JP2003533964A - バキュロウイルスベクター発現系におけるタンパク質の発現 - Google Patents
バキュロウイルスベクター発現系におけるタンパク質の発現Info
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Abstract
Description
プチドの発現を増加するための方法に関する。組換えDNA技術が開発されたと
き、遺伝子改変された細菌を使用する大規模のタンパク質生成に関して期待が高
かった。しかし、大多数の商業的に魅力的なタンパク質は、それらが生物学的に
活性なタンパク質になり得る前に翻訳後修飾を必ず受ける。したがって、動物細
胞が、組換えタンパク質を生成するために現在より頻繁に使用される。
。昆虫細胞を使用する簡便なおよび用途の広いバキュロウイルスベクター系が開
発された。昆虫細胞の生理学に対する情報はかなり少ないが、バキュロウイルス
組換え技術を介して生成されるワクチンは一般に十分に受容される。1つの例は
、臨床試行において可能なAIDSワクチンとしてのヒト免疫不全ウイルスI型
の、バキュロウイルスにより発現されるgp160エンベロープタンパク質の使
用である。
大規模の生成は、約10リットルまでのバイオリアクターに制限される。規模を
大きくするために、懸濁培養は最も良好な可能性を提供する。大規模生成におい
て(Tramperら、Rec.Adv.Biotech.、1992、263
〜284;PowerおよびNielsen、Cytotechnology
20:209〜219、1996を参照のこと)、特別な重要視が細胞増殖およ
びウイルス生成を影響する因子に与えられるべきである。このような因子の変化
は、組換えタンパク質の生成の最終的なレベルを大きく影響する。
徴付けられる。
徴づけられる(多角体としてまた呼ばれる)。バキュロウイルス科は、閉塞ウイ
ルス:核多角体病ウイルス(NPV)および顆粒症ウイルス(GV)の2つの属
を含有する真正バキュロウイルス、ならびに非閉塞ウイルスを含有するヌードバ
キュロウイルス亜科の2つの亜科に分けられる。Autographa cal
ifornica(Ac)NPVの細胞および分子生物学がより詳細に研究され
た。
感染された昆虫細胞において発現されてきた。コードすることは、このようなウ
イルスが非相同タンパク質をコードする核酸配列を提供され、そしてしばしば、
プロモーターのような調節核酸配列をさらに提供されることを意味する。最も頻
繁には、ポリヘドリンプロモーターが外来遺伝子を発現するために使用されるが
、p10プロモーターは等しく十分に適切であり、そして同様に使用される。
胞株SF−21は、アワトウヨウの幼虫(Spodoptera frugip
erda)の卵巣組識に由来した。アメリカンタイプカルチャーコレクション(
CRL 1711)から利用可能であるクローン単離物のSF−9は、組換えウ
イルスのインビトロ生成のためのおおむね標準的な細胞株であり、そして組換え
ウイルスを生成することにおいて優れていると言われる。他の細胞株は、たとえ
ば、Hi−Five細胞株ならびにイラクサキンウワバ(Trichoplus
ia ni)から得られるTn−368およびTn−368A細胞株である。昆
虫細胞が増殖する最も広範に使用される培地としては、TNM−FH、BML−
TC/10、およびIPL−41が挙げられる。これらの培地は、通常、哺乳動
物血清、特に胎児ウシ血清のようなおおむね規定された成分で補充される。血清
置換はまた、昆虫細胞培養に適用されており、そしてEx−Cell 400(
商標)およびSf900のような血清非含有培地が市販される。
で増殖される場合にウイルスのより高い収量を与えることが報告される。感染は
、細胞が指数関数増殖期において感染される場合に最も効果的であるが、細胞当
たりの生成される多角体およびウイルスの量は、細胞周期の異なる段階で感染さ
れた細胞間で有意に変化しない。細胞密度は、ウイルス生成に対して大きな影響
を有する。昆虫細胞は接触阻害の形態を示し得、より高い細胞密度で減少された
ウイルス生成を生じる。
、一般に感染の終了時での感染された細胞の画分および細胞当たりの多角体の数
の両方に影響する。ウイルス生成についての至適なm.o.i.は一般に、約2
0〜30であると考えられる。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えバキュロ
ウイルスでの研究(LicariおよびBailey、Biotech.Bio
eng.、37:238〜246、1991)において、Sf−9細胞は、0と
100との間のm.o.i.値で感染された。β−ガラクトシダーゼの収量は増
加され、そして細胞密度は、m.o.i.の増加とともに減少した。m.o.i
.を増加することおよび減少することは、感染された細胞当たりの組換えタンパ
ク質の最大に達成可能な収量に対して制限された効果のみを有すると一般に考え
られる。しかし、低いm.o.i.を選択することは、感染に必要なウイルスス
トックの減少を許容し、そしてバキュロウイルスの欠陥妨害粒子の生成の危険性
を最小にする。昆虫細胞のバッチ培養が高いm.o.i.(>5)で感染される
場合、次の感染プロセスは本質的に同時進行される(すなわち、全ての細胞は、
同時に感染周期を経る)。細胞がバッチ培養においてm.o.i.1〜5で感染
される場合、培養物はもはや同時進行されない。全ての細胞が感染されそして所
望のタンパク質の生成が終わるまで、培養物は、最初は非感染細胞と個々の感染
周期における異なる時点の細胞とからなる。一般的にはこのような培養物におい
て生成レベルははるかに低い。培養物の挙動は、それぞれ生成の異なる相にある
個々の細胞の組み合わせの挙動であり;至適な状態に及ばない生成レベルを説明
する。連続的な培養において、非感染細胞が連続的に添加され、そして培養物は
明らかに非同時進行的に感染される。
連続的な培養系中でウイルスを増殖する場合に観察される挙動のような複雑な挙
動を予測することが可能であると考えられる。同じ現象についての純粋に経験的
な分析は、不可能でないにしても非常に困難であると考えられる。現在、3つの
モデル、Licari & Baileyモデル、de Gooijerモデル
、およびPower & Nielsenモデルが知られる。これらは、それら
の複雑性およびそれらを詳しく開発した努力にもかかわらず、全て第1世代のモ
デルであり、ポリヘドリンプロモーターの制御下で発現されるモデル組換えタン
パク質(β−ガラクトシダーゼ)を発現するバキュロウィルスの挙動について推
論する。これらは、大部分、DNAおよびRNA集積ならびに感染周期を無視し
て、ブラックボックス系としてみる場合、バキュロウイルスと昆虫細胞との間の
相互作用についての本発明者らの定量的な理解をまとめる。結合および最初の感
染プロセスはなお、定量的に十分には理解されておらず、この分野におけるさら
なる研究が非常に必要とされる。
供する。いくつかの細胞培養配置が、大規模生成のために使用され得る。しかし
、これらの系は、それらの可能性の十分な利点を採用するためにさらなる至適化
を必要とする。商業的な適用について、大規模および低コストの生成が極めて重
要である。大規模細胞培養において報告される多角体生成系は、価格競合製品に
ついての商業的要求を満たすために劇的に改善されるべきである。
バキュロウイルス発現系を使用する大規模で組換えタンパク質を生成するための
方法を提供する。本発明は、昆虫細胞培養物において、組換えタンパク質を生成
するおよび組換えタンパク質の収量を改善するための方法を提供し、当該タンパ
ク質をコードする組換えバキュロウイルスを選択する工程、培養容器において増
殖培地中で昆虫細胞を増殖する工程、および0.01未満の感染多重度で細胞を
感染する工程を包含する。
えタンパク質の収量を増加するための方法を提供し、当該タンパク質をコードす
る組換えバキュロウイルスを選択する工程、培養容器において増殖培地中で昆虫
細胞を増殖する工程、および0.01未満の感染多重度を用いて少なくとも1つ
のバキュロウイルスの接種物で細胞を感染する工程を包含する。漸増する収量は
、いくつかの研究グループの主題である。たとえば、Chenら(Drug m
etabolism and Disposition:24 399〜405
頁、1997)は、同時感染アプローチのためにMOIを至適化する可能性を研
究し、これによって2つの異なるバキュロウイルス発現タンパク質が昆虫細胞培
養物において生成された。本明細書中に記載される結果と反対に、彼らは、彼ら
の2つのタンパク質について約0.015〜0.03の最も良好なMOIを見出
した。MOIを0.01未満に減少することにより、Chenらの同時感染系の
収量は減少した。Radfordら(Cytotechnology24、73
〜81、1997)は、同時感染系を研究することによって妨げられず、1より
も大きいMOIが常に最終的なプロセス収量を最大にするために使用されるべき
であることを明らかに示し、本発明の知見に反対することを再度教示する。彼ら
は、低いMOIを使用して細胞当たりより大きな量のタンパク質およびウイルス
を生成することは不可能であることを述べ、そしてその代わりに感染時間(TO
