CN102492702A - 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法，该方法采用长距离逆转录酶和长距离高保真聚合酶，依据RT-PCR原理扩增一种β诺达病毒基因组两条RNA的全长cDNA，将扩增产物克隆到T载体进行测序比对分析，获得具有正确碱基序列的克隆。本发明有利于设计病毒检测方法，了解病毒的分类、致病性及分子流行病学等，也能通过人工改造将其作为基因转移载体使用。
Description
本专利申请由天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室完成，得到国家自然科学基金（30901094），天津市科技计划（09JCYBJC15000），天津市教委基金（20080618）以及国家科技支撑计划（2011BAD13B07,2011BAD13B04）的资助。
技术领域
本发明属于应用生物技术领域，涉及β诺达病毒检测方面的应用。更具体的说是一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法。
背景技术
病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis，VNN) 又称病毒性脑病和视网膜病(Viral encephalopathy and retinopathy)，流行于除美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加。病鱼表现厌食，上浮于水面，表现螺旋状或旋转游动，或腹部朝上漂浮于水面，难于下沉，病鱼腹部肿大，有的鳔肿大充血，外观无其它明显病变。组织学检查可见中枢神经组织脑细胞和视网膜细胞空泡化。该病的病原属诺达病毒科。
鱼类病毒性神经坏死病是近年来严重危害海水鱼类，引起暴发性流行的重大病害之一。目前，已知受神经坏死病毒感染的鱼类达40多种。该病毒包括4种血清型，即红鳍东方鲀神经坏死病毒、拟鲹神经坏死病毒、条斑星鲽神经坏死病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒。患病鱼常表现出游泳异常，身体失去平衡等典型神经性疾病症状，病理组织学观察可见中枢神经系统特别是脑和视网膜出现严重的坏死、空泡化。病毒可通过垂直和水平两种途径传播。
诺达病毒科只有一个属。本属内的诺达病毒首次分离于日本的Nodamura村，因而得名。过去也将其称为野田村病毒。病毒的基因组由两分子的ssRNA组成，分子量为1.1×106Da和0.48×106Da。两个分子在 5ˊ端都有一个帽，而3ˊ端无多聚(A)尾。病毒在细胞浆中复制，放线菌素D不影响病毒RNA的合成。感染细胞中有3种病毒RNA，即RNA1 (分子量1×106Da)、RNA2(分子量0.5×106Da)和一个亚基因RNA3(分子量0.15×106Da )。RNA1编码蛋白A(分子量112×103Da)，后者可能是病毒RNA聚合酶的成份；RNA2编码衣壳蛋白的前身即α蛋白；RNA3编码蛋白B(分子量10×103Da)，可能在合成正链RNA过程中起作用。用分离的RNA1感染细胞，能合成RNA1和RNA3，但不能合成RNA2。RNA1和RNA2均是形成病毒粒子所必须的。诺达病毒在细胞中的增殖力很低，但它能在34℃的低温条件下，通过病毒RNA对细胞的转染而传代培养。
此病毒于1989年发现，1990年首次报道。此后，在世界各地相继有3目8科15种海水养殖鱼类发生过此病。幼鱼期病鱼可出现螺旋式垂直游动，死亡率较仔鱼期低。组织学检查可见脑细胞和视网膜因细胞坏死和毁坏形成的空胞。电镜观察可见细胞质内球形病毒粒子，直径25～30 nm，病毒基因由两段单链RNA组成，RNA1编码非结构蛋白，RNA2编码一种主要的结构蛋白。
目前，对于诺达病毒基因复制和蛋白成熟过程，科学家们已经有了较多的了解，但快速诊断技术尚不完备，常用的诊断方法例如：行为体色观察、组织病理检查、RT-PCR法检测病毒衣壳蛋白基因、原位杂交法检测病毒核酸在组织中的分布、免疫学方法等。
发明内容
一种β诺达病毒全基因组序列，其特征在于：该病毒基因组由两条不等长RNA组成，RNA1节段全长3104个核苷酸， 5’UTR和3’UTR分别由78和77个核苷酸组成， ORF区含有2949个碱基，编码病毒自身的RNA依赖的RNA聚合酶，在其编码区内部嵌套有另一重叠阅读框（位置：2753-2980 nt），编码非结构蛋白B2，序列为SEQ ID No.1所示； RNA2节段长度为1433个核苷酸，5’UTR和3’UTR分别由26和390个核苷酸组成，ORF区含有1017个核苷酸，序列为SEQ ID No.2所示。
本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNA1节段编码长度为982个氨基酸，其序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒全基因组RNA1节段嵌套的B2蛋白长度为75个氨基酸，其序列如SEQ ID No.4所示。
本发明所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNA2节段编码长度为338个氨基酸，其序列如SEQ ID No.5所示。
本发明主要完成了如下的内容：
1. β诺达病毒基因组全序列的确认：
本发明的方法采用长距离逆转录酶和长距离高保真聚合酶，依据RT-PCR原理扩增出一种β诺达病毒基因组两条RNA的全长cDNA，将扩增产物克隆到T载体进行测序比对分析，获得具有正确碱基序列的克隆。
2.β诺达病毒基因组全序列的制备方法（具体见实施例1）：
包括：RNA抽提，cDNA合成，基因组扩增，扩增产物测序及比对分析
3.β诺达病毒基因组全序列的用途：
β诺达病毒基因组全序列确定后，可根据该基因组的序列进行β诺达病毒的分子检测（具体见实施例2）。
4.β诺达病毒基因组全序列编码氨基酸序列的用途：
β诺达病毒基因组全序列编码的氨基酸序列确定后，可根据该序列制备β诺达病毒相关蛋白的抗体（具体见实施例3）。
附图说明：
图1 扩增RNA1节段全序列的结果；M: DNA分子量标记DL2000；1：对照；2：RNA1 扩增产物；
图2 扩增RNA2节段全序列的结果；M: DNA分子量标记DL2000；1：对照；2：RNA2扩增产物。
具体实施方式：
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别加以说明的是，本发明使用的试剂材料均有市售；其中：大肠杆菌（DH5α）购于购自天根生化公司；牙鲆幼苗由天津海发珍品养殖中心提供。
实施例1
β诺达病毒基因组全序列的制备
1.RNA抽提
②取
上清到一支新的1.5mL离心管中，加入200 μL氯仿振荡15s，之后静置2min；
③将上述②中的液体于4℃下，12000rpm离心 15min后取无色上清；
④向上述③中上清加入500μL异丙醇将管中液体轻轻混匀，室温静置15min，沉淀RNA；
⑤将上述④溶液于4℃，12000rpm离心 10min，弃上清；
⑥向上述⑤中沉淀加入1mL 75%乙醇，轻轻洗涤。之后4℃，7500rpm离心 6min，弃上清；
将上述⑥中沉淀晾干，加入适量的H2O溶解（65℃促溶10-15min），然后置于-80℃保存。
2. cDNA合成
RNA变性：
| 试剂 | 体积（μL） |
| RNA | 2 |
| RNasin | 0.5 |
