CN107201370B - 一种dna分子与重组病毒及它们的制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途。所述DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，除5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列外的序列均来源于黄热病毒减毒株。所述重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与所述DNA分子的序列相同。本发明的DNA分子可用于构建重组病毒，从而获得能够有效预防黄热病毒感染的疫苗。

Description

一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途，具体地，涉及一种DNA分子及其制备方法与应用、重组病毒及其制备方法与应用以及含有所述重组病毒的疫苗。
背景技术
黄热病(Yellow Fever，YF)，是一种由黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)引起的、对人类和非人类灵长类具有高度致死性的出血性疾病。黄热病毒属黄病毒科，黄病毒属。其基因组为单股正链RNA，长度约为11kb，5’端包含1型帽子结构，中间为单一开放阅读框，3’端为不含PolyA的UTR区域。通过经典帽子结构起始的翻译途径，YF17D单一ORF编码一多聚蛋白，包含三个结构蛋白(衣壳蛋白C、膜和膜蛋白前体prM、包膜蛋白E)和七个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。黄热病由蚊虫传播，主要流行于非洲和南美洲，每年大约有20万感染病例的报道，其中90％发生在非洲。人感染黄热病毒以后会产生一系列症状包括：发热，恶心，呕吐等，进一步发展为多器官衰竭，出血最终出现死亡。目前，针对黄热病仍然缺乏特效的治疗手段，疫苗接种是最有效的预防病毒感染的措施。黄热减毒活疫苗YF17D是公认的为最安全有效的减毒活疫苗之一，被广泛使用，到目前为止已经超过5亿人次接种使用。YF17D具有较高的免疫效价，单次接种能够在90％到99％接种者体内诱导中和性抗体的产生，提供98％的保护效果，并且持续至少10年时间。
虽然黄热减毒活疫苗YF17D安全有效，但是越来越多的报道指出，接种该疫苗以后会引起一系列副作用，包括发热，头痛，接种区域红疹等。更为严重的还会较低几率地引起内脏嗜性疾病和神经系统副作用疾病，对接种者的生命安全造成威胁。因此，研发一种新的更加安全的黄热减毒活疫苗具有重要的公共卫生意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够用于制备预防黄热病毒感染的疫苗的DNA分子与重组病毒及它们的制备方法和用途。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种DNA分子，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。内部核糖体进入位点(Internal Ribosom Entry Site，IRES)是一段特异RNA序列，能够结合核糖体，诱导蛋白翻译。在本发明的一种优选实施方式中，本发明的发明人通过反向遗传学技术将IRES整合入黄热病毒减毒株基因组内部，获得了一株高度减毒，并具有较好免疫效果的黄热疫苗株。
第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的DNA分子的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列。
第三方面，本发明提供了含有第一方面所述的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
第四方面，本发明提供了一种重组病毒，该重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与第一方面所述的DNA分子的序列相同。
第五方面，本发明提供了一种制备上述重组病毒的方法，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列。
第六方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗的活性成分为上述重组病毒。
第七方面，本发明提供了上述DNA分子和/或重组病毒在制备用于预防黄热病毒感染的疫苗中的应用。
第八方面，本发明提供了一种预防黄热病毒感染的方法，该方法包括为受试者接种上述疫苗。
本发明的DNA分子可用于构建重组病毒，从而获得能够有效预防黄热病毒感染的疫苗。本发明提供的重组病毒具有如下多方面的优点：(1)充分减毒，安全性很高；(2)减毒特征稳定，遗传稳定性好，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)能诱导产生针对黄热病毒的免疫应答。综上所述，本发明的重组病毒对预防黄热病毒感染具有良好的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为黄热减毒疫苗株YF17D和重组病毒的全长RNA对应的cDNA的结构示意图；
图2为实施例1的步骤三中琼脂糖凝胶电泳的结果图，其中，Maker：DL2000；
图3为实施例2所述的间接免疫荧光的结果；
图4为实施例3所述的空斑试验的结果；
图5为实施例4所述的重组黄热病毒在不同细胞内的增殖特征的测试结果；
图6为实施例5所述的各代重组黄热病毒液空斑试验的测试结果；
图7为实施例6所述的重组黄热病毒的神经毒力特征的测试结果；