I)を調節することを示唆する。
ように他は、MOIの変化における解決を見出さないが、流加培養法を適用する
ことによって収量を増加することにねらいを向けるか、またはウイルスが増殖す
る温度を変化し(Wuら、Cytotechnology、9、141〜147
、1992;Kingら、Biotechnol.Bioeng、38、109
1〜1099、1991)、そして0.01未満のMOI下でのウイルスの増殖
を回避する。
に異なり(たとえば図1を参照のこと)、本明細書中の記載において培養物は0
.01未満(たとえば、0.003、0.001、またはさらに0.0001)
のMOIで感染され、0.01または0.1のMOIで感染される培養物よりも
高い収量を達成する。
において組換えタンパク質を生成するおよび組換えタンパク質の収量を改善する
ための方法を提供する。小量でバキュロウイルス発現ベクター系においてタンパ
ク質を生成するための従来の実験室の方法は、培養フラスコ中の昆虫細胞の単層
培養物を使用する。これらの静置培養物は、同時進行性の感染を確実にするため
に、通常、高いMOIで感染される。単層がコンフルエントになる前に全ての細
胞が感染されることが極めて重要である。なぜなら、接触阻害が細胞中の代謝変
化に導き、これが最終産物の収量を影響し得るからである。単層培養物中の細胞
密度を正確に確立することは困難であるので、MOI実験を行うことは不可能で
ある。培養物を感染するために低いMOI(0.01未満)を使用することはさ
らにより役に立たない。感染時の細胞密度の過剰評価および過小評価の両方は、
有意に至適な状態に及ばないタンパク質の収量を導く。日常的に、高いMOIを
使用し、これは全細胞集団の同時進行性の感染を保証する。このことは、至適な
収量を達成するために、大量のウイルスストックが単層培養物を感染するために
必要とされることを意味する。
スコを使用することを単に意味する。単層培養物を使用する大量のタンパク質の
生成は、非常に労働集中的である。さらに、溶解された酸素濃度およびpHのよ
うな重要な培養パラメーターを調節および/またはモニタすることは可能でない
。
いMOIが単層培養物以外の昆虫培養物における収量を至適化するために有益で
あるという洞察を提供する。
使用され得る。全ての発酵器設計の目的は、十分な通気および高い細胞密度を達
成するが、可能な限り低い剪断力を維持することである(Tramperら、R
ecent advantages in biotechnology(Va
rdar−SukanおよびSukan編 1992)。文献において記載され
る大多数の場合において、気体噴霧器を備えた攪拌タンクバイオリアクターが使
用される。このタイプの容器において、均一性が回転翼を使用することによって
達成される。このタイプの発酵器は、異なる方法において操作され得る。先ず第
1に、バッチ法である。これは、最も簡単なおよび単純な方法である。細胞が培
養され、ウイルスが添加され、そして産物が感染の終了時に採集される。より複
雑な方法は、流加培養法である。栄養素の濃縮混合物が培養容器に添加され、よ
り高い細胞密度およびより高い容量の産物収量が達成される(Nguyenら、
1993 Journal of Biotechnology 第31巻、2
05〜217頁)。これは制限される栄養素がなんであるのか常には明らかでな
いので、より複雑化される。1つの栄養素制限をこの基質を添加することによっ
て取り消すことにより、別の基質制限が直接的に導かれ得、したがって必ずしも
より高い産物収量が導かれないかもしれない。
ら、1992 Cytotechnology 第9巻 141〜147頁)。
このタイプの容器は2つのシリンダからなる。最も小さな直径を備えるシリンダ
(ドラフト管)は、より大きな直径を備えるシリンダ(降下管)の内側に配置さ
れる。中央のシリンダにおいて空気および別の気体が散布され、上昇流を作製す
る。発酵器の上部で、気体は液体を残し、そして液体は中央のシリンダの外側を
下がる。この方法において、通気および均一性の両方が、ドラフト管および降下
管における密度の差異に起因して気体のみの噴霧を使用することによって達成さ
れる。この方法は、ずり応力を減少し得る。しかし、連続的な通気速度が、正確
な混合を達成するために必要とされる。
別の細胞保持デバイスを含むことによる。これは灌流と呼ばれる。これは、発酵
器中に細胞を保持しながら、発酵器から不用な培地を除去し新鮮な培地を添加す
ることを許容する。この方法は、多くの特別の装置およびより困難な発酵器操作
を生じる(Caronら、1994 Biotechnology and B
ioengineering 第43巻、881〜891頁)。さらに、多孔質
床およびゲルマトリクス中の固定化のような方法が報告される。このタイプの方
法は、マトリクス上のまたは内側の細胞の固定化に依存し、細胞培養物を希釈す
ることなく不用な培地の除去および新鮮な培地の添加を可能にさせる。細胞密度
、接触阻害、および単層培養の他の関連の問題が処理可能である場合、本発明の
方法は、上述の種々の培養系において適用され得るのみでなく、単層培養におい
てもまた適用され得る。
パク質を生成するおよび組換えタンパク質の収量を改善するための方法が提供さ
れ、当該タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを選択する工程、少な
くとも2リットルを含むのに十分な容量を備える培養容器において増殖培地中で
昆虫細胞を増殖する工程、および当該バキュロウイルス/細胞の0.01未満の
PFUのm.o.i.で少なくとも1つのバキュロウイルスの接種物で昆虫細胞
を感染する工程を包含する。本発明は、たとえば1〜5のm.o.i.よりもか
なり低い感染多重度が使用され、非同時進行的に感染される培養物を導く方法を
提供する。本発明により提供されるようなm.o.i.を使用してバキュロウイ
ルスで昆虫培養物を感染することによって、至適な平衡が、細胞の複製の速度と
ウイルスの複製の速度との間で達成され、それによって所望のタンパク質の至適
な発現を許容する。本発明によって提供される方法は、同様にm.o.i.を調
整することによってより高いおよびより低い細胞密度に容易に調整され得、ここ
では本発明によって提供される効率および密度にしたがって、複製の種々の相に
おける細胞を感染するために利用可能であるウイルス粒子の相対比が残存する。
本発明の方法の好ましい実施態様は、少なくとも10、より好ましくは少なくと
も20、より好ましくは少なくとも50または250リットルの増殖培地を含む
のに十分な容量を備える培養容器において細胞を増殖し、それによって非相同タ
ンパク質を発現するバキュロウイルス培養物の規模拡大を許容する工程を包含す
る。たとえば、存在する増殖培地の容量について必要とされるよりも大きな容量
を備える培養培地を使用し得る。たとえば、20〜70リットルの細胞培養物を
培養するために100Lの培養容器を使用し得る。本発明の方法の好ましい実施
態様は、1×105〜5×106細胞/ml、より好ましくは5×105〜1.
5×106細胞/mlの細胞密度で細胞を感染し、それによって容易に操作可能
な範囲内にウイルス接種の実際の容量を維持する工程を包含する。本発明の方法
のなお別の実施態様は、0.005未満(たとえば、0.003、0.001、
0.0005、または0.00025)のm.o.i.で細胞を感染し、それに
よって接種物をできるだけ小さく維持する工程を包含する。本発明の方法の好ま
しい実施態様はp10プロモーターの制御下で所望のタンパク質を発現する組換
えバキュロウイルスを選択する工程を包含する。P10プロモーターは、細胞溶
解において役割を果たし、p10タンパク質の不在は、感染された細胞をインタ
クトなままにさせ、そして感染された細胞からの多角体の放出を妨ぎ、それによ
って再感染速度を減少するが、感染力自身は減少しない。ウイルス感染の全プロ
セスは、ポリヘドリン遺伝子、したがって多角体がなお存在するという事実に起
因して、現在視覚的にチェックされ得る。ウイルス感染は、細胞核中に集積する
高密度のタンパク質粒子として観察され得る。本発明の方法の別の実施態様は、
バッチ培養系において昆虫細胞を増殖し、それによって未だ未感染の細胞の感染
および複製を損ない得る欠陥妨害バキュロウイルスウイルス粒子の集積を最小化
する工程を包含する。本発明により提供される別の方法は、懸濁液中で、好まし
くは攪拌され得る(中程度に)発酵器のような培養容器中で昆虫細胞を増殖する
工程を包含する。(攪拌された)懸濁培養物の使用は、特にウイルス増殖を視覚
的にチェックするために所望のタンパク質がp10プロモーターの制御下にある
組換えバキュロウイルスの使用と組み合わされる場合(しかし、CPEを観察す
るようなチェックする他の方法(たとえば、ポリヘドリンプロモーターを使用す
る場合において)がまた利用可能である)、培養のより良好な制御を許容する。
を受けない均一な培養を保証する。さらに、攪拌は、感染された細胞から非感染
細胞へのウイルスの効率的な移動を生じ、細胞のウイルス感染のより高い効率を
与える。最初は約0.1〜0.3%の細胞のみが感染されるので、残りの99.
