HU228122B1 - Protein expression in baculovirus vector expression systems - Google Patents
Protein expression in baculovirus vector expression systems Download PDFInfo
- Publication number
- HU228122B1 HU228122B1 HU0101136A HUP0101136A HU228122B1 HU 228122 B1 HU228122 B1 HU 228122B1 HU 0101136 A HU0101136 A HU 0101136A HU P0101136 A HUP0101136 A HU P0101136A HU 228122 B1 HU228122 B1 HU 228122B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- infection
- cell
- vaccine
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 65
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 76
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 72
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 46
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 36
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 10
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 208000004571 Pestivirus Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 241000500884 Ephemera Species 0.000 claims 1
- 241000447437 Gerreidae Species 0.000 claims 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 211
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 80
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 76
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 36
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 11
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 11
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 10
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 7
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 7
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 7
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 5
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 3
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282819 Giraffa Species 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101100136147 Arabidopsis thaliana PER10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710151325 B2 protein Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000709756 Barley yellow dwarf virus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010010254 Concussion Diseases 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000666657 Homo sapiens Rho-related GTP-binding protein RhoQ Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000209035 Ilex Species 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 1
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150010944 P10 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 101100327906 Picea mariana CSF7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282330 Procyon lotor Species 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038339 Rho-related GTP-binding protein RhoQ Human genes 0.000 description 1
- 229910018497 SFO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 101800001473 Spike glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100033740 Tenomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101710114852 Tenomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 241000893966 Trichophyton verrucosum Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000000531 effect on virus Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 102000013370 fibrillin Human genes 0.000 description 1
- 108060002895 fibrillin Proteins 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 101150044234 mai gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000030247 mild fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021231 nutrient uptake Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 208000025858 pestivirus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 241000701451 unidentified granulovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Képviselő;
Danubia,
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Búd a o e s t
Fehérjeexpreesziá feaculovirus-vektort alkalmadé esqnxessmxós rendszerben
A találmány tárgyát eljárások képezik fehérje vagy polipeptid expresszied ára bacrlovítus-vektort alkaimazó expressziö-s rendszerekben.. A találmány tárgya közelebbről eljárás rekombínáns fehérje rovarsejt-tenyészetben való termelésére és hozamának javítására, amelyben, a fehérjét kódoló rekombináns baculovírust szelektálunk, rovarsejteket növesztünk növesztés! táp-közegben, t-enyész kőedényben, és legalább egy ba-culovírust tartalmazó inokulummal megfertőzzük a sejteket, <0,01 fertőzési aránnyal.
A találmány szerinti eljárás előnyösen alkalmazható rekombínáns proteinek hatékony termelésére»
Rekombínáns DNS-t-echn.ikákat kifejlesztése esetén magasak az elvárások nagy mennyiségé fehérjetermelés vonatkozásában, genetikailag módos í fcofct baktériumok a 1 ka Ima zásával..
Aktaszámunk: S251S-480/PA
A kereskedelmileg jelentős fehérjék többsége azonban szükségszerűen poszttranszlációs, módosításokon megy keresztül, mielőtt biológiailag aktív fehérjék lesznek. Ennélfogva jelenleg állatsejteket gyakrabban alkalmaznak rekombínáns fehérjék előállítására.
Az állatsejtek közül a rovarsejtek egyre nagyobb jelentőséggel rendelkeznek rekombínáns fehérjék termelése szempontjából λ Kényelmes és .sokoldalö. bacuiovírus-vektorrendszert fejlesztettek ki rovarsejtek alkalmazásával. A rovarsejtek fiziológiájáról rendelkezésre álló információk inkább szűkösnek tekinthetők, azonban baculovírust alkalmazó rekombínáns technikák általánosan elfogadottak vakcinák előállítására.·. Például I. típusú, humán iwmunhlányt okozó vírusból származó gplőO-burokfehérj ét baculovírus alkalmazásával expresstálnak, lehetséges AXDS-Vakcinaként klinikai kísérletekben.
Bacuiovi/russal expresszárt fehérjék nagy mennyiségű termelése rovarsejtekben idáig maximum körülbelül 10 literes bioreaktorokra korlátozódott, béretnöveléshez a szüszpenziós tenyészetek, nyújtják a legjobb lehetőséget. Nagy mennyiségű termelésben [lásd Tramper és latsai., Rec. Adv. Biotech, 2-63-284 (1992); Power és Nielsen, Cytotechnology 2-0, 209-219 11996)1 speciális hangsúlyt keli fektetni sejtnövekedést és vírustermelést befolyásoló faktorokra. Ilyen faktorok, változtatása nagymértékben befolyásolja a rekombináns fehérjetermelés végső mennyiségét.
A baoulovirnsokra rúd alakú vírusrészecskék jellemzőek, amelyek általában zárványtestekbe -(poliédernek is nevezik) * *· vannak bezárva. A Bacíjloviridae család két alcsaládra osztható fel: az Subacul ovi ráca e két, zárványtestekfoe záródó ví rusnemzetséget tartalmaz: nukleáris pol íhedrőzi.s-vírust (NPVj és granolózis-vírust (GY) f és a lAviohaeuloví rínaealcsalád zárványtestekbe nem záródó vírusokat tartalmaz. Az Autographa californlca <Ac.|-NPV sejt- és molekuláris biológiáját tanulmányozták részletesebben.
Sok fehérjét expresszáltak rovarsejtekben, melyeket az adott fehérjét kódoló, rekombináns baculovirnssai fertőztek, A kódolás azt jelenti, hogy az ilyen vírusok hefcerológ fehérjét kódoló nnkleinsavszekvenciát tartalmaznak, és továbbá gyakran szabályzó nukieínsavszekvencíákat, például promótert tartalmaznak, A leggyakrabban polihedrin-promótert alkalmaznak idegen gének expresszálására, de a plOpromöter ugyanúgy megfelel, és szinten alkalmazzák.
Számos sejtvonal áll rendelkezésre rekombínáns bacuiovírusokkal való infekcióhoz. Az SF-21-sej tvonal amerikai, sereghernyö (Spodopfera frugiperda) petefészek-szövetéből származik. A.z SF-9-jelű klonális iz-olátum rendelkezésre éli az „American Type Culture Coliec.fcion~ban (-CRL 1711)amely többé-kevésbé standard sej tvonal rekombináns vírus ín vit.ro előállítására, és amelyről azt tartják, hogy a legjobb rekombináns vírus előállítására. Más sejtvonalat is alkalmaznak, például, a „Hi~Fiva**-sejtvonalat és az „fn-G&S- és „Tn.~3'S8A~sej tvonalakat,· melyek káposztaiepke araszoló hernyójából (Ari Chopin sí a ni) származnak. Rovarsejtek növesztésére alkalmas, legelterjedtebben alkalmazott tápkózegek: TNM-PH, BML-TC/1Ö és 1PL.-41, Ezeket a tánközeoeket rendszeránt kiegészítik többé-kevésbé definiált komponensekkel , például emlősszerverétből származó szérumokkal, különösen magzati bor jűszérnmal. Szérumot helyettesítő anyagokat szintén alkalmasnak ro-varsejt-tenyészetben, valamint szérum-mentes tápközeget, például a kereskedelemben rendelkezésre álló Sx-cell 40ő'”;~et vagy SfSŰÖ-at.
