CN112048004B - 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒、其制备方法及应用，属于基因工程和生物医药技术领域。所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒，是由表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，培养至90％以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后所得。本发明还公开了上述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法及应用。本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒与野生病毒颗粒具有相似的外观结构及大小，免疫原性达到甚至超过了野生灭活病毒所具有的程度，可以用于制备柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗。

Description

一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒、其制备方法及应用，属于基因工程和生物医药技术领域。

背景技术

柯萨奇病毒B5型（Coxsackiecirus B5，简称CB5）属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是肠道病毒B组的重要成员。CB5是一个二十面体球形颗粒，直径为24-30nm，由一个非折叠衣壳和一个约7400个核苷酸的单链核糖核酸组成，且含有一个开放阅读框，其两侧分别是5′非翻译区和带有多聚A尾的3′非翻译区。它编码大约2100个氨基酸的多蛋白，该蛋白将被进一步切割形成三种前体蛋白，称为P1、P2和P3。P1裂解成4个结构病毒蛋白，分别为VP1、VP2、VP3和VP4。而P2和P3切割形成7种非结构蛋白，即由P2裂解成的2A、2B和2C，以及由P3裂解成的3A、3B、3C和3D。肠道病毒的病毒衣壳由60个单元的病毒结构蛋白组成；每个单元由VP1、VP2、VP3和VP4组成。外衣壳表面由VP1、VP2和VP3形成，而VP4位于衣壳内部。VP1包含能中和病毒的重要表位，具有抗原性，在病毒功能中起重要作用，且其基因型完全对应血清型。

CB5感染可导致一系列严重疾病及并发症，如手足口病（Hand Foot and MouthDisease,简称HFMD）、无菌性脑膜炎、病毒性脑炎、急性弛缓性麻痹、心肌炎、I型糖尿病以及疱疹性咽峡炎。近十年来，世界范围内已经发生许多与CB5相关的手足口病、无菌性脑膜炎和脑炎暴发，其临床特征包括急性发作、严重临床症状和高死亡率。CB5在多血清型手足口病流行中的发生率为0.7%-19.0%。近年来，在世界各地的手足口病疫情中发现，CB5的感染率和发病率逐年上升，且没有特异性药物和疫苗可用，也未见CB5相关疫苗研究。

肠道病毒一共有70多种血清型，目前国内只有EV71型单价灭活疫苗上市。EV71型单价灭活疫苗无法针对其他型肠道病毒产生交叉保护。肠道病毒灭活疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大缺陷：1、生产周期长：从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的疫情大爆发。2、生产条件高：为预防人为污染及病毒泄露扩散，整套生产必须按规定在严格的控制条件下进行，病毒灭活必须保证完全彻底。

病毒样颗粒（Virus-like particles，简称VLPs）是由病毒的主要结构蛋白和抗原蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，大小和形态与野生型病毒类似，不包含病毒核酸，无复制和感染能力，保持了野生型病毒抗原蛋白的天然构象，具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能。目前已有三种基于病毒样颗粒的人用疫苗被正式批准用于预防乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒和戊型肝炎病毒。但是，目前尚未有肠道病毒相关的病毒样颗粒疫苗上市。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒与野生病毒颗粒具有相似的外观结构及大小，免疫原性达到甚至超过了野生灭活病毒所具有的程度，可以用于制备柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒，是由表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9细胞感染病变后所得。

上述病变，指的是感染后的Sf9细胞变大变圆，细胞核肿大。

本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的有益效果是：

1、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒与野生柯萨奇病毒B5型病毒颗粒具有相似的外观结构及大小。

2、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫原性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

3、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫保护性为100%，而野生灭活病毒的免疫保护性为80%，因此本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫保护性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒的制备方法是：

将经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的3CD蛋白酶基因，与昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5连接，得到pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒；

然后将上述pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，获得表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒；

其中，所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述衣壳蛋白P1基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQID NO.4所示；3CD蛋白酶基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明的目的之二，是提供上述抗柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒

分别合成经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的3CD蛋白酶基因，然后分别连接到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及Ph启动子之后的BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切位点，得到pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒；

其中，所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤2：制备重组昆虫杆状病毒

取步骤1得到的pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒，与昆虫杆状病毒基因组flashBACDNA共同转染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集上清液；再感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，得到重组昆虫杆状病毒；

步骤3：制备和纯化病毒样颗粒

取步骤2得到的重组昆虫杆状病毒，感染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集上清液并对上清液进行纯化，即得到柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法的原理是：

本发明的步骤1中，昆虫杆状病毒穿梭载体pOET5，购于英国Oxford ExpressionTechnologies（OET）公司。

本发明的步骤2中，取步骤1得到的pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒，与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞，这样，衣壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因就可以整合到昆虫杆状病毒基因组内，并产生活的重组昆虫杆状病毒。再感染新的Sf9昆虫细胞,就可以获得扩大培养的、高滴度的活的重组昆虫杆状病毒。

昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA，可以市售购买，如可以购自英国OxfordExpression Technologies公司。

Sf9昆虫细胞，属于昆虫杆状病毒的有效宿主细胞，可以市售购买，如可以购自美国Invitrogen公司。

本发明的步骤2中，转染采用昆虫细胞转染试剂，上述昆虫细胞转染试剂可以市售购买，如可以购自美国Invitrogen公司，名称为CellfectinⅡ。

综上，本发明以昆虫杆状病毒——昆虫细胞表达系统为基础，构建出能同时表达柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组杆状病毒，利用柯萨奇病毒B5型自身蛋白酶酶切柯萨奇病毒B5型衣壳蛋白前体蛋白，重组构建出柯萨奇病毒B5型的空壳。该柯萨奇病毒B5型的空壳在细胞内组装完成之后可以释放到培养上清中。

本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法的有益效果是：

1、本发明的生产工序简便，制备得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒不含病毒的遗传物质，故无需进行灭活处理。

2、本发明可以通过摇瓶培养和感染Sf9昆虫细胞，从而可以大规模生产柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒，进而生产柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤2中，所述培养的温度为27℃，时间为4d-5d。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，经过培养后，大量重组昆虫杆状病毒将被释放入细胞培养液中。

进一步，步骤3中，所述重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞的感染复数MOI为5。

进一步，步骤3中，所述培养的温度为27℃，摇速为100转/min，时间为3d。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，经过培养后，可以得到表达P1结构蛋白和3CD蛋白酶，在宿主细胞内自动组装成柯萨奇病毒B5型病毒的空外壳，即柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒（CB5 VLPs）蛋白。

