CN103260645B - 用作联合疫苗的诺罗病毒壳体和轮状病毒vp6蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合的诺罗病毒和轮状病毒疫苗，其用于在人中预防诺罗病毒和轮状病毒感染和/或病毒-诱导的腹泻及呕吐疾病。更特别是，本发明包含制备联合疫苗组合物的方法，所述联合疫苗组合物包含诺罗病毒和轮状病毒抗原，尤其是诺罗病毒VLP和轮状病毒重组VP6蛋白或双-层的VP2/VP6VLP的混合物。此外，本发明涉及诱导免疫应答的方法。

Description

用作联合疫苗的诺罗病毒壳体和轮状病毒VP6蛋白
【技术领域】
本发明涉及用于预防尤其幼儿中的胃肠炎的疫苗制剂。更特别是，本发明涉及包含至少一种诺罗病毒抗原和至少一种轮状病毒抗原的联合疫苗制剂。
【背景技术】
轮状病毒属（Rotavirus）胃肠炎在世界上在幼儿中每年导致多于500000例死亡。轮状病毒属（Rotavirus）（RV），呼肠孤病毒科（Reoviridae）的成员，也是在发达国家在幼儿中严重的腹泻的最重要单成因物质，导致相比在发展中国家更少死亡，但多数高成本的住院治疗。自2006年起可利用口服轮状病毒疫苗。WHO和许多国家现在建议全部健康儿童针对轮状病毒疫苗接种。
在口服轮状病毒疫苗的开发中，Tampere大学的TimoVesikari教授起到了关键作用。在1982年在Tampere进行任何轮状病毒疫苗的首次临床试验。Vesikari教授及其团队在建立2种目前许可的口服轮状病毒疫苗，牛-人重配株五价疫苗（Merck）和人轮状病毒疫苗（GSK）的功效和安全性的关键试验中发挥作用（Vesikarietal.Safetyandefficacyofapentavalenthuman-bovine(WC3)reassortantrotavirusvaccine.NEnglJMed2006;354:23–33;Vesikarietal.Efficacyofhumanrotavirusvaccineagainstrotavirusgastroenteritisduringthefirst2yearsoflifeinEuropeaninfants:randomised,double-blindcontrolledstudy.Lancet2007;370:1757–63）。
在许多国家有效和成功地实施的目前可利用的口服减毒轮状病毒疫苗具有可限它们的长期使用的潜在安全性问题。USA在1999年弃用基于恒河猴轮状病毒的早先口服轮状病毒疫苗（Wyeth），因为其与肠套叠关联，其可以第1剂量的疫苗的10000名受者中约1例发生。目前许可的轮状病毒疫苗不涉及该大风险，但罕见关联不可排除。
此外，在2010年，发现两种许可的活轮状病毒疫苗含有猪圆环病毒（PCV）DNA。尽管此发现的意义未知，其导致疫苗之一临时悬置，和轮状病毒疫苗接种总体减少。这两个问题均是仅活疫苗固有的，且一起强调开发轮状病毒疫苗用非-活替代物的需求。
轮状病毒基因由在3-层的病毒的内部核心中保持的11段双链RNA组成。3层由结合到dsRNA的核心蛋白VP2，内部壳体蛋白VP6，及有血细胞凝集素突起蛋白VP4的外部壳体糖蛋白VP7组成。主要壳体蛋白VP6决定病毒组特异性，且是最保守的，免疫原性和丰富的轮状病毒蛋白。外部壳体蛋白VP7和VP4含有中和表位及基于中和抗体诱导保护性免疫。
未完全知道由口服轮状病毒疫苗诱导的活性保护机理。表面蛋白VP7和VP4已知诱导血清型特异性中和抗体。但是，血清型之间有显著交叉-保护，其不可被血清型-特异性免疫解释。VP6在轮状病毒感染中及在疫苗接种之后是免疫显性蛋白。尽管VP6不诱导中和抗体，其诱导异源轮状病毒特异性免疫。
多于2十年前从rBV表达系统产生第1个轮状病毒重组VP6（rVP6）蛋白（EstesMetal.1987）。VP6单独形成由变数的三聚体体外组成的包括细管，球和片的寡聚体结构（LepaualtJ,EmboJ,20,2001）。rBV中VP2和VP6的共表达导致双-层的病毒-样粒子（dlVLP）的形成。VP2，VP6和VP7（有或无VP4）的共表达产生模拟天然感染性轮状病毒粒子的三-层的VLP。通过与佐剂使用不同轮状病毒VLP或非-人重组VP6蛋白实现了在动物模型中大部分免疫原性和疫苗功效研究。至今已实现用非-活亚单位轮状病毒蛋白疫苗，使用VLP或重组VP6蛋白的无人临床试验。
在许多地区消除或减少轮状病毒之后，诺罗病毒作为成因物的相对作用在增加。诺罗病毒属（Norovirus）（NV）是嵌杯病毒科（Caliciviridae）的成员，在全部龄组的人中导致散发性急性非细菌胃肠炎，及相关于世界上胃肠炎的暴发。NV每年在世界上在不到5岁的儿童中导致大致1百万住院治疗和多于200000例死亡。在轮状病毒之后，在幼儿中急性胃肠炎的第2种最重要的病毒成因是诺罗病毒。
诺罗病毒基因组由组织进3个开放阅读框（ORF1～3）的约7.6kb的单链RNA组成。与其他ssRNA病毒类似地，ORF1编码RNA-依赖性RNA聚合酶；ORF2编码主要壳体蛋白VP1，和ORF3编码小结构蛋白VP2。影响人的多数NV属于2种基因组（GI和GII），且这2种基因组分为至少8种GI和17种GII基因型。近年来，基因型GII-4已对大多数散发性胃肠炎病例和暴发主要负责。
壳体VP1蛋白的独特特征是其自行-组装成空病毒-样粒子（VLP）的能力。在20年前将基因组INorwalk病毒壳体基因克隆进重组杆状病毒（rBV）导致第1个诺罗病毒VLP的产生（Jiangetal.1992）。这些VLP是形态学上和抗原性地类似于天然NV。通过使用电子低温显微镜检和计算机图像处理技术观察到的诺罗病毒VLP的3-维结构显示，诺罗病毒壳体形成含有组织成90个直径38nm的二聚体的180个VP1壳体蛋白分子的T=3二十面体对称结构。诺罗病毒属（Norovirus）VLP在诊断血清学测定中广泛用作抗原源，以及用于开发针对诺罗病毒的候选疫苗。尽管未完全阐明用于诺罗病毒结合及进入的受体，最近已发现，NV识别人组织-血型抗原（HBGA）作为受体。在HBGA之中，最通常遇到的血型是ABO（ABH）和Lewis。这些复合碳水化合物发现于红细胞和粘膜上皮细胞或作为生物学流体中的游离的抗原。而且，最近已发现，HBGA被NV识别是株-特异性的，且已鉴定几种不同受体结合模式。
对于诺罗病毒，活疫苗并不可行，因为诺罗病毒不可于细胞培养中培育。因此，用于诺罗病毒的候选疫苗已及且可能是VLP疫苗或可溶性抗原疫苗。