7〜99.9%の細胞は成長および増殖を許容される。
提供する。本発明によって提供される例は、ペスチウイルス由来のタンパク質を
、増殖培地中に、少なくとも100、120、または150μg/ml、より好
ましくは少なくとも200、またはさらに300μg/mlの収穫の当該タンパ
ク質の濃度に生成することである。所望のタンパク質はまた、獣医学的および医
学的使用のために、たとえば、ワクチン中におよび診断試験において組込まれた
抗原性物質を調製するために使用され得る。本発明の方法によって生成される所
望のタンパク質は、たとえば、ワクチンを調製するために使用され得る。
ラグメントであり、これはたとえば、ペスチウイルス感染(たとえば、ブタにお
ける伝統的なブタ熱)に対するワクチンを調製するために使用され得る。好まし
い実施態様において、本発明は、組換えペスチウイルスのE2タンパク質もしく
はErnsタンパク質、またはそのフラグメントを含有し、イムノアフィニティ
精製されておらずおよび好ましくは1用量での単回のワクチン接種後にPD95
レベルでペスチウイルスに対して防御を付与するという点で特徴付けられるワク
チンを提供する。これは、CSFVワクチン接種に特に関連する。適用される場
合、CSFVワクチン接種は一般に、CSFVの発生が生じた領域において大規
模なキャンペーンの間に行われる。これは、比較的短い期間における多数の動物
の迅速なワクチン接種を必要とする。このような大規模なキャンペーンにおいて
、十分な防御レベル(野生型ウイルス感染に対して防御されるブタの数)が迅速
に達成されることが差し迫って重要である。防御を達成するために第2のワクチ
ン接種について、第1のワクチン接種後に数週間待つことは、疾患の制御を大き
く妨げおよび遅延する。組換え的に発現されるE2タンパク質を生成するための
種々の方法の間には、バキュロウイルスにおいて発現されるE2(フラグメント
)と比較する場合であっても、差異が存在する。初期に報告されたE2タンパク
質生成培養において、E2タンパク質(フラグメント)の収量は、20〜90μ
g/mlの間で変化し(Hulstら、J.Virol.5435〜5442、
1993;HulstおよびMoormann、Cytotechnology
20:271〜279、1996)、単回注射のワクチン接種のために必要な
および関連のE2抗原質量を得るためにモノクローナル抗体でのイムノアフィニ
ティ精製をさらに必要とする。別の方法(EP 0389034において記載さ
れるE2のフラグメントを使用する)は、さらなるイムノアフィニティ精製を伴
わずに昆虫細胞の上清から採集されたE2を使用し、満足する(防御的な)免疫
応答が得られる前に2回注射されるE2ベースのワクチンを得る。E2抗原を含
有するワクチン(ProcilisRPesti)が現在登録されているが、所
望の免疫応答を提供するために4週間の間隔で少なくとも2回のワクチン接種を
行うので、このワクチンは2回適用されなくてはならず、それによって、所望の
免疫応答を提供するために4週間の間隔で少なくとも2回のワクチン接種を行う
ので、このワクチンでの伝統的なブタ熱感染に対するワクチン接種の有用性は、
妨げられる。
製される開始材料(たとえば、細胞培養上清)中の関連の抗原性物質(この場合
においてE2タンパク質(フラグメント))の低い濃度に関連する。理論的に、
抗原質量をさらに集積し得え、精製および濃縮法は当該分野において知られるが
、これは商業的に魅力的なワクチンの生成を導かず、用量当たり高いコストを引
き起こす。別の例は、ペスチウイルスErnsタンパク質であり、これはまたワ
クチン中でおよび診断試験において、または他の(治療学的)物質中で使用され
得る。
、1995)は、単層昆虫細胞培養物中でE2を発現するバキュロウイルスを、
5〜10μg/106細胞以下の最大収量に増殖した。さらに、Moserら(
Vet.Microbiol.51:41〜53)は、5のMOIを使用して単
層昆虫細胞培養物中でRuglliらのE2を増殖し、そしてELISAの目的
のために未濃縮の形態において十分な抗原を生成し得ない。彼らの経験において
、ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィによるタンパク質のさらなる
精製が、ELISAの操作を単純にし、そしてELISAの質を改善するために
前もって必要である。したがって調製されたE2タンパク質を用いるワクチン調
製は意図されていない。
するために免疫精製されたE2タンパク質を使用して、2回行われることが必要
であったことが見出された。たとえば、Hulstら(J.Virol.67:
5435〜5442、1993)、WO 95/35380、およびvan R
ijnら(J.Gen.Virol.77:2737〜2745、1996)に
おいて、E2は単層中で生成され、そしてイムノアフィニティ精製されて、防御
ワクチンを達成した。
ント)を含有するワクチンであり、タンパク質は今や十分に多くの量が生成され
得、動物が1用量で単回のワクチン接種を受けた2〜3週間以内に伝統的なブタ
熱ウイルス感染に対する防御を付与する(95%の防御用量レベル(PD95)
で)ワクチン中に取り込まれる前にイムノアフィニティ精製される必要がもはや
ない。本発明によって提供される方法は、組換えペスチウイルスE2タンパク質
もしくはErnsタンパク質またはそのフラグメントを含有するワクチンを提供
し、ワクチンは、1用量での単回のワクチン接種後にペスチウイルス感染に対し
て防御を付与し、一方タンパク質(フラグメント)は、イムノアフィニティによ
って精製されていない。本発明はまた、本発明によって提供されるタンパク質を
含有し、さらにアジュバントを含有するワクチンを提供する。適切なアジュバン
ト(たとえば、フロインドアジュバント、または水酸化アルミニウム、または乳
濁液(たとえば、油中水乳濁液、二重油中水乳濁液、または水中油乳濁液))は
当業者に公知である。所望のタンパク質はまた、他の物質(たとえば、獣医学的
または医学的使用)を調製するために使用され得る。本発明によって提供される
なお別の例は、卵胞刺激ホルモン(FSH、αユニットおよび/またはβユニッ
ト、ならびにその複合体およびフラグメント)のようなホルモン様物質であり、
これはたとえば、培養物中でαユニットを発現する1つのバキュロウイルスでお
よび/またはβユニットを発現する別のバキュロウイルスで、昆虫細胞培養物を
感染することによって生成され得る。本発明の方法はまた、生物殺虫剤としての
(組換え)バキュロウイルスの大規模および低コストの生成のために使用され得
る。好ましい実施態様は、生物殺虫剤の生成において外来遺伝子の発現のために
p10プロモーターを利用する組換えウイルスの使用である。なぜなら、昆虫は
一般に多角体遺伝子を欠陥するバキュロウイルスによりあまり十分には感染され
ないからである。本発明の方法を用いて、他の組換えタンパク質を発現する他の
組換えバキュロウイルスを培養すること、ならびに殺虫剤の、医学的、治療学的
、および/または抗原性の物質または産物中に組込むためのこのようなウイルス
タンパク質の生成および/または使用は、当業者の範囲内である。本発明はさら
に、実施例において説明されるが、それらに制限されない。
SFV)、ボーダ病ウイルス(BDV)、およびウシウイルス性下痢ウイルス(
BVDV)からなる。いくつかのBVDVおよびCSFV株のゲノムは配列決定
されている(Renardら、1987 EP特許出願第0208672号;C
ollettら、1988、Virology 165、191〜199;De
ngおよびBrock、1992、Virology 1991、865〜67
9;Meyersら、1989、Virology 171、555〜567;
Moormannら、1990、Virology 177、184〜188)
。BDVについて、未だ不完全なゲノムヌクレオチド配列のみが利用可能である
。ペスチウイルスゲノムは、1つの大きなオープンリーディングフレームを含有
する約12.5キロベースのポジティブ鎖RNA分子である。オープンリーディ
ングフレームは、約4,000アミノ酸の推定のポリタンパク質に翻訳され、こ
れはウイルスおよび細胞にコードされるプロテアーゼによりプロセスされる。オ
ープンリーディングフレームは、2つの高度に保存された小さな非翻訳領域によ
り隣接され、これらはおそらくゲノムの複製に関与する。5’非コード領域はま
た、翻訳の開始において役割を果たす。
ロセスされるポリタンパク質は、ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパ
ク質の全てを含む(C.M.Rice:Fields Virology、第3
版、1996 フラビウイルス科:ウイルスおよびそれらの複製:第30章:9
31〜959頁を参照のこと)。ウイルス構造タンパク質、特にエンベロープタ
ンパク質のErns、E1、およびE2はポリタンパク質のN末端部分に位置さ
れる。非構造タンパク質、特にセリンプロテアーゼNS3ならびにRNAレプリ
カーゼ複合体NS5AおよびNA5Bは、ポリタンパク質のC末端部分に位置さ
れる。
抗体を発生する。しかし、E2に対して指向される抗体のみが強力にウイルスを
中和化し、一方ErnsおよびNS3に対して指向される抗体は、ごく低いウイ
ルス中和化能力を有するか、または全く有しない。この知見は、CSFサブユニ
ットマーカーワクチンとしてのE2の適切性を評価することを開始するように本
発明者らを促した。この設定において、Ernsおよび/またはNS3は、E2
マーカーワクチンを付随する診断試験の開発のために使用され得た。
FVはブタに制限されるようである。ペスチウイルスは構造的におよび抗原的に
密接に関連する。エンベロープ糖タンパク質のE2は最も免疫原性であり、およ
びペスチウイルスの最も可変性のタンパク質である。本発明者らは、多くの異な
るペスチウイルス株のE2遺伝子をクローン化し、シカおよびキリンからの株を
含んだ。E2遺伝子を一過的に発現し、モノクローナル抗体で特徴づけし、配列
決定し、そしてP.A.van Rijnら、1997、Virology、2
37:337〜348に比較した。これらのデータに基づいて、本発明者らは、
ペスチウイルス属内に6つの主要な群を示し得た。4つの群は規定された遺伝子
型に対応したが、2つの他の群は、ペスチウイルス属内の新規な遺伝子型であっ
た。1つの群は、ブタから単離されたCSFV株を含む。第2の群は、ヒツジか
ら単離されたBDV株Moredun、L83、およびX818、ならびにブタ
由来のF株からなる。第3の群は、ヒツジ由来のBD78株、ブタ由来の525
0株、およびウシ由来の178003株を含む。E2に基づいて、これらのウイ
ルスは、ウシウイルス性下痢の急性の重篤な発生と関連するBVDV株(いわゆ
る、2型BVDV)に非常に類似する。第4の群は、ウシに優先的に由来するB
VDV株からなる。このBVDV群は、2つの亜型または亜群のBVDV−1a
および1bに分けられ得:BVDV−1aは、NADLおよびOregonのよ
うな米国に由来するウイルス、ならびに欧州に由来する150022および11
38のような他のウイルスを含む。亜群BVDV−1bは、Osloss株およ
びいくつかのオランダ単離物を含む。第5および第6の「群」は、2つの新規な
遺伝子型として提唱され得、それぞれ、Deer株およびGiraffe株を含
む。
