JP2000139473A - ロタウイルス遺伝子を導入した遺伝子組換え植物、この遺伝子組換え植物に由来するロタウイルスのタンパク質及びこのロタウイルスのタンパク質に対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】使用範囲が広く、かつ、経口ワクチンにおける
応用が容易な、コストパフォーマンスが極めて高いロタ
ウイルスワクチンの提供手段を見出すこと。 【解決手段】少なくともロタウイルスのＶＰ６タンパ
ク質をコードする遺伝子が、自己の遺伝子中に組み込ま
れている植物体細胞、この植物体細胞における発現ベ
クター、さらには、前記の植物体細胞で、全部又は一
部が構成されている植物体、この植物体の増殖方法、
前記植物体又は植物体細胞から単離して得られるロタ
ウイルスのタンパク質、このタンパク質に対する抗
体、このタンパク質を動物に投与し、この動物に、前
記ウイルスに対する免疫を付与する方法を提供すること
により、上記の課題を解決し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルスの遺伝子
を導入した組換え植物に関する技術分野の発明であり、
より詳細には、ロタウイルスの特定のタンパク質をコー
ドする遺伝子を導入した組換え植物に関連する発明であ
る。

【０００２】

【従来の技術】ロタウイルスは、１９７３年にヒトロタ
ウイルスが検出され、現在までにほとんどの哺乳類およ
び鳥類から検出されている〔virology，２nd ed ．Rave
n Press ，NewYork ，1358-1404(1990) 〕。このロタウ
イルスは、乳幼児や若齢動物に下痢を惹き起こすという
病原性を有しており、開発途上国では、年間１００万人
もの乳幼児がロタウイルス感染で死亡している。また、
ウシやブタにおいてもその被害は大きい。

【０００３】ロタウイルスの感染経路は、主として糞口
感染で、ヒトにおいては便に触れた手、指を介して伝播
する。１〜１０個の感染粒子の侵入で感染が成立するほ
ど感染力は強く、家畜においては畜舎内で急速に蔓延
し、ヒトでは院内感染や家族内感染が起きやすい。この
ロタウイルスは、ほとんどの哺乳類に感染し、産業上有
益な家畜に於いても感染、発病が認められ、しかも死に
至らせる場合が多く、その被害は計り知れない。このた
め、ロタウイルス感染防御のためのワクチン開発は急務
の課題となっている。

【０００４】現在では、ロタウイルスについて、腸管免
疫を効果的に誘導する目的で、ヒトロタウイルス反応性
中和抗原を共有する動物ロタウイルスを使用するジェン
ナー方式の弱毒生ワクチン（サル由来のMMU 18006 株，
ウシ由来のRIT 株あるいはWC3 株）、変法ジェンナー方
式の遺伝子組み換え体ワクチン（VP7 のみがヒト由来で
他の遺伝子がサルあるいはウシ由来）、無症候感染を起
こした新生児由来のヒトロタウイルス株（M37 株）、低
温順化株の投与試験が行われている〔Curr TopMicrobio
l Immunol 185,286-337(1994) 〕。

【０００５】しかし、これらの従来技術によっても、ロ
タウイルス病を確実に予防できるワクチンが提供される
には至っていない。また、今後、ロタウイルスについて
の有効なワクチンが開発されたとしても、従来型のワク
チンでは製造コストが高くなるため、経済上の理由か
ら、特に家畜に対して全頭接種をすることは困難なこと
か想定される。また、ワクチンの接種作業に必要とする
医師や獣医師等の人件費も莫大になることも想定され
る。また、注射によって、ヒトや家畜に与えるストレス
も多大であると考えられる。

【０００６】よって、低価格で、かつ、投与が簡便な、
また投与によるストレスを与えないロタウイルスワクチ
ンの早期の開発が必要とされている。

【０００７】このような技術的な背景のもと、ロタウイ
ルスを構成する特定のタンパク質をコードする遺伝子を
植物において発現させ、かかる遺伝子産物を基とした、
コストパフォーマンスに優れたロタウイルスのワクチン
を製造する手段を提供することが試みられている（ＷＯ
９７／１０３４７号公報参照のこと）。

【０００８】この技術は、ロタウイルスのＶＰ４タンパ
ク質乃至ＶＰ７タンパク質をコードする遺伝子を組み込
んだ植物の提供を試みた技術である。

【０００９】ロタウイルスのＶＰ４タンパク質もＶＰ７
タンパク質も、ロタウイルス自体に対する抗原性を発揮
し得ると考えられるロタウイルスの外殻タンパク質であ
る（ＶＰ４タンパク質は、外殻タンパク質であり、中和
抗原であり、赤血球凝集素であり、病原性に直接的に関
わり、融合部位であり、細胞吸着に関わっていることが
知られている。また、ＶＰ７タンパク質は、外殻タンパ
ク質であり、中和抗原であり、細胞吸着に関わっている
ことが知られている）。よって、ワクチン化を考慮して
選択する際の選択としては、ある意味では妥当な選択で
あるとも考えられる。

【００１０】しかしながら、このロタウイルスのＶＰ４
タンパク質乃至ＶＰ７タンパク質に関わる技術には、以
下のような問題点から、未だ、理想とするようなロタウ
イルスに対するワクチンを提供する手段は確立されてい
ない。

【００１１】すなわち、 （Ｉ）使用範囲に関する問題 ロタウイルスは、群特異抗原（群特異エピトープ）の違
いにより、Ａ〜Ｆ群に分類されており、中和抗原（血清
型抗原）により、各々の群毎に、さらに細かく分類され
る。

【００１２】すなわち、ロタウイルスのＶＰ４タンパク
質もＶＰ７タンパク質も、中和抗原（血清型抗原）に対
応するため、これらの外殻タンパク質に対する抗体は、
同じ血清型のロタウイルスにのみにしか反応することが
できない。つまり、ロタウイルスのＶＰ４タンパク質と
ＶＰ７タンパク質とを免疫抗原として、ワクチンを製造
しても、ごく一部のロタウイルスにしか効果を期待する
ことが困難であるという問題が認められる。また、これ
らの外殻タンパク質を免疫抗原として得た抗体を用いた
診断薬も、ごく一部のロタウイルス感染しか検出するこ
とが困難である。

【００１３】（II）経口ワクチン源としての形態の問題 ロタウイルス感染症に対するワクチンとして、非常にコ
ストパフォーマンスの高いワクチンの形態として期待さ
れている「経口ワクチン」のワクチン源として、ロタウ
イルスのタンパク質を用いるには、経口摂取しても作用
点である腸に到達する前に、胃等で消化吸収されないこ
とが必要である。そのためには、ワクチン源がウイルス
粒子の形態をとることが好ましい。