现代疫苗设计中非-复制亚单位疫苗和亚病毒粒子的使用起始于80年代中期，伴随HB感染的患者的血中发现的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）粒子的发现。这些疫苗通常是安全的，由于它们被剥夺任何活衰减的或灭活的病毒或它们的遗传物质，且它们是以高量相对容易和成本有效产生的。亚单位蛋白疫苗的一例是病毒，如模拟活病毒的空壳，由此具有类似于活病毒的那些的抗原性和免疫原性性质的粒子（VLP）。疫苗诱导的血清中和抗体对于保护免于病毒感染是重要的。VLP的必要的特征包括它们模拟天然的病毒，由此保留构象-依赖性的中和表位。
有几个NVVLP和RVVP6蛋白的引起兴趣的特征或主要属性，其使得它们成有希望的疫苗候选体。因为它们的重复的，多价结构，VLP是极其免疫原性的。在VLP的表面上以高度组织的，密的，重复的阵列呈递抗原以非常低剂量引发强抗体应答，然而作为单体呈递的相同的抗原是正常非免疫原性的。B细胞被这些重复的结构有效活化（如VLP或rVP6三聚体组织成六角形及包装成更高级结构,例如细管），其导致在细胞表面上B细胞受体交联。VLP的粒子性质，尤其在约40nm的尺寸范围，其对于由专门的抗原呈递细胞（APC），即树突细胞（DC），经巨胞饮和胞吞摄取纳米粒子是最佳的（FifisT.,JImmunol,2004,173）。因此，VLP与活病毒类似地不需求其他细胞地直接活化及成熟DC。DC在活化先天性和适应性免疫应答中起到中心作用，及涉及长寿的记忆IgG产生，及是能活化幼稚T细胞的唯一的APC。VLP在细胞内复制的缺失下有效引发CTL（KellerSA等人,Intro,JImmunol,2010）。因此，VLP在刺激细胞介导的免疫（CMI）和体液免疫应答二者中有效。
如已以上提及，VP6是轮状病毒的最丰富的和免疫原性亚组-特异性抗原。VP6形成多聚体结构和VP6可引发强免疫应答的能力使得其成优良的轮状病毒疫苗候选体。VP6不诱导针对轮状病毒的中和抗体，但代之以通过引发促进交叉-反应性免疫的强T辅助（Th）细胞应答来诱导异型交叉-保护性免疫（BurnsJWetal.,1996Science;ParezNetal.,2004,JVirol）。VP6-特异性CD4+Th细胞提供特异于VP7和/或VP4分子上的中和表位的同源辅助B细胞（EsquirelFR,Arch.Virol2000,145,813）。此外，VP6-特异性CD4+Th细胞显示由粘膜中的直接细胞毒性机理或由抗病毒细胞因子产生保护免于鼠轮状病毒感染。
考虑到轮状病毒和诺罗病毒感染的严重性和目前可利用的疫苗的缺乏，有对非-活诺罗病毒和轮状病毒疫苗的需求，尤其用于在儿童中防止急性胃肠炎。对NV和RV的免疫应答是复杂的，且未完全阐明与保护的关联。总之，归因于包括NVVLP的VLP，及RV的VP6蛋白的上述独特性质提示，由这2种组分组成的疫苗代表用于针对NV和RV感染免疫的有活力的策略。
【发明概述】
本发明基于惊人的发现，在联合疫苗中包含的诺罗病毒和轮状病毒抗原不彼此干扰，还针对疫苗中存在的各抗原引发协同免疫。
本发明由此提供疫苗组合物，其包含至少一种诺罗病毒VLP抗原和至少一种轮状病毒VP6抗原。
在一些实施方式中，疫苗组合物还包含选自下列的诺罗病毒抗原：抗原性壳体肽，及抗原性壳体蛋白。抗原可源于任何诺罗病毒株，诸如属于GI和GII基因组和其任何基因型的那些。在一些实施方式中，诺罗病毒抗原是GII-4VLP，优选为单价形式。在一些其他实施方式中，诺罗病毒抗原包含多于一种VLP类型。
在一些实施方式中，轮状病毒VP6抗原选自：rVP6蛋白，双-层的VP2/VP6VLP和包含VP6蛋白的VLP。rVP6可为细管，球或片的多聚体形式。
本发明还提供描述的疫苗尤其在幼儿中防止胃肠炎的用途。本发明的此方面也可制成在有需求的受试者，尤其幼儿中防止胃肠炎的方法，包括用本文所述的疫苗组合物免疫接种受试者。
此外，本发明提供产生本文所述的疫苗组合物的方法。方法包括（i）在单个宿主中共表达至少一种诺罗病毒和至少一种轮状病毒抗原，或（ii）（a）产生，分离及纯化至少一种诺罗病毒抗原；（b）产生，分离及纯化至少一种轮状病毒抗原；及（c）混合所述诺罗病毒和轮状病毒抗原的步骤。优选地，抗原在重组杆状病毒-感染的昆虫细胞宿主中产生。
本发明的其他目的，方面，细节和优势会自以下图，详述，及例变得明显。
【附图说明】
以下，会利用优选的实施方式，参照附图更详细描述本发明，其中
图1A是PAGE蓝染色的12%SDS‐PAGE凝胶的照片,展示杆状病毒表达的诺罗病毒GII-4VLP（泳道A），轮状病毒rVP6（泳道B），双-层VP2/VP6VLP（泳道C），混合疫苗（诺罗病毒GIIVLP+rVP6;泳道D），及嵌合疫苗（共感染的诺罗病毒GII-4壳体和轮状病毒VP6;泳道E）的纯度。不同蛋白由凝胶右侧的箭头指示。各蛋白的对应分子量（kDa）在凝胶左侧指示。
图1B显示由重组蛋白组装的形态学结构的电子显微照片。蛋白纯化及结构，通过用3%乙酸双氧铀染色由电子显微镜检检查。检测诺罗病毒（NV）GII-4壳体，及轮状病毒（RV）VP2/VP6的VLP结构（小图A和C），和观察VP6蛋白的管状结构（小图B）。both‘小图D（混合疫苗制剂）和小图E（嵌合疫苗制剂）中观察到GII-4VLP和VP6的细管。
图2例证在BALB/c小鼠用不同剂量和途径（肌内,IM和真皮内,ID）的GII-4VLP免疫之后诺罗病毒(NV)-特异性IgG应答的ELISA测定结果。
图3例证在用不同剂量的GII-4VLP经ID途径免疫之后NV-特异性IgG血清终点滴定测定的结果。
图4显示不同剂量的GII-4VLP免疫的小鼠血清中发展及在ELISA中测量的NV-特异性IgG免疫应答的动力学。上图显示ID免疫的结果和下图显示IM免疫的结果。
图5例证在ELISA中测试的在用GII-4VLPIM免疫之后NV-特异性IgG应答的持续时间。
图6显示来自用GII-4VLP单独或在与rVP6的混合或嵌合制剂中真皮内（上图）或肌内（下图）免疫的小鼠的实验组的血清的IgG终点滴定测定的ELISA结果。
图7例证来自用rVP6单独或在与GII-4VLP的混合或嵌合制剂中真皮内（上图）或肌内（下图）免疫的小鼠的实验组的血清的IgG终点滴定测定的ELISA结果。
图8例证在用GII-4VLP单独或在与rVP6的混合或嵌合制剂中免疫小鼠之后NV-特异性粪便IgG终点滴定测定的结果。
图9描绘用GII-4VLP单独，混合或嵌合制剂ID（左小图）或IM（右小图）免疫的小鼠的NV-特异性IgG1和IgG2a亚型抗体应答的终点滴定测定。
图10显示用rVP6，混合，或嵌合制剂ID（左小图）或IM（右小图）免疫的小鼠的RV-特异性IgG1和IgG2a亚型抗体应答的终点滴定测定。
图11例证单独或在混合或嵌合疫苗制剂中免疫后GII-4（上图）或rVP6（下图）特定IgG抗体的平均亲合力指数（%）。亲合力指数≥50%被认为是高亲合力。