Rovarsejtek általában szilárd hordozókon valamint -szuszpenzlóban növekednek, de magasabb vírushozamokat írnak le akkor, ha szilárd hordozókon, növesztik azokat. A fertőzés akkor a leghatékonyabb, ha. a sejteket az exponenciálisan növekvő fázisban fertőzik, de a sejtenként termelődött, poliéder és vírus mennyisége azonban nem változik szignifikánsan olyan sejtek között, amelyeket a sejtciklus különböző fázisaiban fertőztünk., A sej',sűrűség nagy hatással, van a vírusterme1és re. A rovarsejtek a kontakt gátlás egy formáját képesek mutatni, amely csökkent vírustermelést eredményez nagyóbb sejtsűrűségné1,
A kezdő fertőzési egység* („multzplicity of infectio-r/', rövidítve m.o.i.), amely a fertőző vírusok sejtenként! száma, általában mind a fertőzött sejtek arányát, mind a fertőzés- végén sejtenként termelődött poliéder-számot befolyásolja. Optimális m.o.i. vírus termeléshez általában 20-30nak tekinthető. β-galaktozioázt -expresszálni képes, rekomblnáns: bacuiovírussai végzett kísérletben [Llcari és Balley, B-iote-ch. Bío-eng. 37, 238-246 (1991Π Sf-9-sejteket fertőztek 0 és 100 közötti m. ovi.-értékekkel. A βgalaktoz.idáz hozama növekedett és a sejtsűrűség csökkent a
m.o.í. növelésével. Általában azt tartják, hogy a m.o.i.
» » Φ * X * · »* * φ φ φ φ ♦ j* φ ♦♦ ♦♦ · ♦ - * növelése vagy csökkentése csak korlátozott hatást képes kifejteni a fertőzött sejtenként maximálisan elérhető rekombináns fehérje hozamára. Azonban alacsony a.o.i. választása esetén lehetőség van a fertőzéshez szükséges víruskészletet csökkenteni, és defektiv, zavaré ba-culovírus-részecskék keletkezésének kockázatát minimalizálni. Ha rovarsejtek szakaszos (,,batehw) tenyészetét magas 05) m.o,i.-val fertőzzük, az ebből létrejövő fertőzési folyamat lényegében, szinkronizált lesz, azaz valamennyi sejt szimultán megy át a fertőzési cikluson. Ha a sejteket 1 és 5 közötti m.o.i.val fertőzzük szakaszos tenyészetben, a tenyészet tovább már nem szinkronizált. A tenyészet eleinte nem-fertőzött sejtekből és olyan, sejtekből áll, .amelyek egyedi fertőzöttségi ciklusuk különböző pontjain vannak, ez addig tart, amíg valamennyi sejt megfertőződik, és a kívánt fehérje termelődése befejeződik. Ilyen tenyészetekben a termelés általában sokkal kisebb mértékű A tenyészet viselkedése az egyedi sejtek viselkedésének kombinációja, amely sejtek mindegyike különböző termelési fázisban van; ez magyarázza az optimálisnál kisebb mértékű termelést. Folyamatos tenyészetben. folyamatosan adagolnak, nem-fertőzött sejteket, és a tenyészet nyilvánvalóan sszinkronizáltan fertőződik.
Bár azt tartják, hogy lehet matematikai modelleket tervezni komplex viselkedés előre jelzésére, például olyanokat, amelyeket alacsony m.o.i.-val fertőzött sejteknél figyeltek meg, vagy amelyeket folyamatos tenyésztési rendszerben végzett virusszaporítás esetén figyeltek meg. Úgy tekinthető, hogy ilyen, jelenséget nagyon nehéz tisztán em6 pírikusan analizálni# csaknem lehetetlen. Jelenleg három modell ismeretes# a Llcari és Bailey-féle# a de Gooijértélé és a Power és Nielsen-féle modell. Komplex jellegük és kifejlesztésükért tett erőfeszítések ellenére# ezek mindegyike első generációs: modell# amelyek modell rekombináns fehérjét ($-galaktozidáz# polihedrin-promóter vezérlete alatt) expresszální képes baculovírusok viselkedését tekintik alapnak, összefoglalják jelenlegi kvantitatív tudásunk nagy részét a baculovirus és rovarsejtek közötti kölcsönhatásról# fekete dobozként vizsgálva azt# anélkül, hogy figyelembe vennék a DNS és RBS felhalmozódását és a fertőzési ciklust. A kötődés és a kezdő fertőzési folyamatok kvantitatíven még alig ismertek# és nagyon nagy szükség van további munkára ezen a területen.
A baculovírust alkalmazó expressziós rendszer hatásos eszköz rekombináns fehérje termelésére. Számos sejttenyésztési összeállítást lehet alkalmazni nagy mennyiségű termelésre. Ezek a rendszerek azonban további optimalizálást igényelnek# hogy kihasználjuk hatékonyságuk minden előnyét. Ipari alkalmazásban döntő jelen;, őségé- van a nagy mennyiségű és alacsony költségű termelésnek. Nagy mennyiségű sejttenyészetekre leírt, poliéder-termelő rendszereket drámaian javítani, kell ahhoz, hogy megfeleljenek a gazdasági követelményeknek versenyképes árú termék előállítása céljából.
A találmány tárgya eljárás nagy mennyiségű rekombináns fehérje előállítására# baculovírust alkalmazó expressziós rendszer alkalmazásával# amely lehetővé teszi a kívánt, fehérje javított hozamát. A találmány tárgya eljárás rekombínáns fehérje rovarsejt--tenyészetben való termelésére és hozamának. javítására, amelyben a fehérjét kódoló rekombináns baculovírust szelektálunk# rovarsejteket növesztünk hövesz-
dovíruss-a-1 Megfertőzzük a sejteket <0,01 fertőzési, egységgel .
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás rekombináns fehérjét emelés hozamának növelésére rovarsejt-tenyészetben, amelyben a. fehérjét kódoló, rekombináns baculo-virust szelektálunk, rovarsejteket nővesztőnk növesztés! tápközegben, tenyésztőedényben# és a sejteket legalább egy baculovírus-oitőanyaggal, <0,01 fertőzési egységgel <m„o.í.«) megfertőzzük. A hozam fokozása számos kutatócsoport témája volt. Például C'hen és munkatársai [Drug metaboiism and Disposítion 24, 399-405 (1997} 3 a MG.Í. optimalizálásának lehetőségét vizsgálták koinfekcíós Megközelítésben·, ahol két különböző, teaeulovírus által expresszált fehérjét termeltettek rovarsejttenyészetben. A találmány szerinti eredmények ellenére azt találták, hogy a két fehérjére a legjobb MOX körülbelül 0,015 és 0,03 között volt. A MOX <0,01 alá csökkentésével Chen és munkatársai által leírt, koinfekcíós rendszer hozama csökkent. Radford és munkatársai (Cytotechnology 24, 7381 (1997} ] koinfekcíós rendszert tanulmányozva világosan, kimutatták, hogy minden esetben >1 MOI-t kell alkalmazni a .folyamat végső hozamának maximálása céljából, ami ismét a találmány szerinti felismeréssel ellentétes. Azt állítják, hogy lehetetlen sejtenként nagyobb mennyiségű fehérjét és φ ** φ » φ * « φ ♦ > Jkjt <
vírust termelni alacsony KOI alkalmazásával, és helyette feltételezik, hogy a fertőzési időt (TÓI) kell beállítani.
