CN106854236B - 一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用 - Google Patents

一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用 Download PDF

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Abstract

一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的抑制病毒感染的多肽，能安全、高效的、便捷的抑制乙脑病毒或寨卡病毒的感染；通过表达载体连接表达多肽的目的基因在宿主菌种表达多肽，可以大量的快速的获得目的多肽；抑制病毒感染的药物的活性成分包含上述多肽，方便药物的推广使用，通过多肽制备抗体，可以避免感染的风险，提高实验的安全性；并且具有相同的效果；制备抗体能长期作用，避免多肽被降解或者分解，效果更显著，也更有利于保藏。

Description

一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，且特别涉及一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用。
背景技术
黄病毒属(Flavivirus)是黄病毒科(Flaviviridae)家族成员，包括70多种病毒，这些病毒分布广泛。经过蚊子叮咬传播的黄病毒(即蚊媒病毒)，例如黄热病毒(yellowfever virus,YFV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)1-4型、流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在所流行的区域引起人较高的发病率和死亡率。近年来的全球气候变化影响到黄病毒传播媒介的地理分布，以及病毒基因某些位点的突变使其适应新的传播媒介，因此黄病毒感染呈现出进一步蔓延的趋势。因此对于黄病毒的流行病学调查和预防控制显得尤为迫切。
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染人体引起流行性乙型脑炎，主要分布在亚洲，西太平洋国家，以及澳大利亚北部。乙型脑炎病毒是一种虫媒病毒，每年约有六万多感染病例报道，幸存者中的50％左右会有永久的神经后遗症例如记忆丧失、认知障碍、行为障碍、抽搐等。乙型脑炎病毒对人类的健康造成了严重的威胁，因此采取有效的措施防治疾病的发生十分必要。目前该病的治疗还是以预防为主，并没有有效的治疗药物，因此研制安全有效的抗病毒药物是治疗JEV的关键。
寨卡病毒(zika virus,ZIKV)最先在乌干达ZIKV森林一只发热的猴子体内分离，并以该森林的名字命名。该病毒自分离至2007年很少出现感染人的现象，最初该病的流行具有明显的区域限制，仅在非洲和东南亚地区流行。2015年该病毒入侵巴西，并通过埃及伊蚊传播，迅速在南美洲大规模流行，至今全球62个国家已出现ZIKV的流行。该病毒的传播流行与传染媒介活动区域和季节相一致，目前认为蚊子是ZIKV病毒最主要的传播媒介，因而夏季是ZIKV病毒暴发流行最为严重的季节。ZIKV病毒流行范围较广，已先后于非洲、亚洲和环太平洋地区暴发和流行。流行病学和血清学研究表明，只有大约20％的ZIKV感染者表现出临床症状，临床症状比较轻微并且通常自愈，表现为体温稍升高、关节疼、皮疹、结膜炎、头疼、肌肉疼。目前尚无有效的疫苗和药物能够用于ZIKV病毒感染的预防和治疗。
目前，针对治疗乙脑病毒感染和寨卡病毒感染的药物等都有效果不佳的问题，更没有同时专门针对乙脑病毒感染和寨卡病毒感染的药物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抑制病毒感染的多肽。
本发明的第二目的在于提供编码上述多肽的基因。
本发明的第三目的在于提供含有上述基因的表达载体。
本发明的第四目的在于提供含有上述基因的宿主菌。
本发明的第五目的在于提供上述的多肽在制备抑制病毒感染的药物中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种抑制病毒感染的药物。
本发明的第七目的在于提供上述的多肽在制备抑制病毒感染的抗体中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种抑制病毒感染的多肽，该多肽是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一种或多种；第一多肽的序列如SEQ ID No.1所示，第二多肽的序列如SEQ IDNo.2所示，第三多肽的序列如SEQ ID No.3所示，第四多肽的序列如SEQ ID No.4所示，第五多肽的序列如SEQ ID No.5所示。
编码上述多肽的基因。
含有上述基因的表达载体。
含有上述基因的宿主菌。
上的多肽在制备抑制病毒感染的药物中的应用。
一种抑制病毒感染的药物，该药物的活性成分为上述多肽。