| R3 | 1 |
| DEPC-H2O | 6.5 |
总体系10μL，70℃变性10min；65℃，5min；60℃，5min；冰上2min。
反转录：
| 试剂 | 体积（μL） |
| 5×MLV buffer | 5 |
| RNasin | 0.75 |
| M-MLV Reverse Transcriptase | 1 |
| dNTP | 3 |
| DEPC-H2O | 5.25 |
与上述体系混匀，总体系25μL。42℃，2小时；95℃， 5min；4℃，10min。
3.基因组扩增
①特异性引物的设计
RNA1引物：
RNA2引物：
②PCR扩增反应，反应体系如下：
PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min一共30个循环，最后72℃总延伸10min，4℃保存。
③PCR产物克隆产物纯化回收
PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶（含EB）上进行电泳，凝胶成像系统（VDS）观察照相后切下特异目的条带，用PCR产物凝胶回收试剂盒（BBI）回收DNA，方法按试剂盒说明手册进行，最后DNA溶于超纯水中，-20℃保存备用。
4.扩增产物测序及分析
①扩增片段连接到测序载体
总体系10μL，16℃连接过夜。
②感受态制备
挑大肠杆菌（DH5α）单菌落，在装有5mL LB液体培养基的试管中培养过夜。倒入装有100mL LB液体培养基的1000mL三角瓶中，37℃培养1h；将培养好的细菌转至冰预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；弃上清，将管倒置1min，使培养基流尽；每个50mL离心管中加入20mL冰预冷的0.05MCaCl2重悬；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；每管用2mL冰预冷的0.05MCaCl2重悬；将上述液体以每管0.2mL分装，用于转化，置于-80℃保存。
③转化大肠杆菌（DH5α）
取200μL感受态细胞，加5μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰上放置2min；然后向其中加800μL LB培养基，37℃200rpm震荡培养1h；室温4000rpm离心5min，吸出部分上清，用剩余培养基悬浮细胞；将细菌涂布于预先用20μL，0.1M IPTG和100μL 20mg∕mL的X-gal涂布的氨苄青霉素平板；使平板在37℃下正置1h吸收多余的菌液，然后倒置过夜培养。
④测序及分析
挑取单一的单克隆菌落，进行PCR检测分析，将阳性克隆送北京华大基因公司测序并分析。
结果显示RNA1序列长度为3104bp，碱基序列如序列①：TAACATCACCTTCTTGCTCTGTTGAGTAATCACTTACGCAAGGTTACCGTTCAGCTTAGACAACGACAAGTCTACGCCATGCGTCGCTTTGAGTTCGCACTCGCACGCATGTCTGGAGCAGCATTTTGTGTGTACACAGGCTACCGCCTGTTGACCTCAAAATGGCTCGCGGACCGTGTTGAGGATTATCGCCAACGCGTCATCGCTGAGAAGAAACAAATTCTCCGTGACGCGGCCATGATCCGGACTCAGATCCAGCGGGAAATGGAGCTAGTGCGCATTTCGGTGCGCAAAGGCCATTCCCATCAGGAAGCCGCTACTGAGCGTAACAGCGCTACTGAGACCATGCTCGGTGTGGTGGAGAAATGTGGCTACGAGCCATATGTCATTTCACCATCACCCCGTGAGGTTGGATACCACGGGTCACGTCAGTTCTATAGTCTGGCAGACTTTCGCCAAGACTACCGTCGTGATGACATCACCGACCGTCACATCATTGTGATGACTGATGTTGACTACTACGTGGACATGCATGAGTTGATTGGTTTGGGTGTTCCGATACTGCTATACACCTTCCAGCCAAGTACTGTGTCCGGAGAGGTTAAGGATGGTTACTTTACCATCACTGACGACTCCGTTCACTACCGTGTTGCTGGCGGGAAGGATGTGCGCCATCGCATCTGGAACTACAACCAGGATACCATGTATGTGTGCTCCCGACCTCGTGGTTTCTGGGCGAATCTGATGCAGATCTTGCGTGACATCACTGGTGTCACCGCGATCTGTAGCTTTCTTTACGCCAAGCTCGGTATTGCGCCCTTCGGCGACCCTGTTACCATGTTCACCGTTGATCAATTCAAGATGGGTGAGCATCGTAACATCGTCTCGATTGTGCCCTTTGCAACTTGCCGTTCAAACCTGCTCAAGATCAGTGAGTACGGTGCTGAGTTGGAGTATATGCGCTACCAACAGCGCAACAACATTGCCAACTTCAACGCAGTCACTTATATCTCTGAGAATGGGCCCCTCATCAGCTTGGGTTTGGAAGGCAACTTTGCAAGCGTCCAGCTTCCCCTGCAGGATTTTGAGAACATCCGCACTGCATACGAACTGTCCAAAACTAACAACTTGTCAGATACTGTTCGCCGGTCAGGGCGCCCGTGCAAGGAGGCAGCTATCATCCATAAATGTCTCCAAGCCGAGTGTGCCGTCGTCAGCGAGGTCGTGCATAAACCTGGCGATCTTGCTCGTCATTACCAAGCAGTTGGTAGTGCCTACGACACTGATCCAGCTGAGCAGGGCAAGTGTTACGCTCGTGAGTACGCTCCTGGACCGTTGACTCAAACTGCTGTATTTCCAAGTGAGTCACGTTCCAACGAGCTTGCCACAATCGACGGTCGTATTGCTGGTCCGCAAGCCAAGGCAAAGAGCCGCGAGCACATAACACCTAAGATGCGCAAAGTGGCTAGGGACTTCGTGCACCATCTGGTGCCGATTGCCGGTACGGGCCGTCCCTACCCCCTCACGTATGTCGAGGAGCAGCAGACCAAGCCGTTACAGCGGGCTCGGAATGATGCTAACCGATATCACGATGAGTTCACTATGATGGTCAAAGCGTTCCAAAAGAAAGAAGCATACAACGCCCCAAATTACCCCAGGAACATTTCAACCGTTCCGCATACCCAAAACGTCAAGTTGTCCAGCTACACCTACGCTTTCAAAGCCAGTGTTCTCCAGCATGTTCCGTGGTACATGCCAACGCACACACCAGCTGAAATTGCTGACGCAGTGCAAAACTTGGCCGCAAGTTCCACTGAGCTGGTTGAAACTGACTACAGCAAGTTCGATGGCACATTCTTGCGCTTTATGCGTGAGTGCGTCGAATTTGCTATCTATAAGCGCTGGGTTCACCTGGACCACTTGCCAGAGTTAACAACTTTATTGGCTAATGAGATCCAAGCACCTGCTGTTACACGATTGGGCATCAAGTATGACCCTGATTGCAGTCGCCTCAGTGGCTCTGCTCTCACAACAGACGGAAACAGCATTGCCAATGCTTTCGTCTCATACCTTGCTGGTCGTATGGCTGGCATGGATGACGATGAAGCTTGGTCTTGGATCGGCATTGTTTACGGTGATGATGGGCTCCGATCTGGTAATGTTTCAAATGAGCTCCTCACCAACACTGCTTCTTCCCTCGGCTTTGACTTGAAGATAGTGAATCGCGCGCCACGTTGCTCTCCAGTGACATTTCTGTCTCGAGTATACCTCGATCCTTGGTCCTCACCGGCTTCCGTGCAGTCGCCATTAAGAACATTGTTGAAATTGCACACCACCTGTGACACCCAGTCAGAGATTGACGACATTGGCTGGGCTAAGACGCAGGCGTATTTGGTCACTGATAGCAAGACACCTTTTATTGGTCATTGGTGCCGGGCTTATCAGAGAAATTGCACTGCACGTGTGGTTCAGTATGCAGACTACAGTGACATTCCATTCTGGGTGAAGAATGACGACCACGTTGGCAACTCGTGGCCGCAGTCTGAATCCGATGACTGGAATGACGTTGTAGCCAACGAGCTCGGCGTCACCACCGCTGAGCTGTTGAAGCATCTTGCACTTCTGGATGCTTATACTGGTCCCATTAGTGGCCTCCCACGTCTGACAACATCAATCGATTTGGAACCAAAGATGTCTGTCGCATTAGACGGGGAGATCCAAGCCGGTCCTAGTCAAAACAAAACTAGTAAGGATGGAACAAATCCAACAAGCGATCGATCAGCACCTCGTCGAGCTCGAACAGCTCTTCCAGGTGATGATGGACACGCGCGTCGCTCTCGGCGGAGCGACCGCGATCCAGGTAAACGAGATGCGCACGTTCGTGATAAGCGCCCACGCCGCAGCTCGCCGCCTGCACGTCCTGTCACGCCGGTTCCCACCCCTTCCAGCGGTGATCGAGGAACCGATGGAGACGGACTAGGCCGAGCTGCTGTGCGTCAGCGTCAGCGACGTCGCACTCAAGTGTAGACAGGTCACCTGCCTGCTCTCACCCCCTGGACCGTTTCGGTCCCTTAATCAGCTTTATGCTGTCCTACGCTTCGGCG；
RNA2序列长度为1433bp，碱基序列如序列②：TAATCCATCACCGCTTTGCAATCACAATGGTACGCAAAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACCACCAAGGCCGCGAATCCGCAACCCCGCCGACGTGCTAACAATCGTCGGCGTAGTAATCGCACTGACGCACCTGTGTCTAAGGCCTCGACTGTGACTGGATTTGGACGTGGGACCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATGTCGAGAATCTCCCAGGCCGTCCTCCCAGCCGGGACAGGAACTGACGGATACGTCGTTGTTGACGCAACCATCGTCCCCGACCTCCTGCCACGACTGGGACACGCTGCTAGAATCTTCCAGCGATACGCTGTTGAAACACTGGAGTTTGAAATTCAGCCAATGTGCCCCGCAAACACGGGCGGTGGTTACGTTGCTGGCTTCCTGCCTGATCCAACTGACAACGACCACACCTTCGACGCGCTTCAAGCAACTCGTGGTGCAGTCGTTGCCAAATGGTGGGAAAGCAGAACAGTCCGACCTCAGTACACCCGTACGCTCCTCTGGACCTCGTCGGGAAAGGAGCAGCGTCTCACGTCACCCGGTCGGCTGATACTCCTGTGTGTCGGCAACAACACTGATGTGGTCAACGTGTCGGTGCTGTGTCGCTGGAGTGTTCGACTGAGCGTTCCATCTCTTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACACCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTGGACCGTCCGCTGTCCATTGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGACCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTGCACCAGGGTTGACTCGGAAAACTAACCGGGTCATCCGGTTCCCTAGTGCGTATCGTTGATGACCAATTTGAACAATTGATTAAAGCACTAACAAATATAAATAAAGAAATACAAACAAACAAAACTGAAATTGGAAAGAATAGAAGCGAAATTGAATCACTCGCTAGCAAATTAAACGACAAAGCACCCAAGGAGGGTGCGATTGCTATTGTTGGTACCCTTGACGGCGTACCGGCTACGCTTGAAGGCCTATACACGGCTGGAAGCGCGCCGCGTGCTTAATTGGGTGCCAGTGGTACCAGTCGTATCCAACGCCGAGGAAATCCCTCTTTGGGCTGTTGGGTTACCGTTAGCTCCGCGCAGTGAGCACCACCGCCATGTGGTTAAATGGCCGCTGATCGCTTCTCAACTCGGC。
β诺达病毒基因组RNA1节段编码长度为982个氨基酸： MRRFEFALARMSGAAFCVYTGYRLLTSKWLADRVEDYRQRVIAEKKQILRDAAMIRTQIQREMELVRISVRKGHSHQEAATERNSATETMLGVVEKCGYEPYVISPSPREVGYHGSRQFYSLADFRQDYRRDDITDRHIIVMTDVDYYVDMHELIGLGVPILLYTFQPSTVSGEVKDGYFTITDDSVHYRVAGGKDVRHRIWNYNQDTMYVCSRPRGFWANLMQILRDITGVTAICSFLYAKLGIAPFGDPVTMFTVDQFKMGEHRNIVSIVPFATCRSNLLKISEYGAELEYMRYQQRNNIANFNAVTYISENGPLISLGLEGNFASVQLPLQDFENIRTAYELSKTNNLSDTVRRSGRPCKEAAIIHKCLQAECAVVSEVVHKPGDLARHYQAVGSAYDTDPAEQGKCYAREYAPGPLTQTAVFPSESRSNELATIDGRIAGPQAKAKSREHITPKMRKVARDFVHHLVPIAGTGRPYPLTYVEEQQTKPLQRARNDANRYHDEFTMMVKAFQKKEAYNAPNYPRNISTVPHTQNVKLSSYTYAFKASVLQHVPWYMPTHTPAEIADAVQNLAASSTELVETDYSKFDGTFLRFMRECVEFAIYKRWVHLDHLPELTTLLANEIQAPAVTRLGIKYDPDCSRLSGSALTTDGNSIANAFVSYLAGRMAGMDDDEAWSWIGIVYGDDGLRSGNVSNELLTNTASSLGFDLKIVNRAPRCSPVTFLSRVYLDPWSSPASVQSPLRTLLKLHTTCDTQSEIDDIGWAKTQAYLVTDSKTPFIGHWCRAYQRNCTARVVQYADYSDIPFWVKNDDHVGNSWPQSESDDWNDVVANELGVTTAELLKHLALLDAYTGPISGLPRLTTSIDLEPKMSVALDGEIQAGPSQNKTSKDGTNPTSDRSAPRRARTALPGDDGHARRSRRSDRDPGKRDAHVRDKRPRRSSPPARPVTPVPTPSSGDRGTDGDGLGRAAVRQRQRRRTQV。
