CN110563826A - 重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液。本发明重组胚胎发育后期丰富蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。本发明将重组胚胎发育后期丰富蛋白添加入传统的细胞抗冻液中能显著提高冻存细胞的复苏成活率，能显著提高冻存细胞的存活率；重组胚胎发育后期丰富蛋白对于细胞无毒害，体内可降解，降低低温损伤同时简化细胞低温保存过程。

Description

重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液

技术领域

本发明涉及重组蛋白及抗冻技术领域，涉及一种重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液。

背景技术

重组胚胎发育后期丰富蛋白在冷冻过程中，细胞外的溶液由于结冰而导致渗透压升高，此时细胞内的水将会透过细胞膜流出细胞，细胞内溶液的渗透压随之升高，细胞将由于脱水而导致细胞膜皱缩或者细胞内结构损伤。如胞内的水不能及时渗出，在细胞内会形成大量冰晶，对细胞产生的胞内冰损伤，同时在复温过程中经过危险温区，胞内冰晶将继续长大而造成损伤。由冷冻的过程可知，细胞在冷冻中自由水逐渐减少，细胞处于低温缺水的环境，细胞膜和蛋白质由于缺水受到渗透性低温损伤。为了避免上述问题，人们研制了在抗冻液，即低温保护剂，蛋白在低温保存的过程中添加低温保护剂(CPA)可以降低冷冻损伤，常见的低温保护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PrOH)、乙酰胺等，它们能够透过细胞膜进入细胞内降低胞内冰和溶液渗透造成的低温损伤。目前常用的低温保护剂具有一定毒性，细胞复温后需要去除低温保护剂。目前常用的去除低温保护剂方法是逐步稀释，然而这种方法存在着诸如渗透压损伤大、费时费力、容易被细菌污染等缺点。低温保护剂洗涤添加/去除的操作，不仅会造成细胞丢失，而且细胞活力会严重降低。探索无毒的绿色低温保护剂，可以降低低温损伤同时简化细胞低温保存过程，具有非常重要的理论和临床意义。

另外，最新的研究发现胚胎发育后期丰富蛋白(Late embryogenesis abundantproteins,LEA)可以在干旱、高盐等逆境条件下诱导产生的高亲水性蛋白保护细胞，常存在于植物组织细胞、种子细胞和低等动物细胞中。LEA基因最初被人们认为在种子成熟及干化过程中诱导表达的基因，随后在某些线虫中发现LEA基因产物。LEA蛋白的共同特征在于其是由极性氨基酸组成的高度亲水性的多肽,具有稳定膜结构、保护生物酶活性等多种生物学功能，含有这类蛋白的生物能够迅速适应低温导致的极度缺水环境。

研究发现在缺水情况下，LEA蛋白起到保护蛋白质和细胞膜的作用。可能的原因是LEA蛋白结构中未卷曲的部分可形成能够适应其它分子结构的形状，形成稳定性更强的结合力，保护蛋白质和细胞膜结构，因此从而可以减轻由于失水对细胞造成的伤害。研究发现在生理条件下LEA蛋白中的氨基酸残基以无规则的卷曲形式存在，而无规则卷曲的结构有利于LEA蛋白和周围的水分子相结合，而低温干旱的条件下，LEA蛋白的无规则卷曲结构转变以α-螺旋和β-转角为主二级结构。这种结构的转变为生物维持细胞生命所需的最低限量的水提供了条件，转变后的结构可以稳定其他蛋白质结构，同时释放结合在无规则结构上的水调节渗透压平衡，从而避免当细胞遭受胁迫发生脱水时出现较大程度的破坏，这种作用机制类似于HSP等热激蛋白和脯氨酸。

研究发现LEA蛋白能提高植物的耐脱水胁迫，其原因是LEA蛋白保护了细胞膜的完整性和稳定性。LEA基因转染到HepG2细胞中，LEA蛋白能显著提高哺乳动物细胞的抵抗冻干脱水的性能，在冷冻干燥中LEA蛋白通过保护细胞膜抵抗冷冻干燥引起的损伤。在细胞的低温保存中，LEA蛋白能否降低低温冷冻的损伤并且提高细胞存活率还需要验证。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种重组胚胎发育后期丰富蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。