Mások, például Kguyen és munkatársai. (J. Biotech. 31, 205-217 (1993)] nem találtak célravezető megoldást a Möl változtatásával, viszont a hozamok növelése céljából rátáplálásos szakaszos (fed-batch) tenyészeteket alkalmaztak, vagy azt a hőmérsékletet változtatták, amelyen a vírus növekszik (Wu és mtsaí., Cytotechnology 9, 141-147 (1992); Ring és mtsai., Biotechnoi. Bioeng, 38, 1091-1099 (1991)] és elérték, hogy a vírus ne növekedjen MOI < 0,01 alatt.
Ezek a korai eredmények nyilvánvalóan különböznek a találmány szerinti megoldással elért eredményektől (lásd például az I. ábrát), .amelyben a tenyészeteket KOI < 0,01-el (például 0, 003-al, 0, ÖŐl-ei sőt 0, 0001~el) fertőzzük, amellyel magasabb hozamokat érünk el, mint 0,01 vagy 0,1
MOI-val.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás rekombínáns fehérje termeltetésére és hozamának növelésére rovarsejt-tenyész-etekben, amelyeket nem egyrétegű tenyészetként, növesztünk.. Szokásos laboratóriumi eljárások, amelyekkel fehérjéket kis mennyiségben termeltetnek b-acnlovírust alkalmazó expressziős rendszerben,· egyrétegű rovarsejt-tenyészeteket alkalmaznak tenyésztőedényekben. Ezeket a statikus tenyészeteket normálisan magas MOI-val fertőzik meg, szinkronizált fertőzés biztosítása céljából,. Döntő fontosságú, hogy valamennyi sejt fertőzve legyen, mielőtt az egyrétegű tenyészet kontinens lesz, mivel a kontakt gátlás olyan métábólíkus változások9 hoz vezet a sejtekben, amely befolyásolhatja a végtermék hozamát. Mivel nehéz pontosan beállítani a sejt-söröséget egyrétegű tenyészetekben, lehet étién MQX-kisérleteket. végezni. Sőt, még kevésbé hasznos alacsony MOI-t (<O,Q1) alkalmazni a tenyészetek fertőzésére. A. sejt-sűrűség túlvagy alulbecslése a fertőzéskor egyaránt szignifikánsan szuboptímálís fehérjehozamhoz vezet. Rutinszerűen magas MÖI-t alkalmaznak, amely garantálja a teljes sejtpopulációszinkronizált fertőzését. Ez magában foglalja, hogy nagy mennyiségű víruskészletek szükségesek egyrétegű tenyészet fertőzéséhez, optimális hozamok elérése céljából.
Fehérjetermelés méretnövelése egyrétegű tenyészetek alkalmazásával egyszerűen azt jelenti, hogy több szövettenyésztő edényt alkalmazunk, hagy mennyiségű fehérje termeltetése egyrétegű tenyészetek alkalmazásával nagyon munkaigényes. Továbbá nem lehet szabályozni és/vagy követni fontos tenyésztési paraméterek, például az oldott oxigén koncentrációját és pH-t.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható valamennyi rovarsejfc~tenyészet re, a találmány szerinti megoldás betekintést nyújt abba,· hogy alacsony Möl jótékony hatást képes kifejteni egyrétegű tenyészetektől eltérő, rovarsejt~tenyészetekkel elérhető hozamra.
Különböző típusú tenyésztőedényeket alkalmazhatunk egyrétegű tenyészetektől eltérő, rovarsejtek tenyésztésére. Valamennyi fermentor tervezésének célja megfelelő levegőztetés és nagy sejt-sűrűség elérése, miközben a nyírőerök olyan alacsonyan tarthatók legyenek, amennyire lehetséges •ν <χ<- * .
* - * a « «·* *« <' j. ··, ν ·>
>\>* -e w » #, *- Φ »:» ♦ V ν χ [Tramper és mtsai., Récént advantages- ín biot.echnol.o-gy' c. kényben, sserk. Vsrdar-Sukan és Sukan (1992)]» Az irodalomban leírt esetek többségében az alkalmazott, kevertetett bioreaktor-tank gázbevezetéssel van felszerelve. Az ilyen típusú edényben a homogenitást keverő alkalmazásával érik el. Az ilyen típusú fermentort ; ülönhöző eljárásokban lehet üzemeltetni. Mindenek előtt, szakaszos- (batch) eljárásban. Ez a legcélravezetőbb és legegyszerűbb módszer. Sejteket tenyésztünk, hozzáadunk vírust, és a terméket elkülönítjük a fertőzés végén. Bonyolultabb módszer a rátáplálásós szakaszos (fed-batch) tenyésztés. A fcenyésztoedényhez koncentrált tápanyag-keveréket adagolunk, nagyobb sejtsűrűség és magasabb vo 1 .umetrikus termék-hozam elérése céljából [Nguyen és mtsai., Journal of Biotechnology 31, 20.5217 (1993)] . Ez bonyolultabb eljárás, mivel nem mindig világos, mi a limitáló, tápanyag. Az egyik tápanyag-1 imitáció megszüntetése -ezen szubsztrát hozzáadásával, közvetlenül egy másik szubsztrát-límirációhoz vezethet, és ennélfogva nem szükségszerűen eredményez magasabb termék-hozamot.