图8为实施例9所述的重组黄热病毒的免疫原性的测试结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供的DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株。
其中，本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(RNA)构建某蛋白的编码序列(DNA)，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于黄热病毒的序列是指与黄热病毒的基因序列具有90％以上(优选100％)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。
本发明中，对所述终止密码子序列没有特别的要求，可以为TAG、TAA或TGA。优选情况下，所述终止密码子序列为TAA。
本发明中，所述内部核糖体进入位点序列可以为各种病毒的内部核糖体进入位点序列，优选来源于脑心肌炎病毒。所述脑心肌炎病毒可以为野生型毒株。根据本发明的优选实施方式，所述内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。内部核糖体进入位点序列(IRES)是一段特异的RNA序列，能够结合核糖体，诱导蛋白翻译。本发明的发明人发现，通过使用该特异的序列能够有效地减弱黄热病毒减毒株的毒力。
本发明中，所述黄热病毒减毒株为黄热减毒疫苗株YF17D。
本发明中，所述5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列可以分别来源于同一基因型的黄热病毒，也可以来源于不同基因型的黄热病毒。
所述5’非编码区序列可以为SEQ ID NO：1中第1-119位所示的序列。
所述衣壳蛋白的编码序列可以为SEQ ID NO：1中第120-421位所示的序列。
所述膜蛋白前体的编码序列可以为SEQ ID NO：1中第422-973位所示的序列。
所述包膜蛋白的编码序列可以为SEQ ID NO：1中第974-2452位所示的序列。
所述非结构蛋白的编码序列可以为SEQ ID NO：1中第2453-10354位所示的序列。所述非结构蛋白的编码序列通常包括非结构蛋白NS1的编码序列、非结构蛋白NS2a的编码序列、非结构蛋白NS2b的编码序列、非结构蛋白NS3的编码序列、非结构蛋白NS4a的编码序列、非结构蛋白NS4b的编码序列和非结构蛋白NS5的编码序列。
所述3’非编码区序列可以为SEQ ID NO：1中第10355-10860位所示的序列。
根据本发明最优选的实施方式，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
第二方面，本发明提供的制备上述DNA分子的方法包括在黄热病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列。
第三方面，本发明提供了含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
其中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明的DNA分子相连获得。
所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pANCR-L1载体(序列如SEQ ID NO：3所示)的多克隆位点(如AscI和XhoI)间插入有所述DNA分子的重组载体。
所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞(如BHK-21细胞或Vero细胞)中而获得。
所述重组菌可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株Top10)中而获得。
本发明的重组病毒可以通过将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞(如RD细胞或Vero细胞)中得到。
第四方面，本发明提供的重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与上述DNA分子的序列相同。
第五方面，本发明提供的制备上述重组病毒的方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列。
第六方面，本发明提供的疫苗的活性成分为上述重组病毒。
第七方面，本发明提供了上述DNA分子和/或重组病毒在制备用于预防黄热病毒感染的疫苗中的应用。
第八方面，本发明提供的预防黄热病毒感染的方法包括为受试者接种上述疫苗。所述受试者可以为人和/或鼠。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，涉及定量的实验均设置三次重复，结果取平均值；“室温”是指25℃；限制性内切酶NOT1和Nsi1购自NEB公司；BHK-21细胞购自ATCC，产品目录号为CCL-10；Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)购自ATCC，产品目录号为CCL-81；黄热减毒疫苗株YF17D购自北京天坛生物制品股份有限公司。
实施例1
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES的构建与鉴定。
一、重组质粒pYF-IRES的构建
SEQ ID NO：1所示的DNA分子插入pANCR-L1载体(pANCR-L1载体为SEQ ID NO：3所示的质粒，自SEQ ID NO：3的5’末端第2350-2575位核苷酸为sp6启动子)的Asc I和XhoI酶切位点之间，得到载体pANCR-YFV。