进一步，步骤3中，所述纯化的具体方法是：

步骤3.1：上清液浓缩

将上清液与质量百分浓度为20%的PEG8000、0.6M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000转/min离心30 min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用TEN缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述TEN缓冲液中含有0.01M Tris、0.01M EDTA和0.1M NaCl，pH值为7.6-8.0；

步骤3.2：蔗糖密度梯度超速离心

分别制备质量百分浓度为20%、30%及60%的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心60 min，收集位于20%与30%交界处，以及30%与60%交界处的乳白色物质，即为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

采用上述进一步的有益效果是：收集位于20%与30%交界处，以及30%与60%交界处的乳白色物质，其内含有纯化的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒（CB5 VLPs）蛋白。可以采用BCA（bicinchonininc acid）蛋白浓度测定法，测定纯化后柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒（CB5VLPs）蛋白的浓度，以便进行后续的免疫实验定量。

本发明的目的之三，是提供一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗。本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的疫苗，具有高度的特异性，能诱发宿主免疫系统产生特异性抗体，中和柯萨奇病毒B5型病毒的侵染，其保护效率高于野生柯萨奇病毒B5型灭活疫苗。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，由上述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒为活性成分或活性成分之一。

本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的有益效果是：

1、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的疫苗，具有高度的特异性，能诱发宿主免疫系统产生特异性抗体，产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能中和柯萨奇病毒B5型的侵染，其保护效率为100%。而野生柯萨奇病毒B5型灭活疫苗的保护效率为80%，因此，本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗与灭活野生柯萨奇病毒B5型灭活疫苗相比，可以提高20%的保护效率。

2、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，是一种不含核酸空心颗粒病毒，虽然具有与野生柯萨奇病毒B5型相似的外壳结构，却不能够自主进行复制，不具病毒活性，无传染力，因而非常安全和有效，且生产过程无需特殊环境（诸如生物安全水平2或水平3的车间）以防病毒外泄。

3、本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，生产周期短，完全适应于肠道病毒的快速多突变性特性，从分离出突变株的结构蛋白基因到疫苗产品只需6-8周时间。一旦重组昆虫杆状病毒合成后，柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的生产过程，只需1周左右。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的剂型为液体注射剂、注射粉剂和注射片剂中的任意一种或几种。

采用上述进一步的有益效果是：本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗可以制成多种剂型，用于满足不同的使用需求，更加方便。

进一步，所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自油佐剂、铝盐、水包油佐剂、油包水佐剂和水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

采用上述进一步的有益效果是：佐剂和柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒一起，可以制成本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗。

附图说明

图1为pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒图谱。

图2为pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒酶切鉴定图。其中，泳道M为

15000 bp分子量标准Marker；泳道1为pOET5；泳道2为pOET5-CB5-P1-3CD质粒；泳道3为pOET5-CB5-P1-3CD质粒经EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ同时酶切产物，产物包含3个条带，位于4590bp的条带为pOET5，位于2568bp的条带为柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因，位于1953bp的条带为柯萨奇病毒B5型的3CD蛋白酶基因。

图3为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的SDS-PAGE电泳检测图。其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为Grace昆虫培养基；泳道2为感染野生型杆状病毒的Sf9细胞对照；泳道3为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒；泳道4为浓缩纯化后的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。VP1和VP3是P1被3CD蛋白酶切割后的产物。

图4为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的Western blot检测结果图。其中，泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为感染野生型杆状病毒的Sf9细胞对照；泳道2为感染了重组杆状病毒的Sf9细胞裂解产物，包含了未释放的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒；泳道3为感染了重组杆状病毒的Sf9细胞培养上清液，包含了释放到上清中的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

图5为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的透射电镜照片，比例尺为200nm。

图6为柯萨奇病毒B5型野生灭活病毒的透射电镜照片，比例尺为200nm。

图7为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒或柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的小鼠在第2周、第4周、第6周和第12周时血清中总IgG抗体水平。其中，CB5 VLPs为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠，CB5灭活病毒为免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠。使用双尾t检验（Student′s-two-tailed t test）分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图8为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒或柯萨奇病毒B5型灭活病毒的小鼠第12周时血清中和抗体滴度。其中，CB5 VLPs为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠，CB5灭活病毒为免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠。使用双尾t检验（Student′s-two-tailed t test）分析数据,*p<0.05。

图9为50倍LD₅₀的柯萨奇病毒B5型颅内攻毒乳鼠后的生存率。其中，CB5 VLPs为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的ICR母鼠所产乳鼠，CB5灭活病毒为免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的ICR母鼠所产乳鼠，野生型杆状病毒为免疫了野生型杆状病毒的ICR母鼠所产乳鼠（阴性对照），PBS为免疫了PBS的ICR母鼠所产乳鼠（空白对照）。使用对数秩检验比较每个疫苗组与PBS对照组的生存曲线。每个疫苗组与PBS对照组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。

图10为50倍LD₅₀的柯萨奇病毒B5型颅内攻毒乳鼠后的临床评分。其中，CB5 VLPs为免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的ICR母鼠所产乳鼠，CB5灭活病毒为免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的ICR母鼠所产乳鼠，野生型杆状病毒为免疫了野生型杆状病毒的ICR母鼠所产乳鼠（阴性对照），PBS为免疫了PBS的ICR母鼠所产乳鼠（空白对照）。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒

分别合成经密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因，然后分别连接到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及Ph启动子之后的BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切位点，得到pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒，如图1所示。该质粒主要元件如下：p10 promotor为P10启动子，polyhedrin promotor为Ph启动子，AmpR为氨苄抗性基因，AmpR promotor为氨苄抗性基因启动子。

其中，所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述衣壳蛋白P1基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQID NO.4所示；3CD蛋白酶基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒酶切鉴定图，如图2所示。其中，泳道M为15000 bp分子量标准Marker；泳道1为pOET5；泳道2为pOET5-CB5-P1-3CD质粒；泳道3为pOET5-CB5-P1-3CD质粒经EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ同时酶切产物，产物包含3个条带，位于4590bp的条带为pOET5，位于2568bp的条带为柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因，位于1953bp的条带为柯萨奇病毒B5型的3CD蛋白酶基因。