bio-reaktorokban. [Wu és mtsai., Cytotechnoiogy 9, 141-147 (1992)].. Az ilyen típusú edény két hengerből áll. A kisebb átmérővel rendelkező henger (szivőcsato-rna) a nagyobb átmérőjű henger (levezetőcsö) belsejébe van elhelyezve. A középső hengerbe levegőt vagy más gázokat bef-övatnak, amely™ lyel .felfelé irányuló áramlást hoznak létre. A termen tor tetején a gáz elhagyja a folyadékot, és a folyadék a középső hengeren kívül, áramlik le. Ezzel a módszerrel kizárólag * » gáz befűvat'ásával a levegőztetést és a homogén!zálást egyaránt elérjük, a szívó-csatornában és a levezetőcsőben lévő sűrűs-égkölönbség következtében. Ez a módszer csökkenti a nyíróstresszt is. Azonban folyamatos levegőztetés szükséges megfelelő keveredés eléréséhez»
A fermentorban lévő élő sejt sűrűségének növelésére szolgáló másik módszerben centrifugális szűrőt vagy másfajta sejt-visszatartó eszközt alkalmaznak. Ezt perfűziónak hívják. Ez lehetővé teszi a feleslegessé vált tápközeg eltávolítását a fermentorből, és friss tápközeg adagolását# miközben a sejteket visszatartjuk a fermentorban. Ez a módszer sok extra berendezést és nehezebb fermentor-kezelést eredményez (Cáron és mtsaí., Biotechnology and Bioengineering 43, 881-891 (1994)}, További módszereket is leírtak# például ma.kroporóz.u.s ágyat és gélmátrixban való immobilizálást. Az ilyen típusé módszerek sejtek immobil!zálására alapulnak a mátrixon vagy a mátrix belsejében, amely .lehetővé teszi a feleslegessé vált tápközeg eltávolítását és friss tápközeg adagolását anélkül# hogy hígítanák a sejttenyészetet. Ha a sejt-sűrűség# kontakt gátlás és más hasonló problémák kezelhetők lennének egyrétegű tenyészetekben, a találmány szerinti eljárás nemcsak a fentebb leírt különböző tenyésztési rendszerekben lenne csak alkalmazható# hanem egyrétegű tenyészetben is,
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya például eljárás rekombináns fehérje termeltetésére és hozamának javítására rovarsejt-tenyészetekben, amelyben a fehérjét kódoló rekombináns baculovírust szelektálunk, növesztjük a rovarsejteket növesztés! tápkezegben, elegendő térfogatú, legalább 2 literes tenyésztőédényben, és megfertőzzük a rovar-sejteket legalább egy baculovirus-oltóanyággai, <0,0-1 PFü m.o.i. baculovirussal sejt enkén t. A t a 1 álmány fcárgá t ο1yan eljárás képe z1, amelyben jelentősen kevesebb fertőzési egységet alkalmazunk azokhoz képest, amelyek (például 1-5 m.o.i.} aszinkronizáitan fertőzött tenyészethez vezetnek. Ha rovar sejt-tenyészeteket baculovirussal. a. találmány szerinti m.o.i. alkalmazásával fertőzünk, -optimális- egyensúly érhető el a sejtek replikáciős sebessége és a vírus replíkácíós sebessége vonatkozásában, ezáltal lehetővé tesszük a kívánt fehérje optimális mértékű expressziéj át. A találmány szerinti eljárást könnyen be lehet állítani magasabb vagy alacsonyabb sejt-sűrűségekhez szintén a m.o.i. állításával, amelyben a különböző replikáciős fázisban lévő sejtek és fertőzésükre rendelkezésre álló vírusrészecskék relatív aránya a találmány szerinti fertőzési egységeken és sűrűségi értékeken, marad. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eljárásban sejteket növesztünk elegendő térfogatú tenyésztőedényben, amely legalább 10, előnyösebben legalább 20, előnyösebben legalább 50 vagy 250 liter nő-vesztési 'tápközeget tartalmaz, ezáltal lehetővé tesszük heterolog fehérjéket expresszálni képes bacuiovírus-tenyésze-tek méretnövelését. Például olyan térfogatú tenyésztőedényeket alkalmazhatunk, amely több annál, ami szükséges a jelenlévő növesztési tápközeg térfogatához, például 100 1es tenyésztőedényeket alkalmazhatunk 20-70 literes sejtre13 nyészethez. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eljárásban 1 x 10'’ és 5 x 10” sejt/ml közötti, előnyösebben 5 x 105 és 1,5 x 10” sejt/ml közötti sejt-sűrűségű sejteket fertőzünk, ezáltal a vírusoltóanyag aktuális térfogatát könnyen kezelhető határok között tartjuk. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eljárásban <0,005, például 0,003, 0,001, 0,0005 vagy 0,00025 m.o.i.-val fertőzzük a sejteket, ezáltal az oltóanyagot annyira lecsökkentjük, amennyire csak lehetséges. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eljárásban a kívánt fehérjét plO-promóter vezérlete alatt expresszální képes, rékombináns bacuiovírust szelektálunk. A plO-promóter a sejtlízisben játszik szerepet, a plO-promóter nélkül a fertőzött sejtek intaktak maradnak, amely megakadályozza a poliéder kiszabadulását a fertőzött sejtekből, ezáltal csökkenti az újra fertőzési sebességet, de a fertőzőképessé” get önmagában nem. A vírus fertőzés teljes folyamatát most vizuálisan ellenőrizhetjük annak a ténynek következtében, hogy a poiihedrin-gén, és ezáltal a poliéder még jelen van. A vírusfertőzést a sejtmagbaxi felhalmozódó sűrű fehérjerészecskeként lehet Megfigyelni. A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás rovarsejtek növesztésére szakaszos („hateh} tenyésztési rendszerben, ezáltal minimalizáljuk defektiv, zavaró baculovírus-részecskék felhalmozódását, amely egyensúlyt teremt a még nem fertőzött sejtek fertőzése és replikácíéja között. A találmány másik előnyös megvalósítási módi a sze14 ♦ * * φ φ « φ « φ Λ <· β» φ »*« rint, a találmány tárgya eljárás rovarsejtek növesztéséreszuszpenzióban, előnyösen tenyesztoedényhen, például fe.rmentorban, amelyet (mérsékelten) keverhetni lehet, A (keverhetett) szuszpenziös tenyészetek alkalmazása, különösen ha rekombínáns ba-culo-virus alkalmazásával kombináljuk, amelyben a kívánt fehérje a plO-promŐter vezérlete alatt van a vírus-növekedés vizuális ellenőrzése céljából (de más ellenőrzési módszerek Is rendelkezésre állnak, például a polihedrin-promó-ter alkalmazása esetén a CPS megfigyelése)/ lehetővé teszi a tenyészet jobb kézben tartását,
A szuszpenzió mérsékelt kevertetése homogén tenyészetet garantál, amelyben nem alakul ki szubsztrát-gradiens, é-s amelyben a. sejtek nincsenek kitéve túl nagymértékű nyíróerőknek. A k-evertetés- továbbá hatékony vírustranszfért tesz lehetővé fertőzött sejtekről nem-fertőzött sejtekre, -amely a sejtek vírusfertőzését nagyobb hatékonysággal biztosítja. Mivel kezdetben a sejteknek csak 0,1-0,3%-a fertőzött, lehetővé teszi a sejtek maradék 99,7-99,9%-ának növekedését és s z apórodásáf .