图12中的上图表示GII-4VLP-诱导的IgG抗体向不同NV基因型（GII-12和GI-3）的交叉反应性。下图例证在ELISA中测量的rVP6诱导的抗体向几种人（G1P8,G2P6,G4P6,G8P10和G12P4），牛（BRV）和恒河猴（RRV）轮状病毒株的交叉反应性。
图13例证NVGII-4-特异性血清抗体阻断同源GII-4VLP（小图A）或异源GI-3VLP（小图B）与人组织-血型抗原（HBGA）H-型-3（推定的NVGII-4受体）结合的能力。小图C显示最大程度地阻断GII-4VLP与H-型3结合需要的血清的终点滴度。阻断指数计算如下：100%‐（OD[含血清]/OD[不含血清]x100%）。
图14显示自用不同疫苗制剂免疫的小鼠收获的脾细胞的ELISPOT测定结果。上图例证在收获细胞的天GII-4VLP-特异性IgG抗体分泌细胞（ASC），而下图显示在与GII-4VLP培养4天之后GII-4VLP-特异性ASC的数。上和下图之间ASC的数的差异指示记忆B细胞应答。
【发明详述】
本发明涉及联合疫苗制剂，其包含至少一种诺罗病毒（NV）抗原和至少一种轮状病毒（RV）抗原。
已意外地发现，像许多其他联合疫苗一样，诺罗病毒和轮状病毒抗原不彼此阻断免疫原性。在本疫苗中，组合中个体抗原之间无干扰，使得本发明的联合疫苗能针对疫苗中存在的各抗原引发免疫。适宜地，当个别测量时，针对组合中的单组分的免疫应答是该组分的至少50%的免疫应答，优选100%或基本上100%。免疫应答可例如，由抗体应答适宜地测量，如在本文的实施例中例证。本疫苗制剂不仅缺乏个体抗原之间的负面干扰，而且提供协同效应。
适合在本发明中使用的诺罗病毒属（Norovirus）抗原包括，但不限于，抗原性壳体蛋白，肽，单体，二聚体，VLP或其任何组合。诺罗病毒抗原可源于属于GI或GII基因组及具有期望的基因型的诺罗病毒。在一些实施方式中，诺罗病毒抗原选自：GII-4，GII-12和GI-3VLP。因为基因型GII-4是世界上急性诺罗病毒胃肠炎的主要原因，在本疫苗中使用的优选的诺罗病毒抗原是GII-4VLP。优选地，VLP是单价的。
轮状病毒属（Rotavirus）VP6是亚组-特异性抗原，其是诱导交叉-反应性抗-轮状病毒应答的最丰富的和免疫原性轮状病毒蛋白。用本疫苗制剂免疫的小鼠的轮状病毒属（Rotavirus）-特异性血清抗体向属于亚组1和2的不同人，牛和猿猴轮状病毒株是交叉-反应性的，像感染人类的大部分轮状病毒血清型一样（图12）。
多聚体或任何其他形式形式的轮状病毒属（Rotavirus）VP6，重组VP6（rVP6），或包含VP6的任何轮状病毒VLP可在本疫苗制剂中用作轮状病毒抗原。重组杆状病毒的VP2和VP6的共表达导致双-层的病毒-样粒子（dlVP2/VP6VLP）的形成。作为在本疫苗制剂中使用的适合的轮状病毒抗原包括该VLP。轮状病毒属（Rotavirus）抗原可源于任何轮状病毒株但是优选人自人轮状病毒。
上述诺罗病毒和轮状病毒抗原可在本疫苗制剂中以任何期望的组合使用。在一些实施方式中，疫苗制剂包含单价GII-4诺罗病毒VLP和轮状病毒rVP6蛋白，优选为多聚体形式。在一些其他实施方式中，疫苗制剂包含单价GII-4诺罗病毒VLP和轮状病毒双-层的VP2/VP6VLP。
诺罗病毒属（Norovirus）和轮状病毒抗原可自天然的源分离及纯化。在其他实施方式中，所述抗原可由重组技术在适合的表达系统，包括但不限于，酵母细胞（例如酿酒酵母（S.cerevisiae），粟酒裂殖酵母（S.pombe）或巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）），细菌细胞（例如大肠埃希氏菌（E.coli）），昆虫细胞（例如Sf9细胞），及哺乳动物细胞（例如CHO细胞）中产生。用于各表达系统的适合的表达载体为本领域技术人员所熟知。
本疫苗可包含单诺罗病毒和轮状病毒疫苗以任何比，优选以等同量（1:1）的组合。联合疫苗可至少以2种方式配制。在第1方式中，其中诺罗病毒和轮状病毒疫苗作为重组蛋白独立地产生（以VLP,单体,二聚体,三聚体,球,细管,片或其任何组合的形式），及以特定比体外混合，以获得被称为“混合”疫苗的液体制剂。在第2方式中，诺罗病毒壳体和轮状病毒VP6的嵌合蛋白通过用适合的表达系统（例如表达诺罗病毒壳体基因和轮状病毒VP6基因的重组杆状病毒）共感染期望的宿主（例如Sf9昆虫细胞）来获得。该疫苗制剂在本文被称为“嵌合”疫苗。
当考虑病毒如诺罗病毒和轮状病毒时，除了类型-特异性（同型）免疫应答之外，交叉-反应性（异型）免疫应答的诱导具有高的意义。这些病毒具有大数量的不同基因型/血清型和株循环。理想疫苗诱导针对与疫苗中发现的病毒同源和异源的可变的株的应答。在一些实施方式中，GI-3（属于诺罗病毒基因组I）和GII-12（属于诺罗病毒基因组II）VLP鉴定为对疫苗制剂中存在的GII-4VLP的异源抗原。用GII-4特异性单或联合疫苗免疫的小鼠产生对异源抗原二者，跨基因组及它们之间反应性的抗体。向用联合疫苗相比轮状病毒VP6单疫苗免疫的小鼠血清中的GI-3的交叉-反应性免疫应答大致50%增加指示疫苗制剂中存在的轮状病毒VP6蛋白的佐剂效应。换言之，本联合疫苗的抗原性组分提供协同效应。在一例中，展示RVVP6蛋白具有在增宽由疫苗抗原诱导的免疫应答及增加血清的阻断活性的意义上作为佐剂发挥作用的能力。
除了交叉-反应性应答之外，本联合疫苗制剂由任何免疫途径（优选ID和IM途径）诱导特异于诺罗病毒和轮状病毒的强，系统性，持久的（记忆），及阻断IgG抗体应答和细胞-介导的免疫。这些应答与在感染之后产生的短寿命的和类型-特异性天然的应答成对比。由此，与局部粘膜应答成对比的系统性免疫应答可必要于更长持续时间的保护。
血清IgG抗体转移到肠腔可能提供保护免于肠感染的重要机理。可预期，由如本文所述的肠胃外（ID/IM）施用的疫苗引发的更高系统性免疫应答，更高水平的转移的抗体和更佳保护。
此外，本疫苗制剂诱导混合的平衡的类型的免疫应答，即T辅助（Th）细胞类型1和Th2类型应答。考虑到二种类型的免疫应答可能介导保护免于诺罗病毒和/或轮状病毒感染，此是重要的观察。
此外，本疫苗制剂是高亲合力抗体的有力的诱导物，如例中展示。高亲合力抗体显示与疫苗的保护性功效显著地关联。
而且，本发明显示，基因组之间的交叉-保护是用本文所用的疫苗制剂可达到的。用来自诺罗病毒的特定株/基因型的VLP免疫，如本文所述的GII-4VLP（所谓的单价疫苗），会不仅诱导针对疫苗制剂中不包括的其他基因型（在本文使用的GI-3和GII-12）的交叉-反应性或异型免疫应答，而且其也会阻断异源病毒结合及中和病毒，如本文所述。
