): 3-7], 문헌[Stem Cell Research & Therapy, 2014, 5:51], 문헌[Stem Cell Research & Therapy, 2019, 10:68], WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 동결 보존용 조성물이 사용될 수 있는 동물세포는 줄기세포 이외에도 제I형 당뇨병 환자에게 정맥내 투여되는 췌도세포(islet cell), 암 치료용으로 투여되는 수지상 세포(dendritic cell), 자연살해세포(NK cell), T 세포(특히 세포독성 T 세포, cytotoxic T lymphocyte), CAR-T 세포, CAR-NK 세포 등일 수 있의며, 생물 의약품 생산에 이용되는 CHO 세포, HEK 세포, MCF-7 세포, MDCK 세포, Vero 세포 등일 수 있다.

또 동물세포는 생체로부터 분리된 것이거나 시험관내(In vitro)에서 계대배양된 것일 수 있다.

또 동물세포는 세포가 서로 응집하지 않은 상태의 단일 세포 상태인 것이 바람직할 수 있다. 단일 세포 상태의 포유동물 세포는 인비트로에서 배양한 포유동물 세포를 트립신/EDTA 등으로 효소처리한 후, 피펫팅, 탭핑 등의 당업계에서 주지된 방법에 의해 세포를 현탁함으로써 얻어질 수 있다. 단일 세포 상태의 세포 비율은 세포를 PBS에 분산하고, 이를 현미경으로 관찰하여, 무작위로 선택된 일정 수의 세포에 대해 응집 유무를 조사함으로써 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 세포 동결 보존 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 동결 보존 방법은 펙틴과 알라닌을 포함하는 보존액을 제조하는 단계, 상기 보존액에 세포를 현탁하는 단계, 세포가 현탁된 보존액을 동결하고 보존하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에서 펙틴은 전술한 바와 같이 고메톡시 펙틴이나 저메톡시 메틴일 수 있으며, 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)일 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 상기 보존액은 전술한 바와 같이 세포 배양용 배지, 완충액, 등장액일 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 상기 보존액에는 소 등의 동물 유래 또는 인간 유래의 혈청 또는 혈청 유래 성분(예컨대 알부민)이 포함되지 않을 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 상기 세포는 줄기세포, 췌도세포, 수지상세포, 자연살해세포, T 세포, CAR-T 세포, CAR-NK 세포, CHO 세포, HEK 세포, MCF-7 세포, MDCK 세포, Vero 세포 등일 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 세포 현탁은 보존액 1ml에 대하여 1 × 10³ 세포 내지 약 1 × 10⁹ 세포 범위 특히 1 × 10⁵ 내지 1 × 10⁸세포범위로 첨가되어 이루어질 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 동결은 당업계의 공지된 방법 예컨대 완만 동결법, 급속 동결법(유리화 동결법)을 통하여 수행될 수 있다. 완만 동결법은 일반적으로 세포가 현탁된 보존액을 저온 프리저나 초저온 프리저(통상적으로 -20℃ ~ -150℃ 범위)에서 12시간 내지 24시간 동안 온도를 일정하게 천천히 떨어뜨려 동결시키는 방법이다. 급속 동결법은 일반적으로 세포가 현탁된 보존액을 CRF(controlled rate freezing)와 같은 장비를 이용하여 통상적으로 -150℃ ~ -196℃ 온도 범위의 액체 질소를 이용하여 급속 동결하는 방법이다. 세포를 동결 보존하고, 그 후 융해했을 때의 세포 생존율은 세포의 종류에 따라 상이한 경우가 있다. 따라서 동결 보존 대상 세포에 따라 융해 후의 세포 생존율이 높아지도록 적절한 동결 보존 방법을 채택하는 것이 필요할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 보존은 액체 질소 탱크 또는 초저온 냉장고(deep freezer)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 보관 온도는 -100℃ 내지 약 -300℃, 특히 -150℃ 내지 약 -220℃, 특히 바람직하게는 -150℃ ~ -196℃ 온도 범위일 수 있다. 보존 기간은 상기 보존은 연구용, 의약품 개발용 등 세포의 사용 용도에 따라 1일 또는 3일 이상 특히 1개월, 특히 바람직하게는 3개월이나 6개월 또는 1년 이상 장기간일 수 있다.