步骤2：制备重组昆虫杆状病毒

取步骤1得到的pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒，与昆虫杆状病毒基因组flashBACDNA共同转染Sf9昆虫细胞，在27℃培养4d-5d后，至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集上清液；再感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，得到重组昆虫杆状病毒。

将上述得到的重组昆虫杆状病毒进行病毒滴度的测定，采用空斑计数法，具体是：将Sf9昆虫细胞铺盘后，用不同稀释浓度的重组昆虫杆状病毒感染Sf9昆虫细胞1h，弃去上清并用PBS清洗细胞2次，再盖上一层低熔点的琼脂糖凝胶（购于美国Sigma公司，SIGMA-A9414），于27℃培养箱中培养1周后，加入中性红染液（购于美国Sigma公司），继续培养过夜，第二天计数培养盘中的白色空斑。根据相应的稀释倍数，推算出活的重组昆虫杆状病毒的最终滴度为5.6×10⁷ pfu/ml。

步骤3：制备和纯化病毒样颗粒

取步骤2得到的重组昆虫杆状病毒，按感染复数MOI为5，感染Sf9昆虫细胞。具体而言，是在1 L摇瓶中，加入200 ml密度为2×10⁶/ml的Sf9细胞培养液。按每个细胞被5个病毒感染，以及活的重组昆虫杆状病毒的滴度，计算出所需的病毒量，加入到上述的1 L摇瓶中，侵染Sf9昆虫细胞。将摇瓶放入摇床内，于温度为27 ℃，摇速为100转/min，培养3d至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集细胞培养液，于温度为4℃，转速为7000转/min，离心30 min，保存离心的上清液，弃去细胞沉淀物。对上清液进行纯化，即得到柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。其中，所述纯化的具体方法是：

步骤3.1：上清液浓缩

将上清液与质量百分浓度为20%的PEG8000、0.6M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000 转/min离心30 min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用TEN缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述TEN缓冲液中含有0.01M Tris、0.01M EDTA和0.1M NaCl，pH值为7.6-8.0；

步骤3.2：蔗糖密度梯度超速离心

分别制备质量百分浓度为20%、30%及60%的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心60 min，收集位于20%与30%交界处，以及30%与60%交界处的乳白色物质，即为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的SDS-PAGE电泳检测图，如图3所示。泳道4检测到VP1和VP3条带。P1被3CD蛋白酶切割后的产物，为VP1、VP2、VP3和VP4。

柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的Western blot检测结果图，如图4所示。泳道2和3均检测到VP1和VP3条带。

柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的透射电镜照片，如图5所示,柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒直径约30nm。

柯萨奇病毒B5型野生灭活病毒的透射电镜照片，如图6所示,柯萨奇病毒B5型野生灭活病毒颗粒直径约30nm。

实施例2

本实施例提供一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗由50 μg/mL实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒与弗氏佐剂等体积混合为液体注射剂。

实验例1：动物免疫及其血清抗体测定和病毒中和反应

根据现行使用的肠道病毒动物免疫实验方式进行的。实验动物选用无特定病原体（Specefic pathogen Free,SPF）的6周龄BALB/c雌性小鼠。具体操作如下：第0周、第2周及第4周给每只BALB/c小鼠皮下注射弗氏佐剂乳化的0.3ml实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒（10µg总蛋白），以相同剂量的柯萨奇病毒B5型灭活病毒作为阳性对照，以PBS组为阴性对照，于第0周、第2周、第4周、第6周以及第12周对小鼠进行断尾采血，取血清进行ELISA实验和微量中和实验。

ELISA实验的步骤如下：用包被缓冲液（即pH值为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液）将纯化的柯萨奇病毒B5型灭活病毒稀释至1 μg/ml，96孔板中每孔加入100 μl，4℃包被过夜。洗涤：次日用1×PBST（含0.1% Tween-20）洗涤3次。每孔200 μl，每次1 min;封闭：用1% BSA封闭液封闭，每孔200 μl，37℃封闭1 h；洗涤：1×PBST洗涤3次，每孔200 μl，每次1 min;一抗孵育：加入用稀释液（0.1% BSA）梯度稀释待检血清后，每个稀释度100 μl加入上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1 h（同时做空白、阴性及阳性孔对照）；洗涤：用1×PBST洗涤3次，每孔200 μl，每次1 min；二抗孵育：加入用稀释液（0.1% BSA）按体积比1∶5000倍稀释的酶标二抗HRP-羊抗小鼠鼠IgG 100 μl，37℃孵育1 h；洗涤：用1×PBST洗涤3次，每孔200 μl，每次1 min；显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物显色液100 μl，37℃反应10-20min；终止：于各反应孔中加入1 mol/L硫酸50 μl以终止反应；读值：终止反应后马上在酶标仪上于450 nm读板。

微量中和实验的步骤如下：待检血清56 ℃灭活30 min；柯萨奇病毒B5型分离株稀释：根据CB5分离株滴度，将病毒稀释成每25 μl含100TCID50病毒量，稀释液为细胞维持液；血清实验板：向96孔板中每孔加入25 μl DMEM培养基，向第一孔中加入被检血清，混匀吸出25 μl至第二孔，以此类推按照2倍倍比稀释，稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256，每稀释度设2孔；向每孔中加入100 TCID50/25 μl柯萨奇病毒B5型悬液，轻轻混匀；设置阴性血清对照孔、细胞对照孔。阴性血清对照孔稀释方法同步骤3）；在每个细胞对照孔中加入50 μl细胞维持液，细胞对照设4孔；设置病毒回滴对照：96孔板中每孔加入25 μl细胞维持液，再加入CB5 100 TCID50/25 μl、10 TCID50/25 μl、1 TCID50/25 μl和0.1 TCID50/25 μl，每个稀释度设8孔；将血清实验板、血清对照、细胞对照和病毒回滴对照置于5% CO₂37℃培养箱中和3 h，期间每隔0.5h取出96孔板混匀，以确保被检血清与病毒充分反应。制备细胞悬液：覆盖95%

25 cm²培养瓶的单层细胞消化后加入细胞生长液，进行细胞计数，稀释细胞悬液密度为1.0×10⁵个/ml。中和3 h后，向96孔板各孔加入细胞悬液

100 μl，轻轻晃动混匀，置于5% CO₂、37 ℃培养箱培养；每天观察记录，当100TCID50/25 μl病毒对照孔出现完全CPE时，判断结果，以不产生CPE的最高血清稀释度的倒数作为待测血清的CB5中和抗体效价。细胞对照孔细胞生长良好，血清对照孔无毒性反应，病毒回滴对照在