1、以载体pANCR-YFV为模板，采用NOT1和YF17D-IRES-R1组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(689bp)。
NOT1：5’-CGACGCGGCCGCGCTAGCGATGAC-3’(SEQ ID NO：6)；
YF17D-IRES-R1：5’-GGGAGAGGGGTTAACGGCGTTTCCTTGAGGAC AATC-3’(SEQ ID NO：7)。
2、以质粒pIRES-neo(购自TAKARA公司)为模板，采用IRES-F和IRES-R组成的引物对其进行PCR扩增，终止密码子为TAA(下划线标示)，直接通过PCR引物引入，最终得到PCR扩增产物(613bp)。
IRES-F：5’-GGAAACGCCGTTAACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCT-3’(SEQ ID NO：8)；
IRES-R：5’-GGGATTGTTCCATGGTTGTGGCCATATTATC-3’(SEQ ID NO：9)。
3、以载体pANCR-YFV为模板，采用YF17D-IRES-F2和Nsi1(-)组成的引物对其进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(1291bp)。
YF17D-IRES-F2：5’-GGCCACAACCATGGAACAATCCCATGATGTTC TGACTGTGCAATTCCT-3’(SEQ ID NO：10)；
Nsi1(-)：5’-GGCGGCATGCGGAGGTTCAAATTCG-3’(SEQ ID NO：11)。
4、同时将步骤1，步骤2和步骤3的PCR扩增产物作为模板，采用NOT1和Nsi1(-)组成的引物对进行融合PCR扩增，得到PCR扩增产物(2546bp)。
5、用限制性内切酶NOT1和Nsi1双酶切步骤4得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
6、用限制性内切酶NOT1和Nsi1双酶切载体pANCR-YFV，回收载体骨架(约10503bp)。
7、使用T4DNA连接酶(购于TAKALA公司)将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒pYF-IRES。根据测序结果得到重组质粒pYF-IRES(序列如SEQ ID NO：5所示)的结构如下：在pANCR-YFV载体的Asc I和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO：2所示的双链DNA分子。SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：4的差异仅在于将SEQ ID NO：2所示的核苷酸插入到SEQ ID NO：1的C蛋白基因序列下游(5’端421位置)，两个序列之间加入有外源终止密码子(TAA)(见图1)。
二、重组黄热病毒YF-IRES的拯救
1、用限制性内切酶XhoI酶切重组质粒pYF-IRES，回收线性化质粒。
2、以步骤1的线性化片段为模板，采用SP6RiboMAX Express Large Scale RNAProduction Systems(Promega公司产品)并按说明书的步骤进行体外转录，然后采用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司产品)纯化转录体RNA并定量，纯化后的转录体RNA分装后置-80℃下冻存待用。
3、用脂质体Lipofectamine 3000(购自Invitrogen公司)将步骤2得到的转录体RNA转染单层BHK-21细胞，方法如下：首先将50μl OPTI-MEM培养基与4μl脂质体混匀，室温放置5min后与10μl转录体RNA(5μg)和50μl OPTI-MEM培养基(购自Invitrogen公司)混合，室温放置20min，然后将混合液加入到6孔板的1个孔中(6孔板中已接种BHK-21细胞)，然后补加450μl OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育6h，移去上清并补加含2％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下孵育至出现细胞病变(72h)，离心收集培养上清，将培养上清重新接种于BHK-21细胞并进行培养，细胞出现病变(72h)后离心收集上清，即为重组黄热病毒种子液，冻存于-80℃。
三、重组黄热病毒YF-IRES的RNA检测
1、提取重组黄热病毒YF-IRES种子液的总RNA，采用随机引物(购自TAKALA公司)进行反转录，得到cDNA，以cDNA为模板，采用YF-382-F和YF-M-500-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2；
YF-382-F：5’-GGCCAGTTTGATGAGAGGATTGTC-3’(SEQ ID NO：12)；
YF-M-500-R：5’-GAGAATGTTTTCCCGAGGTCCTCAGATG-3’(SEQ ID NO：13)。
2、将步骤(1)得到的cDNA的PCR扩增产物进行测序，测序结果显示其序列如SEQ IDNO：4所示。
实施例2
本实施例用来说明采用IFA检测重组黄热病毒在BHK-21细胞的病毒蛋白表达。
对实施例1中“二、重组黄热病毒YF-IRES的拯救”部分得到的重组黄热病毒和黄热减毒疫苗株YF17D进行如下测定：
1、用拯救得到的重组黄热病毒以及黄热减毒疫苗株分别感染单层BHK-21细胞，于感染后48h收取细胞，重悬于含有10％FBS的DMEM培养液后铺于载玻片，37℃、5％CO2条件下培养10h，即为抗原片，将抗原片置于-20℃丙酮中固定60min，晾干后放于-20℃冰箱密封待用。