본 발명에 따르면, 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물과 이를 이용한 세포 동결 보존 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 세포 동결 보존용 조성물과 이를 이용한 세포 동결 보존 방법은 기존 동결 보존제인 DMSO와 FBS를 사용한 경우와 유사하게 해동 후 세포 생존율이 높고 세포 특성이 유지되는 효과를 가지며 또한 소 등의 동물 유래 또는 인간 유래의 혈청 또는 혈청 유래 성분을 사용하지 않고도 우수한 동결 보존 효과를 가진다.

도 1은 본 발명의 동결 보존제의 펙틴(Pectin)과 알라닌 (L-alanine)에 의한 지방유래 줄기세포(ADSC; Adipose-derived stem cell)에서의 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 동결 보존제의 동결 보존 효과를 확인한 것으로, 상기 동결 보존제를 이용하여 3일간 지방유래 줄기세포를 동결보존한 뒤 해동하여 생존율을 측정하여 동결 보존 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 해동 후 세포를 배양접시에 배양하여 3일간 배양한 세포를 현미경으로 상, 하부 전체 4x의 배율로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 동결 보존제를 이용하여 동결 보존한 뒤 해동 한 줄기세포의 전분화능 표지 유전자의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 동결 보존제를 이용하여 동결 보존한 뒤 해동한 세포의 지방유래 줄기세포 특이적 표지 유전자의 발현 정도를 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 지방유래 줄기세포의 분리 및 배양

본 실시예에서 사용한 인간 지방조직은 고마바이오텍(주)(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 지방조직에서 줄기세포를 분리하는 방법은 Zuk 등의 방법(Mol Biol Cell. 2002 Dec; 13(12): 4279-4295)을 참고 및 변형하여 사용하였다. 지방조직에서 줄기세포를 분리한 후, 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 ug/ml) 및 10% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 95% 공기, 5% CO₂와 37℃ 조건으로 배양하였다. 배양 접시에 부착되어 세포가 자라면 0.25% 트립신/10mM EDTA를 이용하여 세포를 모으고, 1:3의 비율로 나눠 10% DMEM에서 유지하였다.

<실시예 2> 펙틴 및 알라닌의 지방유래 줄기세포에서의 독성

실험에서 사용된 펙틴(Pectin)(194.14g/mol) 및 알라닌 (L-alanine)은 시그마-알드리치(Sigma-aldrich) 사에서 구입하여 사용하였으며, 지방유래 줄기세포는 상기 실시예 1에서 분리한 세포를 이용하였다.

실험에서 사용된 시약인 CCK-8은 (주)동인바이오텍(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 지방유래 줄기세포를 96-well plates에 1 × 10⁴ cells/well의 농도로 100 ul씩 처리한 다음 24시간 배양하였다. 세포가 바닥에 부착되면 용매인 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)와 최대 100 μM까지 펙틴 및 알라닌을 최대 48시간동안 처리하였다. 이후 10 ul의 CCK-8 시약과 지방유래 줄기세포 배양 배지 100 ul의 조건으로 3시간동안 배양시킨 후 540 nm에서 스펙트로포토미터(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1의 A와 같이 펙틴 및 도 1의 B와 같이 알라닌은 최대 100 uM까지 독성을 보이지 않고 안전히 사용할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3> 펙틴 및 알라닌을 포함하는 동결 보존용 조성물의 제조

본 발명자들은 지방유래 줄기세포를 보존하는 새로운 조성물을 제조하기 위하여, 펙틴 및 알라닌을 유효성분으로 사용하였다.

먼저, 100 μM의 펙틴 용액을 제조하기 위하여, 먼저 펙틴 분말 1 g에 DPBS 51.5 mL을 혼합하고 80 ℃에서 1시간 가온하여 완전히 녹여 100 mM 펙틴 용액을 제조한 후 최종 농도가 100 μM에 이르도록 DPBS와 혼합하였다.

또, 300 μM의 펙틴 용액을 제조하기 위하여, 먼저 알라닌 분말 250 mg에 DPBS 28.06 mL을 혼합 및 Voltexing 하여 완전히 녹여 100 mM의 알라닌 용액을 제조한 후, 최종 농도가 300 μM에 이르도록 DPBS와 혼합하였다. 상기 제조 방법으로 제조한 발명 동결보존제의 조성은 하기 표 1과 같으며, 편의상 FNCP(Frombio New Cryoprotective)로 명명하여 표시하였다.