32-320 TCID50/25 μl范围内的实验结果视为有效。

免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠或免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠，在第2周、第4周、第6周和第12周时血清中总IgG抗体水平，如图7所示。图7可知，第2周免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠和免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠的IgG抗体平均对数值分别为4.2和4.4，第4周免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠和免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠的IgG抗体平均对数值分别为5.6和5.1，第6周免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠和免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠的IgG抗体平均对数值分别为6.4和5.7，第12周免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的BALB/c小鼠和免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的BALB/c小鼠的IgG抗体平均对数值分别为6.0和5.4。因此，本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫原性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒或柯萨奇病毒B5型灭活病毒的小鼠第12周时血清中和抗体滴度，如图8所示。图8可知，第12周时CB5 VLPs和CB5灭活病毒平均中和抗体滴度为160和128。因此，本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的体外中和保护效率超过了野生灭活病毒所具有的程度。

实验例2：实验小鼠病毒攻毒实验

根据现行使用的肠道病毒动物免疫实验及攻毒保护实验方式进行的。免疫接种选用SPF级别的六周龄ICR母鼠，分别对每只小鼠以10 µg/0.1 ml的剂量进行皮下接种实施例2得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，以相同剂量的柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗为阳性对照，PBS组为阴性对照，第0周、第2周及第4周分别免疫一次。于第3周使母鼠交配，第6-7周时分娩，每只母鼠生产约10只乳鼠。

乳鼠的攻毒保护实验：以10只1日龄乳鼠为一组；各组分别以50倍半数致死剂量（LD₅₀）的柯萨奇病毒B5型鼠适应株颅内感染，阳性对照组和阴性对照组分别接受与实验组相同剂量的柯萨奇病毒B5型鼠适应株和PBS颅内感染。

存活率评价：50倍LD₅₀的柯萨奇病毒B5型颅内攻毒乳鼠后的生存率，如图9所示。由图9可知，第15d时，免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的ICR母鼠所产乳鼠、免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的ICR母鼠所产乳鼠、野生型杆状病毒和PBS各实验组小鼠存活率分别为100%、80%、0%和0%。因此，本发明实施例2的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的免疫保护性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

临床症状评价：每天记录乳鼠存活率以及临床症状，持续15天；乳鼠临床症状评分标准如下：0，健康；1，嗜睡和活动减少；2，消瘦；3，肢体无力；4，后肢瘫痪；5，死亡。

50倍LD₅₀的柯萨奇病毒B5型颅内攻毒乳鼠后的临床评分，如图10所示。第15d时，免疫了柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的ICR母鼠所产乳鼠、免疫了柯萨奇病毒B5型灭活病毒疫苗的ICR母鼠所产乳鼠、野生型杆状病毒和PBS各实验组小鼠临床平均评分为0、1、5和5。因此，本发明的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒可以完全阻止柯萨奇病毒B5型攻击后不良临床病症的产生。

总结：

1、本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒与野生柯萨奇病毒B5型病毒颗粒具有相似的外观结构及大小。

2、本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫原性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

3、本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫保护性为100%，而野生灭活病毒的免疫保护性为80%，因此本发明实施例1得到的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的免疫保护性超过了野生灭活病毒所具有的程度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 桂林医学院

<120> 一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒、其制备方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcgctc aggtgtccac tcagaagacc ggtgcccacg aaactggtct gagcgcctcc 60