除了引发免疫刺激的活性成分，即诺罗病毒和轮状病毒抗原之外，本制剂可包含无菌，非毒性，药学可接受的生理学载体。在一些实施方式中，疫苗制剂可还包含防腐剂诸如苯酚，2-苯氧乙醇或硫柳汞，以预防细菌或真菌混杂，和/或稳定剂，如蔗糖，乳糖，氨基酸，或明胶，以稳定化疫苗免于不利的情况及以预防免疫原免于粘附到瓶壁。
在一些实施方式中，本疫苗制剂可包含有效量的一种或更多佐剂。辅佐物质的主要特征之一通常是增宽由疫苗抗原诱导的免疫应答。术语“有效量的佐剂”包括能刺激针对施用的抗原的免疫应答的量的佐剂，即增加施用的抗原组合物的免疫应答的量，例如，在血清中的交叉反应性及阻断抗体活性的意义上测量的，如在本文实施例中例证。适合的有效增加包括相比无佐剂的相同的抗原组合物，那些多于5%，优选多于25%，及尤其是多于50%。适合在疫苗制剂中使用的佐剂为本领域技术人员所知。
本疫苗制剂可以各种形式提供，包括但不限于水溶液和干粉（冻干制剂）。例如，水溶液可以适合通过注射，鼻递送（例如作为喷雾剂或鼻滴），及口腔递送施用的形式提供。
疫苗制剂可由本领域技术人员容易明白的各种途径施用。优选地，本发明的疫苗制剂经肠胃外注射，包括但不限于肌内（IM），真皮内（ID）或皮下（SC）注射施用。
各种施用方案可应用于本疫苗制剂。由于严重的急性轮状病毒胃肠炎和诺罗病毒胃肠炎具有类似的6个月和3岁之间的峰发病率，组合的诺罗病毒和轮状病毒疫苗可以如下2种非限制性方式靶向此年龄范围内的儿童：
（a）可注射的诺罗病毒+轮状病毒疫苗可为幼婴的常规免疫日程表的一部分。认为，2剂量的疫苗会对于婴儿是足够的，可能之后是随后追加剂量。在芬兰，常规免疫日程表在3，5和12月龄。本诺罗病毒+轮状病毒疫苗会符合该日程表。而其他国家具有多少不同日程表，建议的疫苗可在不同程序中容易采用，以在2，4和12个月，4，6和12个月等给出；
（b）可注射的诺罗病毒+轮状病毒疫苗可用作轮状病毒的追加疫苗接种和在12～15月龄诺罗病毒的初次疫苗接种。会给出2剂量。项如果口服轮状病毒疫苗在2～6个月龄持续用于针对轮状病毒的初次免疫，可使用此选。已知，针对轮状病毒的免疫会在生命的第2和第3年衰减，及在许多情况中会期望追加疫苗接种。但是，口服疫苗不可用于追加疫苗接种，因为在更老龄，即正常追加疫苗接种时间，更大肠套叠风险。
在12和15个月龄之间以2剂量给出的可注射的诺罗病毒+轮状病毒疫苗会作为用于轮状病毒的追加疫苗接种及作为用于诺罗病毒的初次疫苗接种。尽管在小于12月龄的婴儿中（小）比例的诺罗病毒胃肠炎，大多数情况在此龄之后发生，且疫苗会仍具有预防幼儿中多数情况的诺罗病毒胃肠炎的潜力。
本疫苗可用于通过用药学有效量的本疫苗制剂免疫接种受试者来在由需求受试者的中预防或减少诺罗病毒和轮状病毒感染，诺罗病毒-及轮状病毒-诱导的腹泻及呕吐疾病以及胃肠炎，及针对诺罗病毒和轮状病毒诱导免疫应答。“药学有效量”的疫苗是能引发保护疫苗受者免于诺罗病毒和轮状病毒的免疫应答的量。
【实施例】
本领域技术人员明白，作为技术发展，发明的概念可以各种方式实施。本发明和其实施方式不限于以下描述的实施例，而是可在权利要求的范围之内。
【实施例1．诺罗病毒属（Norovirus）VLP产生和纯化】
【诺罗病毒GII-4壳体基因的提取及克隆】
在芬兰，在1999年，从患者粪便分离诺罗病毒属（Norovirus）GII-4。用QiaAmpRNA病毒小型试剂盒（Qiagen,德国）提取来自粪便的RNA。由反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），用以下引物：JV24正向引物（5′-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3′;SEQIDNO:1）（Buesa等人,2002）和反向引物（5′-TTATAATGCACGTCTACGCCC-3′;SEQIDNO:2）扩增含有诺罗病毒VP1壳体基因（1620bp）的完全基因的DNA片段。VP1壳体序列的全长DNA拷贝通过用ABIPRISMTM310遗传分析仪（AppliedBiosystems,USA）测序来获得。根据EMBL/Genbank和EuropeanFood-borneVirusesinnetwork（FBVE）将目标诺罗病毒株分类进遗传簇（GenBank序列数据库登录号No.AF080551）。用以下引物：GII-4-fwd（5’CACAGGATCCATGAAGATGGCGTCGAATGAC-3′;SEQIDNO:3）和GII-4-rev（5’CTCTGAATTCTTATAATGCACGTCTACGCCCCGCTCCA-3′;SEQIDNO:4）使用PTC-200DNA引擎（MJResearch）扩增完全VP1壳体基因。扩增的片段克隆进pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen,USA），和进一步亚克隆进杆状病毒pFastBac1转移载体（Invitrogen）。在转化进TOP10化学感受态大肠埃希氏菌（E.coli）细胞之后，通过用ABIPRISMTM310遗传分析仪（AppliedBiosystems）测序来确证VP1。
【诺罗病毒GII-12和GI-3壳体基因的提取及克隆】
在芬兰，自诺罗病毒感染的患者收集粪便样本。如上述提取RNA（Qiagen）。由RT-PCR，用以下引物扩增诺罗病毒GII-12VP1壳体基因和GI-3VP1壳体基因：
GII-12-fwd（5’-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3′;SEQIDNO:5），
GII-12rev（5’TTACTGTACTCTTCTGCGCCC-3′;SEQIDNO:6）及
GI-3fwd（5’-GTAAATGATGATGGCGTCTAA-3’;SEQIDNO:7）及
GI-3rev（5’-TGGGCCATTATGATCTCCTAAT-3′;SEQIDNO:8）。
测序扩增子（1.6Kb），及根据EMBL/Genbank和FBVE分类株（GenBank序列数据库登录号No.GII-12AJ277618和GI-3AF414403）。诺罗病毒属（Norovirus）VP1壳体基因（GII-12和GI-3）经密码子-优化。将GII-12克隆进pFastBacDual转移载体（Invitrogen）和将GI-3克隆进pFastBac1转移载体（Invitrogen）。
【诺罗病毒属（Norovirus）壳体重组杆状病毒（BV）浓储物产生】