上述的多肽在制备抑制病毒感染的抗体中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：一种抑制病毒感染的多肽，能安全、高效的、便捷的抑制乙脑病毒或寨卡病毒的感染；通过表达载体连接目的基因在宿主菌种表达目的蛋白，可以大量的快速的获得目的蛋白；抑制病毒感染的药物的活性成分包含上述多肽，方便药物的推广使用，通过多肽制备抗体，可以避免感染的风险，提高实验的安全性；并且具有相同的效果；制备抗体能长期作用，避免多肽被降解或者分解，效果更显著，也更有利于保藏。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的多肽毒性实验结果图；
图2为本发明实验例2提供的噬斑实验的结果图；
图3为本发明实验例3提供的western blot实验的结果图；
图4为本发明实验例4提供的qRT-PCR实验的结果图；
图5为本发明实验例5提供的噬斑实验的结果图；
图6为本发明实验例5提供的qRT-PCR实验的结果图；
图7为本发明实验例6提供的第五多肽体内抑制乙脑病毒的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
HindⅢ和BamHI内切酶及反应缓冲液购自TAKARA公司，T4连接酶及反应缓冲液购自TAKARA公司。
下面对本发明实施例的一种抑制病毒感染的多肽及应用进行具体说明。
包膜病毒通过病毒膜和宿主细胞膜的融合感染细胞，融合后释放病毒的基因组到细胞质中。黄病毒科病毒在受体介导的内吞作用下进入细胞，在内体中发生膜融合。膜融合的发生是由融合蛋白介导的。黄病毒科包膜蛋白envelope(E)蛋白在适当的条件诱导下，融合蛋白暴露并插入宿主细胞膜，E蛋白发生构象变化最终介导整个膜融合过程。根据膜融合蛋白结构的不同，可将其分为ClassI,ClassⅡ和ClassⅢ三种。而黄病毒科的E蛋白属于ClassⅡ型膜融合蛋白，富含β折叠。乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的E蛋白有三个结构域，黄病毒膜融合始于酸性pH引起E蛋白的二体发生解离，E蛋白向外翻转，暴露出融合肽并插入到内体膜中，之后形成E蛋白三体，其核心部位为：中心三聚体(core trimer)，结构域Ⅲ向三聚体中间体发生回折，与E蛋白顶端形成37°的夹角并且嵌入到两个相邻E蛋白单体形成的凹槽中，同时拉动茎区折向中间三聚体，最终导致与宿主细胞发生膜融合，茎区从结构域Ⅲ的羧基端开始，沿着结构域II像拉链一样嵌入中间体中，直到与融合肽重合。不同黄病毒的茎区氨基酸序列具有高度保守性。因此，茎区对膜融合时E蛋白三体的变构十分重要，拉动DⅢ发生回折，驱动膜融合。
常规的预防或治疗方法是用干扰素、预防疫苗或药物治疗。而干扰素的长期使用容易导致耐药性；疫苗的研制一般周期较长，需要进行有效性、安全性的评价，耗时比较长；对一些突发性的传染病的治疗就缺乏时效性；针对性治疗的药物的研发周期更长，耗时以及需要大量的资金，同样缺乏时效性。
本发明通过设计短的多肽，通过原核表达获得多肽片段，多肽片段能竞争性的结合到宿主细胞的靶位点，从而达到抑制乙脑病毒和寨卡病毒感染的效果。
一种抑制病毒感染的多肽，该多肽是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一种或多种；第一多肽的序列如SEQ ID No.1所示，第二多肽的序列如SEQ IDNo.2所示，第三多肽的序列如SEQ ID No.3所示，第四多肽的序列如SEQ ID No.4所示，第五多肽的序列如SEQ ID No.5所示。
以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的茎区序列为设计基础，用合成多肽竞争性阻止病毒E蛋白茎区回折与结构域II的结合，从而抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和寨卡病毒(zika virus,ZIKV)的感染。本发明还发现进一步研究发现第五多肽在体内能有效抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)感染，还能有效的抑制寨卡病毒(zika virus,ZIKV)的感染。
发明人巧妙的通过病毒自身能够与感染的宿主的细胞膜的相关接合位点发生识别的蛋白序列，该蛋白序列与病毒本身产生竞争性结合，挤占病毒的结合位点，使病毒无从结合，也就没有办法感染宿主，从而达到预防或治疗感染的目的。并且，蛋白序列没有感染或传染能力，并不会导致感染，所以是一种安全、有效、便捷的预防或治疗手段。
当然，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽等五条多肽既可以通过原核表达获得多肽序列，也可以通过人工合成来获得多肽。
编码上述多肽的基因。
由于蛋白合成的时候，存在密码子的简并性；所以编码同一条多肽的基因序列有可能会有很多条；真核生物或者病毒等基因做原核表达的时候，由于不同物种的基因表达，由于密码子的偏好性，容易导致部分转运RNA的耗尽，导致蛋白的翻译失败等，所以允许对基因序列的密码子优化。基于以上原因，同一条蛋白的序列确定的情况下，所以会有不同的编码基因，而且这些编码序列也是可以预见。