A találmány tárgya eljárás különböző eredetű r e. kombináns fehérje expres-szá-lására és termeltetésére. A találmány szerinti megoldásban például pestivírűsból származó fehérjét termeltetünk, legalább 100, 120 vagy 150 pg/mi-es, előnyösebben legalább 200 ^uj/xai-es, sőt 300 pg/ml-es koncentrációban a növesztési táp közegben, a fermentáció· végére. A kívánt fehérjét alkalmazhatjuk olyan a-ntigenikus anyag előállítására, amelyet állatorvosi vagy orvosi célokra alkalmazunk, például beépítjük vakcinába vagy diagnosztikai »φ» * χ « κ ♦ « ν*«Α «» «φ Φ ** * tesztbe. A találmány szerinti eljárással termeltetett, kívánt fehérjét például vakcina előállítására lehet alkalmazA φ
A találmány szerinti példában pestivírusból származó '£'2-fehérjét vagy fragmenseit például pestivírus-föntözések, például sertésekben előforduló, klasszikus sertésláz elleni vakcina előállítására lehet alkalmazni. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya rekombináns, pestívírusfoől származó E2- vagy Eő's~fehérje vagy fragmenseit tartalmazó vakcina, amelyet az jellemez, hogy nincsen ímmunoaffínitással tisztítva, és előnyösen védelmet biztosít pest Ivírus-fertőzés ellen a PD'95-szinten, egy dózist tartalmazó, egyetlen vakcináció után. .Ez különösen CSFV-vakcinációra helytálló. Alkalmazása esetén a CScV-vakoinációt általában tömegesen alkalmazzák azon a területen, ahol a CSFV kitört. ilyenkor nagyszámú állat gyors vakcinácíójára van szükség viszonylag rövid idő alatt. Ilyen tömeges vak-eináciöban nagy jelentősége van annak, hogy gyorsan elérjünk kielégítő védelmi szintet (a vad típusú vírusfertőzéssel szemben védett sertések száma). Néhány hét várakozás egy első vakcináciő után egy második vakclnációra a védelem biztosítása céljából nagymértékben gátolja és késlelteti a betegség megfékezését. Különbségek vannak a rekombinánsan expresszi!t E2-fehérje előállítására szolgáló eljárások között, különösen, ha E2 ífragmensek)· foaculovírusban való expresszólásához hasonlítjuk azokat. A régebben közölt E2-fehérje termelésére- szolgáló tenyészetekben az E2-fehérje (fragmensek)· hozama 20-90 pg/mi között « « φ* >
35-5442 változott ÍHulst és mtsai.·, J. Vírol, 5435-5442 (1993); finist és Moormann, Cytotecbnology 20, 271-279 (1996)], amelyben további immunoaf finitás-tisstításra volt szükség monokiónális ellenanyagok alkaÍrna zásá val, hogy eiőáiií tsák a szükséges és releváns E2 an.tigeni.kus tömeget egyetlen adag, injekció .formájú vakcinációhoz. Sgy másik módszerben ÍEP 9389034. sz. európai közzé •'.ételi iratban leírtak szerint E.2~f ragmenst alkalmasnak) rovar sejtek felülúszó jóból izolálnak E2~t további. ímxaunoa.f fimitás-t isztltás nélkül, amely E2-alapű vakcinát eredményez, amelyet kétszer injektálnak, mire kielégítő (védelmet biztosító) immunválaszhoz jutnak. Bár az Ek-autígént tartalmazó vakcinát (PorciIis®Fest.i) jelenleg regisztrálták, ezt a vakcinát kétszer kell beadni, ezáltal komolyan akadályozza a kiaszszikus sertésláz-fertőzéssk elleni vakcináeió hatékonyságát, mivel legalább két vakcínácíót kell alkalmazni 4 hetes időkülönbséggel a kívánt immunválasz biztosítása céljából.
Ezek a problémák (amelyeket megoldunk a találmány szerinti eljárásban) többek között a releváns antígenikus anyag, ebben az esetben az E2-fehérje (fragmensekj alacsony koncentrációjának tulajdoníthatók a kiindulási anyagban, például a sejttenyészet felüiúszójában, amelyből a vakcinát preparálják. Elméletileg lehet tovább akkumulálni az antigenikus anyag mennyiségét szakember által ismert tisztítási és kondenzációs eljárásokkal, azonban ez nem vezet gazdaságilag vonzó vakcina-termeléshez, viszont a dózisonként! költségeket megnöveli. Másik példaként szolgái a pestivírusböl származó Err:s~ fehér je, amelyet szintén lehet vakcina17 bán és diagnosztikai tesztekben alkalmazni, vagy más (terápiás) anyagokban.
Például Kuggii és munkatársai [Vírus Genes 10, 115-126 (1935) 1 P2-t expresszáini képes bacuiovirust növesztettek egyrétegű -rovar sejt-tenyészetben, amelynek maximális hozama nem volt több, mint 5-1 0 μσ/ΙΟ11' sejt. Továbbá Moser és munkatársai [Vet. Microbiol. 51, 41-53] E2~t termeltettek Ruglli és munkatársai által leírt egyrétegű rovarsejttenyészetben MGI-5 alkalmazásával, és nem tudtak elegendő antigént termeltetni tömény!tetlen formában ELTSA-célokra. Kísérletükben tovább tisztították a fehérjét nikkel-kelát affínítás-kromatográfiával, amely nélkülözhetetlen előfeltétele volt a kezelés egyszerűsítésének és az ELTSA-m.inőség javításának. Nem. tervezték vakcina előállítását az Így preparált E2-fehérjéből.
Ha vakcinádé volt a kutatási cél, azt találták, hogy kétszer kell beadni a vakcinát, amelyben inaaunológiailag tisztított E2-fehérjét alkalma ’tak, bizonyos mértékű védettség elérése céljából. Például Hűlst és munkatársai [J. Viroí. 67, 5435-5442 (1993)) és van Rijn és munkatársai (J. Gén. Virul. 77, 2737-2745 (1336)], valamint a WG 95/35380.
számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint E2-t termeltettek egyrétegű tenyészetekben és immunoaffínrtással tisztították védő hatású vakcina előállítása céljából.
A találmány szerinti példában a vakcina rekombináns CSFV-E2~fehér j ét (-fragme.nse.ketj tartalmaz, amelyet most már elegendően nagy mennyiségben lehet termeltetni, már nincsen szükség immunoaf f ind. tás-t 1 sztitásra, mielőtt be18 építjük egy olyan vakcinába, amely klasszikus sertéslázvirusfertőzések ellen biztosit védelmet (95%-os védettséget biztosító dózis-szinten (ED95)1 két-bárom héttel azután, hogy egy dózist tartalmazó, egyetlen vakciná-ciót kaptak az állatok. A találmány tárgya eljárás olyan vakcina előállítására, amely rekombináns, pestivírusból származó Ez- vagy Srns-fehérje vagy fragmenseit tartalmazza,· amely vakcina védelmet biztosít pes-tiví rus-fertőzés ellen egy dózist tartalmazó, egyetlen vakcínácíö után, miközben a fehérje (fragmense) nincsen, immuno a f tini fással tisztítva, A találmány tárgyát képezi olyan vakcina is,· -amely találmány szerinti fehérjét és továbbá egy séjuvánst tartalmaz. Alkalmas adjuvánsok átlagosan képzett szakember számára ismeretesek, például Freund-adjuvánsok, vagy alumínium-hidroxid, vagy emulziók, például víz-olajban vagy dupla-víz-olajban. vagy olaj-vízben emulziók. Kívánt fehérjét más anyagok előállítására is lehet alkalmazni, például állatorvosi vagy orvosi alkalmazásra. A találmány szerinti másik példában hormonszerű anyagot, például folli-culus-stímuláló hormont '(FSH-t, α-aiegységeket és/vagy ^-alegységeket és komplexeket és ezek fragmenseit) termeltetünk például úgy, hogy rovarsejttenyészetet megfertőzünk egy a-alegységet expresszální képes baculovírussal és egy másik, ^-alegységet expresszální képes baculovírussal a tenyészetben. A találmány szerinti eljárással bioinszekticidként alkalmazott (rekombináns) baculovírusokat lehet termeltetni nagy mennyiségben és. alacsony költséggel. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya olyan rekombináns vírusok ♦« * ν * ♦ ♦ > at 9 *V«« ** :♦ ♦·» alkalmazása, amelyek plO-promötert tartalmaznak idegen gén expressziójára bioínszekticidek előállításában, mivel a rovarok általában kevésbé jól fertőződnek poliéder-gént nem tartalmazó baculovírussal. Más rekombínáns fehérjéket expresszálni képes, más rekombínáns baculovírusok tenyésztése a találmány szerinti eljárás alkalmazásával, és/vagy ilyen virusf ehérj ék termeltetése inszekticidek.be, orvosi, terápiás és/vagy antigenikus anyagokba vagy termékekbe való beépítés céljából szakember számára nyilvánvaló. A találmány szerinti megoldást tovább szemléltetjük a kísérleti részben, amellyel azonban ne® kívánjuk azt korlátozni.