为了产生重组体杆粒，将pFastBac构建体由Bac-到-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）根据生产商的使用说明转化进DH10BacTM感受态大肠埃希氏菌（E.coli）。杆粒DNA由PureLinkHiPure质粒DNAMiniprepKit（Invitrogen）纯化自2ml过夜LB培养物。由PCR分析重组体杆粒DNA，以确证杆粒中基因的存在。为分析pUC/M13，使用正向及反向引物（Invitrogen）。在用重组杆状病毒根据Bac-到-Bac表达系统感染的草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）（Sf9）昆虫细胞中产生VLP。为了更精确，将Sf9细胞以1×106细胞/ml的无血清培养基（Sf900SFMIII;Invitrogen）接种于Multidish6-孔（Nunc,ThermoFisher,丹麦），及由杆粒DNA（1μg）使用Cellfectin（Invitrogen）转染。细胞于26℃生长，及在转染后72小时收获。细胞悬浮液以500×g离心5min，和将上清液（P1杆状病毒浓储物）等分及存储于4℃。用杆状病毒P1浓储物感染Sf9细胞，及在感染后（dpi）6天，将细胞悬浮液以500×g离心5min，及将等分的上清液（P2杆状病毒浓储物）存储于4℃。通过BacPak快速滴度试剂盒（Clontech实验室,USA）测定P2浓储物的表达为感染复数（MOI）的杆状病毒滴度（噬斑形成单元;pfu）。
【重组体（r）诺罗病毒壳体表达和VLP产生和纯化】
为产生诺罗病毒VLP，200mlSf9细胞培养物设置为1×106细胞/ml的密度，并将细胞以1的MOI用P2浓储物感染。在第6天，将感染的细胞培养物通过以3000×g于4℃离心30min来澄清。将上清液中的VLP通过以100,000×g于4℃超速离心2小时（L8-60M超速离心机,BeckmanSW-32.1Ti转子）来浓缩，和沉淀重悬浮于3ml0.2MTris-HCl（pH7.3）。VLP装载到10%～60%非连续蔗糖梯度，及以100,000×g于4℃超速离心1h。由底部穿刺收集级分。大致25个级分收集，及将各级分由SDS-PAGE，就壳体蛋白的表达进行分析。第1蔗糖梯度级分的指示的级分的分析显示，壳体蛋白的明显的峰迁移到35%蔗糖，及将这些级分合并。而且，GII-4VLP用另外的非连续蔗糖梯度（35%～60%）纯化。将含有VLP的级分收集及合并。蔗糖由过夜透析针对1l的磷酸盐缓冲液（PBS）去除。VLP通过超滤浓缩。简言之，通过使用AmiconUltra30kDa离心机过滤装置（Millipore公司,德国）根据生产商的使用说明浓缩达15ml的透析的产物。VLP在PBS中存储于4℃。总蛋白浓度通过使用BCA蛋白测定（ThermoScientific,USA）定量。由12%SDS-PAGE确证纯度和完整性，之后是密度计分析和EM。
【实施例2．轮状病毒属（Rotavirus）抗原】
【A．轮状病毒属（Rotavirus）rVP6产生和纯化】
【轮状病毒VP6的提取及克隆】
为了获得VP6基因段的完全核苷酸序列，由QIAampRNA病毒小型试剂盒（Qiagen）根据生产商的使用说明提取来自强G1[P8]RT-PCR阳性急性胃肠炎患者的10%粪便悬浮液的RNA。使提取的dsRNA用VP6的特异性引物对经历RT-PCR反应（Matthijnssens等人,2006），产生1362bp的扩增子。扩增子由QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化，及由ABIPRISMTM310遗传分析仪（AppliedBiosystems）测序。将VP6扩增子的序列密码子-优化，及克隆进pFastBac1载体（Invitrogen）。
【轮状病毒属（Rotavirus）VP6重组杆状病毒（BV）浓储物产生】
基本上如上述关联诺罗病毒实施产生。
【轮状病毒属（Rotavirus）rVP6产生和纯化】
为产生重组VP6，将200ml的Sf9昆虫细胞用含有VP6的基因的重组杆状病毒，以5pfu/细胞的MOI，以1×106细胞/ml的细胞浓度感染。在6dpi收集培养上清液，及以1000rpm于+4℃澄清20min。通过以100000×g于+4℃超速离心1.5h来浓缩重组蛋白，和将沉淀重悬浮于0.2MTris-HCl（pH7.3），及在连续蔗糖梯度（10%～60%）上以100000×g于+4℃纯化16h。也可应用另外的蔗糖梯度纯化。合并含有VP6蛋白的蔗糖级分，针对PBS透析过夜，和通过在AmiconUltra-50离心过滤单元（Millipore公司）中离心来浓缩。将蛋白在PBS中于4℃存储。通过使用BCA蛋白测定来定量总蛋白浓度。由12%SDS-PAGE，之后是密度计分析和EM来确证纯度和完整性。
【B．双-层的（dl）轮状病毒VP2/VP6VLP产生和纯化】
【轮状病毒VP2的提取及克隆】
为了获得VP2基因段的完全核苷酸序列，由QIAampRNA病毒小型试剂盒（Qiagen）提取相同的G1[P8]RT-PCR阳性急性胃肠炎患者的RNA，如关联轮状病毒rVP6产生和纯化描述。用VP2的特异性引物对实施RT-PCR反应（Matthijnssens等人,2006），以产生2662bp的扩增子。将扩增子以类似于关联VP6使用的方式纯化及测序。将VP2扩增子的序列密码子-优化，及克隆进pFastBacDual载体（Invitrogen）。
【轮状病毒属（Rotavirus）VP2重组杆状病毒（BV）浓储物产生】
基本上如上述关联诺罗病毒实施产生。
【轮状病毒属（Rotavirus）dlVP2/VP6VLP产生和纯化】
为了产生轮状病毒双-层的（dl）VP2/VP6VLP，将Sf-9昆虫细胞用含有VP2和VP6的基因的重组BV，以等同MOI/细胞，以1×106细胞/ml的细胞浓度共感染。在7dpi收集培养上清液，及以1000rpm于+4℃澄清20min。将重组VP2/6-VLP浓缩及与重组诺罗病毒VLP类似地在连续蔗糖梯度上纯化。将含有VP2和VP6的蔗糖级分合并，针对PBS透析，和通过在AmiconUltra-100离心过滤单元（Millipore公司）中离心来浓缩。VLP在PBS中于4℃存储。通过使用BCA蛋白测定（ThermoScientific）来定量总蛋白。由12%SDS-PAGE和EM确证VP2/6的纯度和完整性。由密度计分析定量VP2/VP6样品中VP6的比例。
【实施例3．嵌合蛋白（GII-4壳体+VP6）产生和纯化】