进一步地，上述基因含有SEQ ID No.6-10所示序列中的一种或多种；SEQ ID No.6所示的基因编码第一多肽，SEQ ID No.7所示的基因编码第二多肽，SEQ ID No.8所示的基因编码第三多肽，SEQ ID No.9所示的基因编码第四多肽，SEQ ID No.10所示的基因编码第五多肽。
含有上述基因的表达载体。
通过表达载体连接能表达上述多肽的基因序列，可以通过原核表达的方法，大量表达目的蛋白；通过大量表达目的蛋白，然后可以大规模的应用。上述表达载体可以是连接单一目的蛋白的编码基因的表达载体，也可以是一个表达载体连接同时连接两个或以上的目的蛋白的编码序列进行原核表达。
含有上述基因的宿主菌。
通过宿主菌，可以将目的蛋白大量表达。宿主菌通常是选用生长繁殖快，细胞周期短的菌类，通常选用大肠杆菌作为表达的宿主菌，比如BL21(DE3)、Rosetta等；当然，宿主菌也可以是其他类型的菌株。
上述的多肽在制备抑制病毒感染的药物中的应用。
上述多肽通过研究发现，该蛋白序列与病毒本身产生竞争性结合，挤占病毒的结合位点，使病毒无从结合，也就没有办法感染宿主，从而达到预防或治疗感染的目的。所以，在药物中应用也是可行的和安全的。
一种抑制病毒感染的药物，该药物的活性成分为上述的多肽。
进一步地，病毒是乙脑病毒和/或寨卡病毒。
多肽为是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中的一种或多种时，多肽都能抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)；尤其是多肽为第五多肽是还具有抑制寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的功能。
进一步地，药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释剂、控释剂或注射剂中的任意一种。
药物制成不同剂型，可以适用不同的人群、病症；也方便用药和给药。
上述的多肽在制备抑制病毒感染的抗体中的应用。
由于上述的多肽能与病毒竞争性抑制，说明多肽具有与病毒相似的识别位点和空间取向、空间结构；通过多肽制备抗体，就可以避免使用减毒的病毒用于制备抗体，可以避免感染的风险，提高实验的安全性；并且具有相同的效果；制备抗体能长期作用，避免多肽被降解或者分解，效果更显著，也更有利于保藏。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种抑制病毒感染的多肽，该多肽是第五多肽；第五多肽的序列如SEQ ID No.5所示，第五多肽的编码序列如SEQ ID No.10所示。
实施例2
本实施例提供一种抑制病毒感染的多肽，该多肽包括第一多肽、第二多肽；第一多肽的序列如SEQ ID No.1所示，第二多肽的序列如SEQ ID No.2所示；第一多肽的编码序列如SEQ ID No.6所示，第二多肽的编码序列如SEQ ID No.7所示。
实施例3
本实施例提供一种抑制病毒感染的多肽，该多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽，共五条多肽；第一多肽的序列如SEQ ID No.1所示，第二多肽的序列如SEQ ID No.2所示，第三多肽的序列如SEQ ID No.3所示，第四多肽的序列如SEQ IDNo.4所示，第五多肽的序列如SEQ ID No.5所示；第一多肽的编码序列如SEQ ID No.6所示，第二多肽的编码序列如SEQ ID No.7所示，第三多肽的编码序列如SEQ ID No.8所示，第四多肽的编码序列如SEQ ID No.9所示，第五多肽的编码序列如SEQ ID No.10所示。
实施例4
本实施例提供含有编码实施例1提供的第五多肽的表达载体和宿主菌。
本实施例中优选以pET-28a作为主要表达载体，当然也可以用其他的载体作为第五多肽的表达载体。
经过对第五多肽的编码基因的碱基序列以及结合pET-28a载体的多克隆位点的分析，选用多克隆位点HindⅢ和BamHI作为第五多肽的编码基因在pET-28a载体上插入位点。
第五多肽的表达载体的构建
1.1人工合成第五多肽的编码基因全长序列并在5’端加上BamHI，在3’端加上终止密码和HindⅢ酶切序列，命名为PP5，序列为：GGATCCGCCTGGGACTTTGGCTCCATTGGAGGGGTCTTCAACTCCATAGGAAAAGCCGTTCACCAAGTGTTTTGAAAGCTT；
1.2双酶切pET-28a载体质粒和PP5序列，酶切反应体系：HindⅢ和BamHI酶1μL，10×内切酶反应缓冲液5μL，pET-28a载体质粒/PP5序列15μL，ddH2O 28μL；
1.3琼脂糖凝胶电泳回收pET-28a载体质粒和PP5序列的双酶切片段；
1.4用T4连接酶连接回收的pET-28a载体质粒和PP5序列的双酶切片段，得到第五多肽的表达载体pET-28a-PP5载体质粒；连接反应体系：pET-28a片段2μL，PP5序列片段6μL，T4ligase buffer 2μL，T4ligase1μL，ddH2O 4μL；
1.5将pET-28a-PP5载体质粒转化宿主菌E.coli Rosetta大肠杆菌感受态细胞，得到表达第五多肽的宿主菌。
可以预见的，第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽参考上述方法，也可以得到相应的表达载体和宿主菌。