β诺达病毒全基因组RNA1节段嵌套的B2蛋白长度为75个氨基酸：MEQIQQAIDQHLVELEQLFQVMMDTRVALGGATAIQVNEMRTFVISAHAAARRLHVLSRRFPPLPAVIEEPMETD。
β诺达病毒基因组RNA2节段编码长度为338个氨基酸： MVRKGEKKLAKPATTKAANPQPRRRANNRRRSNRTDAPVSKASTVTGFGRGTNDVHLSGMSRISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPRLGHAARIFQRYAVETLEFEIQPMCPANTGGGYVAGFLPDPTDNDHTFDALQATRGAVVAKWWESRTVRPQYTRTLLWTSSGKEQRLTSPGRLILLCVGNNTDVVNVSVLCRWSVRLSVPSLETPEETTAPIMTQGSLYNDSLSTNDFKSILLGSTPLDIAPDGAVFQLDRPLSIDYSLGTGDVDRAVYWHLKKFAENAGTPAGWFRWGIWDNFNKTFTDGVAYYSDEQPRQILLPVGTVCTRVDSEN。
实施例2
β诺达病毒的分子检测
1.引物设计
根据β诺达病毒基因组RNA2序列设计两条引物，序列如下：
正向引物： NDAs-26 TAATCCATCACCGCTTTG
反向引物： NDAr1407 GCCGAGTTGAGAAGCGAT
2.提取感染β诺达病毒病灶组织的RNA，通过反转获得cDNA，然后利用上述1中的引物进行PCR检测；
3.将上述2中PCR产物进行核酸电泳分离；
4.将上述3中的DNA片段连接到PMD18-T载体中，并转化感受态细胞；
5.选择阳性转化子测序；
6.将测序结果与β诺达病毒基因组RNA2节段序列进行比对，并判定是否有β诺达病毒检出。
实施例3
β诺达病毒相关蛋白的抗体制备
1.表达载体构建
①引物设计：
正向引物：5’ CATATGGTACGCAAAGGTGAG 3’
反向引物：5’ AAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT 3’
②以反转得到的β诺达病毒基因组RNA2节段的cDNA为模板，以上述①中的引物进行PCR反应；
③将上述②中的产物进行核酸电泳，并回收合适片段；
④将上述③中的片段连接到PMD18-T载体中，转化并送测序；
⑤将上述④中的阳性测序结果摇菌，提取质粒；
⑥将上述⑤中的质粒进行双酶切（两种内切酶分别为Nde I与Hind III），使其与表达载体Pet21有相同的黏性末端，同时用相同的酶对Pet21进行双酶切；
⑦将上述⑥中的酶切产物分别进行核酸电泳，回收两个合适片段；
⑧用T4 DNA Ligase 将上述⑦中两片段进行连接；
⑨将上述⑧中的产物进行转化，并测序，将阳性测序保种待用。
2.诱导表达
①取上述1中保的菌种50μL接入到3mL含氨苄的LB培养基中过夜摇菌（37℃，200rpm）；
②将上述①中的菌液接入300mL LB培养基中扩大培养；
③向上述②中培养液中加入IPTG（终浓度为1mmol/L）诱导表达5h；
④将上述③中的菌液进行低温离心，4℃，10000rpm，10min，弃上清；
⑤向上述④沉淀中加入30mL 裂解液（50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5% TritionX-100，1mg/mL 溶菌酶；PH=8.0），使用细胞破碎仪进行破碎，然后低温离心（同上述④），弃上清；
⑥向上述⑤沉淀中加入洗涤液（300mM KCl，50mM KH2PO4，5mM Imidazole，1M Urea；PH=8.0）30mL，用力震荡15min，然后低温离心10min（同上述④），弃上清，如此再重复两次；
⑦向上述⑥中加入Wash I溶液（300mM KCl，50mM KH2PO4，5mM Imidazole，8M Urea；PH=8.0）25mL，溶解蛋白。
3.蛋白纯化与复性
①将上述2中溶解的蛋白，经0.22μm微孔滤膜过滤后，使用蛋白纯化仪进行纯化；
②将上述①中纯化的蛋白移入透析袋，依次用8M、6M、4M、3M、2M、1M、0M的尿素中透析复性，复性温度为7℃，每个梯度透析5h；
③将上述②中的蛋白冷冻干燥后保存于-80℃冰箱。
4.免疫动物
①准备两只成年实验雄兔，将3中所述复性后的抗原蛋白100μg溶入1mL磷酸缓冲溶液（pH=7.2）中待用，加入1mL福氏完全佐剂，剧烈震荡使之充分乳化；
②在4个不同的部位进行皮下注射，分别各注射约500μl ①中所述乳化的抗原溶液；
③每4-6周注射抗原，并在注射后的7-10天采集血液。
5.收集多抗
①检测上述4种收集的血清中是否有抗体产生，待确定产生抗体后可大量收集血液，每只兔子收集血液不能多于40mL以防止休克；
②亲和层析法纯化抗体，将纯化的抗体分装后在2-8℃保存。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3104
<212> DNA
<213> β诺达病毒PONNV毒株基因
<400> 1
taacatcacc ttcttgctct gttgagtaat cacttacgca aggttaccgt tcagcttaga 60
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cgttaccaac aacgtaataa cgtcgcaaac ttcaacgctg tcacctacat ctccgaggag 1020
ggcccactta tcagcttggg attggagggc aattttgcta gtgtacaact cccgcttcag 1080
gactttgaaa acgtccgtac cgcatacgag ctgtcgaaga ataacaactt gtcagatact 1140
gtccgtcgat caggtcgacc gtgcagggag gctgccatca ttcataagtg tctccaggct 1200
gaatgtaccc tcgctagcga ggtagtccat aagcctggtg atctggctcg ccactaccaa 1260
gccatcggta gcctctacga cgtcgatccc gccgagcagg gcaagtgtta tgcccgtgag 1320
tatgctcctg ggccgttgac tcaaacagct gtgtttccaa gtgagtctcg gtccaacgag 1380
cgtgccacga ttgacggccg cattgcgggt ccgcaagcaa aggcaaagag ccgtgagcat 1440