通过用5的MOI的诺罗病毒GII-4rBV和5的MOI的轮状病毒VP6rBV共感染Sf9昆虫细胞来产生嵌合蛋白制备物。在6dpi收获共感染的昆虫细胞的上清液。通过以3000×g于4℃离心30min来澄清细胞培养物，和将上清液以100000×g于4℃超速离心2小时。将沉淀重悬浮于0.2MTris-HCl（pH7.3）和将嵌合蛋白由连续蔗糖梯度（10%～60%）以100000×g于4℃共纯化3小时。由底部穿刺收集含有二种重组蛋白（NV壳体和RVVP6,分别）的级分，及由SDS-PAGE分析。将来自含有嵌合蛋白的40%蔗糖的级分合并，及由透析针对PBS移出蔗糖。在AmiconUltra30kDa离心机过滤装置中浓缩透析的产物。将产物在PBS中于4℃存储。通过使用BCA蛋白测定（ThermoScientific）来定量总蛋白浓度。由12%SDS-PAGE之后是密度计分析和EM确证各蛋白的纯度和完整性。
【实施例4．诺罗病毒和轮状病毒VLP的表征】
【SDS-PAGE和密度计定量】
在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，使用在分离胶中含12%丙烯酰胺和在浓缩胶中含5%丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶（BioradLaboratories,USA）中运行样品。将样品在含有2%SDS，5%β-巯基乙醇，62mMTris-HCl（pH6.8），25%甘油，及0.01%溴酚蓝（Biorad）的Laemmli样品缓冲剂中热沸5min。凝胶用PageBlueTM蛋白染色溶液（Fermentas,Lithuania）染色。
在SDS-PAGE凝胶上，由FC软件（αInnotech,USA）根据生产商的使用说明定量蛋白运行。
图1A显示PAGE蓝染色的凝胶的照片，预期的分子量的鉴定的蛋白用箭头标记。在相同的蔗糖梯度级分中检测GII-4壳体和轮状病毒VP6的嵌合蛋白。图1A显示在SDS-PAGE上纯化的蛋白。
【电子显微镜检（EM）】
将制备物用3%乙酸双氧铀（UA）（pH4.6）负染色。将3μl的蛋白样品应用于碳包被的网格30s。将网格干燥，及将3μl的UA再应用于网格30s。过量液体移出，及由FEITecnaiF12电子显微镜（PhilipsElectronOptics,Holland），在120kV操作下检查网格。
在EM下检查各蛋白的形态（图1B），和确认包括GII-4VLP，rVP6细管及dlVP2/VP6VLP的高级结构。显示rVP6的细管，但可组装任何形式的rVP6蛋白，包括但不限于三聚体和更高级多聚体结构，包括球和片。将GII-4VLP和rVP6以1:1的比混合进混合体未损伤混合体中各部分的蛋白完整性或形态。对混合疫苗和嵌合疫苗检测类似形态学特征，鉴定填充GII-4VLP的rVP6细管。也可形成NV壳体和RVVP6的其他结构。
【实施例5．小鼠免疫】
用不同疫苗2次，在第0周和第3周真皮内（ID）或肌内（IM）免疫雌性BALB/c小鼠7～9周龄（4～5小鼠/组）。在一些实例中，小鼠仅用疫苗接收一次免疫。用于免疫的疫苗如下：GII-4VLP，rVP6蛋白，dlVP2/VP6VLP，混合体（GII-4VLP和rVP6的混合物），嵌合疫苗，及混合VLP（GII-4VLP及dlVP2/VP6VLP的混合物）。使用的疫苗剂量是：50μg，10μg，1μg和0.1μg。在多数实例中，将小鼠用10μg的单疫苗制剂或20μg的联合疫苗（混合或嵌合）免疫。10μg的各单疫苗组分含于混合疫苗中。例如，为获得混合疫苗，将PBS中10μg的GII-4VLP与在PBS中10μg的rVP6体外混合，及于+4℃存储。在第0（放血前,非-免疫血清），2，3和4周收集血（血清）样品和粪便。将小鼠在最终免疫之后2周无痛处死，和收集粪便，全血，及淋巴样组织。将接收无疫苗制剂的幼稚小鼠用作对照。
【实施例6．由疫苗诱导的免疫应答的剂量应答，动力学和持续时间】
将小鼠（5小鼠/组）组用10，1或0,1μg的GII-4VLP，在第0和21天由IM和ID途径免疫。在第0，2，3和4周收集血清，和在第5周终结小鼠。以1:200稀释对NV-特异性IgG测试各终止血清。有由10和1μg剂量诱导的类似水平的应答，但用0.1μg剂量观察到多少更低应答（图2）。此外，自以上组小鼠的合并的血清的终点滴度类似（图3）。对照幼稚小鼠对NV无应答。图4显示在每周收集的血清中测量的免疫应答的动力学。免疫点由箭标显示。结果显示，用一个剂量免疫诱导非常有力的免疫应答，尤其对于10μg和1μg剂量。50μg剂量诱导与10μg剂量类似的应答，测定以10μg剂量的应答平台期。总之，这些结果鉴定10和1μg剂量作为最佳剂量，尽管可使用其他剂量的疫苗制剂。此外，10μg剂量诱导持久的免疫应答，其未衰退直到第25周（图5）。
【实施例7．粪便分析】
IgG自血清转移到肠腔已相关于保护免于肠病原体如NV和RV。已由在儿童中的被动免疫球蛋白治疗显示IgG在肠中介导保护免于RV感染或改善疾病的能力。
为了测试单疫苗制剂或联合疫苗对可能的IgG转移的效应，将新鲜小鼠粪便悬浮于含有100mMNaCl，1mMCaCl2，0,05%吐温，1%抑肽酶和10μM亮抑酶肽（全部自Sigma～Aldrich）的10mMTris缓冲剂，以重新开始通过涡旋均质化的10%粪便悬浮液。均质化的悬浮液保持在冰上20分钟，及以18000×g于+4℃离心15分钟。提取上清液，及于-80℃存储。
如对于血清抗体ELISA描述，有一些修饰，在ELISA中测试粪便样品的诺罗病毒GII-4和轮状病毒VP6特异性IgG。在包被及阻断之后，将粪便样品（10%粪便悬浮液）自1:2～1:32进行2倍连续稀释，及添加到板。将山羊抗-小鼠IgG-HRP（Sigma-Aldrich）1:3000稀释，和将板显影及如上述测量吸光度。
图8显示，在免疫的小鼠粪便中，但不在对照小鼠中检测到显著水平的NV-特异性IgG。
【实施例8．血清分析】
小鼠组如上述用各单疫苗制剂或联合疫苗免疫。自能测定由疫苗制剂诱导的免疫应答的类型的免疫的小鼠的血清测量IgG亚型IgG1和IgG2a。已测定T辅助（Th）1和Th2二分之间的关系，和一级免疫球蛋白同种型：IgG1分类为Th2-型应答和IgG2a分类为Th1-型应答。Th1-型促进细胞介导的免疫和Th2-型促进体液免疫。
【诺罗病毒属（Norovirus）血清IgG和IgG亚型ELISA】