同样地，如果将第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中任意两条多肽或多条多肽的编码基因串联，或者第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或第五多肽中任意一条多肽的编码基因串联重复两次或两次以上，串联的基因然后参考上述表达载体的构建方法和转化宿主菌的方法，同样也可以得到相应的多肽串联表达载体和宿主菌。
实施例5
本实施例提供一种抑制病毒感染的药物，将实施例1提供的第五多肽应用于制备抑制乙脑病毒或寨卡病毒感染的药物中，能有效的抑制病毒的感染；当然，第五多肽也能同时的抑制乙脑病毒和寨卡病毒感染。
将药物制成注射剂的剂型，直接通过注射静脉给药，能快速的达到病灶，并发挥作用。
当然，第五多肽制成抑制病毒感染的药物的剂型还可以是片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释剂或控释剂中的任意一种。
实施例6
本实施例提供了实施例1提供的第五多肽在制备抑制病毒感染的抗体中的应用。
由于第五多肽能与乙脑病毒和寨卡病毒形成竞争性的抑制，与宿主的识别位点结合，说明第五多肽具有与病毒相似的识别位点和空间取向、空间结构；通过第五多肽制备的抗体，抗体能有效的识别第五多肽，抗体就能特异的识别出乙脑病毒和寨卡病毒，达到预防和抑制病毒感染的目的。
实验例1
本实验例提供细胞存活实验，验证第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽的毒性；本实验例通过MTT法检测细胞存活率，来验证多肽的毒性。第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽分别设定5个浓度，分别是10μM，1μM，100nM，10nM，1nM。
具体操作如下：
1.1将细胞铺到96孔板中，细胞密度为1.0×105个/mL；
1.2将梯度稀释的多肽(稀释在含2％FBS的DMEM培养基中加入到细胞中)，培养24小时；
1.3吸弃细胞上清，每孔加入25μL的MTT溶液(终浓度5mg/mL),并继续在37℃培养4小时；
1.4孵育完毕后，吸弃残余MTT溶液，并每孔加入50μL DMSO。
1.5在室温下充分溶液15分钟后，通过酶联免疫检测仪492nm波长检测每孔吸光度；
1.6计算各孔吸光度与对照组吸光度的比值，计算各个浓度下对细胞活性的影响；
细胞存活率(％)＝(实验组OD492/对照组OD492)×100％
结果如图1所示，可以看出，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽以及sP5多肽在10μM的情况下，对细胞均表现出一定的抑制情况，说明不是第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽本身毒性的影响，有可能是因为多肽的浓度高，影响渗透压等因素导致的细胞被抑制；当浓度进一步降低后，基本上第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽以及sP5多肽基本上未表现出细胞毒性，可以认为第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽是安全没有细胞毒性的。
实验例2
本实验例提供噬斑实验验证第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽体外抗乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的情况。
将乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)分别与不同浓度的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等五种多肽37℃孵育1h，然后感染细胞，24h之后进行噬斑减少实验。
具体的操作方法如下：
多肽抗病毒感染体外实验：在BHK-21上面检测多肽的抗病毒效果，将BHK-21细胞铺板于24孔板细胞中，每孔约8×104个细胞，具体步骤如下：
1.1按照感染复数为1(MOI＝1)用无血清的DMEM分别稀释乙脑病毒JEV；
1.2用稀释好的病毒液稀释五种多肽，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽均设置五个梯度，分别为10μM、1μM、100nM、10nM、1nM。五条多肽和病毒混合液37℃混合孵育1h；
1.3吸弃培养板上旧的培养基，用PBS洗一遍，并将不同浓度的病毒与多肽混合液加入到细胞板上，对照组设置为不加多肽但加入相同浓度的DMSO，感染等量的乙型脑炎病毒JEV；放在37℃培养箱中培养1h；
1.4吸弃多肽病毒混合液，用PBS洗一遍，加入10％的DMEM培养基；
1.5在感染细胞24h的时候，计算第一到第五多肽的半数有效浓度，在感染细胞24h之后收样。
噬斑减少实验检测多肽抗病毒实验：在多肽抗病毒感染实验培养24h之后，收集上清至离心管中，-80℃保存。仍用BHK-21细胞测滴度，步骤如下：