【００１４】しかしながら、ロタウイルスのＶＰ４タン
パク質とＶＰ７タンパク質とを組み合わせても、ウイル
ス粒子は形成されない。

【００１５】よって、ロタウイルスのＶＰ４タンパク質
とＶＰ７タンパク質のみの組み合わせでは、ロタウイル
ス感染症に対する経口ワクチン源としては不十分であ
る。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、これらの従来技術における問題点を克服した、使
用範囲が広く、かつ、経口ワクチンにおける応用が容易
な、コストパフォーマンスが極めて高いロタウイルスワ
クチンの提供手段を見出すことにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて鋭意検討を重ねた。その結果、ロタウイル
スに対する免疫を動物において誘導するための免疫抗原
となり得るタンパク質として、少なくともＶＰ６タンパ
ク質を選択して、このロタウイルスのＶＰ６タンパク質
をコードする遺伝子を少なくとも組み込んだ遺伝子組換
え植物における遺伝子産物が、ロタウイルス感染症に対
する診断薬やワクチンのおいて非常に有効であることを
見出した。また、この遺伝子組換え植物自体が、ロタウ
イルス感染症に対する経口ワクチンとしても有用である
ことを見出した。

【００１８】すなわち、本発明者は、本願において、 （Ｉ）少なくともロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコ
ードする遺伝子が、自己の遺伝子中に組み込まれている
植物体細胞、特に、このロタウイルスのＶＰ６タンパク
質をコードする遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ
酸配列の全部又は一部をコードする遺伝子（例えば、配
列番号２で表される塩基配列を含む遺伝子）である、前
記の植物体細胞を提供する。

【００１９】（II）ロタウイルスのＶＰ６タンパク質を
コードする遺伝子を含む、前記（Ｉ）の植物体細胞にお
ける発現ベクターを提供する。

【００２０】（III）前記（Ｉ）の植物体細胞で、全部
又は一部が構成されている植物体を提供する。

【００２１】（IV）前記（III）記載の植物体を交配す
ることによりＦ１植物体を作出する、植物体の増殖方法
を提供する。

【００２２】(V) 前記（II）記載の発現ベクターに含ま
れている、ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコードす
る遺伝子が自己の遺伝子の中に組み込まれている植物体
又は植物体細胞から単離して得られるロタウイルスのタ
ンパク質を提供する。

【００２３】(VI)前記(V) のロタウイルスのタンパク質
に対する抗体を提供する。

【００２４】(VII) 前記(V) のウイルスのタンパク質
を、動物に投与し、この動物に、前記ウイルスに対する
免疫を付与する方法を提供する。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。

【００２６】本発明において、植物を形質転換するため
の遺伝子の供給源となる、ロタウイルスは、現在では、
血清学的にＡ群からＦ群まで分類されており、さらに各
血清群内においても、多くの血清型が存在する〔Virolo
gy，2nd ed．Raven Press ，New York，1353-1404(199
0) 〕が、本発明において用いられ得るロタウイルス
は、一つの血清群や血清型のロタウイルスに限定される
ものではない。

【００２７】ロタウイルスの遺伝子ＲＮＡは、１１本に
分節した二本鎖ＲＮＡからなるが、それらの分節遺伝子
のうち、少なくとも分節遺伝子の６番のＲＮＡがコード
している「ＶＰ６タンパク質」をコードする遺伝子を、
植物に導入する遺伝子として選択することが好ましい。

【００２８】このロタウイルスのＶＰ６タンパク質（以
下、特に断わらない限り、ＶＰ６タンパク質と記載す
る）は、内殻タンパク質を構成し、前述のロタウイルス
の群毎に分類される群抗原である。よって、ロタウイル
スのＶＰ６タンパク質は、前述のロタウイルスのＶＰ４
タンパク質やＶＰ７タンパク質（以下、特に断わらない
限り、ＶＰ４タンパク質及びＶＰ７タンパク質という）
のように、同群のロタウイルスであっても、その血清型
が異なるロタウイルスには対応しないということはな
く、これを免疫抗原とした抗体は、より多くのロタウイ
ルスを認識することが可能である。

【００２９】さらに、必要に応じて、他の分節遺伝子の
うち、ロタウイルスの核粒子形成に関与している遺伝
子、例えば、分節遺伝子２番、４番、７番及び９番から
選ばれる１種又は２種以上から選ばれるロタウイルスの
粒子形成に関与している遺伝子を、植物に導入する遺伝
子として選択することが可能であり、さらにロタウイル
スの他の要素をコードする分節遺伝子を選択するのに比
べ、好ましい。

【００３０】また、ロタウイルスのうち、特に上記のＡ
群に属するロタウイルスは、ロタウイルス全体の７割程
度を占めることが知られており、特に、このＡ群に属す
るロタウイルスを、少なくとも本発明における第１次的
な標的とすることにより、効率的にロタウイルス感染症
に対する、診断や予防を行うことが可能である。

【００３１】ロタウイルスの遺伝子のクローニングは、
通常公知の方法により行うことができる。例えば、ロタ
ウイルスの遺伝子ＲＮＡを分離し、この遺伝子ＲＮＡを
鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、この
ｃＤＮＡを用いてロタウイルスの遺伝子をクローニング
することができる。

【００３２】ロタウイルスの遺伝子ＲＮＡの分離は、通
常公知の方法によって行うことができる。例えば、ロタ
ウイルスに感染している生物材料からロタウイルス粒子
を分離して、このウイルス粒子から遺伝子ＲＮＡを、フ
ェノール法、グアニジン・ホットフェノール法等の通常
公知のＲＮＡ抽出方法を用いて抽出することにより、ロ
タウイルスの遺伝子ＲＮＡを分離することができる。

【００３３】この遺伝子ＲＮＡを鋳型にしたｃＤＮＡの
合成も、通常公知の方法を用いて行うことができる。例
えば、逆転写酵素を用いて、得られたロタウイルスの遺
伝子ＲＮＡを鋳型とし、かつ、ランダムプライマー、又
はロタウイルスの遺伝子ＲＮＡに相補な配列に基づく合
成ＤＮＡをプライマーとしてｃＤＮＡを合成し、さらに
二本鎖化の過程を経て、所望するロタウイルスの遺伝子
ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡを調製することができる。