由酶联免疫吸附测定（ELISA）测试自免疫的及对照小鼠的血清的免疫球蛋白G（IgG），IgG1和IgG2a。诺罗病毒属（Norovirus）GII-4，GII-12和GI-3VLP用来在10mMPBS中，以分别0.2μg/ml，0.4μg/ml和1μg/ml的浓度（100μl/孔）包被（4℃,过夜）96-孔微孔板（NuncImmunoMaxisorp,ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA,USA）。在用含有0.05%吐温20（PBS-T）的PBS洗涤3次之后，将板于室温（RT）用含有5%脱脂的乳的PBS（Sigma-Aldrich）阻断1h。然后将孔用PBS-T洗涤3次，及于37℃用1:200稀释的100μl的血清或含有1%脱脂的乳的PBS-T中的2倍稀释系列温育1h。以一式两份孔测试全部血清样品。在洗涤6次之后，将1:4000稀释于PBS-T中1%乳中的辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗-小鼠IgG（Sigma-Aldrich）加入孔。
通过使用1:6000稀释于PBS-T中1%乳中的山羊抗-小鼠IgG1或IgG2aHRP缀合物（Invitrogen,Carlsbad,California）来测定抗-GII-4IgG亚型应答。温育（1h,37℃）后，将板洗涤，及以0.4mg/ml的浓度添加o-苯二胺二盐酸盐（SIGMAFASTOPD,Sigma-Aldrich）底物。将板于室温避光温育30分钟，和反应用2M硫酸（H2SO4）停止。在酶标仪（Victor21420,PerkinElmer,Waltham,MA,USA）中，在490nm波长测量吸光度（光密度,OD）。将自幼稚小鼠的一个知道的阳性及一个阴性血清样品加入全部板作为对照。自在板OD读数的全部减去自空白孔（无血清的孔）的背景信号。样品被认为是阳性，如果净吸光度值在设置的截止值以上，如下计算：平均OD（幼稚小鼠）+3×SD和至少0.100OD。
【轮状病毒属（Rotavirus）血清IgG和IgG亚型ELISA】
VP6蛋白用于在碳酸氢盐/碳酸盐缓冲剂（0,1mMNa2CO3,0,8mMNaHCO3,pH9,55）中，以1μg/ml的浓度（100μl/孔）包被96-孔微孔板。以上步骤后，以类似于对于诺罗病毒的ELISA实施ELISA。为交叉-反应性轮状病毒-特异性血清抗体的检测，将多克隆兔抗-轮状病毒属（Rotavirus）（人）（DAKO）用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲剂1:200稀释，及使用100μl/孔用于包被微孔板（+4℃过夜）。在用PBS-T洗涤4次之后，将板用如上述制备的100μl/孔的轮状病毒抗原（4℃过夜）包被。在用PBS-T洗涤4次之后，将板于+37℃用含有5%脱脂的乳的PBS阻断1h。在此步骤之后，与对诺罗病毒的血清ELISA类似地实施ELISA。
【血清IgG量值和亚型】
图6和7显示相应诺罗病毒和轮状病毒特异性血清IgG滴定。除了对照小鼠之外，对于各组免疫的小鼠，终点滴度略微高（交互滴度>4～5log10）。这些结果显示，无由联合疫苗中的组分的特定免疫应答的相互抑制或阻遏。
图9和10显示，本发明的全部疫苗制剂诱导混合的平衡的类型的免疫应答，即Th1类型和Th2类型。考虑到二种类型的免疫应答可能介导保护免于NV和/或RV感染，此是重要的观察。Th细胞给B细胞提供辅助（由细胞间接触或可溶性细胞因子），尤其分化为记忆B细胞，其一般旨在被疫苗诱导的长期记忆应答需要。RVVP6-特异性Th细胞诱导保护免于鼠轮状病毒感染，及给特异于RV的异型VP4或VP7分子上的中和表位的B细胞提供同源辅助（EsquivelFR,Arch.Virology2000;Peraltaetal.,VirologyJournal,2009）。因此，Th细胞对于异型免疫应答诱导重要。
【实施例9．免疫应答的亲合力】
抗体亲合力是功能抗体成熟或亲和性成熟的量度。高亲合力抗体已显示与疫苗的保护性功效显著地关联（Makidon等人,2008）。我们之前显示了（Nurminen等人,2010），在它们的血中具有高亲合力NV-特异性IgG抗体的更年长儿童相比具有低亲合力抗体的小于2岁的儿童具有更少NV感染。
为了测定NV和RV抗体的亲合力，脲洗脱用于移出低亲合力抗体［Kanno和Kazuyama，2002］。如以上描述实施ELISA测定，除了另外的脲温育步骤之外。在抗原（诺罗病毒GII-4VLP或轮状病毒VP6蛋白）包被的板上血清温育之后，自板抽吸血清，和添加PBS-T中的8M脲（Sigma-Aldrich）。在5分钟的温育之后，重复处理。在添加缀合了HRP的抗-小鼠IgG之前，将板洗涤4次，及将上述板显影。亲合力指数计算为［含脲的OD/不含脲的OD］x100%，指数值>50%被认为是高亲合力。
用单或联合疫苗免疫诱导具有高亲合力（亲合力指数>50%,分别）的NV-及RV-特异性IgG抗体。结果显示，本疫苗制剂是具有保护性特征的高亲合力抗体的有力的诱导物（图11）。
【实施例10．交叉-反应性免疫应答】
胚胎恒河猴肾（MA104）细胞（MA104）中培养不同血清型（G1P8,G2P6,G4P6,G8P10,G12P4,BRV和RRV）的轮状病毒属（Rotavirus），及制备在用于交叉反应性研究的ELISA中用作抗原。
如在实施例8中描述在ELISA中测试自免疫的及对照小鼠的血清的诺罗病毒和轮状病毒抗体。诺罗病毒属（Norovirus）GII-4-诱导的血清抗体向异源GI-3和GII-12抗原是交叉-反应性的（图12,上图）。而且，用疫苗制剂免疫的小鼠的轮状病毒-特异性血清抗体向属于亚组1和2的不同人，牛和猿猴轮状病毒株是交叉-反应性的（图12,下图）。
意外地，轮状病毒VP6抗原导致用联合疫苗相比轮状病毒VP6单疫苗免疫的小鼠血清中向GI-3的交叉-反应性免疫应答大致50%增加（图12,上图）。此结果显示，本联合疫苗的抗原性组分提供协同效应。
【实施例11．阻断测定】
阻断测定是对于NV的替代中和测定。NV不可在细胞培养物中体外生长，由此，典型地，用阻断病毒结合及感染允许的细胞的抗体的中和测定是不可能实施的。人组织-血型抗原（HBGA）已最近发现作为尤其是在粘膜表面的细胞（例如肠细胞）上表达的NV的受体。例如，碳水化合物H3型已鉴定为NVGII-4的推定的受体，由此GII-4VLP结合于以上碳水化合物（LHuhti等人,2010）。预期NVVLP与受体的结合用具有中和性质的抗体阻断。的确，GII-4VLP与H-型3的结合可由来自在急性胃肠炎的水介暴发期间不被NV感染的儿童的血清阻断（KNurminen等人,2010）。保护免于与血清的强阻断活性关联的NV感染。因此，当考虑不同疫苗方法时，抗体的阻断活性可为NV保护的关联替代品标记物。