atcacaccta ggatgcgcaa ggtggctaga gatttcgtgc gccatctggt gcccgaggcc 1500
ggtctcggcc gtccctaccc cctcacgtat gtcgaagagc agcagagcaa gccattacag 1560
cgggctcgca atgatgctaa tcgatatcac gatgagttca ctatgatcgt taaggcgttc 1620
caaaagaaag aagcatacaa tgccccaaac tatccccgga acatttcgac cgttccgcac 1680
aaccaaaatg tcaagctgtc cagctacacc tatgctttca aagctagtac tctccagcat 1740
gttccgtggt acatgccaac gcacacacca gctgaaatag ctgacgcagt gcaaaacttg 1800
gctgctagta ccactgagtt ggttgagact gactacagca aattcgatgg cacattcttg 1860
cgcttcatgc gtgagtgcgt cgagtttgca atttataagc gttgggtgca tctggaccac 1920
ttggctgagt tatctcaact attggcaaat gaactccagg cacctgctgt tacgcgtctt 1980
ggtcttaagt atgaccctga ttgcagccgc ctcagtggct cagcattgac aactgacggt 2040
aacagcattg ctaacgcatt cgtttcatat ttggccaacc gcttggctgg tatggacgat 2100
ggcgaagcat ggtcttggat tggcattgtt tatggtgatg atggtcttcg ttccggaaac 2160
gtttcgaatg ctctcctcac tgacactgct tcctcccttg gctttgactt gaaaatagtg 2220
aatcgcgctc cccgtggctc tcctgtgaca ttcctcgcac gagtttacct cgatccctgg 2280
tcgtcaccgg cttccgtgca gtcaccttta cgcacgttgc tgaagctaca tacgacctgc 2340
gatacccagt ccgaaattga ggatattggc tgggctaaaa cgcaggcgta tttagtgact 2400
gattgcaaga ctccatttat tggccattgg tgtcgagctt atcagcgcaa ctgcactgca 2460
cgtgtggtcc aatacgcgga ctacaacgac attccatttt gggttaagaa tgacgaccat 2520
attggcaatt cttggcccca atccgactcg tcggattgga atgacgttgt ggctaccgag 2580
ctcggtctta ccactgctga gctcctcagg cacattgcgt tgcttgaggc gtacactggg 2640
cccacaagtg gacttccccg cctgacaaca tcaattgatt tggaaccgaa gatgtctgtc 2700
gcattagacg gtgaggtcca agccggtcct agtcaacaac aaacagacaa ggatggaaca 2760
aatccaacag gcgatcgatc agcacctggt cgagctcgag cagctcttcc aggcgttgat 2820
ggacaagcga gttgctctcg gcggagtaac cgtggtccag gtgaacgaga tgcgaacgtt 2880
cgtgataagc gcccacgccg cagcatgccg ccttcacgtt ctgtcacgtc ggtacccccc 2940
cgccccagtg gcggacgggg agccgatgga gatggaatag aaggtgctgc tcgtcgtcgg 3000
cgtacacaac gtcgcactcc cgtgtagaca ggtcacctgc ctgctctcac cccctggacc 3060
gtttcggtcc cttaatcagc tttatgctgt cctacgcttc ggcg 3104
<210> 2
<211> 1433
<212> DNA
<213> β诺达病毒PONNV毒株基因
<400> 2
taatccatca ccgctttgca atcacaatgg tacgcaaagg gaataagaaa ttggctaaac 60
cagcgaccac aaaggccgtt aatccacaac cccgtcgacg caacaacaac cgtcggcgtg 120
gcatgagagc ggatgcacct ttagctaagg cctcgactat cacgggattt ggacgtggga 180
ccaatgacgt ccatctcacg ggtatgtcga gaatcgccca agcggttatc ccagctggca 240
ccggcacgga cggatacatc gtggttgacg aaaccatcgt ccccgagctc ttgccaagac 300
tgggatttgc tgctagaatc ttccagcgat acgctgttga gacactggag ttcgaaattc 360
agccaatgtg ccccgcaaac acgggcggtg gttacgtggc tggcttcctg cctgatccaa 420
ctgacagcga ccacaccttc gacgcaattc aagcgactcg tggtgcggtc gttgccaaat 480
ggtgggaaag cagaacaatc cgaccccagt atgcccgcgc actcctctgg acctcggtcg 540
ggaaggagca gcgtttgaca tccccgggcc ggttgatact cctgtgtgtc ggcaacaaca 600
ctgacgtcgt caacgtgtca gtgctatgtc gctggagtgt gcgtctcagt gttccatctc 660
tcgagacacc tgaagataca ttcgctccaa tcctaacctt gggaccactc tacaacgact 720
cccttgcagc caatgatttc aaatcaatac ttcttggctc tacccagctt gacatcgccc 780
ctgaaggagc cgtctattca ttagatcggc cgctgtccat tgactacagt ctgggcactg 840
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ctgcggggtg gttccattgg gggctatggg ataatttcaa caaaacattc acacagggcg 960
ttgcctacta ttctgatgcg cagcctcgac agatcctgct gccagtgggc acgctcttca 1020