Kísérleti rész
A Flavi virídae-családhoz tartozó Festivírus-nemzetség a klasszikus sertésiáz-vírnsből (CSFV) , „bordér''-betegség vírusából (SDV) és marhában előforduló, vírusos hasmenést okozó vírusból <SVDV) áll. Számos BVDV- és CSFV-törzsből származó genomot szekvenáitak [Renard és mtsai., 0208 672. számú európai közzétételi irat (1987); Coliét és mtsai., Virology 16S, 191-199 (1988); Peng és Brock, Virology 199, 865-679 (1992); Meyers és mtsai., Virology 171, 555-567 (1989); Moorman és mtsai., Virology 177, 184-188 (1990)}. BDV-re csak részleges nukleotidszekveneia áll még rendelkezésre. A pestivlrus-genom körülbelül 12,5 kilobázís méretű, pozitív szálú WS-molekula, amely egy nagy nyitott leolvasási fázist tartalmaz. A. nyitott leolvasási fázis körülbelül 4000 aminosavbói álló, hipotetikus poiiproteinné transzláíődík, amely vírus és sejt által kódolt proteázokkal prooesszálödik. A nyitott leolvasási fázist két, nagy20 « φ φ φ φ φ : ·' φ Φ * φ « jt * » φ«» Φ «*« mértékben konzervatív, kisméretű nem-transzIáiódó régió szegélyezi, amelyek valószínűleg a genom rspiikációjáfoan. játszanak szerepet, Az S'-nemködoió régió szintén szerepet játszik a transzláció iniciálásában.
A. ko~ és poszttranszlácíősa.n, celluláris és virális proteázokkal processzálódéit poliprotein tartalmazza az vírus összes struktúráiig és nem-strukturális fehérjéit [őszszefoglaló irodalomként lásd: C,. M. Rice: Fíelds Viroiogy című könyvben, harmadik kiadás (1996) ; 'The Vírusos and Their Repllcation 30. rész, 931-959. old.]. A vírus strukturális fehérjéi, amelyek közé tartozik az E*ns-, El- és E2fehérje, a poliprotein N~terminális részén helyezkednek el. A nem-struktúráiis fehérjék, amelyek közé tartozik az NS3jelö szerinproteáz és az NS5A- és NSSB-jelű RNS ~ra.pl ikázkomplex, a poliprotein C-terminális részén helyezkednek el.
Pestivírussal fertőzött állatok ellenanyagokat fejlesztenek Eras~, E2- és NS3-fehérja ellen. Azonban csak az E2 ellen termelődött ellenanyagoknak van erős virus-samiegesítő képessége, mig az scns- és NS3-fehérje ellen termelődött ellenanyagoknak csak alacsony virus-semlegesítő képessége van, vagy egyáltalán, nem képesek virus-semlegesitésre, Ennek ismerete alapján elkezdtük megvizsgálni annak a lehetőségét, hogy az E2 alkalmas-e CSF-alegység-markervakeinának. Ez esetben az .Eras és/vagy az NS3 alkalmazható az E2markervakeinával társítható diagnosztikai teszt kifejlesztésére.
Napjainkig BDV-t és BVDV~t különféle fajokból izoláltak, míg úgy tűnik, hogy CSFV sertésre korlátozódik. &
pestivirusok strukturálisan. és antigenikusan közeli rokonságban vannak. Az E2 burok-glikoprotein a legimmunogénebb és varlábíiisabb fehérje a pestivítusokban. Sok különböző, például szarvasban és zsiráfban előforduló pestivlrustörzsből klónoztak E2~géneket. Az E2~géneket tranziensen expresszáltáfc, jaonoklonális ellenanyagokkal jellemezték, szekvenálták és összehasonlították ÍP. A. van Rijn és latsai., Virolögy 237, 337-348 (1997) j. Ezen adatokra alapozva, hat fő csoportot vázoltak fel. a pestivírusnemzetségben. Négy csoport meghatározott', genotípusoknak felel meg, míg két másik csoport új genotípusoknak felel meg a pestivlrus-neBizetségben. Az első csoport sertésből izolált CSW-törzseket tartalmaz. A második csoport juhból izolált Moredun-, 133- és X818-jelü BDV-törzsekből, és serteseredetü F~tő.rzsből áll.. A harmadik csoport juhból származó 3D78-törzshői, sertésből származó 525ö~törzsből és marhából származó 173003-törzsböl áll. Az E2 alapján ezek a vírusok nagyon hasonlóak a marhában, előforduló, vírusos hasmenés súlyos akut fellépésével asszociált BVWtörzsekhez, az úgynevezett 2. típusú BVDV-hez. A negyedik csoport főleg marhából származó BVBV-törzsekbői áll. Ezt a BVDV-csoportot fel lehet osztani két altípusra vagy alcsoportra, a BVDV-la-ra és -Ifa-re; BVDV-ia olyan vírusokat tartalmaz, amelyek az USA-ból származnak, például NADL és Oregon, és néhány mást, például 150022- és 1138-jei.ut, amelyek Európából származnak. A. BVDV-lb-alcsoport az Oslosstörzsefc és néhány holland izolátumot tartalmaz. Az ötödik és hatodik „csoport/ felállítását két új genotípus képvise<*V létéként javasoljuk, és szarvasból és zsiráfból származó törzseket tartalmaz, sorrendben.
Markervakeínak ki fejlesztése állatorvosi alkalmazásra új koncepciókhoz vezetett tenyészállatok gazdaságilag jelentős virusbetegségeinek szabályzására és felszámolására. Markervakcina alkalmazása lehetővé tesz szerolögiai megkülönböztetést a vakcinázott és természetesen előforduló vírussal fertőzött állatok között, és ezáltal lehetővé teszi a vírus szabályzott eliminálását. Például a legtöbb Edtagországban Aujeszky-féle betegség {AU} elleni vakcinádéra gE-negatív vakcina van csak engedélyezve. Természetes AB-virussai fertőzött állatokban ellenanyagok fejlődnek ki g£ ellen, Ezen ellenanyagokat detektálni képes ELISAtesztet alkalmaznak fertőzött állatok detektálására, amely állatokat rögtön ezután el lehet távolítani a tenyészetből, és követni lehet a természetes vírusfertőzés helyzetét a tenyészetben a (meghosszabbított} vakcinációs időszakok alatt. & végső cél természetes vírustól mentes tenyészetet elérése. A vakcináciőt azután félbe lehet szakítani, és szerolögiai megfigyelési programot lehet érvénybe .léptetni ezen állapot védelmében. Tehát markervakcinát alkalmazó vakcinádé szignifikánsan csökkenti a fertőzés megszűntepésére irányuló kampány költségeit, amely fertőzött tenyészetek elpusztítására alapult, ahelyett, hogy csak a fertőzött egyedi állatokat vennék ki a tenyészetből, és következetesen elegendően nagy léptékben, és elegendően hosszú ideig végezve még gyorsabb módszer lehet természetes vírustól mentes állapotú sertéspopuiáciő elérésére, mint az elpnsz23
Α V0 X* Ί* i * 0 » « X* 00
J> » * ·. 0 *Κ*0 * < ♦ V ύ
0*»« *- · 0 -A<' titás,
Most és a jövőben, amikor a jelenleg még elterjedt endemikus betegségeket, például AD-t már felszámolták, marke r vakcinákat/ például olyan betegségek kitörésének szabályzására lehet alkalmazni, amelyeket már felszámoltak a populációban, és amelyek ellen már na alkalmaznak rutin vakcinádét. Ilyen esetekben, ahol egy állatpopuláció szeroiógiailag naiv, a nagymértékben járványos betegségek robbanásszerűen képesek terjedni, és óriási gazdasági veszteségeket képesek okozni.