ggcaactcca tcatccacta cactaacatc aactactaca aggacgctgc ttccaactcc 120

gctaaccgtc aggacttcac ccaggaccct ggtaaattca ccgagcccgt caaggacatc 180

atgatcaaga gcatgcccgc cctgaactcc ccttccgccg aagagtgcgg ttactccgac 240

cgtgtgcgct ccatcactct gggtaactcc accatcacta cccaggagtg cgccaacgtc 300

gtcgtgggtt acggcgtctg gcctagctac ctgaaggacg acgaggctac cgctgaagac 360

cagcctaccc agcctgacgt cgctacctgc cgcttctaca ccctggagag cgtcatgtgg 420

cagcagtcct cccccggttg gtggtggaag ttccctgacg ctctgagcaa catgggtctg 480

ttcggtcaga acatgcagta ccactacctg ggtcgcgctg gttacaccgt gcacgtccag 540

tgcaacgcta gcaagttcca ccagggctgc ctgctggtgg tgtgcgtccc tgaagccgaa 600

atgggctgcg ccactctggc taacaagcct gaccagaaga gcctgtccaa cggtgagacc 660

gccaacatgt tcgagtccca gaacagcacc ggtcagactg ctgtgcaggc taacgtgatc 720

aacgccggta tgggtgtggg tgtgggtaac ctgaccatct tcccccacca gtggatcaac 780

ctgcgtacta acaactccgc caccatcgtc atgccctaca tcaacagcgt gcctatggac 840

aacatgttcc gccacaacaa cttcactctg atgatcatcc ctttcgctcc cctgtcctac 900

agcactggtg ccactaccta cgtgcccatc accgtcaccg tggctcctat gtgcgccgaa 960

tacaacggcc tgcgtctggc tggtaaacag ggcctgccta ccatgctgac ccctggttcc 1020

aaccagttcc tgacttccga cgacttccag tccccttccg ctatgcctca gttcgacgtc 1080

acccctgaga tggacatccc tggccaggtg aacaacctga tggaaatcgc tgaggtcgac 1140

agcgtcgtgc ccgtgaacaa caccgaaggc cgcgtcctgt ccatcgagag ctaccagatc 1200

cctgtgcagt ccaactccac taacggtagc caggtcttcg gtttccccct gatgcctggc 1260

gcctcctccg tgctgaaccg tactctgctg ggcgaggtcc tgaactacta cacccactgg 1320

agcggctcca tcaagctgac cttcatgttc tgcggctccg ctatggctac cggcaagttc 1380

ctgctggctt acagcccccc tggcgctggc gctcctacca ctaggaagga agccatgctg 1440

ggcactcacg tcatctggga cgtcggtctg cagtcctcct gcgtcctgtg catcccttgg 1500

atcagccaga cccactaccg ctacgtggtg gtggacgagt acactgctgg cggctacatc 1560

acctgctggt accagaccaa catcgtcgtc cccgctgaca ctcagtccga ctgcaagatc 1620

ctgtgcttcg tctccgcttg caacgacttc tccgtgcgta tgctgaagga cacccctttc 1680

atcaagcagg acaacttcta ccagggtccc accggtgaag ccgtggaacg tgctatcgcc 1740

cgtgtcgctg acaccatcgg tagcggccct gtcaactccg aaagcatccc tgctctgacc 1800

gctgctgaaa ccggccacac tagccaggtc gtccccgccg acactatgca gactcgtcac 1860

gtcaagaact accactcccg ttccgagagc accgtcgaaa acttcctgtg ccgttccgct 1920

tgcgtgttct acactactta ccgtaaccac ggcaccgacg gtgacaactt cggctactgg 1980

gtcattaaca cccgccaggt cgctcagctg cgtcgtaagc tggagatgtt cacttacgcc 2040

cgcttcgacc tggagctgac tttcgtcatc accagcaccc aggagcagag cactatccag 2100

ggccaggact cccccgtcct gactcaccag atcatgtacg tccctcccgg tggtcccgtg 2160

cctactaagg tgaacagcta ctcctggcag acctccacca acccctccgt cttctggacc 2220

gaaggcagcg ctcctcctcg catgtccatc cccttcatca gcatcggtaa cgcctacagc 2280

atgttctacg acggttgggc caagttcgac aagcagggta cctacggtat caacaccctg 2340

aacaacatgg gcactctgta catgcgccac gtcaacgacg gttcccccgg ccctatcgtc 2400

tccaccgtgc gtatctactt caagcccaag cacgtgaaga cctgggtgcc ccgcccccct 2460

aggctgtgtc agtaccagaa ggccggcaac gtgaacttcg aacccactgg cgtcactgag 2520

tcccgcactg acatcaccac catgcagacc acctaa 2556

<210> 2

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcccag ccttcgagtt cgctgtggct atgatgaagc gcaactccag cactgtgaag 60

actgagtacg gtgagttcac catgctgggt atctacgacc gttgggccgt cctgccccgc 120

cacgctaagc caggtcctac tatcctgatg aacgaccagg aagtgggcgt gctggacgct 180

aaggagctgg tggacaagga cggcaccaac ctggaactga ctctgctgaa gctgaaccgc 240

aacgagaagt tccgtgacat ccgtggcttc ctggctaagg aggaggtgga ggtcaacgaa 300

gccgtgctgg ccatcaacac cagcaagttc cctaacatgt acatccctgt cggtcaggtg 360

actgactacg gcttcctgaa cctgggcggt acccccacta agcgcatgct gatgtacaac 420

ttccctaccc gcgctggcca gtgcggtggc gttctgatgt gcactggtaa agtcctgggc 480

atccacgtcg gcggcaacgg tcaccagggc ttctccgccg ctctgctgaa gcactacttc 540

aacgacgagc agggcgaaat cgagtttatt gagaactcca aggacgccgg tttccccgtg 600

atcaacactc cttccaagac caagctggag ccctccgtgt tccaccaggt gttcgagggt 660

aacaaggaac ctgctgtcct gcgcaacggt gacccccgcc tgaaggctaa cttcgaggag 720

gccatcttct ccaagtacat cggtaacgtc aacacccacg tggacgaata catgctggaa 780

gctgtcgacc actacgccgg tcagctggcc accctggaca tcaacactga gcctatgaag 840

ctggaggacg ctgtctacgg cactgaaggt ctggaggccc tggacctgac tacctccgcc 900

ggttacccct acgtcgccct gggcatcaag aagcgtgaca tcctgagcaa gaagactaag 960

gacctgacca agctgaagga gtgcatggac aagtacggtc tgaacctgcc catggtgact 1020

tacgtgaagg acgaactgcg ttccgccgag aaggtcgcta agggcaagtc ccgtctgatc 1080

gaggccagca gcctgaacga ctccgtcgcc atgcgccaga ccttcggcaa cctgtacaag 1140

accttccacc tgaaccctgg tatcgtcact ggttccgccg tgggctgcga ccccgacttg 1200

ttctggagca agatccctgt catgctggac ggccacctga tcgctttcga ctacagcggt 1260

tacgacgctt ccctgagccc tgtctggttc gcttgcctga agctgctgct ggaaaagctg 1320

ggttacagcc acaaggagac caactacatc gactacctgt gcaacagcca ccacctgtac 1380

cgcgacaagc actactttgt gcgcggtggt atgcccagcg gctgcagcgg taccagcatc 1440

ttcaactcca tgatcaacaa catcatcatc cgcaccctga tgctgaaggt ctacaagggt 1500

atcgacctgg accagttccg tatgatcgcc tacggcgacg acgtgatcgc tagctaccct 1560

tggcctatcg acgcctccct gctggccgaa gccggtaaag gctacggcct gatcatgacc 1620

cctgctgaca agggtgaatg cttcaacgaa gtcacttggg ccaacgtcac tttcctgaag 1680

cgttacttcc gcgccgacga acagtacccc ttcctggtgc accccgtcat gcctatgaag 1740

gacatccacg agagcatccg ttggactaag gacgctaaga acacccagga ccacgtgcgc 1800

tccctgtgcc tgctggcttg gcacaacggc gaacacgagt acgaagagtt catccgccgt 1860

atccgtagcg tccccgtggg ccgttgcctg accctgcctg ctttctccac tctgcgccgt 1920

aagtggctgg actccttcta a 1941

<210> 3

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggagctc aagtatcaac acagaagact ggtgcacacg aaaccggttt gagtgctagt 60