2.1准备96孔板，排枪，无血清DMEM，枪头；
2.2用排枪取180μL的无血清DMEM，取待测病毒样20μL到第一个180μL的孔里，200μL混匀，依次稀释做梯度；
2.3将铺好的BHK-21细胞取出，弃上清，加入不同滴度的病毒液，从低浓度向高浓度加；
2.4 37℃，CO2培养箱中孵育1h。PBS洗，洗完后加上甲基纤维上层覆盖物；
2.5三天后，弃甲基纤维上层覆盖物，加甲醛固定过夜。结晶紫染色15min。用水冲洗掉上层覆盖物，在烘箱里烘干。多肽抑制病毒感染的计算公式为：抑制率％＝[1-(样品噬斑数量/对照噬斑数量)]×100。
实验结果如图2所示，(图中：P1-P5分别代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的乱序多肽)，当乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)分别与不同浓度的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽混合后的噬斑实验可以看出；第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽均有抑制病毒感染的效果，而且随着多肽的浓度的升高，抑制效果明显加强；通过对比发现，第五多肽的抑制效果相对优于其余的多肽。
表1多肽半数有效浓度
多肽 半数有效浓度IC<sub>50</sub>(nM)
第一多肽 3790.71
第二多肽 94.10
第三多肽 58.07
第四多肽 7.66
第五多肽 3.93
通过计算第一多肽到第五多肽的半数有效浓度，其结果如表1所示，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽对乙脑病毒JEV的半数有效浓度IC50分别为3790.71nM、94.10nM、58.07nM、7.66nM和3.93nM；从表1中可以看出，除了第一多肽的半数有效浓度为3790.71nM，第一多肽的半数有效浓度的值较大；而第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的半数有效浓度均小于100nM，说明第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽在低浓度的条件下就能达到抑制乙脑病毒JEV的效果；尤其是第四多肽和第五多肽，在低于10nM浓度的条件下，就能达到效果，说明第四多肽和第五多肽抑制乙脑病毒JEV感染的效果最佳，是抑制乙脑病毒JEV感染的药物等的最佳选择。
实验例3
本实验例通过Western blot的方法检验第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽体外抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的情况。
由于乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)具有感染宿主细胞的能力；如果存在感染，会导致病毒的核酸进入宿主细胞表达出病毒的包膜蛋白；如果有第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽等多肽抑制剂的存在，病毒无法感染宿主，所以就不能坚持到目的条带。
Western blot实验的具体操作如下：
参考实验例2中收集的细胞样品的方法收集样品，然后进行样品处理，将样品定量并调整到统一的浓度。
1.1配制10％的SDS-PAGE凝胶；
1.2上样15μL并电泳，上样完成后，先60V电压电泳，再以120电压电泳；
1.3转膜，PVDF转移目的蛋白，0.35A稳流电泳2小时；
1.4 5％脱脂奶粉(TBST配制)封闭PVDF膜1小时；
1.5分别加第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽对应的一抗抗体(1:5000稀释)，4℃孵育12h，水平摇床低速摇动；然后用TBST洗膜，每次15分钟，洗三次；
1.6将对应的辣根过氧化物酶标记的二抗抗体(1:5000)，水平摇床低转速摇晃孵育2小时；用TBST洗膜，每次15分钟，洗三次；
1.7加入ECL发光液，并凝胶成像仪分析。
实验结果图3所示，(图中：P1-P5分别代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的乱序多肽)，从结果可以看出，相对于内参GAPDH，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中，除了第一多肽有一条较浅的条带，说明第一多肽的抑制效果不如其余多肽的效果；而且蛋白质印迹的结果也与实验例1中的半数有效浓度结果吻合，由于第一多肽的抑制效果不如其余多肽，导致微量的目的条带表达；其余多肽基本上都没有明显的目的条带；说明第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽有抑制乙脑病毒的能力，且第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽具有较好的抑制乙脑病毒JEV作用。