2、采用黄热减毒疫苗株的小鼠免疫血清(制备方法见后)，通过间接免疫荧光对BHK-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测。方法如下：将抗体按适当比例稀释，与抗原片中的BHK-21细胞在37℃下孵育2h，用PBS缓冲液(10mM K2HPO4，2mM KH2PO4，135mM NaCl，2.7mMKCl，pH7.4)振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干；在病毒抗原片上加入用PBS缓冲液800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(购自中杉金桥，货号ZF-0312)，置37℃作用60min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。
间接免疫荧光的结果见图3。图3中，YF17D代表黄热减毒疫苗株，YF-IRES代表重组病毒YF-IRES。图3显示YF17D和YF-IRES均能够在BHK-21细胞中表达黄热病毒蛋白(均呈现黄绿色荧光)。
黄热减毒疫苗株的小鼠免疫血清的制备方法如下：
将105PFU的疫苗株YF17D经皮下途径免疫4周龄BALB/c雌鼠，免疫后第3周再次用相同剂量的疫苗株经相同途径加强免疫一次。于再次免疫后第2周摘眼球取血，4℃静置1h，获取疫苗株的小鼠免疫血清。
实施例3
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES的空斑特征。
分别将实施例1制备的重组黄热病毒YF-IRES种子液和黄热减毒疫苗株YF17D种子液进行如下检测：
将滴度为1×105PFU/mL的重组黄热病毒YF-IRES种子液用含2％FBS的DMEM培养基进行10倍梯度稀释(稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4)。将滴度为4×105PFU/mL的黄热减毒疫苗株YF17D种子液用含2％FBS的DMEM培养基进行10倍梯度稀释(稀释度依次为10-1、10-2、10-3、10-4)。将各个稀释液分别以500μl/孔接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞，37℃、5％CO2条件下静置2h，吸弃培养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2％FBS和1％琼脂的DMEM培养基)，37℃、5％CO2条件下培养3d，然后用4％甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(PFU)。
空斑形态观察结果的照片见图4。图4中，YF17D代表黄热减毒疫苗株YF17D，YF-IRES代表重组黄热病毒YF-IRES。重组黄热病毒YF-IRES能形成大小较为均一，边缘清晰的空斑，相比较，黄热减毒疫苗株YF17D形成的空斑直径明显较大。上述结果表明，重组黄热病毒YF-IRES的空斑直径小于黄热减毒疫苗株YF17D，因此其具有显著的小斑(small plaque，sp)特征。
实施例4
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES在不同哺乳类细胞系上的增殖特征。
为了观察重组黄热病毒YF-IRES在哺乳类细胞系中的增殖特征，分别将实施例1制备的重组黄热病毒YF-IRES种子液和黄热减毒疫苗株YF17D种子液进行如下检测：
分别将两种病毒种子液以MOI＝0.01的接种量接种24孔板中的BHK-21细胞或Vero细胞，37℃、5％CO2条件下静置1h，吸弃培养上清，补加含2％FBS的DMEM培养液，37℃、5％CO2条件下培养，接种后第24、48和72小时收取培养上清，用空斑滴定法测定病毒滴度(方法同实施例3，均采用BHK-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为PFU/mL，即每毫升上清液中的病毒含量)，绘制生长曲线。
生长曲线结果见图5。图5中，YF17D代表黄热减毒疫苗株YF17D，YF-IRES代表重组黄热病毒YF-IRES。在BHK-21细胞中，YF-IRES在24h时的病毒滴度与黄热减毒疫苗株YF17D相同，在48小时后，病毒滴度略低于疫苗株病毒。在Vero细胞中，YF-IRES能够有效复制，达到较高病毒滴度，病毒滴度在各个时间点均略低于疫苗株病毒。结果表明，重组病毒YF-IRES可在不同哺乳类细胞系中有效复制，在哺乳类动物细胞中复制效率略低于黄热减毒疫苗株。
实施例5
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES病毒的遗传稳定性。
将实施例1制备的重组黄热病毒YF-IRES种子液(第零代病毒液)进行如下检测：
1、将第零代病毒液以MOI＝0.01的接种量接种于单层BHK-21细胞，2d后收集细胞上清(第一代病毒液)，通过空斑试验测定病毒滴度。
2、将前一步骤得到的病毒上清以MOI＝0.01接种于单层BHK-21细胞，通过空斑试验测定病毒滴度。
重复进行9次步骤2，收集每一代的病毒上清，于-80℃冻存待用。
3、分别提取每代病毒上清的RNA，采用随机引物进行反转录，得到cDNA，以cDNA为模板，采用YF-382-F和YF-M-500-R组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。每代病毒上清的测序结果均一致，均如SEQ ID NO：4所示。结果表明，经BHK-21细胞传代后，YF-IRES具有基因的遗传稳定性。