ggtaactcca tcatccacta tacaaatata aattattata aggatgccgc ctcaaactca 120

gcaaatagac aggacttcac tcaagatcca gggaagttta cagaacctgt gaaggacatt 180

atgatcaagt cgatgcctgc tctcaactct ccgtcagcag aggagtgtgg ttacagtgat 240

agggtaaggt ccatcacctt gggtaattca actataacaa cacaggagtg tgcaaacgtg 300

gttgtaggat atggagtgtg gccctcctac ttaaaggatg atgaagcaac agcagaagac 360

caacccacac aaccagacgt ggctacgtgc aggttttaca cgcttgaatc cgtaatgtgg 420

caacagagct cgcctgggtg gtggtggaaa ttccctgacg cactatctaa catgggcttg 480

ttcggacaaa acatgcagta ccattacctt ggaagggctg gatacacggt gcatgtacag 540

tgcaacgcat ctaaatttca tcaggggtgt ttattggtag tatgtgtgcc agaggcggaa 600

atggggtgcg ccacgttagc caataaacct gaccagaaga gcctgagcaa cggggagacc 660

gccaacatgt ttgaatccca aaactcgaca gggcagacag cggtccaggc caacgtgatt 720

aatgctggca tgggtgttgg agtcggcaat ctgaccatat tcccgcatca gtggatcaac 780

ctgcgcacta acaatagtgc gacgattgtc atgccgtaca tcaatagtgt gcccatggat 840

aacatgttta ggcacaataa cttcaccctc atgatcatcc cgtttgcccc gctgagttat 900

agtacaggtg ctaccacata cgtgccaatt acagtgacag tggctccgat gtgtgctgaa 960

tacaatgggt tgcgcttggc cggcaagcag ggcctaccca cgatgttaac acctggtagt 1020

aaccagtttc tcacatctga tgatttccaa tctccctcag ctatgccaca gtttgatgtt 1080

acccccgaaa tggatatccc agggcaggtc aacaacttga tggaaattgc agaggtggac 1140

tccgtggtac ccgttaataa cactgaaggg agagtgttgt ccattgagtc ataccagatc 1200

cctgttcagt caaattcaac aaacggttcc caggtttttg ggtttccact gatgccagga 1260

gctagcagtg tgttgaacag gacactgttg ggggaagtat taaactacta cacccactgg 1320

tcgggcagca tcaagttgac attcatgttc tgtgggtcag caatggcaac gggtaaattc 1380

ctgctggcgt attcaccacc aggcgctggc gcaccaacta cacgcaagga ggcaatgctg 1440

ggcactcatg tgatctggga tgtgggactg cagtcgagct gcgtgttgtg cattccatgg 1500

atcagtcaaa cacactatag atatgtggtt gtggatgaat acacagctgg tgggtatata 1560

acatgttggt accagacgaa tattgtggtg cctgcggaca cccaaagtga ttgcaagatc 1620

ttgtgttttg tgtcagcttg caacgatttc tctgtcagaa tgctcaagga tacgcccttt 1680

ataaagcaag ataacttcta ccaagggccc acaggtgagg cggtggaaag ggccattgca 1740

cgcgtcgctg acaccattgg gagcggtcca gtcaactcag agtctattcc agccttgacc 1800

gccgcagaaa cgggacatac gtcacaggtg gtaccagcag acacaatgca aaccagacac 1860

gtaaaaaact atcattcaag atcagagtca acggtggaga acttcctgtg taggtcagca 1920

tgcgtctttt acaccacata cagaaatcat ggtactgatg gtgacaactt tggttattgg 1980

gtgatcaaca cgcgccaggt ggctcaacta cggcgtaagc ttgagatgtt tacatatgca 2040

agatttgatc tcgagctaac ctttgtgatc acgagcactc aagaacagtc caccatacaa 2100

ggccaggatt caccagtgct cacacatcaa atcatgtatg tgcccccagg tggcccagtg 2160

cccacgaaag tgaatagcta cagctggcag acatccacca accctagcgt gttctggaca 2220

gaagggagtg caccaccccg catgtcaata ccgtttatca gcataggtaa tgcatatagt 2280

atgttctatg atgggtgggc gaagtttgac aagcaaggaa catatggtat aaacacatta 2340

aataacatgg ggacactgta catgagacac gtgaatgatg gcagtcccgg cccaattgtg 2400

agtaccgtac gcatatattt caaaccaaag catgttaaga catgggtccc aaggccaccc 2460

agattatgtc agtaccagaa ggcaggcaac gtgaattttg aacctactgg tgtgaccgag 2520

agtaggacag atataacaac tatgcagacc acctaa 2556

<210> 4

<211> 851

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Ile His Tyr Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Ser Ala Asn Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Gly Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Ile Met Ile Lys Ser

50 55 60

Met Pro Ala Leu Asn Ser Pro Ser Ala Glu Glu Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Arg Ser Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Cys Ala Asn Val Val Val Gly Tyr Gly Val Trp Pro Ser Tyr Leu Lys

100 105 110

Asp Asp Glu Ala Thr Ala Glu Asp Gln Pro Thr Gln Pro Asp Val Ala

115 120 125

Thr Cys Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Met Trp Gln Gln Ser Ser

130 135 140

Pro Gly Trp Trp Trp Lys Phe Pro Asp Ala Leu Ser Asn Met Gly Leu

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Met Gln Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ala Gly Tyr Thr

165 170 175

Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Cys Leu Leu

180 185 190

Val Val Cys Val Pro Glu Ala Glu Met Gly Cys Ala Thr Leu Ala Asn

195 200 205

Lys Pro Asp Gln Lys Ser Leu Ser Asn Gly Glu Thr Ala Asn Met Phe

210 215 220

Glu Ser Gln Asn Ser Thr Gly Gln Thr Ala Val Gln Ala Asn Val Ile

225 230 235 240

Asn Ala Gly Met Gly Val Gly Val Gly Asn Leu Thr Ile Phe Pro His

245 250 255

Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Met Pro

260 265 270

Tyr Ile Asn Ser Val Pro Met Asp Asn Met Phe Arg His Asn Asn Phe

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ile Pro Phe Ala Pro Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala

290 295 300

Thr Thr Tyr Val Pro Ile Thr Val Thr Val Ala Pro Met Cys Ala Glu

305 310 315 320

Tyr Asn Gly Leu Arg Leu Ala Gly Lys Gln Gly Leu Pro Thr Met Leu

325 330 335

Thr Pro Gly Ser Asn Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro

340 345 350

Ser Ala Met Pro Gln Phe Asp Val Thr Pro Glu Met Asp Ile Pro Gly

355 360 365

Gln Val Asn Asn Leu Met Glu Ile Ala Glu Val Asp Ser Val Val Pro

370 375 380

Val Asn Asn Thr Glu Gly Arg Val Leu Ser Ile Glu Ser Tyr Gln Ile

385 390 395 400

Pro Val Gln Ser Asn Ser Thr Asn Gly Ser Gln Val Phe Gly Phe Pro

405 410 415

Leu Met Pro Gly Ala Ser Ser Val Leu Asn Arg Thr Leu Leu Gly Glu

420 425 430

Val Leu Asn Tyr Tyr Thr His Trp Ser Gly Ser Ile Lys Leu Thr Phe

435 440 445

Met Phe Cys Gly Ser Ala Met Ala Thr Gly Lys Phe Leu Leu Ala Tyr

450 455 460

Ser Pro Pro Gly Ala Gly Ala Pro Thr Thr Arg Lys Glu Ala Met Leu

465 470 475 480

Gly Thr His Val Ile Trp Asp Val Gly Leu Gln Ser Ser Cys Val Leu

485 490 495

Cys Ile Pro Trp Ile Ser Gln Thr His Tyr Arg Tyr Val Val Val Asp

500 505 510

Glu Tyr Thr Ala Gly Gly Tyr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Thr Asn Ile