实验例4
本实施例通过qRT-PCR的方法验证细胞是否感染乙脑病毒，进一步验证第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽有抑制乙脑病毒的能力。
参考实验例2中1.1-1.5的实验操作方法进行实验并获得细胞样本。
用Trizolti法提取细胞中的DNA样本，进行qRT-PCR实验。
实验结果如图4所示，(图中：P1-P5分别代表第一多肽到第五多肽，sP5表示第五多肽的乱序多肽)，实验结果与噬斑实验和western blot实验的结果一致，基本吻合；在高浓度(10μM)的多肽存在的情况下，对乙脑病毒JEV的抑制效果最高；随着浓度的降低，抑制率也逐渐降低；第一多肽的抑制效果相对略低，而第五多肽的抑制效果最好。
实验例5
本实验例提供第五多肽体外抑制寨卡病毒ZIKV的实验。
本实验例通过噬斑实验和qRT-PCR实验验证第五多肽对寨卡病毒的抑制效果。
噬斑实验的操作方法参考实验例2。
qRT-PCR实验操作方法参考实验例4。
结果如图5和图6所示，(图中，JP5表示第五多肽)，从噬斑实验和qRT-PCR实验可以发现，第五多肽对寨卡病毒也表现出抑制的效果。
实验例6
本实验例提供验证第五多肽在体内抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)感染的能力。
第五多肽体内抑制乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染：将1μM的第五多肽和病毒(PFU为1×106、100μL的体积)在37℃孵育1h之后，腹腔注射到小鼠体内，每天称量体重以及观察临床症状。
具体操作如下：
4周龄BALB/c雌鼠分为三组，每组15只：PBS组(空白对照组)、JEV组(AT31株感染组)、JEV+P5组(感染治疗组)。制备感染小鼠样品。将第五多肽稀释在病毒液中，最终每只小鼠用腹腔注射的方法感染1×106PFU的AT31(体积100μl)，感染治疗组第五多肽的终浓度为1μM，感染组不加入多肽，但加入对应浓度的DMSO(浓度小于1％)。观察并记录小鼠临床表现与死亡数量。感染第7天收样，每组各6只取脑组织匀浆，各3只进行石蜡包埋。每组仍各留6只小鼠，每天称重并观察临床症状。
结果如图7所示，感染到5-9天左右，感染组明显有小鼠体重减轻、毛发零乱，精神不振、四肢僵硬，而治疗组小鼠体重减轻的个数和程度明显低于感染组(图7A)。感染至第10天，感染组小鼠死亡5只，死亡率高达83％，幸存的一只小鼠体重逐渐恢复并增长。而治疗组感染到第10天死亡2只，小鼠死亡的数量、死亡出现的时间明显少于或短于感染组，最终死亡率为33％(图7B)，两者差异显著(P<0.01)。感染7天之后取各组小鼠的脑组织匀浆测病毒滴度，在感染组出现噬斑，滴度约103PFU，而在治疗组的检测结果中没有噬斑的形成。实验结果说明第五多肽可缓解乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起的临床症状并降低死亡率。
综上所述，本发明实施例的提供的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽五条多肽能有效的抑制乙脑病毒的感染，而且第五多肽还有抑制在卡病毒的效果，在10μM的浓度条件下，效果较好；通过第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽能制备成相关的药物和抗体同样能有效的抑制病毒的感染。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种抑制病毒感染的多肽及其基因、药物及应用
<130> PA16031581SC
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> Flaviviridae
<400> 1
Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Flaviviridae
<400> 2
Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln
1 5 10 15
Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu
20 25
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> Flaviviridae
<400> 3
Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val
1 5 10 15
Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe
20 25 30
Arg Thr Leu
35
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Flaviviridae
<400> 4
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys
1 5 10 15
Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu
20 25
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> Flaviviridae
<400> 5
Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys
1 5 10 15
Ala Val His Gln Val Phe
20
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> Flaviviridae
<400> 6
agcacgctgg gcaaagcctt ttcaacaact ttgaagggag ctcagagact ggcagcgttg 60
ggtgacacag cctgggactt tggc 84
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<211> 75
<212> DNA
<213> Flaviviridae
<400> 7
ggctccattg gaggggtctt caactccata ggaaaagccg ttcaccaagt gtttggtggt 60
gccttcagaa cactc 75
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<211> 105
<212> DNA
<213> Flaviviridae
<400> 8
gcagcgttgg gtgacacagc ctgggacttt ggctccattg gaggggtctt caactccata 60
ggaaaagccg ttcaccaagt gtttggtggt gccttcagaa cactc 105
<210> 9
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<212> DNA
<213> Flaviviridae
<400> 9
gcctgggact ttggctccat tggaggggtc ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa 60
gtgtttggtg gtgccttcag aacactc 87
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> Flaviviridae
<400> 10
gcctgggact ttggctccat tggaggggtc ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa 60
gtgttt 66

Claims (9)

1.一种抑制病毒感染的多肽，其特征在于，所述多肽是第一多肽、第二多肽、第三多肽或第四多肽中的一种或多种；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.编码如权利要求1所述多肽的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因含有SEQ ID No.6-9所示序列中的一种或多种；SEQ ID No.6所示的基因编码所述第一多肽，SEQ ID No.7所示的基因编码所述第二多肽，SEQ ID No.8所示的基因编码所述第三多肽，SEQ ID No.9所示的基因编码所述第四多肽。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
6.如权利要求1所述的多肽在制备抑制病毒感染的药物中的应用。
7.一种抑制病毒感染的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为如权利要求1中的多肽。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述病毒是乙脑病毒。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释剂、控释剂或注射剂中的任意一种。
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Peptide Inhibitors of Dengue-Virus Entry Target a Late Stage Fusion Intermediate;Aaron G. Schmidt et al;《PLOS》;20100408;第6卷(第4期);摘要，第12549页左栏第1-3段，右栏第1-3段，第12550页右栏第1段-第12551页左栏第2段，图1 *
Peptide inhibitors of flavivirus entry derived from the E protein stem;Aaron G. Schmidt et al;《Journal of virology》;20101231;第84卷(第24期);摘要，第3页右栏第2段-第4页左栏第1段，图1-2 *

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