동결 보존용 조성물의 조성

	FNCP
	용액 농도	용량 (1mL)	최종 농도
Pectin	100 μM	100 μL	10 μM
L-alanine	300 μM	300 μL	30 μM
DPBS	-	700 μL	-

<실시예 4> 발명 동결 보존용 조성물의 동결보존 효과 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 제조된 동결 보존용 조성물의 지방유래 줄기세포에서의 동결보존 효과를 확인하였다.

75T Flask에 배양한 지방유래 줄기세포를 0.25% 트립신/10mM EDTA로 모은 다음, 1 × 10⁶ cells/mL의 세포를 상기 표 1의 조성대로 제조한 동결 보존용 조성물에 현탁하여 Freezing Container를 이용, 동결시켰다. 또, 10 w/v% DMSO 및 90 w/v% FBS를 사용한 군을 Control로 사용하였다. 그 다음, 3일간 LN2 탱크에 보관하고 해동한 다음, 트리판 블루 익스클루젼 어세이(Trypan blue exclusion assay)를 이용하여 생존 세포를 계수하였다.

그 결과, 도 2와 같이 발명 동결보존용 조성물(FNCP)을 사용할 경우 대조군과 유사하게 높은 세포 생존율을 확인하여, 본 발명 동결보존제의 동결 보존 효과를 확인하였다.

또한, 배양 접시에 접종하여 3일간 배양하였을 때, 도 3과 같이 우태아혈청 및 디메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide)를 포함하는 기존 동결보존제 대비 동결 보존 후에도 생존한 지방유래 줄기세포가 동등한 수준의 밀도로 부착, 배양되는 것을 확인하였다. 형태적으로도 대조군과 유사하여 해동 후에도 세포의 부착능력에 영향을 주지 않고 본 발명 동결보존용 조성물을 이용하여 무 이종성 (Xeno-free) 및 무 동물성 (Animal-free) 상태로 안정적인 보관이 가능함을 확인하였다.

<실시예 5> 해동 후 줄기세포 전분화능 표지 유전자 발현량 확인

상기 실시예 4에 따라 동결 보존하여 해동 후 3일간 배양한 다음 줄기세포 전분화능 표지 유전자의 발현량을 조사하였다. 동결 보존하지 않은 세포를 음성대조군 (Negative Control; NC)로, 10 w/v% DMSO 및 90 w/v% FBS로 동결 보존한 세포를 양성대조군 (Positive Control; PC)로 사용하였다.

동결 보존 후 해동한 세포를 100mm 세포 배양용 접시에 접종하여 3일간 배양 후 부착 된 세포를 Trizol Reagent(Invitrogen)를 이용하여 Total RNA를 분리하였다. 다음 SuperscriptII reverse transcriptase (Invitrogen)와 올리고 dT를 이용하여 1 ㎍ total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 및 아래 표 2의 줄기세포 전분화능 표지 유전자의 프라이머를 이용하여 SYBR green method 방법으로 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하였다. SYBR Green I는 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약 (interchelator)이다. 인터킬레이트(Interchelator)는 PCR 반응으로 합성된 이중 가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있었다.

줄기세포의 전분화능 표지 유전자로 알려진 Sox2, Oct4, c-myc, Klf4, Nanog의 발현량을 실시간 PCR을 이용하여 확인하였다. 이때, 데이터는 각 조건당 세 번의 독립적인 실험결과를 바탕으로 평균±표준 편차로 표기하였다. 각 인자의 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

줄기세포 전분화능 표지 유전자의 프라이머 서열

Sox2-Forward	GCTACAGCATGATGCAGGACCA
Sox2-Reverse	TCTGCGAGCTGGTCATGGAGTT
Oct4-Forward	CCTGAAGCAGAAGAGGATCACC
Oct4-Reverse	AAAGCGGCAGATGGTCGTTTGG
c-myc-Forward	CCTGGTGCTCCATGAGGAGAC
c-myc-Reverse	CAGACTCTGACCTTTTGCCAGG
Klf4-Forward	CATCTCAAGGCACACCTGCGAA
Klf4-Reverse	TCGGTCGCATTTTTGGCACTGG
Nanog-Forward	CTCCAACATCCTGAACCTCAGC
Nanog-Reverse	CGTCACACCATTGCTATTCTTCG