515 520 525

Val Val Pro Ala Asp Thr Gln Ser Asp Cys Lys Ile Leu Cys Phe Val

530 535 540

Ser Ala Cys Asn Asp Phe Ser Val Arg Met Leu Lys Asp Thr Pro Phe

545 550 555 560

Ile Lys Gln Asp Asn Phe Tyr Gln Gly Pro Thr Gly Glu Ala Val Glu

565 570 575

Arg Ala Ile Ala Arg Val Ala Asp Thr Ile Gly Ser Gly Pro Val Asn

580 585 590

Ser Glu Ser Ile Pro Ala Leu Thr Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser

595 600 605

Gln Val Val Pro Ala Asp Thr Met Gln Thr Arg His Val Lys Asn Tyr

610 615 620

His Ser Arg Ser Glu Ser Thr Val Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala

625 630 635 640

Cys Val Phe Tyr Thr Thr Tyr Arg Asn His Gly Thr Asp Gly Asp Asn

645 650 655

Phe Gly Tyr Trp Val Ile Asn Thr Arg Gln Val Ala Gln Leu Arg Arg

660 665 670

Lys Leu Glu Met Phe Thr Tyr Ala Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe

675 680 685

Val Ile Thr Ser Thr Gln Glu Gln Ser Thr Ile Gln Gly Gln Asp Ser

690 695 700

Pro Val Leu Thr His Gln Ile Met Tyr Val Pro Pro Gly Gly Pro Val

705 710 715 720

Pro Thr Lys Val Asn Ser Tyr Ser Trp Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser

725 730 735

Val Phe Trp Thr Glu Gly Ser Ala Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe

740 745 750

Ile Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Ser Met Phe Tyr Asp Gly Trp Ala Lys

755 760 765

Phe Asp Lys Gln Gly Thr Tyr Gly Ile Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly

770 775 780

Thr Leu Tyr Met Arg His Val Asn Asp Gly Ser Pro Gly Pro Ile Val

785 790 795 800

Ser Thr Val Arg Ile Tyr Phe Lys Pro Lys His Val Lys Thr Trp Val

805 810 815

Pro Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln Tyr Gln Lys Ala Gly Asn Val Asn

820 825 830

Phe Glu Pro Thr Gly Val Thr Glu Ser Arg Thr Asp Ile Thr Thr Met

835 840 845

Gln Thr Thr

850

<210> 5

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggtcccg cttttgaatt tgccgtagct atgatgaaga ggaattctag cacggtaaaa 60

acagaatatg gtgaattcac catgctgggc atctatgata gatgggctgt cctcccgcgc 120

cacgccaaac ccggaccaac tattctcatg aacgatcaag aagttggcgt gttggacgca 180

aaagagctgg tggataagga tggcacaaac cttgaactta cattgttgaa actcaatcgg 240

aatgagaaat ttagagacat cagggggttt cttgccaagg aggaagtgga agtcaatgaa 300

gctgttttgg caataaatac tagcaaattt ccaaatatgt acatccctgt ggggcaagtc 360

acagattatg gttttctgaa tctgggtggc acccccacga agagaatgct tatgtacaac 420

ttcccaacta gggcgggcca gtgtggtggt gtcctcatgt gtaccggcaa agtgctgggg 480

atacatgttg gtggaaacgg ccaccagggc ttctctgctg cactcctcaa gcattacttt 540

aatgatgagc aaggtgagat tgaatttata gaaaattcaa aagatgcagg gttcccagtc 600

atcaacacac cgagcaagac caaactggaa ccaagcgttt tccaccaagt ctttgagggt 660

aacaaggaac cagcagttct cagaaatggt gacccacgcc tcaaagccaa ttttgaggag 720

gctattttct caaagtacat tggaaatgtt aacacgcatg tggatgagta catgctagag 780

gcagtggacc attatgcagg gcaactggcc accctagaca tcaacactga acccatgaaa 840

ctagaggatg ctgtgtatgg caccgaaggg ttagaggctc tcgacttgac aacaagtgcg 900

ggataccctt acgttgcatt gggcatcaag aagagagaca tactgtcaaa aaagactaaa 960

gacttgacca agctgaaaga gtgtatggac aaatatggac taaacctgcc aatggtgaca 1020

tatgtaaaag atgaactcag atcagcggaa aaggtggcca aggggaaatc taggcttatt 1080

gaggcatcta gcctgaatga ttctgtagca atgaggcaaa catttggaaa cctatataag 1140

acatttcacc taaaccctgg aatagtgaca ggcagcgcgg ttgggtgtga tcccgatctt 1200

ttctggagta aaatacctgt aatgctggac ggacatctca tagcctttga ttactccgga 1260

tacgacgcta gtctgagccc tgtatggttc gcctgtttga agctgttgct tgagaaactt 1320

gggtactcgc acaaggagac aaactacatc gattacttat gcaactcgca ccacctgtac 1380

agggacaaac actactttgt gcgcggtggt atgccctcag ggtgttccgg caccagcatt 1440

ttcaattcaa tgatcaacaa cattataatt agaacactaa tgctgaaggt gtacaaaggt 1500

attgatttgg atcaattcag gatgattgca tatggtgacg atgtaattgc ctcgtacccg 1560

tggcccattg acgcatcact gcttgctgag gcaggcaaag gttatggatt gatcatgaca 1620

ccagcagata agggagagtg ctttaatgag gtgacttggg ctaacgttac cttcctgaaa 1680

aggtacttta gagcggatga gcaataccct ttcttggttc acccagttat gcccatgaag 1740

gatatacacg aatccatcag atggacaaaa gacgcaaaga acacccaaga ccacgtgcga 1800

tccctgtgcc tattggcttg gcataacggg gagcacgaat atgaggagtt tatccgcagg 1860

attaggagtg tcccagtagg gcgctgttta actctacctg cgttttcgac cctgcgcagg 1920

aaatggttgg attccttcta a 1941

<210> 6

<211> 646

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Pro Ala Phe Glu Phe Ala Val Ala Met Met Lys Arg Asn Ser