优选的，所述重组胚胎发育后期丰富蛋白中含有亲水氨基酸，且亲水氨基酸占比大于50％，所述亲水氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述亲水氨基酸占比为56％。

优选的，用于编码所述重组胚胎发育后期丰富蛋白的核苷酸序列序列如SEQ IDNO.3所示。

一种抗冻液，包括如权利要求1，2，3任一所述的重组胚胎发育后期丰富蛋白。

优选的，所述抗冻液包括以下百分比的组分：0.1～2mg/ml的重组胚胎发育后期丰富蛋白、2～10％渗透性低温保护剂、10～25％胎牛血清，余量为培养基。

优选的，所述渗透性低温保护剂为二甲基亚砜或者乙二醇。

重组胚胎发育后期丰富蛋白和抗冻液在细胞冻存中的应用。

本发明提供一种重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液及应用，与现有技术相比优点在于：

本发明将重组胚胎发育后期丰富蛋白添加入传统的细胞抗冻液中能显著提高冻存细胞的复苏成活率，能显著提高冻存细胞的存活率；并且含有重组胚胎发育后期丰富蛋白的抗冻液能够避免细胞收到渗透性低温损伤，加入重组胚胎发育后期丰富蛋白的抗冻液，能够降低低温冷冻的损伤并且提高细胞存活率，含有重组胚胎发育后期丰富蛋白的抗冻液能够达到传统具有毒性渗透性的低温保护剂浓度能够达到保存效果；而且重组胚胎发育后期丰富蛋白对于细胞无毒害，体内可降解，降低低温损伤同时简化细胞低温保存过程。

本发明重组胚胎发育后期丰富蛋白中亲水性氨基酸较高，使得蛋白具有稳定膜结构、保护生物酶活性等多种生物学功能，从而使得含有这类蛋白的抗冻液有助于提高细胞对低温和极度缺水环境的耐受性；重组胚胎发育后期丰富蛋白的加入，使得渗透性低温保护剂的加入量降低，进而降低了原具有毒性的渗透性低温保护剂浓度，又能达到很好的保存效果，而且重组胚胎发育后期丰富蛋白对于细胞无毒性、可降解，降低低温损伤同时简化细胞低温保存过程。

附图说明

图1为本发明含有0.1mg/ml重组LEA蛋白与2％DMSO的抗冻液，冻存复温后MSC细胞流式细胞仪检测细胞存活和凋亡结果图；

图2为本发明含有0.2mg/ml重组LEA蛋白与2％DMSO的抗冻液，冻存复温后MSC细胞流式细胞仪检测细胞存活和凋亡结果图；

图3为本发明含有0.5mg/ml重组LEA蛋白与2％DMSO的抗冻液，冻存复温后MSC细胞流式细胞仪检测细胞存活和凋亡结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明书中重组胚胎发育后期丰富蛋白简称重组LEA蛋白。

实施例中：

DMSO为二甲基亚砜。

重组胚胎发育后期丰富蛋白的制备方法包括如下步骤：

首先，获得所述LEA蛋白的基因表达质粒。

通过软件设计LEA基因引物，引物两端引入NdeI/BamHI酶切位点，通过Invitrogen合成PCR扩增引物。

PCR扩增获得含有LEA基因的双链DNA片段，将PCR扩增片段回收后，通过NdeI/BamHI双酶切体系处理，大肠杆菌表达载体pET15b同样经NdeI/BamHI双酶切体系处理，处理完成后回收DNA片段。用T4连接酶将LEA基因片段连接到pET15b，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得的重组质粒。提取该重组质粒进行NdeI/BamHI双酶切和测序验证重组质粒。

将LEA-pET15b质粒转化Rosseta表达菌株，挑选单菌落于5ml液体培养基培养，以1％比例接种至500ml液体培养基扩大培养，37℃摇床培养至OD值为0.6，1mM IPTG于37℃诱导12小时，离心收集表达菌体备用。

表达菌体加入裂解液超速破碎，分离溶解的蛋白，将裂解后的细胞悬液进行硫酸铵沉淀和Ni柱亲和层析。获得重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。