그 결과, 도 4와 같이 본 발명 동결보존용 조성물을 사용하여 세포의 동결 보존한 경우에도 줄기세포 전분화능 표지 유전자의 발현량은 음성대조군 및 양성대조군과 상이하지 않았으며, 따라서 본 발명 동결보존용 조성물을 사용할 경우 지방유래 줄기세포의 전분화능 표지 유전자의 발현에 대한 영향 없이 보존 가능함을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 해동 후 줄기세포의 특이적 표지 유전자 발현 확인

상기 실시예 5에서 제조한 cDNA를 사용하여 동일한 방법으로 지방유래 줄기세포의 특이적 표지 유전자의 발현량을 조사하였다.

지방유래 줄기세포의 특이적 표지 유전자로 알려진 CD73. CD90, CD105의 발현량을 실시간 PCR을 이용하여 확인하였으며, 각 인자의 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.

지방유래 줄기세포의 특이적 표지 유전자의 프라이머 서열

CD73-Forward	AAGTGTCGAGTGCCCAGTTA
CD73-Reverse	TGATCCGACCTTCAACTGCT
CD90-Forward	AGTACGAGTTCAGCCTGACC
CD90-Reverse	TCTGAGCACTGTGACGTTCT
CD105-Forward	TCCATTGTGACCTTCAGCCT
CD105-Reverse	CTTGGATGCCTGGAGAGTCA

그 결과, 도 5와 같이 본 발명 동결보존용 조성물을 사용하여 세포를 동결 보존하여도 지방유래 줄기세포 특이적 표지 유전자의 발현량이 음성대조군 및 양성대조군과 상이하지 않았으며, 따라서 본 발명 동결보존용 조성물은 지방유래 줄기세포의 고유한 특성을 보존하면서 안정적으로 동결 보존이 가능함을 확인하였다.

통계학적 유의성을 검증하고자 각 실험별 음성대조군 결과와의 통계 분석을 Independent T-Test를 통해 분석하였으며, 이를 p-value로 환산하여 나타내었다. 이상의 모든 통계처리는 Excel 프로그램을 이용하여 분석하였다. p-value가 0.05보다 낮은 경우를 통계학적으로 유의하게 분리하고 결과에 별표(*)로 표시하였다.

Claims

동결보존제로서 펙틴과 알라닌을 포함하는 지방유래 줄기세포의 동결 보존용 조성물.
제1항에 있어서,
펙틴은 분자량이 100 내지 300 범위의 펙틴이고,
상기 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 펙틴은 5 내지 15μM의 범위의 농도로 상기 조성물에 포함되고,
상기 알라닌은 알라닌 20 내지 40μM의 범위의 농도로 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 보존액을 포함하고,
상기 보존액은 세포 배양 배지이거나, 완충액이거나 등장액인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
동물이나 인간 유래의 혈청이나 혈청 유래 성분을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 펙틴은 10μM의 농도로 상기 조성물에 포함되고,
상기 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)이고 그 엘-알라닌은 30μM의 농도로 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지방유래 줄기세포는 인간 지방유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
동결보존제로서 펙틴과 알라닌을 포함하는 보존액을 제조하는 단계, 상기 보존액에 지방유래 줄기세포를 현탁하는 단계, 지방유래 줄기세포가 현탁된 보존액을 동결하고 보존하는 단계를 포함하는 세포 동결 보존 방법.
제8항에 있어서,
상기 펙틴은 분자량이 100 내지 300 범위의 펙틴이고,
상기 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)이고,
상기 펙틴은 5 내지 15μM의 범위의 농도로 상기 보존액에 포함되고,
상기 알라닌은 알라닌 20 내지 40μM의 범위의 농도로 상기 보존액에 포함되며,
상기 보존액은 세포 배양 배지이거나, 완충액이거나 등장액인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 보존액은 동물이나 인간 유래의 혈청이나 혈청 유래 성분을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 펙틴은 10μM의 농도로 상기 조성물에 포함되고,
상기 알라닌은 엘-알라닌(L-alanine)이고 그 엘-알라닌은 30μM의 농도로 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 지방유래 줄기세포는 인간 지방유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.