cccgtgctga ctcgggaaac taaccgggtc atccggttcc ctagtgcgta tcgttgatga 1080
ccaatttgaa caattgatta aagcactaac aaatataaat aaagaaatac aaacaaacaa 1140
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agcacccaag gagggtgcga ttgctattgt tggtaccctt gacggcgtac cggctacgct 1260
tgaaggccta tacacggctg gaagcgcgcc gcgtgcttaa ttgggtgcca gtggtaccag 1320
tcgtatccaa cgccgaggaa atccctcttt gggctgttgg gttaccgtta gctccgcgca 1380
gtgagcacca ccgccatgtg gttaaatggc cgctgatcgc ttctcaactc ggc 1433
<210> 3
<211> 982
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum
<400> 3
Met Arg Arg Phe Glu Phe Ala Leu Ala Arg Met Ser Gly Ala Ala Phe
1 5 10 15
Cys Val Tyr Thr Gly Tyr Arg Leu Leu Thr Ser Lys Trp Leu Ala Asp
20 25 30
Arg Val Glu Asp Tyr Arg Gln Arg Val Ile Ala Glu Lys Lys Gln Ile
35 40 45
Leu Arg Asp Ala Ala Met Ile Arg Thr Gln Ile Gln Arg Glu Met Glu
50 55 60
Leu Val Arg Ile Ser Val Arg Lys Gly His Ser His Gln Glu Ala Ala
65 70 75 80
Thr Glu Arg Asn Ser Ala Thr Glu Thr Met Leu Gly Val Val Glu Lys
85 90 95
Cys Gly Tyr Glu Pro Tyr Val Ile Ser Pro Ser Pro Arg Glu Val Gly
100 105 110
Tyr His Gly Ser Arg Gln Phe Tyr Ser Leu Ala Asp Phe Arg Gln Asp
115 120 125
Tyr Arg Arg Asp Asp Ile Thr Asp Arg His Ile Ile Val Met Thr Asp
130 135 140
Val Asp Tyr Tyr Val Asp Met His Glu Leu Ile Gly Leu Gly Val Pro
145 150 155 160
Ile Leu Leu Tyr Thr Phe Gln Pro Ser Thr Val Ser Gly Glu Val Lys
165 170 175
Asp Gly Tyr Phe Thr Ile Thr Asp Asp Ser Val His Tyr Arg Val Ala
180 185 190
Gly Gly Lys Asp Val Arg His Arg Ile Trp Asn Tyr Asn Gln Asp Thr
195 200 205
Met Tyr Val Cys Ser Arg Pro Arg Gly Phe Trp Ala Asn Leu Met Gln
210 215 220
Ile Leu Arg Asp Ile Thr Gly Val Thr Ala Ile Cys Ser Phe Leu Tyr
225 230 235 240
Ala Lys Leu Gly Ile Ala Pro Phe Gly Asp Pro Val Thr Met Phe Thr
245 250 255
Val Asp Gln Phe Lys Met Gly Glu His Arg Asn Ile Val Ser Ile Val
260 265 270
Pro Phe Ala Thr Cys Arg Ser Asn Leu Leu Lys Ile Ser Glu Tyr Gly
275 280 285
Ala Glu Leu Glu Tyr Met Arg Tyr Gln Gln Arg Asn Asn Ile Ala Asn
290 295 300
Phe Asn Ala Val Thr Tyr Ile Ser Glu Asn Gly Pro Leu Ile Ser Leu
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Asn Phe Ala Ser Val Gln Leu Pro Leu Gln Asp Phe
325 330 335
Glu Asn Ile Arg Thr Ala Tyr Glu Leu Ser Lys Thr Asn Asn Leu Ser
340 345 350
Asp Thr Val Arg Arg Ser Gly Arg Pro Cys Lys Glu Ala Ala Ile Ile
355 360 365
His Lys Cys Leu Gln Ala Glu Cys Ala Val Val Ser Glu Val Val His
370 375 380
Lys Pro Gly Asp Leu Ala Arg His Tyr Gln Ala Val Gly Ser Ala Tyr
385 390 395 400
Asp Thr Asp Pro Ala Glu Gln Gly Lys Cys Tyr Ala Arg Glu Tyr Ala
405 410 415
Pro Gly Pro Leu Thr Gln Thr Ala Val Phe Pro Ser Glu Ser Arg Ser
420 425 430
Asn Glu Leu Ala Thr Ile Asp Gly Arg Ile Ala Gly Pro Gln Ala Lys
435 440 445
Ala Lys Ser Arg Glu His Ile Thr Pro Lys Met Arg Lys Val Ala Arg
450 455 460
Asp Phe Val His His Leu Val Pro Ile Ala Gly Thr Gly Arg Pro Tyr
465 470 475 480
Pro Leu Thr Tyr Val Glu Glu Gln Gln Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ala
485 490 495
Arg Asn Asp Ala Asn Arg Tyr His Asp Glu Phe Thr Met Met Val Lys
500 505 510
Ala Phe Gln Lys Lys Glu Ala Tyr Asn Ala Pro Asn Tyr Pro Arg Asn
515 520 525
Ile Ser Thr Val Pro His Thr Gln Asn Val Lys Leu Ser Ser Tyr Thr
530 535 540