【００３４】次に、このようにして得られたｃＤＮＡか
ら、公知の方法により、ｃＤＮＡ断片群を調製して、こ
れを大腸菌を宿主とする増幅用のベクターに組み込み、
さらにこれを適切な宿主中で増幅させて大量にｃＤＮＡ
を増幅させて、遺伝子ライブラリーを調製することがで
きる。ここで用いられ得る増幅用ベクターは特に限定さ
れず、例えば、pUC ベクターシリーズ、pGEMベクターシ
リーズ、pBR ベクター、PBluescript ベクター、λファ
ージベクター等の通常クローニングに用いられる増幅用
ベクターを用いることができる。

【００３５】このようにして得られたｃＤＮＡクローン
に組み込まれているＤＮＡ断片の塩基配列の確認は、例
えば、マキサム−ギルバート法（Maxam,A. and Gilber
t,W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560(1977) 〕、ゲノミ
ッタシークエンス法〔Church. G.M. and Gilbert,W.:Ge
nomic sequencing.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,1991-19
95(1984)〕、マルチプレツクス法〔Church, G.M., Scie
nce 240,185-188(1988) 〕、サイクルシークエンス法
〔Nature 321,674(1988)〕、サンガ一法〔Sanger,F.,Ni
cklen,S. and Coulson,A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74,5463(1977) 〕等の方法を用いて、確認することがで
きる。なお、これらの原理を応用した塩基配列自動解析
装置〔例えば、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer，ABIM
odel３７３A （両者ともPERKIN ELMER社製）、ALF ＤＮ
Ａ Sequencer II （Pharmacia 社製）等〕を用いて塩基
配列の確認を行うことも勿論可能である。

【００３６】また、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を駆使し
て、目的とする特定領域（少なくともＶＰ６タンパク質
のコード領域）のｃＤＮＡを特異的に増幅させて、目的
とする領域のロタウイルスの遺伝子を、直接的に、か
つ、効率良く相当量得ることも可能である。

【００３７】上記の方法で得たロタウイルス遺伝子の一
部又は全部の塩基配列をもとに、いわゆる部位特異的変
異法等の通常公知の遺伝子の塩基配列の変更手段を駆使
ずることで、前記の工程により調整したロタウイルス遺
伝子の塩基配列の一部を改変して、その遺伝子を基に産
生され得るタンパク質のアミノ酸配列を変更することも
可能である。このようなロタウイルス遺伝子の一部を人
為的に変更した遺伝子を、後述する植物への導入遺伝子
として用いることは、本発明の技術的範囲に含まれるこ
とを本発明者は認識する。

【００３８】次いで、上記のごとくして得られたロタウ
イルスの遺伝子のうち、少なくともＶＰ６遺伝子を植物
に導入する前提として、このＶＰ６遺伝子等を植物に導
入して、かつ、発現させることが可能な発現ベクター
（本発明発現ベクター）を作出することが必要である。

【００３９】本発明発現ベクターは、上述したように、
ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコードする遺伝子を
含む、このウイルス遺伝子の植物における発現ベクター
であり、必須の要素として、ロタウイルスのＶＰ６タン
パク質をコードする遺伝子（以下、特に断わらない限
り、ＶＰ６遺伝子という）を含む遺伝子発現ベクターで
ある。そして、このロタウイルスのＶＰ６遺伝子の他
に、必要に応じて、例えば、カリフラワーモザイクウイ
ルスの３５S プロモーター、イネアクチンプロモータ
ー、イネワキシープロモーター等の植物で機能するプロ
モーター配列；何えば、トウモロコシのAc／Dsトランス
ポゾン、ヒマカタラーゼのイントロン配列等の植物体内
での遺伝子発現調節に関与する配列；例えば、ノパリン
ターミネーター、３５S ターミネーター等のターミネー
ター配列；大腸菌やアグロバタテリウム菌体内での自己
複製に必要な複製起源配列等を含みうるものである。ま
た、必要に応じて、ＶＰ６遺伝子以外のロタウイルスを
構成するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。

【００４０】また、上記のＶＰ６遺伝子を組み込んだ本
発明遺伝子発現ベクターと、ＶＰ６遺伝子以外の、核粒
子等のロタウイルスを構成するタンパク質をコードする
遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを組み合わせて
用いて、植物細胞にＶＰ６遺伝子と他のロタウイルスを
構成するタンパク質をコードする遺伝子を導入すること
も可能である。

【００４１】本発明発現ベクターの具体的な態様は、後
述する実施例において記載する。

【００４２】この本発明発現ベクターを用いて、上述の
ロタウイルス遺伝子を植物に導入し、この植物を形質転
換することにより、この植物細胞ないし植物体内で、組
み込んだウイルス遺伝子産物を発現させることが、本発
明の主要な目的の一つである。

【００４３】先ず、上述のロタウイルス遺伝子を導入す
る対象となる植物は特に限定されず、例えば、イネ科植
物では、イネ（水稲、陸稲）、イタリアンライグラス、
ソルガム等を；マメ科植物では、アカクローバー、シロ
クローパー、アズキ、ダイズ、アルファルファ等を；ナ
ス科植物では、ジャガイモ、タバコ、トマト等を広く例
示することができる。なお、上述のロタウイルス遺伝子
を導入して発現させる植物が、家畜やヒトにおいて、実
生、塊茎、葉等が食用可能な、経口摂取され得る植物で
あることが、経口摂取により、技術的にも経済的にも容
易に免疫誘導するという目的に最も適合し、かつ、好ま
しい。

【００４４】本発明発現ベクターを植物に導入する方法
は、通常公知の方法を用いて行うことができる。例え
ば、アグロバクテリウムによる導入方法〔Horsch R.B.e
t al.,Science 227,1229-1231(1985) 、Hiei,Y.et al.,
Plant J. 6. 271-282(1994)〕、日的の植物体から通常
公知の方法を用いてプロトプラストを調整し、このプロ
トプラストにエレクトロポレーション法（Fromm,M.et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824-5828）、ポリエチ
レングリコール法（Zhang,W.and Wu，R. Theor.Appl.Ge
net 76,835-840(1988)〕等を用いる方法、例えば、パー
ティクルガン法〔Gordon−kamm,WJ.et al.,Plant Cell
2,603(1990) 〕、組織または胚を本発明発現ベクターの
溶液に浸す方法〔Topfer.R.et al., Plant Cell 1, 133
(1989)〕等を挙げることができる。

【００４５】本発明発現ベクターの導入操作を行った植
物細胞群において、ロタウイルス遺伝子が組み込まれた
植物細胞の選抜は、適切なマーカー遺伝子、又はこれを
含んだベクターを同時に植物への導入し、このマーカー
遺伝子等が導入された植物細胞群をまず選抜して、ロタ
ウイルス遺伝子が導入された植物細胞の存在確率を高め
る等の補助的な手段を講ずることが好ましい。このよう
なマーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、
ハイグロマイシン耐性遺伝子、除草剤パスタ耐性遺伝子
（bar 遺伝子）等を挙げることができる。