的に重要な制御および根絶のための新しい概念を導いた。マーカーワクチンの使
用は、ワクチン接種された動物と野外ウイルスに感染された動物との間の血清学
的な区別を許容し、それによってウイルスを制御して排除をできる。大部分のメ
ンバにおいて、たとえば、アウエスキー病(AD)に対するEUワクチン接種の
状況は、gEネガティブなワクチンのみで許容される。AD野外ウイルスで感染
された動物は、gEに対する抗体を発生する。これらの抗体を検出するELIS
A試験が、感染された動物の検出のために(続いて感染された動物は集団から除
去され得る)、および(長期間の)ワクチン接種キャンペーンの間、集団におけ
る野外ウイルス感染の状況をモニタするために使用される。最終的に、目的は、
集団の野外ウイルスがない状態を達成することである。次いで、ワクチン接種は
中止され、そしてこの状況を保護する血清学的な監視プログラムが行われる。し
たがって、マーカーワクチンでのワクチン接種は、感染された個々の動物のみの
ではなく感染された集団の撲滅にかかる根絶運動の費用を有意に減少し、および
十分に大きな規模で、および十分に長期間、結果的に行われる場合であっても、
ブタ集団の野外ウイルスがない状態を達成するためには、撲滅よりも早い方法で
あり得る。
団から根絶された疾患および日常的なワクチン接種がない疾患の発生を制御する
ために、マーカーワクチンはなお使用される。このような場合において、動物集
団が血清学的にネイティブである場合、非常に伝染性の疾患が爆発的に広がり得
、次いで莫大な経済的な損失を引き起こし得る。
くの例が示された。高レベルの発現は非常に有利である。なぜなら、デッドサブ
ユニットワクチンは、一般に、大量の抗原が適用される場合に防御的な免疫応答
を誘発し得るのみであるからである。本発明者らの最初のアプローチにおいて、
2つの組換えバキュロウイルス(一方はTMRを伴ってE2を発現する(Bac
E2[+])および他方はTMRを伴わないでE2を発現する(BacE2[−
]))が構築された(Hulstら、1993、J.Virol.67:543
5〜5442)。この刊行物および他の比較可能な刊行物において、E2は未だ
その古い名称のE1で表されることに注意のこと。TMRを伴わないE2は、細
胞培養培地に分泌されるが、TMRを伴うE2は分泌されなかった。さらに、両
方のE2は、E2上の4つの抗原性ドメインのそれぞれを提示するモノクローナ
ル抗体と同一に反応する。このことは、細胞会合性E2および分泌性E2の抗原
特性が同一であることを示唆し、そして分泌性E2が細胞会合性E2よりも非常
に高いレベル(10倍以上の高さ)に生成されたので、ブタにおけるワクチン接
種試行において分泌性の免疫アフィニティ精製されたE2を試験することが決定
された。二重水−油アジュバント中に20μgE2/mlおよび100μgE2
/mlを含有する2つのワクチン処方物を調製した。2つのSPFブタの4つの
群のうち、2つの群を20μgE2で、および2つの群を100μgE2で筋肉
内にワクチン接種した。28日後、20μgE2でワクチン接種された1つの群
および100μgE2でワクチン接種された1つの群を、同じ用量のE2で再ワ
クチン接種した。42日目に、全ての動物を病原性CSFV株のBrescia
で鼻腔内に攻撃した。適用されたワクチン用量にかかわらず、全てのワクチン接
種されたブタは、異なるレベルにであったが28日目で中和化抗体をマウントし
た。攻撃の日にちの42日まで、抗体力価は、全ての動物において、それらが追
加免疫されようがなかろうが高レベルに上昇したままであった。それゆえ、20
μgの免疫アフィニティ精製されたE2の用量で一回のみワクチン接種された動
物であっても、CSFに対して既に完全に防御されたということは驚くことでは
ない(Hulstら、1993J.Virol.67:5435〜3442)。
質のErnsに対する抗体を必ず生成するので(Kwangら、1992、Ve
t.Microbiol.32:281〜292)、これはE2と組み合わせて
診断試験を開発するために最も適切なウイルスタンパク質の1つである。しかし
、ErnsがCSFに対するブタの防御のために重要な抗原であり得たことを示
唆する1つの報告がまたある(Konigら、1995、J.Virol.69
:6479〜6486)。これらの研究において、Ernsは生存ウイルスワク
シニアベクターで発現された。注射部位あたり5×107PFUのワクシニア−
Erns組換えウイルスで3つの異なる経路(皮内、静脈内、および腹腔内)に
より同時にワクチン接種された動物は、ワクチン接種の5週間後での致死用量の
CSFV株Alfortでの攻撃でも生存し、CSFの任意の徴候を示さなかっ
た。
キュロウイルスにより発現されたBrescia株のrns(Hulstら、1
994、Virology、200:558〜565)を、ブタにおいて試験し
た。6匹のSPFブタの群を、それぞれ、5.0および20μgErnsで筋肉
内に1回ワクチン接種した(Moormannら、1996、Proc.14t
hIntern.Pig.Vet.Society Congress、25〜
29頁、Bologna、Italy)。4匹のワクチン接種されなかったSP
Fブタの第3の群は、コントロールとして作用した。ワクチン接種の3週間後、
全ての動物を、105TCID50のBehring株で筋肉内に攻撃した。攻
撃の5日後以内に、最も低い用量のErnsでワクチン接種された全ての動物は
、CSFの重篤な徴候を発症した。攻撃の14日後以内に、2匹の動物が死亡し
、3匹は瀕死の状態になったときに殺傷され、1匹は見かけ上、回復した。回復
した1匹を含むこれらの動物のうちの5匹は、IFTにおいてポジティブであっ
た。攻撃後、最も高い容量のErnsでワクチン接種された全ての動物は、数日
間多かれ少なかれCSFの重篤な徴候および高熱を示したが、14日以内に、6
匹のうちの4匹の動物が回復し、1匹の動物は死亡し、そして残りの1匹は瀕死
の状態になったときに殺傷された。4匹の生存する動物のうちの1匹のみが、I
FTにおいてポジティブであるようであった。対照的に、全てのコントロール動
物が、攻撃後5日以内にCSFの重篤な徴候を示し、攻撃後14日以内に死亡し
、IFTにおいてポジティブであった(Moormannら、1996、Pro
c.14thIntern.Pig.Vet.SocietyCongress
、25〜29頁、Bologna、Italy)。
ルスにより発現されたE2投与よりも非常に低い効率であるが、非相同CSFV
攻撃に対してブタを防御し得ることを結論した。
激ホルモン、TSH)においてまたは胎盤(ヒト絨毛性ゴナドトロピン、hCG
;妊馬血清ゴナドトロピン、PMSG)においてのいずれかで生成される糖タン
パク質ホルモンのファミリに属する。種内で、これらのホルモンのそれぞれは共
通のαサブユニットからなり、これはホルモン特異的なβサブユニットに非共有
結合される。単独でまたはLHと組み合わせて投与された精製されたFSHは、
ウシを含む多くの種において過剰排卵応答を誘導するために広範に使用される。
ることが困難であることである。この理由のために、ヒツジのFSH(oFSH
)、ブタのFSH(pFSH)、またはウマのFSH(eFSH、PMSG)起
源のFSHがウシの過剰排卵処理のために一般に使用される。しかし、ウシにお
いてウシ海綿状脳症(BSE)、およびおそらくヒトにおいてクロイツフェルト
−ヤコブ病(CJD)の変形を引き起こし得るプリオン様タンパク質の潜在的な
存在に起因して、脳組識に由来する材料の適用は危険がなくはない。さらに、胎
盤由来の材料の使用は、生物学的半減期が非常に長いという不利益を有し、これ
は特異的な抗体の注射によるその中和化を必要とする。最後に、全ての現在使用
されるFSH調製物は、過剰排卵の結果において観察される大きな変分を少なく
とも一部担うと考えられるいくつかのLH活性を含む。
発現系)のような非哺乳動物細胞において生成される組換えウシFSH(rbF
SH)を適用することにより、有益であり得るようである。
数、4〜10×106細胞/ml)を20〜30℃の温度で融解する。融解後、
バイアルの内容物を、無血清培地SF900II8.5mlを含む15ml容量
ファルコンチューブに移し、懸濁させる。懸濁後、ファルコンチューブの内容物
を100〜200×gで10分間遠沈し、細胞を沈殿させる。培地を廃棄し、ペ
レットを4〜6mlのSF900IIに懸濁する。懸濁した細胞を、10mlの
SF900IIを容れた100ml容量の振盪フラスコに移す。フラスコを軌道
旋回式シェーカの台上にのせ、40〜80rpm、26〜30℃で3〜7日間、
細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は、工程途上サンプルを取出しモニタ
する。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、それぞれ1
00mlのSF900IIを容れた2個の500ml容量振盪フラスコに移す。
これは10倍希釈の細胞に相当する。再度、フラスコを軌道旋回式シェーカの台
上にのせ、40〜80rpm、26〜30℃で3〜7日間、細胞を培養する。細
胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりする。細胞密度が1
.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、二度目として、今回はそれぞれ
100mlのSF900IIを容れた6〜11個の500ml容量振盪フラスコ
に移す。過剰の細胞材料は廃棄する。また、この場合、10倍の希釈を達成する
。フラスコを軌道旋回式シェーカの台上にのせ、40〜80rpm、26〜30
℃で3〜7日間、細胞を培養する。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コ
ントロールによりモニタする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに
達成したとき、該細胞を含む懸濁液500mlまたは1000mlを、それぞれ
約4.5リットルまたは9リットルのSF900IIを容れた5リットルまたは
10リットル醗酵槽に移す。これは10倍希釈の細胞に相当する。この細胞を2
6〜30℃で3〜7日間培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する(50〜10
0rpm)。細胞の増殖と細胞生存度は定常的に工程内コントロールによりモニ
タする。細胞密度が1.0〜6.5×106細胞/mlに達したとき、5リット
ル容量醗酵槽の内容物を、約40リットルのSF900IIを容れた50L醗酵
槽に移す。この細胞を、密度が±5〜15×105細胞/mlに達するまで26
〜30℃で培養する。この懸濁液を定常的に攪拌する(50〜100rpm)。
サンプルを工程内コントロール用に採取する。
WVS)(BacE2[−])1〜2mlを添加する。細胞の70〜100%が
細胞変性効果を示すまで、28℃にて3〜8日間培養する。培養の間に工程内コ
ントロール用にサンプルを採取する。次に、この懸濁液を精密濾過による細胞除
去により清澄とする。得られた濾液(すなわち、抗原溶液)を集め、不活化工程
(3.3)を始めるまで≦−20℃にて保存する。工程内コントロール用にサン