Sok példával kimutatták, hogy a baculovírus-rendszer képes nagymértékű, heterolég fehérj©expressziót támogatni. Nagymértékű expresszié igen. kívánatos, mivel az elpusztított alegység-vakcinák általában csak akkor képesek kiváltani védő hatású immunválaszt, ha nagy mennyiségű antigént alkalmazunk. Első megközelítésünkben két rekombináns baculovírust állítottunk elő, az egyik E2-t expresszált TMR-el (BacE2(T]j és a másik £2-t expresszált TMR nélkül (Sac£2í]} [Hulst és mtsai,, J, Virol. 67, 5435-5442 (1993)]. Megjegyezzük, hogy ebben a közleményben, valamint más hasonló közleményekben az £2-t még régi nevén El-ként jelölik. E2-t TMR nélkül a sejttenyészto tápközegbe szekretalódik, míg az E2 TMR-ei nem. Továbbá, mindkét E2 azonos mértékben reagál olyan móhöklónáiis ellenanyagokkal, amelyek az E2-h lévő négy antigeníkus doménre specifikusak. Ezek alapján feltételezték, hogy a sejt-asssocíált és szekretált E2 antigenikus tulajdonságai azonosak, és ad.vei a szekretált E2 sokkal (tízszer) nagyobb mennyiségben termelődik, mint. a sejt24 vakcinaerős ele, sós 1) mére asszociált E2, elhatározták, hogy az ímmun-af finitássai tisztított, szekretált E2-t tesztelnek sertéseken végzett kísérletekben. Két vakcinaformát állítottak 20 pg/ml-t illetve 100 pg./ml E2~t tartalmaztak dupla~viz~olaj-adjuvánsbanEgyenként két SÉF-sertésből álló, négy csoportból kettőt oltottak IM 20 μσ S2-vel, és kettőt 10Ö μμ E2-vel. 28 nap múlva ugyanekkora EÚ-dőzissal újra oltottak 1 csoportot, amelyet előzőleg 20 μ^ E2~vel oltottak, és 1 csoportot, amelyet előzőleg 100 gg E2~vel oltottak. A 42. napon valamennyi állatot íntranazá.lísan megfertőztek virulens CSF7 Brescia-törzzsel. A vakcina alkalmazott dózisától függetlenül valamennyi oltott sertésben termelődtek semlegesítő ellenanyagok a 28. napra, már különböző mértékben. A 42. napig, a fertőzés napjáig az ellenanyag-titerek valamennyi állatban folyamatosan növekedtek, akár kaptak ismétlő oltást, akár nem.. Ezért nem volt meglepő, hogy még azok az állatok is már teljesen védettek voltak CSF ellen, amelyeket csak egyszer oltottak 20 μσ, immuno-affinitással tisztított £2-t tartalmazó dózissal [Hulst és mtsai.-, J. Virol. 67, 5435-5442 (1993)].
Mivel pes-tivírusokkai fertőzött állatok azonos mértékben fejlesztenek ellenanyagokat Erna ellen [Kwang és mtsai-.., Vet. Microbiol. 32, 281-292 (1992)], amely egy másik virális burok-glikoprotein, és amely a virális fehérjék közül a legalkalmasabb- diagnosztikai teszt fejlesztésére az Ε.'2-vel együtt. Azonban csak egy közleményben feltételezték, hogy az fontos antigén lehet sertések CSF elleni védelés mtsai., J. Virol. 69, 6479-6486 (1995)].
IKönig
Virol. 69, 6479-6486 mtsai
Ezekben a kísérletekben Erns-t élő tehénhímlő-vírusvektorral expresszáltak. Három különböző módon (intradermálisan#· intravénásán. és intraperitoneáiisanj# injektálási helyenként 5 x 105 PFU tehénhímlő-ErKSf rekombináns vírus-sál# szimultán oltott állatok túlélték letális dózisé# CSFV Aifort-torzs
IN-fertőzését S héttel a vakcinádé után anélkül# hogy CSF bármilyen jelét .mutatták volna.
Az Erfts elpusztított alegyssgvakcinaként való alkalmasságának elemzése céljából Brescia-törzsből származó E'^-t expresszálni képes baculovírust teszteltek sertésekben (összhangban Huist és mtsai.# Vírology 2 0 0 # 558-565 (1994) ] . Egyenként hat SPF-serfcésbő-1 állő csoportokat oltottak egyszer IM 5# 0 és 20 pg E*'“s~el, sorrendben (Mooraan és mtsai.# Proc. 14rr> Intern. Pig Vet. Society Congress(1996), 25-29. old., Bologna# Olaszország] . Négy nem-olfeott SPF-sertésből álló# harmadik csoport szolgáit kontroliként. Bárom, héttel a vakcinádé után valamennyi állatot megfertőztek IN 10 TCIDsö Behring-törzzseX. A fertőzés után S napon belül a legalacsonyabb dózis EC!SS-el beoltott Összes állat CSF súlyos jeleit mutatta. A fertőzés után 14 napon belül 2 állat elpusztult# 3 haldoklót elpusztítottak és 1 látszólag helyrejött. Ezen állatok közül öt, beleértve a meggyógyultat is# pozitív volt az IFT-ben. Fertőzés után a legmagasabb dózis E‘r'a:~el beoltott összes állat CSF többékevésbé súlyos jeleit mutatta és néhány napig lázas- lett, de 14 napon belül a 6 állatbői 4 meggyógyult# 1 állat elpusztult, és egy másikat elpusztítottak, amikor haldokolt. A 4 túlélő állat közül csak egy tűnt pozitívnak aa IFT-ben.
Ezzel ellentétben, valamennyi kontroll állat a fertőzés után 5 napon belül CSF többé-kevésbé súlyos jeleit mutatta, a fertőzés után 14 napon belül elpusztult, és pozitívak voltak az. IFT-ben (Moonaan és mtsai., Proc. 14:;Ώ Intern. Pig Vet. Society Congress (1996), 25-29. old., Bologna# Olaszország].
Azt a következtetést vonjuk le, hogy Err‘s~t éxpresszáló baculovírus képes védelmet biztosítani, sertésekben hétére lóg CS.SV-fertőzés ellen, bár sakkal alacsonyabb hatékonysággal., Mint S'2-t expres.száló baculovírus alkalmazásával.