【００４６】このようにして、上述のロタウイルス遺伝
子が組み込まれた、本発明植物体細胞を製造することが
できる。

【００４７】次に、本発明植物体細胞から植物体への再
分化方法および増殖方法について説明する。

【００４８】上記のように製造した上述のロタウイルス
遺伝子を導入した本発明植物体細胞（群）からの植物体
の再分化は、常法を用いて行うことができる。

【００４９】例えば、再生能、分裂能の旺盛な懸濁培養
細胞からプロトプラストを分離し、培養する方法〔Yama
da,Y.et al.,Rice genetics newsletter 2,94(1985)
〕、アガロースビーズ法とナース培養法〔Kyozuka, J.
et al.,Mol.Gen Genet,206,408(1987)〕、リーフディス
ク法〔De Block,M.et al.,Thero.appl.Genet.76,767-77
4(1988) 〕、チューバーディスク法〔Sheerman,S.et a
l.,Plant Cell Reports 7,13-16(1988)〕等の方法を利
用することができるが、これらに限定されるものではな
い。

【００５０】そして、これらの方法により幼植物体が得
られた時点で、この幼植物体を馴化用培土等に鉢上げし
て馴化する等により、所望する植物体（本発明植物体）
を得ることができる。

【００５１】なお、本発明において、植物体とは、植物
の根、茎、葉、花、実（種籾）、塊茎を総称するもので
ある。従って本発明植物体の技術的範囲は、ロタウイル
ス遺伝子を導入して作出した種苗のみならず、その収穫
物にも及ぶものである。

【００５２】また、本発明において、植物体細胞とは、
プロトプラスト及びカルスの両者を含むものである。従
って、本発明植物体細胞の技術的範囲には、その植物の
プロトプラストおよびカルスの両者を含むものである。

【００５３】ここまで述べた一連の本発明植物体細胞な
いし本発明植物体の作出工程等の具体的な態様について
は、後述する実施例において具体的に説明する。

【００５４】上記の工程を経て作出された本発明植物体
が、自殖、他殖が可能な場合、通常公知の交配手法を用
いてＦ１植物体を作出することが可能であり、本発明植
物体の特徴は、安定して後代に遺伝する。

【００５５】次に、上記のようにして得られた、本発明
植物体ないし同植物体細胞からの、本発明ウイルスのタ
ンパク質の製造方法について説明する。

【００５６】前述のように、本発明植物体（本発明植物
体細胞を含む）では、その植物体内で、遺伝子として組
み込んだロタウイルスのタンパク質が発現される。

【００５７】本発明ウイルスのタンパク質は、本発明植
物体（本発明植物体細胞を含む）において、組み込んだ
上述のロタウイルス遺伝子が発現している部位であれ
ば、根、茎、葉、花、実（種籾）、塊茎、カルス等、ど
この部分であっても、どの分化段階であっても、その原
材料として用いることができる。なお、カルスは、通年
タンク内で培養できることから、本発明ウイルスのタン
パク質の抽出材料としては好ましい素材である。

【００５８】これらの原材料から、本発明ウイルスのタ
ンパク質は、常法により抽出することができる。例え
ば、これらの原材料を適当な緩衝液とともに磨砕するこ
とにより、本発明ウイルスのタンパク質の粗抽出液を得
ることができる。例えば、これらの原材料を磨砕し、こ
の磨砕液に速心分離を施し、遠心上清液を得て粗抽出液
とすることができる。次いで、この粗抽出液に硫酸アン
モニウム等のタンパク質沈殿剤を加え、目的とする本発
明ウイルスのタンパク質を沈殿物として得ることができ
る。

【００５９】本発明ウイルスのタンパク質の用途によっ
ては、この粗抽出の段階でも目的を達成することができ
るが、更に高い純度を所望する場合は、透析、限外濾
過、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフイー、アフイニティークロマトグラフィー、電気泳
動又はこれらの方法を組み合わせて精製をすることがで
きる。

【００６０】かかる精製方法は、例えば、バキュロウイ
ルスベクターで昆虫細胞内で発現させたＶＰ６タンパク
質を抽出する公知の方法〔Tosser,G.et al.,Virology 6
6,5825-5831(1992) 〕に準じて行うことができる。すな
わち、得られた本発明ウイルスのタンパク質の沈殿物
を、特定の酸性緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対して透
析を行い、透析後の試料に対して超遠心分離を行い、そ
の上清を陰イオンカラムクロマトグラフィーで分画する
ことが可能である。

【００６１】上述のように、本発明ウイルスのタンパク
質として、ＶＰ６タンパク質を選択し、免疫抗原とする
ことにより、効率的に動物（ヒトを含む）に免疫誘導を
行うことができる。

【００６２】驚くべきことに、本発明植物体（本発明植
物体細胞を含む）では、ロタウイルスが本来動物を宿主
とするウイルスで、動物細胞内で複製、増殖するウイル
スであるにもかかわらず、自然界ではあり得ない非宿主
である植物体内でその遺伝子産物を発現させることがで
きるのである。

【００６３】しかも、本発明ウイルスのタンパク質を通
常公知の方法で免疫動物に接種することにより、この免
疫動物から、本発明ウイルスのタンパク質を保有するロ
タウイルスに対する抗体（ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体：本発明抗ウイルス抗体）を得ることが
できる。

【００６４】本発明抗ウイルス抗体は、本発明ウイルス
のタンパク質を免疫抗原として、通常公知の方法で製造
することができる。

【００６５】ここで使用される免疫抗原としての本発明
ウイルスのタンパク質は、特に限定されるものではな
く、上記のごとく調製される本発明ウイルスのタンパク
質を用い得ることは勿論のこと、本発明ウイルスのタン
パク質の部分ペプチドをも本発明抗ウイルス抗体を製造
する上での免疫抗原とすることができる。

【００６６】免疫される動物は特に限定されるものでは
なく、マウス，ラット等を広く用いることができるが、
本発明抗ウイルス抗体がモノクローナル抗体である場合
には、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。

【００６７】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹
腔内注射等で投与することにより行うことができる。

【００６８】より具体的には、上記免疫抗原を所望によ
り通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動
物に２〜１４日毎に上記手段により数回投与し、ポリク
ローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル
抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を
得ることができる。