プルを採取する。抗原含量を定量するために、サンプルを、たとえば、抗原質量
を定量するために、酵素結合免疫アッセイで、または水中タンパク質容量あたり
の実質重量を定量するために、タンパク質アッセイで、あるいはかかる方法の併
用により試験する。
の濃度に加えることにより不活化する。pHを8.2〜8.7に、温度を34〜
37℃に調節することにより、BEAを臭化2−ブロモエチル−インミン(BE
I)に変換する。BEIはウイルスを不活化する活性成分である。ウイルス殺滅
は工程内コントロール用サンプルを採取することによりチェックする。不活化に
は24〜72時間を要する。不活化後、10000リットルあたり1個未満の感
染性粒子が存在する。ウイルスの不活化後、チオ硫酸ナトリウムを5〜25ミリ
モル/L添加し、pHを5.7〜6.3に調整することによりBEIを中和する
。工程内コントロール用にサンプルを採取する。不活化し、中和した抗原溶液を
1リットルおよび/または5リットル容量のバッグに移し、≦−20℃にて保存
する。
り希釈し、50μg/mlの抗原溶液とする。抗微生物剤としてチオメルサール
を100μg/mlまで加える。工程内コントロール用にサンプルを採取する。
この溶液(すなわち、第1水相)を2〜8℃にて<3日間保存する。この間、マ
ルコール(Marcol)52とモンタニド(Montanide)80とを混
合する(9:1)ことにより油相を調製する。また、この溶液も2〜8℃にて3
日を超えない範囲で保存する。油相は0.22μm−無菌フィルタにより無菌濾
過する。工程内コントロール用にサンプルを採取する。最後に、第2水相をリン
酸バッファー塩溶液(PBS)またはSF900IIをモンタノックス(Mon
tanox)80と混合することにより調整し(98:2)、チオメルサールを
最終濃度100μg/mlまで添加する。この溶液を使用時まで2〜8℃にて保
存する(<3日間)。使用前、第1水相を無菌濾過する。工程内コントロール用
にサンプルを採取する。第1水相と油相とを混合(1:1.1)することにより
第1エマルジョンを調製する。このエマルジョンを2〜8℃にて3日以内保存す
る。工程内コントロール用にサンプルを採取する。二重油中水エマルジョンは、
第1エマルジョンを第2水相で乳化することにより(2.1:1)調製する。二
重エマルジョンはバイアルに詰めるまで隔離保存室内に2〜8℃にて保存する。
工程内コントロール用にサンプルを採取する。
する。充填量は50、100または250mlバイアルに、それぞれ51、10
2または255mlである。充填容量は濾過容積の重量をチェックすることによ
り定常的にモニタする。充填直後、バイアルには栓をし、キャップを被せる。最
後に、バイアルは隔離保存室内に2〜8℃で保存し、その後の品質管理を開始す
る。
におけるE2タンパク質の安定性を検討するため。細胞培養におけるバキュロウ
イルス感染過程の溶菌性のために、感染サイクルの後期培地にプロテアーゼが放
出されていると思われる。このことがE2タンパク質の分解と容量タンパク質レ
ベルの低下に至らしめるのか否かが、本実験の命題である。
8含有SF900II培地を意味する。
0mlのSF900IIにより、インキュベータ内軌道旋回式シェーカ台座上、
培養する。細胞培養が必要とする細胞密度に達したところで、細胞を500ml
振盪フラスコ中、10倍に希釈して100mlとする。この細胞培養が必要とす
る細胞密度に達したところで、再度、10倍に希釈し100mlとし、過剰の細
胞性物質を廃棄した。この細胞培養が必要とする細胞密度に達したところで、こ
れを10倍に希釈し、3個の500ml振盪フラスコに各フラスコ100ml容
量ずつ入れた。過剰の物質を廃棄した。振盪フラスコをIKS軌道旋回式シェー
カ台座に載せ、28℃のインキュベータ中70rpmで攪拌する。細胞密度1m
l当たり0.612×105細胞で、100倍希釈のウイルス懸濁液63μlを
フラスコ番号2および3に加える。振盪フラスコ番号1は未感染ブランクとして
維持する。培養物を感染させたMOIは(0.063×0.01×0.8×10
7)/(100×0.612×105)=0.00008である。
Vバイアル253をQCにより融解し、TC100培地に100倍希釈し、10
%FBS(ロット番号97QC0139)を添加し、0.5mlずつに分割して
−70℃に保存した。
と非感染振盪フラスコの両方から採取する。サンプル採取は以下に概括したよう
に実施した。
ラGP8R遠心分離機により1000rpmで6分間遠心分離する。次いで、上
清をゲルマン・アクロディスク・シリンジフィルタにより0.45μmで濾過し
、なお残存する細胞を廃棄する。サンプル0.4mlを後の分析用にナルゲン低
温バイアル中に−70℃で保存する。
胞増殖曲線はおおよそ類似している。191hpiの後、それ以上の細胞計数は
なされなかったが、その理由は事実上すべての細胞が死滅し、感染したからであ
る。フラスコ2の139hpiサンプルはグラフから除外する。このサンプルの
細胞計数は、前記のサンプルおよび以下のサンプル両方よりもはるかに高い。こ
のことは、恐らくある種の沈殿がサンプル採取の前後に起こり、その結果、トリ
パンブルー溶液と混合したサンプルが不正確となったことを示している。この仮
定は生存率と感染率両方が予測した結果と一致するという事実により確認される
。このことは、感染培養物それ自体にはなんら異常なことが起こっていないこと
を意味する。この不正確なサンプル採取は、サンプル中のE2濃度になんら影響
を与えることはないだろう。というのは、E2は培地には存在するが、細胞内に
は存在しないからである。
μg/mlの最大値となるが、そこからゆっくり低下して215hpiで170
μg/mlとなる。次いで、E2−含量がさらに急速に降下して、306.5h
piで<100μg/mlの最終レベルとなる。
また139hpi付近で到達するが、フラスコ2よりもわずかに高いだけである
。E2濃度は139hpiでの233μg/mlから191hpiでの212μ
g/mlにゆっくりと低下するが、それ以後はより急速に低下し、215hpi
で141μg/mlに至る。フラスコ2および3は良好な相関性を示す。
た。生存細胞密度は2.435×106細胞/ml、死滅細胞密度は0.190
×106細胞/mlであり、総細胞密度は2.625×106細胞/mlであっ
て、生存度は92.8%となった。生存細胞密度はフラスコ2および3両方より
も有意に高く、感染が細胞増殖をすでに減速しつつあることを示している。この
ブランクを次いで濾過した。
アッセイの結果を示す。
サンプルでなお検出不可である。この結果はE2−ELISAの結果とよく相関
する。V3およびV8はともにE2バンドに検出されるので、115hpi以降
のサンプルにはインタクトのE2が検出される。
視できる。2つの個々のブロットにおけるV3とV8での免疫ブロッティングは
、分解産物がV3エピトープを含み、V8エピトープを含まないことを示す。V
8はブロット上のいずれの場所にも検出されないが、未処理E2バンドには検出
される。このアッセイは、E2タンパク質の分解がプロテアーゼの存在により起
こることを明瞭に示している。事実、これがE2タンパク質含量降下の原因であ
り、この降下はバルクE2抗原溶液の精密濾過工程の際に観察される。この下流
の処理加工段階で、細胞はウイルスの不活化が始まる前に除かれる。
計測E2含量間の関係をさらに検討すること。一方で、完全な細胞母集団の感染
は培地が消費し尽くされるまでに完了しなければならないが、他方で、低細胞濃
度の総母集団の感染は最適以下のタンパク質収量に至る。
IIに希釈し、ゆるやかに混合する。培養物希釈直前の生存細胞密度は、3.4
1×106細胞/ml、死滅細胞密度は0.190×106細胞/mlであり、
生存率は94.8%となる。この希釈により、細胞密度は±5×105細胞/m
lとなる。
を50mlずつ250ml振盪フラスコ中に9分割し、過剰の細胞は廃棄した。
最初の50mlを振盪フラスコ1に移し、最後の50mlを振盪フラスコ5に移
した。フラスコ番号1および6はMOI=0(ブランク)に使用し、番号2およ
び7はMOI=0.000001用とし、番号3および8はMOI=0.000
01用とし、番号4および9はMOI=0.0001用とし、番号5はMOI=
0.001とする。
ルス懸濁液を入れたバイアルから調製する(該バイアルは1ml当たり0.8×
105プラーク形成単位(pfu)を含む)。この100倍希釈したウイルス原
液は以下のように調製した。マスター種子ウイルスを融解し、TC100培地に
100倍希釈し、10%FBSを添加して、0.5mlに分割、−70℃にて保
存する。
lで希釈して希釈ファクタ10−1とし、この溶液1mlを培地9mlに加えて
希釈ファクタ10−2とし、この溶液1mlを培地9mlに加えて希釈ファクタ
10−3とし、そしてこの溶液1mlを10倍に希釈して希釈ファクタ10−4
とする。細胞培養物を含む振盪フラスコ1および6(ブランクフラスコ)に培地
3.1mlを加える。ウイルス希釈液10−2、10−3および10−4をそれ
ぞれ振盪フラスコ4と9、3と8、および2と7に加える。これらの振盪フラス
コにはすでに細胞培養物を入れてある。
5=2.5×103pfuが存在する。50mlの細胞懸濁液を容れた振盪フラ
スコには、0.5×106×50=2.5×107の細胞が存在する。そこで、
50mlの細胞懸濁液に3.1mlのウイルス希釈液10−2を加えると、MO
Iが2.5×103/2.5×107=0.0001となる。他のウイルス希釈
液について同等の計算をすると、細胞培養物50mlに添加したウイルス希釈液
10−3と10−4については、MOI計数0.00001と0.000001
が得られる。最終的に、2.85mlの希釈液10−1を振盪フラスコ番号5に
加えると、MOIが0.001ではなく0.00092となる。
中の細胞は15mlファルコンチューブ中、IECセントラGP8R遠心分離機
により遠沈する(10分、1000rpm)。サンプル採取は低MOIから始め
て高MOIについて実施し、高MOIの感染細胞懸濁液から低MOI感染細胞懸
濁液にウイルスが伝播するのを防止する。遠心分離後、サンプルを0.45μm
で濾過し(上清になお存在する可能性のある細胞を除去するため)、3個のナル
ゲン低温バイアルに分割し、後の試験用に−70℃にて保存する。
細胞接種すべき最初と最後のフラスコであった。細胞密度が殆ど一致したので、
すべてのフラスコは両方の細胞計数平均値に等しい細胞密度を有すると見なした
。当初の生存細胞密度は0.423×106細胞/mlであり、一方、0.01
2×106細胞が死滅していたので、生存率は97.3%となった。
の室内にて約75rpmで攪拌した。
、すべてのフラスコからサンプル採取した。細胞密度を定量したサンプルは容量
が3.3mlあり、その0.2mlを用いて細胞密度を定量した。残り3.1m
lはt=0サンプルのために上記のように取扱う。計測しなかった培養物サンプ
ルは容量が3.1mlあった。194hpiでの細胞密度を定量し、この実験を
終えた。残りの細胞懸濁液(約30ml)は、その1ml、3部をナルゲン低温
バイアルに、約6mlの4部を15mlファルコンチューブに入れ、保存した。
E2タンパク質収率との間に良好な相関があることを示す。このことは、MOI
0.001で感染した培養物の最大容量E2タンパク質収率を100%とした場
合のグラフに見て取れる。それは容量E2タンパク質収率がMOIの減少ととも