然后将制备的重组胚胎发育后期丰富蛋白，与其他原料制备成含有重组胚胎发育后期丰富蛋白的抗冻液，然后检验其抗冻效果，具体为实施1、实施2、实施3。

实施例1：

配置抗冻液：

冷冻处理：

取对数期生长人间充质干细胞(MSC)细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.3ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1.5℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

复温后使用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测，检测结果如图1。其中，存活率＝冷冻后细胞存活数/冷冻后总细胞数*100％，凋亡率＝冷冻后细胞凋亡数/冷冻后总细胞数*100％。

实施例2：

配置抗冻液：

冷冻处理：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～

1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.3ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1.5℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

复温后使用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测，检测结果如图2。其中，存活率＝冷冻后细胞存活数/冷冻后总细胞数*100％，凋亡率＝冷冻后细胞凋亡数/冷冻后总细胞数*100％。

实施例3：

配置抗冻液：

冷冻：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.3ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1.5℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

复温后使用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测，检测结果如图3。其中，存活率＝冷冻后细胞存活数/冷冻后总细胞数*100％，凋亡率＝冷冻后细胞凋亡数/冷冻后总细胞数*100％。

对比例1：

配置抗冻液：

DMSO 2％(v/v)

胎牛血清 10％

培养液 余量

冷冻：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.3ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1.5℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

复温后使用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测。其中，存活率＝冷冻后细胞存活数/冷冻后总细胞数*100％，凋亡率＝冷冻后细胞凋亡数/冷冻后总细胞数*100％。

对比例2(实验室常用的抗冻液)：配方是DMEM/F12+10％DMSO+10％胎牛血清。

冷冻：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.3ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1.5℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

复温后使用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测。其中，存活率＝冷冻后细胞存活数/冷冻后总细胞数*100％，凋亡率＝冷冻后细胞凋亡数/冷冻后总细胞数*100％。

将实施例1-3提供的和对比例1-2提供的抗冻液冻存人间充质干细胞(MSC)、人卵巢颗粒细胞(KGN)同样以实施例1～3的方法复苏后，用流式细胞仪进行细胞存活率和凋亡率检测，检测结果如表1和结果如表2所示：

表1细胞存活率

细胞类型	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2
						MSC	47.1％±8.9％*	69.4±9.9％#	74.4％±8.4％#	32.9％±9.7％	80.2％±4.2％
KGN	51.2％±10.7％	70.1％±11.2％#	77.2％±10.2％#	41.5％±5.4％	84.5％±6.3％

表2细胞凋亡率

细胞类型	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2
						MSC	41.1％±6.8％*	20.9％±8.9％#	17.4％±6.4％#	60.8％±14.2％	12.8％±4.5％
KGN	38.2％±8.7％	18.3％±7.3％#	11.3％±7.3％#	58.3％±11.4％	9.5％±5.8％

注：*示与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。

根据上述试验结果，表1和表2数据显示，使用含有LEA蛋白的抗冻液进行冷冻试验后的存活率明显高于使用不含抗冻蛋白的抗冻液的存活率，并且含有重组胚胎发育后期丰富蛋白的抗冻液降低传统的毒性渗透性低温保护剂浓度达到保存效果。本发明的重组胚胎发育后期丰富蛋白在较低渗透性低温保护剂浓度下显著提高冻存细胞的复苏成活率的能力，重组胚胎发育后期丰富蛋白对于细胞无毒害，体内可降解，降低低温损伤同时简化细胞低温保存过程。

实施例4：

配置抗冻液：

冷冻处理：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

实施例5：

配置抗冻液：

冷冻处理：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1.5ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-2℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

实施例6：

配置抗冻液：

冷冻处理：

取对数期生长人间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，细胞的最终密度为2×10⁶/ml～1×10⁷/ml。将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5ml。按照慢速冻存程序冷冻，降温速率-1～-2℃/min降温至-70℃时，迅速浸入液氮中保存15天。

复温：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，复温5分钟，取出冻存管中细胞悬液，逐滴加培养液，混匀离心，弃去上清液。加入含PBS重悬细胞。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