【００６９】本発明抗ウイルス抗体がモノクローナル抗
体である場合には、上記のように免疫した動物の免疫細
胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、こ
れにより本発明ウイルスのタンパク質を認識する抗体を
産生するクローンを選択し、このクローンを培養するこ
とにより製造することができる。

【００７０】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００７１】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００７２】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００７３】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００７４】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００７５】このようにして得られる本発明ウイルスの
タンパク質を認識する所望のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養すること
が可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存すること
もできる。

【００７６】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００７７】このようにして得られる本発明抗ウイルス
抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体共）
は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラ
フィー等の通常の手段により精製することができる。

【００７８】このようにして得られる本発明抗ウイルス
抗体は、本発明ウイルスのタンパク質に特異反応性を有
する抗体である。

【００７９】本発明抗ウイルス抗体を用いて、動物（ヒ
トを含む）のロタウイルス病診断薬を常法を用いて製造
することができる。

【００８０】また、上述のように動物（ヒトを含む）に
対して、本発明ウイルスのタンパク質を免疫抗原とする
ことにより、その動物に免疫誘導をかけることも可能
（上記の免疫誘導方法が、本発明免疫方法である）であ
り、この現象を、ロタウイルスに対するワクチンの構成
原料として本発明ウイルスのタンパク質を用いることが
可能である。

【００８１】また、本発明ウイルスのタンパク質を発現
する本発明植物体を、免疫誘導対象に、直接経口接種さ
せることにより、容易に免疫誘導を図ることが可能であ
る。

【００８２】すなわち、本発明は、本発明植物体を直
接、経口ワクチンとして用いる途を与える発明である。

【００８３】

【実施例】以下、実施例により、本発明をより具体的に
鋭明するが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例によ
り限定されるべきものではない。 Ａ．ロタウイルス２２Ｒ株の遺伝子の取得 1 ．ウイルス粒子の精製 1986年に北海道立新得畜産試験場で飼養されていたヘレ
フオード雄子牛から採取した下痢便に、10％（w ／v ）
になるようにイーグル培地（GIBCOBL 社製）を加えて攪
拌し、3000回転で10分間の遠心分離（KUBOTA KS-5000）
を行い、乳剤上清を得た。この上清に、10μg ／mLにな
るようにトリプシン（シグマ社製）を加え、37℃で30分
間感作させた。これを、サル腎臓由来株化細胞（ＭＡ１
０４）に接種して、37℃で1 時間吸着させた後、1 μg
／mLのトリプシンを含むイーグル培地を添加して３〜４
日間回転培養した。同様の方法で３代継代培養し、細胞
変性効果を示すロタウイルスを分離した。分離ウイルス
をプラーク純化法により純化し、ウシロタウイルス２２
Ｒ株と命名した。

【００８４】ウシロタウイルス２２Ｒ株感染培養液を10
000gで20分間の遠心分離（KUBOTATA‐6rotorを用いた）
を行い、得られた上清を25000rpmで２時間の超遠心分離
（日立RT‐50T2を用いた）し、これにより得られた沈殿
を、トリス緩衝液（0.05M トリス、0.1M塩化ナトリウ
ム、1mM 塩化カルシウム,pH7．5 ）に懸濁後、30％蔗糖
溶液に重層し、250OOrpmで２時間の超遠心分離（日立SR
P40rotorを用いた）を行った。得られた沈澱を、少量の
トリス緩衝液に懸濁し、部分純化ウイルスとした。

【００８５】このウシロタウイルス２２Ｒ感染株は、２
２Ｒ株がＡ群である証明は、２２Ｒ株が市販の抗Ａ群ロ
タウイルス血清（ＤＡＣＯ ＪＡＰＡＮ社製等）と反応
することから、群特異抗原（群特異エピトープ）で、Ａ
群に分類されるべきロタウイルスであることが明らかに
なった。

【００８６】２．ウイルスＲＮＡの抽出 上記の操作により得られた部分純化ウイルス溶液に、TE
緩衝液（10mMトリスpH8.0 、1mM EDTA）飽和フェノール
溶液を等量加えて激しく攪拌した。これを14000rpmで５
分間の遠心分離（Kubota KM ‐15200 を用いた）し、水
相を分取した。

【００８７】この操作を繰り返した後、水相に等量のク
ロロホルムを加え、攪拌後、再び上記の遠心分離操作を
行い、水相を新たなチューブに移した。これに、１／１
０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と、２．５倍量のエタノ
ールを加え、−２０℃に静置した。14000rpmで５分間の
遠心分離で沈殿を回収後、風乾し、少量のRNase フリー
の滅菌蒸留水に溶解して、ロタウイルス遺伝子ＲＮＡ溶
液とした。

【００８８】３．ロタウイルスVP６遺伝子のｃＤＮＡの
クローニング 上記の操作により得られたロタウイルス全遺伝子ＲＮＡ
を鋳型として、既に報告されているロタウイルス分節遺
伝子の末端保存配列〔Estes M.K. and Cohen J.1989 Mi
crobiol Rev 53:410-449：配列番号１（アミノ酸配
列），配列番号２（塩基配列）〕をもとに作製したプラ
イマー（配列番号３：primer UK VP６U ：５’‐TCTCCC
GGGCTTTTAAACGAAGTCTTC ‐３’、配列番号４：primer U
K VP６D ：５’‐TAGAGCTCGGTCACATCCTCTCACTACG‐
３’）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって、ロタウイル
スVP６タンバク質をコードしている分節遺伝子のｃＤＮ
Ａ断片を増幅した。

【００８９】即ち、１μg のロタウイルス遺伝子ＲＮＡ
に、終濃度１０％になるようにＤＭＳＯを加え、６６
℃、５分間の熱処理を行った。これを、室温で空冷後、
逆転写反応緩衝液（５０mMトリス‐塩酸pH8.3 、４０mM
塩化カリウム、６mM塩化マグネシウム、１mMヂチオスレ
イトール、０．５mM dNTPs、１００pmol UK VP６U prim
erとUKVP６D primer、SuperScriptTM II RNase H‐Reve
rse Transcriptase ２００U を加え、３７℃で６０分間
反応させた。この反応産物の一部をＰＣＲ反応において
用いた。ＰＣＲ反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ T
aqGold（パーキンエルマー社製）を用い、これに添付の
緩衝液および反応試薬を用いて、添付の解説書に記載さ
れた方法に従って行った。熱反応は、９４℃で９分間、
加熱した後、９４℃１分間、６０℃１分間及び７２℃２
分間の熱サイクル反応を、３０サイクル行った。最後に
７２℃で７分間伸長反応を行い、ＰＣＲ反応を終了し
た。