に増大することを示す。0.0001のMOIまでは、細胞密度は、最大達成可
能細胞密度に達する前に感染される。0.00001またはそれ以下のMOIを
用いると、培養物の感染が終了する前に培地が消耗されてしまうという感染結果
となり、最適以下のタンパク質収率となる。したがって、引き出される結論は、
感染過程とE2の産生が完了するまでに培地が消尽しない限り、使用されるMO
Iが低い程、E2タンパク質収率が高くなるということである。 bFSHαおよび/またはbHSFβを発現する組換えバキュロウイルス 伝達ベクターpDW−アルファ−9.1およびpDW−ベータ−3.1を構築
した。Sf21細胞はpDW−アルファ−9.1またはpDW−ベータ−3.1
、および細胞外ウイルス粒子から単離した野生型(wt)AcNPV/M021
DNA(PCT出願:WO96/25696)により同時移入した。β−ガラク
トシダーゼ発現ポリヘドリン陽性プラークを単離し、bFSHαまたはbFSH
βを発現するかについて、培地のELISAにより分析した。一つのプラーク精
製したbFSHαウイルス(AcNPVα3.4)および一つのプラーク精製し
たbFSHβ(AcNPVβ1.4)を用い、それぞれ約107と108のTC
ID50をもつウイルス原液を調製した。FSHの産生は上記方法により生じ、
産生レベルは17〜33μg/mlとなった。
に対し、予防接種したブタの95%(PD50)を予防する、1回の予防接種後
に必要とするE2用量(μg)の評価。
8頭ずつの3群(A〜C)と2頭の1群(D)に分けた。これらの動物をID−
DLOの高度封じ込め設備内にある家畜小屋B18、B19、B20およびB2
1に収容した。動物は3日間順化させる。動物は1日に1度、飼い葉桶で完全食
物ペレット(ホープ・ファームス)として給餌し、水は給水器(niple a
d libitum)から飲むことができた。
それぞれ異なるE2抗原濃度、32.0、8.0および2.0μg/投与量とし
た。ブタには筋肉内に一度接種したが、各ブタは左耳の後方2cmのところに1
回量(A:2μgのE2、B:8μgのE2、C:32μgのE2、D:0μg
のE2)を受けた。対照群DはDOEアジュバントのみを接種し、前哨用のブタ
にはまったく接種しなかった。予防接種の3週間後に前哨用を除く各動物に、C
SFV株ブレスシア456610の100 50%致死量(=100Va LD
50)を鼻腔内攻撃した。攻撃直前に前哨用をその群から隔離し、24時間後に
戻した。接種物のウイルス含量は家畜小屋から戻した後に採取したサンプルの滴
定により定量した。
監督者の獣医を呼んだ。各群は給餌時および小屋の清掃前およびその間に1日少
なくとも15分間観察した。
取し、白血球および血小板数の変化をモニタした。血中の白血球(血球減少症)
および血小板(血小板減少症)数減少はCSFの典型的な徴候の一つである。通
常のブタでは、白血球細胞と血小板に対する正常細胞計数は、それぞれ11〜2
3×109/Lおよび320〜720×109/Lの範囲にある。SPFのブタ
では、これらの値がやや小さい;6〜12×109/Lおよび300〜700×
109/L。双方言及の範囲は各ブタで変動する。血液細胞の分析はメドニック
RCA570クールタ計数器により実施した。血球減少症および血小板減少は、
細胞/血小板計数が、好ましくは1日以上、上記の最小数よりも顕著に低い場合
と定義した。。
ターとして使用し、接種した動物からこれらの動物へとウイルスが伝播したこと
を検出した。死後の組織サンプルは以下の器官から採取した:扁挑腺、脾臓、腎
臓、および回腸について、ウイルス抗原の存在につき直接免疫蛍光法により試験
した。これら組織サンプルからの低温維持切片(厚さ4μm、各器官2切片)を
固定化し、ポリクローナルブタ抗ペスチウイルスFITC−接合血清と培養した
。洗浄後、切片を蛍光顕微鏡下で読取った。結果を陽性(=蛍光性)または陰性
(=非蛍光性)として表した。
した。サンプルを−20℃にて保存し、ウイルス中和試験(VNT)およびセデ
ィテスト(CeditestR)(CSF特異抗体を検出するためのELISA
)によりアッセイした。血清中のCSFV中和抗体タイタをミクロタイタシステ
ムにより定量した。血清の段階2倍希釈液を、30〜300TCID50含有の
CSFV(ブレスシア株)懸濁液等容量と混合した。CO2インキュベータ内3
7℃で1時間培養した後、ウエル当たり約25.000PK15細胞を添加した
。4日後に、マイクロタイタプレートを上記のように処理し、顕微鏡下に読取っ
た。CSFV中和タイタは、すべてのウイルスを中和する最高希釈の逆数として
表した。
表わすという仮定にもとづいた。
た。A群およびC群には、軽い下痢、食欲不振、およびうつ症状が、予防接種後
3日目に見られた。A群からの1頭(no.448)は全期間にわたり定常的に
嘔吐し、成長が遅れた。B群からのブタno.438は一度嘔吐した。ブタno
.434(C群、前哨)は体温がわずかに上昇したが、この動物は右後肢の跛行
をわずらっていた。食餌摂取量は、予防接種から攻撃までの期間、1日1群当た
り3kgから6kgに増加した。
0)にCSFの徴候を示し始めた。発熱、群がり行動、震え、食欲喪失およびう
つ症状が攻撃から10日後の死亡時まで見られた。さらに、この動物は、チアノ
ーゼ、後肢不全麻痺、下痢および重症の嘔吐を示した。両動物は瀕死の状態のと
きに殺した。
徴候を示し始め、主に、発熱、群がり、うつ症状および食欲不振を示した。発熱
は2〜10日に及び、最高体温(Tmax)は40.7〜42.2℃で変動した
。7日目以降、ブタの内、443〜446は発熱が収まり、食餌摂取量も攻撃前
の量まで増大した。しかし、448のブタは9日目に死亡しているのが見つかり
、447のブタは急性のCSF(痙攣、後肢不全麻痺)に懸り、同日瀕死の状態
であるときに殺した。両前哨用は攻撃7〜9日後まで正常であったが、その後、
急性のCSFとなり、20日目、瀕死の状態であるときに殺した。
量増大とともに軽くなった。
℃と41.7℃の間で変動した。ブタno.436は非常に軽度の臨床徴候で攻
撃に抵抗した。1頭のブタ(no.440)は18日後に急性のCSFで死亡し
たが、瀕死の状態であるときに殺した。残り、B群からの5頭の動物は回復した
。両前哨用は攻撃後11〜12日目まで正常であったが、その後、急性のCSF
となり、20日目に死亡させた。
れ、Tmaxは40.5℃〜41.2℃で変動した。臨床的徴候は、攻撃後6日
目にわずかなうつ症状が見られた以外、注目すべきものはなかった。従前どおり
、攻撃ブタno.430は嘔吐した。
小板減少を示した。ブタno.445および446は攻撃後、7日目および10
日目に、また、ブタ449は10日目および14日目に血小板減少となった。B
群からのブタ1頭(440)は白血球減少および血小板減少を示したが、他は正
常であった。両前哨用は14日目に血小板減少となり始める徴候を示した。C群
では、前哨用も含めて、白血球減少も血小板減少も検出しなかった。
D50/mlとした。CSFVウイルス抗原(表7)は、A群およびB群から選
択した対照と前哨用の組織サンプルすべてに検出された。A群およびB群におい
て、6頭の接種した動物の内、1頭が陽性であった。C群では前哨用も含めて陽
性がなかった。
NTに用いたブレスシアウイルスの量を定量するための逆滴定の結果は、41T
CID50/ウエルであった。
た(表8)。A群の動物6頭の内2頭が3週間後にセロコンバーションを受けた
。しかし、6頭の内4頭は攻撃後、追加刺激を受けた(表8)。B群およびC群
は予防接種後21日目にセロコンバーションを受けたが、この動物はすべて攻撃
後に追加刺激を受けた。後者のみが、当該動物において攻撃ウイルスの複製が成
功していることを物語っている。
2μgのE2と決定した。この投与量により、毒性の非常に高いCSFV株を攻
撃したことによる疾患の臨床徴候が最小に止まり、接触した動物へのウイルス拡
散も発生しない。要約すると、6頭のブタ4群(A〜D)につき、筋肉内投与に
より、アジュバント(DOE)2ml当たりそれぞれ32(A)、8(B)、2
(C)および0μg(D)で予防接種した。2頭の非予防接種ブタを各群(A〜
C)内に置き、接触感染の原因となるウイルスの排出を検出した(前哨用)。3
週間後、鼻腔内投与により毒性の非常に高いCSFV株ブレスシア100LD5
0で動物を攻撃した。臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメーターを測
定し、E2サブユニットワクチンの効能を評価した。予測どおりに、C群の動物
は他の群の動物よりもより良好に攻撃に抵抗した。ウイルス抗原は、E2の最大
投与量(32μg)を接種した動物の組織サンプルに検出されず、この群には疾
病も存在しなかった。PD95用量は、≧50のNPLA力価(予防接種後21
日目)が完全な予防効果を与える(ウイルスの拡散がない)という仮定にもとづ
き計算した。この結果がPD95用量32μg/頭である。
し、その防御効果のレベルをさらに評価するために、6頭のブタ2群(A〜B)
を32μgのE2により筋肉内経路で予防接種した。2頭の非予防接種ブタを各
群内(A〜B)に置き、接触感染の原因となる予防接種ブタからのウイルスの排
出を検出した。2週(A)および3週(B)後、予防接種した動物および対照の
動物を毒性の非常に高いCSFV株ブレスシア100LD50で鼻腔内経路によ
り攻撃した。予防接種の2週間および3週間後、臨床学的、ウイルス学的および
血清学的パラメーターを測定し、E2サブユニットワクチンの効能を評価した。
予測どおりに、B群はA群よりも臨床徴候が少なく、攻撃に抵抗した。前哨用へ
のウイルスの伝播はA群にのみ起こり、両群からの動物すべての白血球フラクシ
ョンにウイルスが検出された。B群の動物1頭のみが予防接種の14日目にセロ
コンバーションを受けていた(no.414)。同一群からの動物1頭は21日
後にもセロコンバーションを受けなかったが、防御されており、発熱は2日間の
みであり、攻撃後11日以内にセロコンバーションを受けた。対照と前哨用の1
頭(A群)のみが白血球減少症と血小板減少症に罹患した。A群およびB群動物
からの組織サンプルいずれにもウイルス抗原は検出されなかった。結論として、
動物はすべて単回投与での予防接種後2週間および3週間目の攻撃に対し防御さ
れていた。
し、その予防効果のレベルをさらに評価するために、6頭のブタ2群(A〜B)
を32μgのE2により筋肉内経路で予防接種した。2頭の非予防接種ブタを各
群内(A〜B)に置き、接触感染の原因となる予防接種ブタからのウイルスの排
出を検出した。3ヵ月(A)および6ヵ月(B)後、予防接種した動物および対
照の動物を毒性の非常に高いCSFV株ブレスシア100LD50で鼻腔内経路
により攻撃した。この期間の後、臨床学的、ウイルス学的および血清学的パラメ
ーターを測定し、E2サブユニットワクチンの効能を評価した。A群およびB群
からの動物はすべて攻撃に抵抗し、臨床徴候はわずかであった。そして対照のみ
が白血球減少症と血小板減少症に罹患した。前哨用へのウイルスの伝播は起こら
なかった。また、両群から選択された白血球フラクションのいずれにもウイルス
は検出されなかった。B群の動物1頭のみが予防接種後の28日目にセロコンバ
ーションを受けていた(no.1983)。A群、B群および前哨用動物のいず
れの組織サンプルにもウイルス抗原は検出されなかった。結論として、すべての
