JP2015015931A - ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10%以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。
【選択図】 なし
Description
(1)ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10%以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。
(2)昆虫細胞の培養期間が、5日以上であることを特徴とする(1)に記載の製造方法。
(3)ウイルスが、カリシウイルス科に属するウイルスであることを特徴とする(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)ウイルスが、ノロウイルスであることを特徴とする(1)又は(2)に記載の製造方法。
(5)ウイルスの核酸配列が、ノロウイルスの構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする(4)に記載の製造方法。
(1)実験方法
1 組換えバキュロウイルスの作製
GII-4に分類されるノロウイルスのウイルス株(タンペレ大学の入院患者から採取)のVP1(アミノ酸配列を配列番号1に示す。)をコードするcDNAをトランスファープラスミドpFastBac(Invitrogen)に組み込んだ。次にcDNAを組み込んだトランスファープラスミドを、バキュロウイルスゲノムDNAを保持する大腸菌であるDH10Bac(Invitrogen)に導入し、相同組換えによってノロウイルスVP1をコードするcDNAをバキュロウイルスゲノムDNAに組み込んだ。大腸菌からバキュロウイルスゲノムDNAを抽出精製し、昆虫細胞(expresSF+細胞、Protein Sciences)に導入して培養した。この培養上清から組換えバキュロウイルスを得た。
組換えバキュロウイルを昆虫細胞(expresSF+細胞)(1x106/mL)にMOI=1となるように播種した。expresSF+細胞の培養は、培地としてPSFM培地を用い、27℃で行った。組換えバキュロウイル播種後1日毎に培養液を1mL分取し、5000×g, 5分間遠心分離し、培養上清と細胞ペレットに分けた。
培養上清には250μLの5×DB(300mmol/L Tris-HCl pH6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 0.5% BromoPhenolBlue, 500mmol/L DTT)を混合した。細胞ペレットは1×DB(5×DBを蒸留水で5倍希釈したもの)1250μLに溶解した。両者を95℃5分間加熱後、10μLを1レーンにアプライし、200V、 35分間電気泳動した。
図1に電気泳動の結果を示す。図中の「dpi」はdays post infectionの略で、播種後培養何日目のサンプルかを示す。左から2番目GII-4 500ngのレーンは、精製したGII-4 VP1を1×DBで希釈し、50ng/μLとしたものを10μLアプライしたものを示す。
バイオリアクターを用いてexpresSF+細胞を培養した。培地はPSFM培地を用い、培養時の温度は27℃とした。GII-4 VP1発現バキュロウイルスを、播種する直前、及び播種後1から6日目に培養液を採取し、生死細胞オートアナライザー(Vi-CELL XR, ベックマン・コールター)を用いて生細胞数、総細胞数、細胞径、生存率を計測した。
Claims (5)
- ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10%以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。
- 昆虫細胞の培養期間が、5日以上であることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- ウイルスが、カリシウイルス科に属するウイルスであることを特徴とする請求項1又は2に記載の製造方法。
- ウイルスが、ノロウイルスであることを特徴とする請求項1又は2に記載の製造方法。
- ウイルスの核酸配列が、ノロウイルスの構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする請求項4に記載の製造方法。
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