【００９０】上記のＰＣＲ 反応で増幅きれたｃＤＮＡ
断片は、ｐＧＥＭ−Ｔ vector system（Promega 社）を
用い、その方法に従ってサブクローニングを行い、得ら
れたクローンの内、任意に一つのクローンを選択し（pG
EMVP６）、ｃＤＮＡの塩基配列の解析に用いた。

【００９１】すなわち、ｃＤＮＡクローンpGEMVP６のプ
ラスミドＤＮＡのｃＤＮＡ断片部分の塩基配列をサイク
ルシークエンス法〔Nature321,674(1986) 〕により決定
し、既報のロタウイルスVP６塩基配列との高い相同性か
ら、挿入されているｃＤＮＡ断片がウシロタウイルス２
２R 株のVP６遺伝子であることを確認した。

【００９２】上記のｃＤＮＡクローンを、制限酵素Sma
I 及びSaｃI を用いて切断し、得られたウシロタウイル
ス２２Ｒ株のVP６遺伝子ｃＤＮＡ断片を、カリフラワー
モザイクウイルス３５S プロモーター、β−グルクロニ
ダーゼ遺伝子、ノパリンシンターゼターミネーターをも
つプラスミドpBI121（Clontech社製）を制限酵素SmaI及
びSacIを用いて切断した、前記の部位にクローニングし
て、本発明発現ベクターであるプラスミドpBIVP ６を得
た（第１図の本プラスミドの構築図を参照のこと）。

【００９３】なお、この組み換えプラスミドpBIVP ６
は、大腸菌（Escherichia coli HB 101 ）に組み込ま
れ、「Escherincia coli HB101／pBIVP ６」として、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（受
託番号：ＦＥＲＭ−１７００７）。

【００９４】Ｂ．ウシロタウイルス２２Ｒ株VP６遺伝子
のジャガイモヘの導入と発現 １．アグロバクテリウムヘのウシロタウイルス２２R 株
VP６遺伝子の導入 上記のようにして得られた、ウシロタウイルス２２Ｒ株
VP６遺伝子発現プラスミドpBIVP ６を凍結溶解による直
接導入法によって、Agrobacterium tumefaciens LBA ４
４０４（Clontech社製）に導入した。

【００９５】すなわち、Agrobacterium tumefaciens LB
A ４４０４を、５０mLのＬＢ液体培地中（１％ Bacto t
orypton ，０．５％ Yeast extracts ，１％塩化ナトリ
ウム）で、Ａ６００の吸光値が、約１．０になるまで２
８℃で振盪培養した。氷上で冷却後、４℃で3000g の遠
心分離（Kubota RA ‐６を用いた）を行い、集菌後、１
mLの氷冷した２０mM塩化カルシウム溶液に浮遊させた。
これを、０．１mL毎にエッベンドルフチューブに分注し
た。

【００９６】これに組み換えプラスミドpBIVP ６を１μ
g を加え、液体窒素中で急速に凍結した。次に、得られ
た凍結細胞を、３７℃で溶解した後、５分間静置した。
これに、１mLのＬＢ培地を加え、２８℃で２〜４時間振
盪培養した。約10000gで１分間遠心分離（Kubota KM-15
200 を用いた）して集菌し、０．１mLのＬＢ培地に浮遊
させた後、リファンピシン（１００μg ／mL）、カナマ
イシン（２５μg ／mL）及びストレプトマイシン（３０
０μg ／mL）を含むＬＢ固形培地に広げた後、２〜３日
間、２８℃で培養して、pBIVP ６が組み込まれた形質転
換菌を得た。

【００９７】上記で得られた形質転換されたAgrobacter
ium tumefaciens LBA ４４０４は、LB液体培地で２８℃
下で振盪培養後、４℃で3000g の遠心分離（Kubota RA
‐６を用いた）を行い、集菌し、ＭＳ液体培地〔Physio
l,Plant.15:473(1962)〕中に浮遊させ、これを植物の形
質転換操作に用いた。

【００９８】２．アグロバクテリウム法によるジャガイ
モヘの導入 ジャガイモヘのウシロタウイルス２２Ｒ株VP６遺伝子の
導入は、上記において作出したアグロバクテリウムとチ
ユーパーティスク法により行った。

【００９９】すなわち、ジャガイモ塊茎の皮をむき、１
％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５分間殺菌し、滅菌蒸
留水で６回洗浄した。この塊茎から、殺菌したコルクボ
ーラーで直径約１cmの円柱状にくり抜き、さらに２〜３
mm厚の平板状にスライスした。このディスクを、上記
１．で作出したpBIVP ６を保有するAgrobacterium tume
faciens LBA ４４０４のMS液体培地懸濁液に１５分間浸
した。この後、MS培地〔３％蔗糖、０．１μg ／mLイン
ドール酢酸、０．１μg ／mLジベレリン、０．１μg ／
mLアブシジン酸、２μg ／mLゼアチンリボシドを含む
（pH５．９）〕上で、２８℃で３日間培養後、抗生物質
カナマイシン１００μg ／mL及びカーベニシリン５００
μg ／mL（いずれもシグマ社製）を含むＭＳ液体培地で
ディスクを洗浄した。

【０１００】洗浄後のディスクは、上記抗生物質を含む
ＭＳ固形培地（３％ 蔗糖を含む）上、２５℃で２週間
毎に継代培養した（１６時間照明、８時間暗期）。培養
４〜８週間目にディスク表面上にカルスが形成され、さ
らに継代培養することによりシュートが誘導された。

【０１０１】このシュートを根本から切り取り、ホルモ
ンを含まないＭＳ固形培地〔３％蔗糖、カナマイシン１
００μg ／mL、カーベニシリン５００μg ／mLを含む
（PH５．９〕上に移植し、培養した。２〜４週間後に発
根してきた植物体は、培養土をいれたポット（径１０c
m）に移植し、人工気象器の中で栽培した。

【０１０２】３．再分化植物体におけるロタウイルス遺
伝子の導入確認および遺伝子の発現確認 （１）ＥＬＩＳＡによるロタウイルス遺伝子発現の確認 再分化したジャガイモの葉を、生重の３倍量のＰＢＳ−
Ｔ緩衝液（１３５mM塩化ナトリウム、１．５mMリン酸二
水素カリウム、２．７mM塩化ナトリウム、０．５％（ｖ
／v ）Tween20 ,pH ７．２）で磨砕後、3000g で１５分
間の遠心分離（Kubota KS-5000を用いた）により得られ
た上清を粗汁液とした。