動物が単回投与での予防接種後3ヵ月および6ヵ月目の攻撃に対し防御されてお
り、ウイルス伝播は起こらなかった。 0 BVDV株4800、150022および178003を用い、実験的E2
サブユニットワクチンを生成させた。これらの株のE2遺伝子はバキュロウイル
ス発現系において発現させた(ハルスト(Hulst)ら、1993、J.Vi
ol.67:5435〜5442)(リジュン(P.A.van Rijn)ら
、1996、I)、Gen.Virol.、77:2737〜2745)。スポ
ドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞
系SF21を、組換えバキュロウイルスの増殖とE2タンパク質の生産に用いた
。SF21細胞は無血清SF900培地(ギブコBRL)中28℃にて増殖した
。SF21細胞の集密単層を組換えバキュロウイルスにより、細胞当たり5TC
ID50(50%組織培養感染用量)の感染多重度にて感染させた。4〜5日後
、培養は80〜90%の細胞変性効果を示した。細胞を1500×gで10分間
遠心分離し、バキュロウイルスとE2を含むその上清を収集し、−20℃にて保
存する。バキュロウイルスを不活化するために、臭化2−ブロモエチル−インミ
ン(BEI)での処理を標準手法に従い実施した。手短に説明すると、BEI
600μlと1M−NaOH600μlとを混合した。20℃、30分後、上清
150mlを加え、20℃で24時間攪拌した。次いで、25%チオ硫酸20m
lを加えた。バキュロウイルスの不活化はSF21細胞上、上清の滴定により確
認した。
なっていた。該油は90%マルコール52(エッソ)および10%モンタニド8
0(セピック)を含んでいた。水性フラクション(PBS+)は98%リン酸バ
ッファ塩溶液、2%モンタノックス80(セピック)および100ppmチオメ
ルサールを含んでいた。上清、油およびPBS+は、10:11:10の比で用
いた。まず、上清と油を乳化し、次いでPBS+を加え、乳化した。対照のワク
チンは、野生型バキュロウイルスで感染させたSF21細胞の上清から同様に調
製した。調製後、ワクチンは無菌であると判定された。
であろうとする我々の当初の仮定は、間違っていた。抗原量の差は恐らく昆虫細
胞での発現の差に原因がある。ワクチン150022は用量当たり55μgのE
2を含んでおり、2回の予防接種(0日および21日目)後、胎児に対し防御的
であった(ブラッシェ(Brusche)ら、1997、Vaccine、印刷
中)。ワクチン4800およびワクチン178003は用量当たり12μgと1
7μgのE2をそれぞれ含んでおり、胎児に対し防御的ではなかった。この結果
はE2タンパク質量と胎児の防御との間に相関性のあるこを示唆している。しか
し、E2糖タンパク質の免疫原性の差と、攻撃株が胎盤を通過する能力のないこ
とが、攻撃が異なる結果をもたらすことに対する説明となるかも知れない。非相
同BVDVの攻撃に対し、該ワクチンは防御しなかった。
将来有望である。その理由は我々が、エンベロープ糖タンパク質E2での予防接
種により胎児の防御を達成し得ることを示したからである。さらにそれはマーカ
ーワクチンであり、予防接種した動物と野外ウイルス株との間に識別を可能とす
る。これは将来のBVDV撲滅プログラムに照らして有利である。
伝子がエンコードする非相同タンパク質の最適生産を達成することを目的とする
。バキュロウイルス発現ベクター系(BEVS)は異なる組換えタンパク質の産
生に非常によく適合する。その理由は、正しいタンパク質の折りたたみと正確な
翻訳後プロセシングが、動物とヒトへの応用のために生物学的に活性なタンパク
質に至らしめるからである。バキュロウイルスは2つの非本質的遺伝子を含み、
それは非常に強力なプロモーター、p10およびポリヘドリンプロモーターから
転写される。p10遺伝子の欠失突然変異誘発(バン・オアーズ(van Oe
rs)ら、J.Gen Virol.74:563〜574;1993)は、そ
れが細胞培養におけるウイルスの複製にとって必須ではないが、p10が細胞溶
解において一つの役割を演じており、p10タンパク質が存在しないと、感染し
た細胞が損なわれないままに存在することの原因となり、感染細胞からの多角体
の放出を妨ぎ、それによって再感染率を降下させるが、それ自体感染性ではない
ということを示した。遺伝子産物(p10(またはフィブリリン)およびポリヘ
ドリン)は感染段階の後期に発現される。これらの遺伝子を、必要とするタンパ
ク質の遺伝子に置換えても(ポリヘドリンプロモーターの場合)、理論的に、昆
虫細胞培養の総タンパク質生産収率は50%までとなるが、発現レベルは培養1
リットル当たりポリヘドリンタンパク質1グラムを超えるものとなる(マイオレ
ラ(Maiorella)ら、(1988)組換えタンパク質生産のための大規
模昆虫細胞培養。Bio/technology、6、1406〜1410)。
感染多重度(MOI、1ml当たりのウイルス密度と1ml当たりの細胞密度の
比)は、タンパク質生産の最適化にとって重要なパラメーターである。感染多重
度の低い感染であることの明白な理由は、ウイルス植菌量をできるだけ少なくし
ていることにある。もし感染が、50L醗酵槽内でMOIを0.1として1ml
当たり2百万の細胞密度で起こるならば、その場合は、1×1010のウイルス
が必要となる。このことは約1リットルの植菌量を必要とすることである。さら
に、かかる植菌量を造るための余分な生産工程が必要となる。付着培養の2つの
主な欠点は、効率の悪い培地の使用と酸素量が制限されることである。水性液で
の酸素溶解度が比較的乏しいという事実のために、単層培養での細胞にとって、
酸素は制限のある基質である。静置培養での最大細胞密度の決定因子は利用可能
な表面である。その表面が細胞の単層で一旦被われると、細胞増殖は停止してし
まうことになる。その結果、細胞密度は培地1ml当たり約1×106に留まる
。懸濁培養では酸素の制限が存在せず、他の基質の利用可能性が細胞密度にとっ
ての制限因子となる。この制限は酸素の制限よりもより高い細胞密度で起こり、
したがって、細胞密度が静置培養におけるよりもより高くなる。酸素の制限は、
溶解酸素濃度をモニタする酸素電極を使用することにより防止される。酸素があ
る値以下に落ちると、酸素は自動的に、培養槽の上部空間を経て散布によりまた
は添加により、懸濁液に添加される。懸濁液を適度に攪拌することは均一な培養
を保証し、そこでは基質の勾配が形成されず、また、細胞も過度に高い剪断力に
さらされることがない。さらに、攪拌は感染細胞のウイルスを非感染細胞に効率
的に移動させることになり、細胞のウイルス感染効率を高めることとなる。最初
、細胞はわずかに約0.1〜0.3%が感染しているだけなので、残り99.7
〜99.9%の細胞は増殖し、複製することが可能となる。感染細胞内で産生さ
れるウイルス粒子は、感染後12〜20時間で放出される(ディーおよびシュラ
(Dee,K.U.and Shuler,M.L.)1997、Biotec
hnology Progress,13、14〜24)。細胞当たりに放出さ
れるウイルス粒子数は100〜200であり、それが新たなサイクルにおいてそ
れまで非感染であった細胞を感染させる。ウイルス粒子が十分に産生され、培養
物内に存在するすべての細胞を感染させるまでには、数回のサイクルを要する。
目指すところは、培地が使い尽くされ、すべての代謝工程が停止するようになる
までに、最終の感染経路のタンパク質産生を完遂することである。また、最適以
下の細胞密度で完全な感染を達成させることも望ましくない。というのは、培地
が効率的に使用されなければ非相同タンパク質の容量収率も低くなるからである
。ウイルス感染の全工程は、ポリヘドリン遺伝子がなお存在するという事実によ
り、目視によりチェックすることができる。ウイルスの感染は細胞核に蓄積する
密集したタンパク質粒子として観察することができる。細胞に対する剪断損傷を
防止するためには、プルロニックF−68を最終濃度が0.2%となるように培
地に添加する。さらに、要すれば、消泡剤Aを加えて、過度の泡立ちを防止する
が、これもまた細胞死を招く。50Lの培養に添加される消泡剤Aの総量は平均
で20mlである。細胞を感染させる最適ウイルス密度は計算することができる
。この密度は、細胞の増殖率、新たなウイルス粒子が放出されるまでの感染後の
時間、および感染細胞当たりに産生される新たなウイルス粒子の数に依存する。
本発明により提供される方法の例証となるのはペスチウイルスE2タンパク質の
産生である。このタンパク質は活性の高い抗原として知られていたが、ワクチン
用または診断試験用のE2(フラグメント)の生産は常に不成功である。PD5
0は2μgと低い(特に、免疫原E2フラグメントを用いる場合)にもかかわら
ず、問題は、多数動物群の防御的予防接種を1頭当たり単回の予防接種で可能と
するために、商業的に魅力のある方法で、十分な抗原性部分をもつワクチンの投
与に十分な量を如何に集めるかである。この問題はとりわけ、CSFVの予防接
種に関連性がある。投与に際しては、CSFVの予防接種は、一般に、CSFV
が突然発生した地域での集団活動で実施される。この場合には、膨大な数の動物
を、比較的短期間で、迅速に予防接種することを求められる。かかる集団活動に
おいては、適切な防御レベル(野生型ウイルスの感染に対し防御されるブタの数
)を迅速に達成することが差し迫って重要である。防御を達成するために、最初
の予防接種後二回目の予防接種まて数週間も待つことは、この疾患の制御を著し
く妨害し、遅らせる。組換えにより発現したE2タンパク質を産生させる様々な
方法の間には、バキュロウイルスで発現したE2(フラグメント)を比較するだ
けでも、違いが存在する。初期に報告されたE2タンパク質産生培養において、
E2タンパク質(フラグメント)の収量は20〜90μg/mlの間で変動する
(ハルスト(Hulst)ら、J.Vir.5435〜5442、1993;ハ
ルストおよびムーアマン(Hulst and Moormann)、Cyto
technology、20:271〜279、1996)が、単回投与予防接
種に必要な関連するE2抗原性部分を得るためには、モノクローナル抗体による
免疫アフィニティ精製をさらに必要とする。他の方法(EP0389034に記
載されたE2のフラグメントを使用する)は、この方法では昆虫細胞の上清から
取得したE2をさらに免疫アフィニティ精製することなしに使用するが、それが
E2ベースのワクチンであって、満足すべき(防御)免疫応答が得られるまでに
、2回注射する。これらの問題は、とりわけ、該ワクチンを調製する出発原料、
たとえば、細胞培養上清における関連する抗原性物質、この場合にはE2タンパ
ク質(フラグメント)、の低濃度に関係する。理論的には、技術上既知の精製・
濃縮法により抗原性部分をさらに蓄積することができるが、しかし、この方法で
は商業的に魅力のあるワクチン生産法に導き得ず、しかも1用量当たり高コスト
の原因ともなる。本発明方法により提供される方法を用いる生産工程では、我々
の50L容量醗酵槽において、定常的に約200〜300μg/mlのCSFV
E2タンパク質フラグメントを生成するに至り、理論的に、1回の培養当たり
100,000頭の動物を予防接種するのに十分な量である。細胞はおおよそ1
07TCID50/mlを含むウイルス菌量1〜10mlにより、0.5〜1.