4、取第零代病毒液、第四代病毒液和第八代病毒液，分别进行蚀斑大小测定(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)。测定结果的照片见图6。经过在BHK-21细胞上8代传代以后，重组黄热病毒YF-IRES的蚀斑大小无明显变化，且较为均一，表明该重组病毒具有很好的遗传稳定性。
实施例6
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES的神经毒力特征。
分别将实施例1制备的重组黄热病毒YF-IRES种子液和黄热减毒疫苗株YF17D种子液进行如下检测：
将两种病毒分别以1000PFU的剂量颅内接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，每种剂量接种8只小鼠，观察21天内的小鼠发病和死亡情况，接种15天后统计该剂量组小鼠的死亡率，绘制颅内接种小鼠生存曲线。结果见图7。图7中，YF17D代表黄热减毒疫苗株，YF-IRES代表重组黄热病毒YF-IRES。上述结果表明，重组黄热病毒YF-IRES的小鼠神经毒力低于黄热减毒疫苗株，具有明显的减毒特征。
实施例7
本实施例用来说明重组黄热病毒YF-IRES的免疫原性。
将实施例1制备的重组黄热病毒YF-IRES种子液进行如下检测：
实验组(6只)：重组黄热病毒YF-IRES腹部皮下接种4周龄BALB/c小鼠，每只小鼠接种剂量为105PFU。
实验组(7只)：黄热减毒疫苗株YF17D腹部皮下接种4周龄BALB/c小鼠，每只小鼠接种剂量为105PFU。
阴性对照组(5只)：将与实验组的重组黄热病毒YF-IRES等体积的PBS缓冲液接种4周龄BALB/c小鼠。
分别于免疫后第28d剪尾取血。于4℃静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。
1、免疫小鼠血清中的黄热病毒特异IgG抗体效价的测定
用PBS缓冲液将免疫血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280的稀释液，再通过酶联免疫吸附试验测定血清中的IgG抗体效价。酶联免疫吸附试验中的抗原为黄热减毒疫苗株。具体方法如下：将制备的黄热病毒种子液(105PFU/ml)用包被液按照1:200比例稀释，加入酶联免疫吸附实验96孔板中，每孔100μl，4℃过夜。移去包被液，PBS缓冲液(10mM K2HPO4，2mM KH2PO4，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)洗涤3次，加入稀释好的血清，置37℃作用60min；PBS缓冲液洗涤3次，加入PBS溶液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，置37℃作用60min，PBS缓冲液洗涤3次，加入100μl可溶性TMB底物，避光反应10min；加入2mol的H2SO4终止反应，在OD450吸光度下，读取结果。
IgG抗体滴度即抗体组OD值为PBS组的1.5倍时的稀释倍数。实验组小鼠的结果见图8。免疫28d后时，YF-IRES小鼠的IgG抗体效价可以达到1:12000。上述结果表明，用105PFU重组黄热病毒YF-IRES免疫小鼠后，可有效激发小鼠产生高水平且持久的黄热病毒特异的IgG抗体，YF-IRES具有良好的免疫原性。
从以上实施例可以看出，本发明方法获得的重组病毒可以用来有效预防黄热病毒感染。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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Claims (7)

1.一种DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有串联连接的5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列，其中，5’非编码区序列、衣壳蛋白的编码序列、膜蛋白前体的编码序列、包膜蛋白的编码序列、非结构蛋白的编码序列和3’非编码区序列来源于黄热病毒减毒株；
其中，所述内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述黄热病毒减毒株为黄热减毒疫苗株YF17D；
所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种制备权利要求1所述的DNA分子的方法，其特征在于，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组RNA对应的cDNA中第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子的内部核糖体进入位点序列对应的DNA序列。
3.含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.一种重组病毒，其特征在于，该重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列与权利要求1所述的DNA分子的序列相同。
5.一种制备权利要求4所述的重组病毒的方法，其特征在于，该方法包括在黄热病毒减毒株基因组的第421-422位核苷酸之间插入5’端连接有终止密码子序列的内部核糖体进入位点序列。
6.一种疫苗，其特征在于，该疫苗的活性成分为权利要求4所述的重组病毒。
7.权利要求1所述的DNA分子和/或权利要求4所述的重组病毒在制备用于预防黄热病毒感染的疫苗中的应用。
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