【０１０３】０．０５M の炭酸ナトリウム緩衝液（１リ
ットル中、炭酸二ナトリウム１．５９g 、炭酸水素ナト
リウム２．９３g 、アジ化ナトリウム０．２g 、 pH
９．６）で、５μg ／mL濃度に希釈した抗ロタウイルス
ポリクローナル抗体（Virostat社製：NCDV由来）を、イ
ムノプレート（Nunc社製、Maxisope）に分注し、室温で
数時間静置してコーティングした。

【０１０４】コーティングしたプレートをＰＢＳ−Ｔ緩
衝液で３回洗浄後、葉の粗汁液をプレートに分注し、６
℃で一晩静置して抗体と反応させた。このプレートをＰ
ＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４００倍
希釈したＨＲＰＯ標識抗ロタウイルス抗体（Virostat社
製又はＤＡＫＯ社製）をプレートに分注し、３７℃で３
時間反応させた。このプレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３
回洗浄後、基質溶液（１リットル中、クエン酸一水和物
７g 、リン酸一水素ニナトリウム１２水 ２３．９g 、
Ｏ−フェニレンジアミン０．５g 、過酸化水素水１mLを
含む）をプレートに添加して室温で反応させた。反応
は、停止液（５％硫酸水溶液）で停止後、Ａ４９３の吸
光値をマイクロプレートリーダー（Bio ‐Rad model ２
５５０ EIAreader ）で測定した。その結果、いくつか
の再分化ジャガイモ個体でロタウイルスのタンパク質が
発現していることが明らかになった（第２図参照のこ
と）。

【０１０５】（２）導入したロタウイルス遺伝子産物の
ジャガイモ体内での転写の確認 ＥＬＩＳＡで反応の認められた、いくつかの個体の葉
を、液体窒素存在下で乳鉢を用いてパウダー状に磨砕し
た。これに試薬ISOPLANT（ニッポンジーン社製）を、そ
の説明書の記載に従って用い、前記のジャガイモの葉の
全ＲＮＡの抽出を行った。抽出したＲＮＡ ４μg を鋳
型にプライマーVP６＋３０３（５’‐ACGTATGTATGGATGA
GATGG ‐３’：配列番号５）とプライマーVP６‐９２５
（５’‐GTCATATTTGGTGGTCTCATC ‐３’：配列番号６）
を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。このＲＴ−ＰＣＲに
は、One-stepＲＴ−ＰＣＲ kit（TAKARA社製）を用い、
９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃１分間の熱サイ
クル反応を３５サイクル行った。この熱サイクル反応に
は、サーマルサイクラー（TAKARA MP −３０）を使用し
た。反応後の試料の一部を、２％アガロースゲル電気泳
動した結果、ロタウイルス転写産物から増幅されてくる
位置にバンドが確認され、これらのジャガイモ体内でロ
タウイルス遺伝子が転写されていることが確認された
（第３図の電気泳動図参照のこと：図中、矢印は、VP６
転写産物由来のバンドの位置を示す）。

【０１０６】（３）ロタウイルス遺伝子導入ジャガイモ
の抗原性の確認 ロタウイルス遺伝子が発現しているジャガイモの葉にＰ
ＢＳ−Ｔ緩衝液を加えて乳鉢で磨砕した。この磨砕液
を、10000gで２０分間の遠心分離後（Kubota RA‐６rot
or を用いた）、得られた上清を更に、100000g で５．
５時間の超遠心分離（Beckman Ti‐６０rotor を用い
た）した。この超遠心分離により得られた上清を、限外
濾過膜（amicon YM-３０）を用いて１／１００量まで濃
縮し、マウスの腹腔内注射に用いた。

【０１０７】すなわち、上記の方法で調製した材料０．
５mLに、等量のフロインドの完全アジュバント（シグマ
社製）を混和し、BALB／ｃマウス雄２匹の腹腔内に０．
５mLずつ接種した。次いで２週後に、本材料０．５mLを
等量のフロインドの不完全アジュバント（シグマ社製）
に混和後、その０．５mLを同マウスの腹腔内に再度接種
した。各接種時ならぴに２回目接種２週後に血液を尾動
脈から採取し、遠心分離により血清を得た。血清を５６
℃に３０分間静置し非動化した後、抗体検査に用いた。

【０１０８】９６穴マイクロプレート（コーニング社
製）で培養したＭＡ１０４細胞に、ロタウイルス２２Ｒ
株を接種して、３７℃で２０時間培養後、アセトン固定
を行い、ウイルス感染細胞を得た。この感染細胞に、上
記の血清をＰＢＳ緩衝液で、１０倍希釈したものから、
順次２倍階段希釈したものを、各ウエル当たり０．０５
mL添加した。これを３７℃で３０分間反応後、ＰＢＳ緩
衝液で２回洗浄した。

【０１０９】これにＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（和光
純薬社製）を、各ウエル当たり０．０５mL添加し、３７
℃で３０分間反応させた。

【０１１０】これをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄後、蛍光顕
微鏡（オリンパス社製）で観察し、感染細胞が特異蛍光
を呈する最高血清希釈数の逆数をロタウイルス抗体価と
した。

【０１１１】この試験の結果を第１表に示す。

【０１１２】 第 １ 表 ──────────────────────────────────── マウスの個体番号 １回目接種時 ２回目接種時 ２回目接種２週間後 ──────────────────────────────────── Ｎｏ．１ ＜１０ ４０ ３２０ Ｎｏ．２ ＜１０ ３２０ １２８０ ──────────────────────────────────── 第１表より、初回接種時においては両マウスとも抗体価
１０未満であったが、第２回接種２週後には、抗体価が
３２０−１２８０を示し、ロタウイルスのＶＰ６タンパ
ク質をコードする遺伝子を導入したジャガイモの免疫原
性が確認された。

【０１１３】

【発明の効果】本発明により、（Ｉ）ロタウイルスのＶ
Ｐ６タンパク質をコードする遺伝子を含む植物細胞、
（II）この植物細胞に、ロタウイルスのＶＰ６タンパク
質をコードする遺伝子を発現させ得る発現ベクター、
（III）上記の植物体で構成される植物体、（IV）この
植物体を交配することによりＦ１植物体を作出する、植
物体の増殖方法、(V) この植物体又は植物体細胞から単
離して得られるロタウイルスのＶＰ６タンパク質、(VI)
このロタウイルスのＶＰ６タンパク質に対する抗体及び
(VII) このロタウイルスのＶＰ６タンパク質を、動物に
投与し、この動物に、このウイルスに対する免疫を付与
する方法が提供され、その結果、コストパフォーマンス
に優れたロタウイルスに対するワクチンを開発する途が
提供される。