5×106細胞/mlの密度で感染される。この培養では、好ましくは、細胞の
〉50〜80%がCPEを示したときに収得する。これは感染後約100〜15
0時間である。初期E2タンパク質生産培養においては、細胞はMOI〉1で(
同時に)免疫されるが、タンパク質収量は本発明により提供されるものより3倍
低くなる。本発明により提供される方法では、50L容量の醗酵槽は、5Lの醗
酵槽内で増殖した細胞懸濁液5Lにより、または10Lの醗酵槽内で増殖した懸
濁液のすべて10Lにより接種する。初期細胞密度は約3×105細胞/mlで
ある。細胞は、この懸濁液にウイルスを加える前に、計算した細胞密度まで増殖
させる。下流のプロセシングは精密濾過による細胞と多面体の除去とともに始ま
る。中空糸精密濾過装置を醗酵槽に結合し、原料を0.22μmの孔径をもつ濾
過モジュールにポンプ輸送する。保持流動体は醗酵槽を再循環させ、浸透する流
動体は100Lの容器に収集する。濾過が完了したとき、現段階で無細胞ではあ
るが、感染性のバキュロウイルスをなお含む抗原溶液を100L容器中で不活化
する。一般に、臭化2−ブロモエチル−アンモニウム(BEA)を、最終濃度が
8〜12mMとなるように該懸濁液に加える。2M−NaOHを添加して、pH
を約5.8から8.2〜8.7に上昇させる。このpH移動はBEAをBEI(
臭化2−ブロモエチル−インミン)に変換する。これはDNA不活化剤である。
pHを注意深くモニタして、6〜10に調整し、温度は34〜39℃に維持する
。不活化の6時間後に、抗原溶液を第2不活化容器に移す。これにより、容器中
のすべての物質がBEIと接触し、その結果、不活化されるであろうことが保証
される。ウイルスを含むが、BEIを含まない液体のしずくが第1容器には存在
し、第2容器には存在しないはずである。104〜107pfu/mlの濃度で
存在するバキュロウイルスは、〈10−7pfu/mlの値(10m3当たり〈
1個のウイルス粒子)まで分解される。これは、宿主動物を感染させ得るウイル
スにもとづくウイルスに対して用いたのと同じ水準である(FMD同様)。ブタ
はバキュロウイルスに対して宿主ではない。不活化した抗原の大部分は、水−油
−水エマルジョンに剤形化するまで≦−20℃に保存する。32μgのE2を含
む単回投与物(投与容量2ml)は、古典的なブタコレラに対し、予防接種後2
週間から少なくとも6ヵ月まで防御効果(〉PD95)を与えるに十分である。
生産工程は、該工程のスケールアップが簡単で、250Lまたはそれより大きい
醗酵槽の使用が可能となるような方法で設計する。静置培養生産のスケールアッ
プもまた簡単である(さらに多くの組織培養フラスコを使用するだけである)。
しかし、50L醗酵槽にて定常的に達成される総タンパク質生産には、約700
0個のT175組織培養フラスコを必要とする。細胞の増殖と感染は、酸素およ
びpH−電極が存在するので、醗酵槽中でより良好にモニタし、調整することが
できる。組織培養フラスコでは、フラスコ同士の変動が多分存在するが、それを
量的に決めることはできない。不活化は静置培養生産にて実施したように、容器
中でさらにより正確にモニタし、調整することができる。BEVSで発現される
他のタンパク質の容量産生レベルは(我々の研究所にて)、もし細胞が本発明に
より提供される方法で増殖するならば、著しく改善される。たとえば、ウシFS
Hの収率は、10Lの醗酵槽を用いたとき、3〜4のファクタで増加する。細胞
は2種の組換えバキュロウイルスそれぞれについて0.003のMOIで、1.
1×106細胞/mlの細胞密度で同時感染させた。BVDVの異なるE2の、
およびErnsタンパク質またはBVDVおよび/またはCSFVの収率は、振
盪フラスコ中の懸濁培養において3倍に増加した。この方法は他の組換えタンパ
ク質にも適用可能である。
Claims (21)
- 【請求項1】 昆虫細胞の培養において産生される組換えタンパク質の収量を
増加させる方法であって、当該タンパク質をエンコードする組換えバキュロウイ
ルスを選択することと、培養容器中の増殖培地において昆虫細胞を増殖させるこ
と、および感染多重度〈0.01にて、少なくとも1種のバキュロウイルス接種
物で該細胞を感染させること、とを含む方法。 - 【請求項2】 増殖培地を2リットル、より好ましくは10リットル、より好
ましくは50リットル、より好ましくは250リットル収容するのに十分な容量
の培養容器中で該細胞を増殖させることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 細胞密度1×105〜5×106細胞/ml、より好ましくは
5×105〜1.5×106細胞/mlにて該細胞を感染させることを含むこと
を特徴とする請求項1または2記載の方法。 - 【請求項4】 感染多重度≦0.005にて細胞を感染させることを含むこと
を特徴とする請求項1、2または3記載の方法。 - 【請求項5】 感染多重度が≦0.003であることを特徴とする請求項4記
載の方法。 - 【請求項6】 p10プロモーターの制御下に所望のタンパク質を発現する組
換えバキュロウイルスを選択することを含むことを特徴とする請求項1〜5のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 昆虫細胞を、懸濁液中、好ましくは、(適度に)攪拌し得る醗
酵槽などの培養容器内で増殖させることを含むことを特徴とする請求項1〜6の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 組換えペスチウイルスE2またはErnsタンパク質またはそ
のフラグメントを産生させる請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 昆虫細胞の培養において産生される組換えペスチウイルスE2
またはErnsタンパク質またはそのフラグメントの収量を増加する方法であっ
て、収獲時の増殖培地における当該タンパク質(フラグメント)の最終濃度が少
なくとも100μg/mlであることを特徴とする方法。 - 【請求項10】 該濃度が120μg/mlを超える、または少なくとも15
0μg/ml、より好ましくは少なくとも200μg/mlであることを特徴と
する請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 抗原性物質を産生させるための請求項1〜10のいずれかに
記載の方法の使用。 - 【請求項12】 該抗原性物質がペスチウイルスタンパク質(フラグメント)
、より好ましくは古典的なブタコレラタンパク質(フラグメント)であることを
特徴とする請求項11記載の使用。 - 【請求項13】 請求項1〜10のいずれかに記載の方法を用いることにより
得られる抗原性物質を含んでなるワクチン。 - 【請求項14】 組換えペスチウイルスE2またはErnsタンパク質またはそ
のフラグメントを含んでなるワクチンであって、それが免疫アフィニティ精製さ
れたものではなく、好ましくは、単回投与量での単回予防接種後にPD95レベ
ルでペスチウイルス感染に対し防御力を付与することを特徴とするワクチン。 - 【請求項15】 ペスチウイルス感染が古典的なブタコレラ感染であることを
特徴とする請求項14記載のワクチン。 - 【請求項16】 さらにアジュバントを含んでなり、当該アジュバントが好ま
しくは二重油中水エマルジョンを含むことを特徴とする請求項13〜15のいず
れかに記載のワクチン。 - 【請求項17】 収獲時の増殖培地における濃度が少なくとも15μg/ml
で、組換え卵胞刺激ホルモン、α−ユニットおよび/またはβ−ユニット、なら
びにその複合体およびフラグメントを生産する方法。 - 【請求項18】 該濃度が少なくとも20μg/ml、より好ましくは少なく
とも25μg/mlであることを特徴とする請求項17記載の方法。 - 【請求項19】 培養において、該α−ユニットを発現する1種のバキュロウ
イルスで、およびβ−ユニットを発現する他種のバキュロウイルスで昆虫細胞培
養物を感染させることを含むことを特徴とする、請求項17または18記載の方
法。 - 【請求項20】 ホルモン様物質を生産するための、請求項1〜7または17
〜19のいずれかに記載の方法の使用。 - 【請求項21】 生殖性疾患を治療するために医薬組成物に取込ませるための
ホルモン様物質を生産するための請求項20記載の使用。
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