<110>安徽医科大学第一附属医院

<120>重组胚胎发育后期丰富蛋白及包含其的抗冻液

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Thr Ala Glu Phe Arg Asp Ser Ala Gly Glu Thr Ile Arg Asp

1 5 10 15

Leu Thr Gly Gln Ala Gln Glu Lys Gly Gln Glu Phe Lys Gyl Arg

20 25 30

Ala Gly Glu Lys Ala Gly Glu Glu Thr Lys Arg Ala Gly Glu Lys

35 40 45

Met Asp Glu Thr Lys Glu Arg Ala Gly Glu

50 55

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 燕麦真滑刃线虫（Aphelenchus avenae）

<400> 2

Met Ser Ser Gln Gln Asn Gln Asn Arg Gln Gly Glu Gln Gln Glu

1 5 10 15

Gln Gly Tyr Met Glu Ala Ala Lys Glu Lys Val Val Asn Ala Trp

20 25 30

Glu Ser Thr Lys Glu Thr Leu Ser Ser Thr Ala Gln Ala Ala Ala

35 40 45

Gln Lys Thr Ala Glu Phe Arg Asp Ser Ala Gly Glu Thr Ile Arg

50 55 60

Asp Leu Thr Gly Gln Ala Gln Glu Lys Gly Gln Glu Phe Lys Gyl

65 70 75

Arg Ala Gly Glu Lys Ala Gly Glu Glu Thr Lys Arg Ala Gly Glu

80 85 90

Lys Met Asp Glu Thr Lys Glu Arg Ala Gly Glu Met Arg Glu Asn

95 100 105

Ala Gly Gln Lys Met Glu Glu Tyr Lys Gln Gln Gly Lys Gly Lys

110 115 120

Arg Glu Glu Leu Arg Asp Thr Ala Ala Glu Lys Leu His Gln Ala

125 130 135

Gly Glu Lys Val Lys Gly Arg Asp

140 143

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 燕麦真滑刃线虫（Aphelenchus avenae）

<400> 3

atgtcctctc agcagaacca gaaccgacag ggtgagcagc aggagcaggg ctacatggag 60

gcggccaagg agaaggtcgt caacgcatgg gagagcacga aggaaaccct ctcgagcacg 120

gctcaagcgg ccgccgagaa gacggctgag tttcgcgatt ccgccggtga gaccatccgt 180

gacctgaccg gacaggcgca ggagaagggt caggagttca aggagcgcgc tggcgagaag 240

gcagaggaga cgaagcagcg tgccggggag aagatggatg agaccaagca gcgggctggc 300

gaaatgcgcg agaacgcggg ccagaagatg gaggagtaca agcagcaggg caagggcaag 360

gccgaggagc ttcgcgacac tgccgccgag aagctccacc aggctggcga gaaggtcaag 420

ggccgcgact aa 432

Claims (8)

1.一种重组胚胎发育后期丰富蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。

2.根据权利要求1所述的重组胚胎发育后期丰富蛋白，其特征在于：所述重组胚胎发育后期丰富蛋白的氨基酸片段中含有亲水氨基酸，且亲水氨基酸占比大于50％，所述亲水氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的重组胚胎发育后期丰富蛋白，其特征在于：所述亲水氨基酸占比为56％。

4.根据权利要求2所述的重组胚胎发育后期丰富蛋白，其特征在于：用于编码所述重组胚胎发育后期丰富蛋白的核苷酸序列序列SEQ ID NO.3所示。

5.一种抗冻液，其特征在于：包括如权利要求1，2，3任一所述的重组胚胎发育后期丰富蛋白。

6.根据权利要求5所述的抗冻液，其特征在于，所述抗冻液包括以下百分比的组分：0.1～2mg/ml的重组胚胎发育后期丰富蛋白、2～10％渗透性低温保护剂、10～25％胎牛血清，余量为培养基。

7.根据权利要求6所述的抗冻液，其特征在于：所述渗透性低温保护剂为二甲基亚砜或者乙二醇。

8.权利要求1所述重组胚胎发育后期丰富蛋白和权利要求5所述的抗冻液在细胞冻存中的应用。