1 5 10 15

Ser Thr Val Lys Thr Glu Tyr Gly Glu Phe Thr Met Leu Gly Ile Tyr

20 25 30

Asp Arg Trp Ala Val Leu Pro Arg His Ala Lys Pro Gly Pro Thr Ile

35 40 45

Leu Met Asn Asp Gln Glu Val Gly Val Leu Asp Ala Lys Glu Leu Val

50 55 60

Asp Lys Asp Gly Thr Asn Leu Glu Leu Thr Leu Leu Lys Leu Asn Arg

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Leu Ala Lys Glu Glu Val

85 90 95

Glu Val Asn Glu Ala Val Leu Ala Ile Asn Thr Ser Lys Phe Pro Asn

100 105 110

Met Tyr Ile Pro Val Gly Gln Val Thr Asp Tyr Gly Phe Leu Asn Leu

115 120 125

Gly Gly Thr Pro Thr Lys Arg Met Leu Met Tyr Asn Phe Pro Thr Arg

130 135 140

Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Leu Met Cys Thr Gly Lys Val Leu Gly

145 150 155 160

Ile His Val Gly Gly Asn Gly His Gln Gly Phe Ser Ala Ala Leu Leu

165 170 175

Lys His Tyr Phe Asn Asp Glu Gln Gly Glu Ile Glu Phe Ile Glu Asn

180 185 190

Ser Lys Asp Ala Gly Phe Pro Val Ile Asn Thr Pro Ser Lys Thr Lys

195 200 205

Leu Glu Pro Ser Val Phe His Gln Val Phe Glu Gly Asn Lys Glu Pro

210 215 220

Ala Val Leu Arg Asn Gly Asp Pro Arg Leu Lys Ala Asn Phe Glu Glu

225 230 235 240

Ala Ile Phe Ser Lys Tyr Ile Gly Asn Val Asn Thr His Val Asp Glu

245 250 255

Tyr Met Leu Glu Ala Val Asp His Tyr Ala Gly Gln Leu Ala Thr Leu

260 265 270

Asp Ile Asn Thr Glu Pro Met Lys Leu Glu Asp Ala Val Tyr Gly Thr

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Leu Asp Leu Thr Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr

290 295 300

Val Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Ser Lys Lys Thr Lys

305 310 315 320

Asp Leu Thr Lys Leu Lys Glu Cys Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asn Leu

325 330 335

Pro Met Val Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ala Glu Lys Val

340 345 350

Ala Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser

355 360 365

Val Ala Met Arg Gln Thr Phe Gly Asn Leu Tyr Lys Thr Phe His Leu

370 375 380

Asn Pro Gly Ile Val Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asp Pro Asp Leu

385 390 395 400

Phe Trp Ser Lys Ile Pro Val Met Leu Asp Gly His Leu Ile Ala Phe

405 410 415

Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Ala Cys

420 425 430

Leu Lys Leu Leu Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser His Lys Glu Thr Asn

435 440 445

Tyr Ile Asp Tyr Leu Cys Asn Ser His His Leu Tyr Arg Asp Lys His

450 455 460

Tyr Phe Val Arg Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile

465 470 475 480

Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Thr Leu Met Leu Lys

485 490 495

Val Tyr Lys Gly Ile Asp Leu Asp Gln Phe Arg Met Ile Ala Tyr Gly

500 505 510

Asp Asp Val Ile Ala Ser Tyr Pro Trp Pro Ile Asp Ala Ser Leu Leu

515 520 525

Ala Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Gly Leu Ile Met Thr Pro Ala Asp Lys

530 535 540

Gly Glu Cys Phe Asn Glu Val Thr Trp Ala Asn Val Thr Phe Leu Lys

545 550 555 560

Arg Tyr Phe Arg Ala Asp Glu Gln Tyr Pro Phe Leu Val His Pro Val

565 570 575

Met Pro Met Lys Asp Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala

580 585 590

Lys Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His

595 600 605

Asn Gly Glu His Glu Tyr Glu Glu Phe Ile Arg Arg Ile Arg Ser Val

610 615 620

Pro Val Gly Arg Cys Leu Thr Leu Pro Ala Phe Ser Thr Leu Arg Arg

625 630 635 640

Lys Trp Leu Asp Ser Phe

645

Claims (9)

1.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒，其特征在于，是由表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后所得，所述表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒的制备方法是：

将经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的3CD蛋白酶基因，与昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5连接，得到pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒；

然后将上述pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，获得表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒；

其中，所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：制备pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒

分别合成经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的3CD蛋白酶基因，然后分别连接到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及Ph启动子之后的BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切位点，得到pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒；

其中，所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤2：制备重组昆虫杆状病毒

取步骤1得到的pOET5-CB5-P1-3CD重组质粒，与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集上清液；再感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，得到重组昆虫杆状病毒；

步骤3：制备和纯化病毒样颗粒

取步骤2得到的重组昆虫杆状病毒，感染Sf9昆虫细胞，培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后，收集上清液并对上清液进行纯化，即得到柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的温度为27℃，时间为4d-5d。

4.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞的感染复数MOI为5。

5.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述培养的温度为27℃，摇速为100转/min，时间为3d。

6.根据权利要求2-5任一项所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述纯化的具体方法是：

步骤3.1：上清液浓缩

将上清液与质量百分浓度为20%的PEG8000、2.5M的NaCl溶液等体积混合，4℃搅拌过夜，再8000转/min离心30 min，弃掉上清液，留蛋白沉淀，使用TEN缓冲液重悬上述蛋白沉淀，得到病毒浓缩液；所述TEN缓冲液中含有0.01M Tris、0.01M EDTA和0.1M NaCl，pH值为7.6-8.0；

步骤3.2：蔗糖密度梯度超速离心

分别制备质量百分浓度为30%、45%、60%及80%的蔗糖溶液，对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心，290,000转/min离心4 h，收集位于45%与60%交界处的乳白色物质，即为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

7.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，由权利要求1所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒为活性成分或活性成分之一。

8.根据权利要求7所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的剂型为液体注射剂、注射粉剂和注射片剂中的任意一种或几种。

9.根据权利要求7所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自油佐剂、铝盐、水包油佐剂、油包水佐剂和水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

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