【０１１４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４６８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：ポリペプチド 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp 16 Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln 32 Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr 48 Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly 64 Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr 80 Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys 96 Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln 112 Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Arg Phe Lys Arg Ile Asn 128 Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg 144 Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr 160 Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu 176 Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly 192 Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe 208 Glu His Val Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr 224 Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser 240 Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro 256 Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr 272 Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile 288 Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val 304 Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Val 320 Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala 336 Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu 352 Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr 368 Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg 384 Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys 397

【０１１５】 配列番号：２ 配列の長さ：１３５６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 GGCTTTTAAA CGAAGTCTTC AACATGGATG TCCTGTACTC CTTGTCAAAA ACTCTTAAAG 60 ATGCTAGAGA CAAAATTGTC GAAGGCACAC TATACTCCAA TGTGAGTGAT CTAATTCAAC 120 AATTTAATCA AATGATAATT ACTATGAATG GAAATGAGTT CCAAACTGGA GGAATTGGTA 180 ATCTACCAAT TAGAAACTGG AATTTTGATT TTGGATTACT TGGAACAACT CTACTGAATT 240 TAGACGCTAA CTACGTCGAA ACAGCCCGCA ATACAATTGA TTATTTTGTA GATTTTGTAG 300 ATAATGTATG CATGGACGAA ATGGTTAGAG AATCGCAAAG AAATGGAATT GCACCACAAT 360 CAGATTCACT TAGAAAGTTG TCAGGTATTA GATTTAAAAG AATAAATTTT GATAATTCAT 420 CGGAATACAT AGAGAACTGG AACTTGCAAA ATAGAAGACA GAGAACAGGT TTTACATTTC 480 ATAAACCGAA CATTTTCCCT TATTCAGCGT CATTCACACT GAACAGATCT CAACCGGCGC 540 ATGATAACTT GATGGGTACG ATGTGGCTGA ACGCGGGATC AGAAATCCAG GTCGCTGGAT 600 TCGATTATTC ATGTGCAATT AATGCGCCAG CTAATACACA ACAATTTGAG CATGTTGTAC 660 AGCTCCGAAG AGTGTTAACT ACAGCTACAA TAACCCTTTT ACCAGATGCA GAAAGATTTA 720 GTTTTCCAAG AGTGATTAAT TCAGCTGACG GAGCAACTAC ATGGTATTTC AACCCAGTGA 780 TTCTTAGACC AAACAACGTT GAAGTAGAGT TTTTACTAAA CGGGCAGATA ATAAATACTT 840 ACCAGGCAAG ATTTGGAACA ATTATAGCTA GAAATTTTGA TACAATCAGA TTGTCGTTTC 900 AGTTGATGAG ACCACCAAAT ATGACACCAG CGGTAGCGGC GTTATTTCCA AATGCGCAGC 960 CATTTGAACA TCATGCTACA GTAGGACTCA CACTTAGGAT TGAATCTGCA GTTTGTGAAT 1020 CTGTACTTGC CGACGCAAGC GAAACAATGC TAGCAAATGT GACGTCTGTT AGACAAGAAT 1080 ACGCGATACC AGTTGGACCA GTCTTTCCGC CAGGTATGAA TTGGACTGAT TTGATCACTA 1140 ATTATTCACC GTCTAGAGAG GATAACTTGC AGCGTGTATT TACAGTGGCT TCCATTAGAA 1200 GCATGCTTGT CAAATGAGGA CCAAGCTAAC CACTTGGTAT CCGACTTTGG TGAGTATGTA 1260 GCTACGTCAA GCTGTTTGAA CTCTGTAAGT AAGGATGCGT CTACGTATTC GCTACACAGA 1320 GTAATCACTC AGATGACGTA GTGAGAGGAT GTGACC 1356

【０１１６】 配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 TCTCCCGGGC TTTTAAACGA AGTCTTC 27

【０１１７】 配列番号：４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 TAGAGCTCGG TCACATCCTC TCACTACG 28

【０１１８】 配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 ACGTATGTAT GGATGAGATG G 21

【０１１９】 配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 起源：ロタウイルスゲノム遺伝子 配列 GTCATATTTG GTGGTCTCAT C 21

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明発現ベクターの構築図である。

【図２】ロタウイルスのＶＰ６遺伝子を導入した遺伝子
組換えジャガイモにおけるＥＬＩＳＡの結果を示す図面
である。

【図３】ロタウイルスのＶＰ６遺伝子を導入した遺伝子
組換えジャガイモにおけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電
気泳動図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西森 知子 北海道札幌市豊平区羊ケ丘５家衛試宿舎Ｋ ３−１ (72)発明者 今井 邦俊 北海道札幌市豊平区羊ケ丘５家衛試宿舎Ｋ ９ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 AD08 CA06 CA07 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD09 CD10 CD13 CD17 CD21 4B024 AA01 AA14 BA32 BA51 DA01 FA10 GA21 4B064 AG01 AG26 AG32 CA11 CA12 CA19 CC24 DA03 DA15 4B065 AA88X AA95Y AB01 BA02 BA12 BA25 CA45 CA46 4C085 AA03 BA56 CC01 CC02 CC08 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA01 DA75 DA86 EA29 EA31 EA53 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくともロタウイルスのＶＰ６タンパク
   質をコードする遺伝子が、自己の遺伝子中に組み込まれ
   ている植物体細胞。
2. 【請求項２】ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコード
   する遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の全
   部又は一部をコードする遺伝子である、請求項１記載の
   植物体細胞。
3. 【請求項３】ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコード
   する遺伝子が、配列番号２で表される塩基配列を含む遺
   伝子である、請求項１記載の植物体細胞。
4. 【請求項４】ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコード
   する遺伝子を含む、請求項１乃至３のいずれかの請求項
   記載の植物体細胞における発現ベクター。
5. 【請求項５】請求項１乃至３のいずれかの請求項記載の
   植物体細胞で、全部又は一部が構成されている植物体。
6. 【請求項６】請求項５記載の植物体を交配することによ
   りＦ１植物体を作出する、植物体の増殖方法。
7. 【請求項７】請求項４記載の発現ベクターに含まれてい
   る、ロタウイルスのＶＰ６タンパク質をコードする遺伝
   子が自己の遺伝子の中に組み込まれている植物体又は植
   物体細胞から単離して得られるロタウイルスのタンパク
   質。
8. 【請求項８】請求項７記載のロタウイルスのタンパク質
   に対する抗体。
9. 【請求項９】請求項７記載のロタウイルスのタンパク質
   を、動物に投与し、この動物に、前記ロタウイルスに対
   する免疫を付与する方法。