Tyr Ala Phe Lys Ala Ser Val Leu Gln His Val Pro Trp Tyr Met Pro
545 550 555 560
Thr His Thr Pro Ala Glu Ile Ala Asp Ala Val Gln Asn Leu Ala Ala
565 570 575
Ser Ser Thr Glu Leu Val Glu Thr Asp Tyr Ser Lys Phe Asp Gly Thr
580 585 590
Phe Leu Arg Phe Met Arg Glu Cys Val Glu Phe Ala Ile Tyr Lys Arg
595 600 605
Trp Val His Leu Asp His Leu Pro Glu Leu Thr Thr Leu Leu Ala Asn
610 615 620
Glu Ile Gln Ala Pro Ala Val Thr Arg Leu Gly Ile Lys Tyr Asp Pro
625 630 635 640
Asp Cys Ser Arg Leu Ser Gly Ser Ala Leu Thr Thr Asp Gly Asn Ser
645 650 655
Ile Ala Asn Ala Phe Val Ser Tyr Leu Ala Gly Arg Met Ala Gly Met
660 665 670
Asp Asp Asp Glu Ala Trp Ser Trp Ile Gly Ile Val Tyr Gly Asp Asp
675 680 685
Gly Leu Arg Ser Gly Asn Val Ser Asn Glu Leu Leu Thr Asn Thr Ala
690 695 700
Ser Ser Leu Gly Phe Asp Leu Lys Ile Val Asn Arg Ala Pro Arg Cys
705 710 715 720
Ser Pro Val Thr Phe Leu Ser Arg Val Tyr Leu Asp Pro Trp Ser Ser
725 730 735
Pro Ala Ser Val Gln Ser Pro Leu Arg Thr Leu Leu Lys Leu His Thr
740 745 750
Thr Cys Asp Thr Gln Ser Glu Ile Asp Asp Ile Gly Trp Ala Lys Thr
755 760 765
Gln Ala Tyr Leu Val Thr Asp Ser Lys Thr Pro Phe Ile Gly His Trp
770 775 780
Cys Arg Ala Tyr Gln Arg Asn Cys Thr Ala Arg Val Val Gln Tyr Ala
785 790 795 800
Asp Tyr Ser Asp Ile Pro Phe Trp Val Lys Asn Asp Asp His Val Gly
805 810 815
Asn Ser Trp Pro Gln Ser Glu Ser Asp Asp Trp Asn Asp Val Val Ala
820 825 830
Asn Glu Leu Gly Val Thr Thr Ala Glu Leu Leu Lys His Leu Ala Leu
835 840 845
Leu Asp Ala Tyr Thr Gly Pro Ile Ser Gly Leu Pro Arg Leu Thr Thr
850 855 860
Ser Ile Asp Leu Glu Pro Lys Met Ser Val Ala Leu Asp Gly Glu Ile
865 870 875 880
Gln Ala Gly Pro Ser Gln Asn Lys Thr Ser Lys Asp Gly Thr Asn Pro
885 890 895
Thr Ser Asp Arg Ser Ala Pro Arg Arg Ala Arg Thr Ala Leu Pro Gly
900 905 910
Asp Asp Gly His Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ser Asp Arg Asp Pro Gly
915 920 925
Lys Arg Asp Ala His Val Arg Asp Lys Arg Pro Arg Arg Ser Ser Pro
930 935 940
Pro Ala Arg Pro Val Thr Pro Val Pro Thr Pro Ser Ser Gly Asp Arg
945 950 955 960
Gly Thr Asp Gly Asp Gly Leu Gly Arg Ala Ala Val Arg Gln Arg Gln
965 970 975
Arg Arg Arg Thr Gln Val
980
<210> 4
<211> 75
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum
<400> 4
Met Glu Gln Ile Gln Gln Ala Ile Asp Gln His Leu Val Glu Leu Glu
1 5 10 15
Gln Leu Phe Gln Val Met Met Asp Thr Arg Val Ala Leu Gly Gly Ala
20 25 30
Thr Ala Ile Gln Val Asn Glu Met Arg Thr Phe Val Ile Ser Ala His
35 40 45
Ala Ala Ala Arg Arg Leu His Val Leu Ser Arg Arg Phe Pro Pro Leu
50 55 60
Pro Ala Val Ile Glu Glu Pro Met Glu Thr Asp
65 70 75
<210> 5
<211> 338
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum
<400> 5
Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys
1 5 10 15
Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser
20 25 30
Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe
35 40 45
Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser
50 55 60
Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val
65 70 75 80
Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala
85 90 95
Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln
100 105 110
Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asp His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr
130 135 140
Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro
145 150 155 160
Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg
165 170 175
Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr
180 185 190
Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser
195 200 205
Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr
210 215 220
Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser
225 230 235 240
Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val
245 250 255
Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly
260 265 270
Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Glu Asn
275 280 285
Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe
290 295 300
Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro
305 310 315 320
Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser
325 330 335
Glu Asn
Claims (5)
1.一种β诺达病毒基因组全序列，其特征在于：该病毒基因组由两条不等长RNA组成，RNA1节段全长3104个核苷酸， 5’UTR和3’UTR分别由78和77个核苷酸组成， ORF区含有2949个碱基，编码病毒自身的RNA依赖的RNA聚合酶，在其编码区内部嵌套有另一重叠阅读框,位置：2753-2980 nt，编码非结构蛋白B2，序列为SEQ ID No.1所示； RNA2节段长度为1433个核苷酸，5’UTR和3’UTR分别由26和390个核苷酸组成，ORF区含有1017个核苷酸，序列为SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNA1节段编码长度为982个氨基酸，其序列如SEQ ID No.3所示。
3.权利要求1所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒全基因组RNA1节段嵌套的B2蛋白长度为75个氨基酸，其序列如SEQ ID No.4所示。
4.权利要求1所述β诺达病毒基因组全序列，其中β诺达病毒基因组RNA2节段编码长度为338个氨基酸，其序列如SEQ ID No.5所示。
5.权利要求1所述的β诺达病毒基因组全序列在制备β诺达病毒蛋白抗体方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104077545A CN102492702A (zh) | 2011-12-09 | 2011-12-09 | 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011104077545A CN102492702A (zh) | 2011-12-09 | 2011-12-09 | 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102492702A true CN102492702A (zh) | 2012-06-13 |
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ID=46184564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011104077545A Pending CN102492702A (zh) | 2011-12-09 | 2011-12-09 | 一种β诺达病毒基因组全序列及其克隆方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102492702A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104004068A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-08-27 | 天津师范大学 | 具有免疫保护作用的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白及其制备方法 |
| CN104178584A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-12-03 | 大连海洋大学 | 检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒 |
| CN106831963A (zh) * | 2016-06-29 | 2017-06-13 | 福建省水产研究所 | 石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用 |
-
2011
- 2011-12-09 CN CN2011104077545A patent/CN102492702A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104004068A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-08-27 | 天津师范大学 | 具有免疫保护作用的牙鲆β诺达病毒衣壳蛋白及其制备方法 |
| CN104178584A (zh) * | 2014-07-30 | 2014-12-03 | 大连海洋大学 | 检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒 |
| CN104178584B (zh) * | 2014-07-30 | 2016-04-20 | 大连海洋大学 | 检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒 |
| CN106831963A (zh) * | 2016-06-29 | 2017-06-13 | 福建省水产研究所 | 石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用 |
| CN106831963B (zh) * | 2016-06-29 | 2019-10-11 | 福建省水产研究所 | 石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用 |
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