用免疫的及对照小鼠血清实施阻断NVVLP与HBGAH-型3的结合的测定。用2μg/ml浓度的在PBS（pH7.2）中的GII-4或GI-3VLP包被微孔板，及于室温温育4h。在洗涤之后，将板与在PBS中的5%乳于4℃过夜温育。将自1:200～1:6400连续稀释的血清加入孔，和将板于37℃温育1h。在抽吸血清之后，添加在含有1%乳的PBS-T中的20μg/ml或40μg/ml浓度的100μl的生物素化的H-型-3或LewisB（Leub）（LectinityHoldings,Inc.,莫斯科,俄罗斯）作为对照。在于37℃4h之后，将孔洗涤，及添加缀合了链霉亲和素的HRP（ThermoFisherScientificInc.）的1:2000稀释液，及于37℃温育1h。如上述实施颜色反应的显影和在490nm波长下吸光度的测量。读自未与血清温育的孔的OD被认为是对于H-型3与GII-4VLP的结合的最大信号。阻断指数计算如下：100%～（OD[含血清]/OD[不含血清]x100%）。未检测到VLP与阴性对照LeubHBGA的结合。自测试的样品的全部OD值减去自空白孔（缺少HBGA的孔）的背景信号。
图13A和13B分别显示GII-4和GI-3与它们的推定的受体H3型结合的阻断。最大程度地阻断用单疫苗相比联合疫苗免疫的小鼠的GII-4VLP与H3型的结合需要2倍更大滴度（图13C）。此结果显示，联合疫苗中的rVP6蛋白不抑制或抑制GII-4特异性血清的阻断活性。相反，通过联合疫苗制剂免疫的小鼠的血清的显著的阻断活性指示类似于在之前实验中检测的rVP6蛋白的佐剂效应。而且，我们的数据显示，基因组之间的交叉-保护是用我们的研究中使用的疫苗制剂容易可检测的。此种观察在诺罗病毒疫苗研究领域中相当地独特。结果也显示，用1株/基因型的病毒（所谓的单价疫苗）的免疫会不仅诱导针对上述疫苗制剂中不包括的其他株的交叉-反应性或异型免疫应答，而且其也会阻断异源病毒结合及将其中和。
【实施例12．抗体分泌细胞（ASC）ELISPOT】
抗体分泌细胞（ASC）分为负责长期保护免于病原体（记忆应答）和再暴露后会与病原体快速反应的血浆B细胞和记忆B细胞，其是旨在被任何疫苗接种诱导的记忆应答的标志。ELISPOT测定用于检测免疫的小鼠脾脏中分泌IgG抗体的浆细胞和记忆B细胞的频度。
在Hanks平衡的盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich）中收集来自无痛处死的小鼠的脾脏。用解剖刀破坏脾脏结构，及通过使用70μm细胞粗滤器（Becton,DickinsonandCompany,USA）解离为单细胞悬浮液。将悬浮液在300×g离心10分钟，和将细胞重悬浮到HBSS。红细胞用1:10稀释的HBSS裂解，之后用2×HBSS恢复悬浮液的摩尔浓度。将脾细胞悬浮液洗涤3次，在冷冻培养基（补充40%FBS和10%DMSO的RPMI,Sigma-Aldrich）中冷冻，及在液氮中存储，用于进一步使用。
将96-孔PVDF板（Millipore）用诺罗病毒GII-4VLP或轮状病毒VP6蛋白，以40μg/ml的浓度，在100μl/孔的体积中于+4℃过夜包被。将脾细胞自液氮解冻，洗涤及悬浮于细胞培养基（补充10%FBS,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,50μM2-巯基乙醇和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640）。在洗涤及阻断板之后，以4×105细胞/孔的浓度添加脾细胞，及于+37℃，5%CO2温育过夜。将板用PBS-T洗涤6次，及将山羊抗-小鼠IgG-HRP（Sigma-Aldrich）以1:1000稀释加入孔。在3小时的于室温温育后，将板精洗涤及用DAB底物（SigmaFASTDAB,Sigma-Aldrich）显影，及对斑点计数。自实验组减去自幼稚对照动物的孔中呈现的斑点。数据表达为GII-4VLP或VP6特异性抗体-分泌细胞（ACS）及对每1×106细胞标准化。
在一些实例中，将细胞与GII-4VLP或rVP6体外温育4天，洗涤及平铺，如关联记忆B细胞定量描述。用无体外刺激的细胞实施的自ELISPOT测定获得的斑点推定为是活跃地-分泌的浆细胞。用4天培养的细胞获得的斑点，在减去浆细胞-产生的斑点之后，表示记忆B细胞活性。
图14显示，本疫苗制剂诱导产生NV和RV特异性IgG抗体的血浆B细胞。而且，以用单和联合疫苗的类似量诱导高频度的记忆B细胞分泌特异性IgG抗体，显示诱导的应答是记忆性应答。
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Claims (10)

1.疫苗组合物，其所包含的引发免疫刺激的活性成分为：
诺罗病毒GII-4VLP抗原，
轮状病毒VP6抗原，和
任选地，其他诺罗病毒VLP抗原，其中所述其他诺罗病毒VLP抗原选自GI和GII诺罗病毒VLP抗原。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述GII-4VLP是单价的。
3.权利要求1的疫苗组合物，其中所述诺罗病毒抗原包含多于一种VLP类型。
4.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒VP6抗原选自：rVP6蛋白，双-层的VP2/VP6VLP，包含VP6蛋白的VLP，及其任何组合。
5.权利要求4的疫苗组合物，其中所述rVP6处于选自下列的多聚体形式：细管、球、片及其任何组合。
6.权利要求1～5之任一项的疫苗组合物，还包含无菌的、非毒性的、药学可接受的生理学载体。
7.权利要求1～5之任一项的疫苗组合物，其用于预防选自下列的疾病：诺罗病毒和轮状病毒感染，病毒-诱导的腹泻及呕吐疾病，和胃肠炎。
8.权利要求6的疫苗组合物，其用于预防选自下列的疾病：诺罗病毒和轮状病毒感染，病毒-诱导的腹泻及呕吐疾病，和胃肠炎。
9.产生权利要求1～5之任一项的疫苗组合物的方法，
所述方法包括在单个宿主中共表达所述诺罗病毒GII-4VLP抗原、所述轮状病毒VP6抗原和任选地所述其他诺罗病毒VLP抗原，或者
所述方法包括下列步骤：
(a)产生、分离及纯化所述诺罗病毒GII-4VLP抗原；
(b)产生、分离及纯化所述轮状病毒VP6抗原；
(c)任选地，产生、分离及纯化所述其他诺罗病毒VLP抗原；和
(d)混合所述诺罗病毒GII-4VLP抗原、所述轮状病毒VP6抗原和任选地所述其他诺罗病毒VLP抗原。
10.权利要求9的方法，其中所述抗原在重组杆状病毒-感染的昆虫细胞宿主中产生。
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