.& follíeulus stimuláló hormon (FSfí) a gliko.prote.in~ hormonok családjához tartozik, amelyek az agyalapi mirigyben (luteinlzáló hormon, LH; tiroid-stimuláló hormon, TSH) vagy a méhlepényben (humán choriogonadotropin, hCG; vemhes kancaszérum-gonadotropin, PMSG) termelődnek. Egy fajban ezen valamennyi hormon mindegyike egy közös alfa-alegységből áll, amely nem-kovalensen kapcsolódik-egy hormcnspecífikus béta-alegységhez. Tisztított FSB-t, egymagában vagy LH-val kombinációban beadva, eiterjedten alkalmaznak peteérést fokozó válasz indnkálására sok fajban, például marhában.
A probléma a marhával van, ugyanis marhából származó FSH-t nehéz tisztítani elfogadható mennyiségben marha-agyalapi mirigyekből. Ezen okból juhból (oFSH), sertésből (pFSH) vagy lóból (eFSH, PMSG) származó FSH~t általánosan alkalmaznak peteérést fokozó kezelésre marhában. Azonban agyszövetből származó anyag alkalmazása nem kockázatmentes, a prionszerű fehérjék lehetséges jelenléte miatt, amelyek ♦ * * * · » » * *
X «♦*» ** ** « kergemarha-kört (szivacsos .agyvelőbántalmat, BSS) okozhatnak marhákban,: és valószínűleg a Creutzíeldt-Jacob-féle betegség (CuD) egy variánsát emberekben. Továbbá, méhlepényből származó anyagnak hátránya, hogy nagyon hosszú a biológiai fél-életidejük, amely szükségessé teszi semlegesítésüket specifikus ellenanyagokat tartalmazó injekció alkalmazásával. Végül, valamennyi jelenleg alkalmazott FSH-készítmény tartalmaz valamennyi LH-aktivitást, amelyet, legalábbis részben, felelősnek, tekintünk a peteérést fokozó kezelés változó eredményeiért.
Szén okokból valószínűnek látszik, hogy marhák peteérést fokozó kezelését jótékoryan szolgálhatja nem-emlős sejtekben, például rovar-sejtekben termeltetett rekombináns marhaeredetű. F.SH (rhFSBJ alkalmazása.
ANYAGOK ES MÓDSZEREK
1. Példa SF21-sejtek termelő sejttenyészetének (PCS) előállí tására
Felolvasztunk 20-3ü°C hőmérsékleten 1,5 ml (osszsejtszám 4-10 x lö* sejt/ml} 3F21 működő sejt-oltóanyagot (WCS) tartalmazó, lefagyasztott edényt. Felolvasztás után az edény tartalmát átvisszük egy 15 ml-es Falcon-csőbe, amely 8,5 ml szé.rummentes 5F9ÖÖU- tápközeget tartalmaz, és felsauszpendál juk. .Sz-uszpendálás után centrifugáljuk 10 percig, 100-200 x g-n a sejtek ölepítése céljából. .A tápközeget kidobjuk és az üledéket felszuszpendáljuk 4-6 ml SFSOOIX-foen. A f elszuszpendá.it sejteket átvisszük 100 mles, 10 ml S'F900II.-t tartalmazó rásólombíkba. Tenyésztjük a sejteket 3-7 napig, 2S~3ÖaC~on, körkörös mozgást biztosító rázótálcávai ellátott inkubátor-rázógépbe helyezve, 40-80 rpm-en. A sejtnövekedést és a sejt-életképességet a folyamat közben vett mintákkal követjük. Ha a sej t-sűrös-ég 1,06,5 x 18® sejt/mí-t elért, a sejteket átvísszük két 500 mles, 100 ml SF9ÖÖII-fc tartalmazó rázólombíkba. Ez megfelel a sejtek tízszeres hígításának. Ismét tenyésztjük a sejteket
3-7 napig, 26~30°C~on, körkörös mozgást biztosító rázótálcával ellátott inkübátor-rázogépbe helyezve, 40-80 rpm-en. A sejtnövekedést és a sejt-életképességet a folyamat közben vett mintákkal követjük. Ha a sejt-sűrűség 1,0-6,5 x 106 sej't/ial-t elért, a sejteket másodjára is passzáljük, hattizenegy, egyenként 100 ml SF98-0IJ-t tartalmazó, 500 ml-es rázólombíkba. Ebben az esetben szintén 10-szeres hígítást érünk el. A sejteket tenyésztjük 3-7 napig, 26-30°C-on, körkörös mozgást biztosító rázótálcávai ellátott inkubátorrázógépbe helyezve, 40-80 rpm-en. A sejtnövekedést és sejtéletképességét a folyamat közben állandóan követjük. Ha a sejt-sűrűség 1,0-6,-5 x 10s sejt/ml-t elért, 500 ml vagy 1000 ml, sejteket tartalmazó szuszpenziót átviszünk egy 5 i-es vagy 10 i-es fermentorba, amely körülbelül 4,5 I. vagy 9 1 SFSOÖII-t tartalmaz, sorrendben. Ez megfelel a. sejtek 10-szeres hígításának. Tenyésztjük a sejteket 3-7 napig, 26-30sC~on, A szuszpenziót állandóan kevertetjük (50-100 rpra) . A sejtnövekedést és sejt-életképességét a folyamat közben állandóan követjük. Ra a sejt-sűrűség 1,0-6,5 x 10” sejt/ml-t elért, az 5 1-es fermentor tartalmát átvisszük egy 50 I-es fermentorba, amely körülbelül 40 1 SE90GII-t amely körülbelül 40 1
X » 4 * * ** »* φ >4 » tartalmaz. Tenyésztjük a sejteket 26-30X-on, aráig + 5-15 x 105 sejt/ml-t elérünk. A s-zuszpenz.iót állandóan kevertetjük (50-100 rpm). A folyamat közben ellenőrzés céljából mintákat vessünk..
2. Példa E2~antigén előállítására
A fentebb említett s-ejtszuszpenziófeoz hozzáadunk + 10' TCXDsc/ral-h tartalmazó, 1-2: ml működő vírus-oltóanyagot (WSV) (Sac£2(-]·>. A szusspenzlő' 28°C~on inkubáljuk 3-8 napig, amíg a sejtek 70-100%-a citopatíkus hatást (CPE) nem mutat. Az inkubálás alatt mintákat veszünk a folyamat ellenőrzése céljából. Ezután a szaszpenzíöt tisztítjuk úgy, hogy a sejteket mikroszüréssel eltávolítjuk. Az így kapott szőrletec (azaz az antigén-oldatot) gyűjtjük, és -20°C-on tároljuk az .inaktivációs lépésig (.3.3) . Mintákat veszünk a folyamat ellenőrzése céljából. Az antígéntartal-om meghatározása céljából a mintákat például enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárásban teszteljük az antigén mennyiségének meghatározása, céljából, vagy fehérje-vizsgálati eljárásban, a vizes fázisban lévő fehérje aktuális tömeg/térfogat-értékének meghatározása céljából, vagy ilyen eljárásokat kombinációban alkalmazunk.
3. Példa a vírus-inkativálásra
A vírust 2-brómetil-ammón;ium-.foromídot (BEA? hozzáadásával inaktiváljnk, 10 mmoi/1 koncentrációban» Beállítjuk a pH-t 8,2-8,7-re, és a hőmérsékletet 34-39®C-ra. A BEA-t 2amelv a vírus fo rómét í 1 - imínbromíddá (BEIf konvertá1juk, ♦ φ k Φ * « Χ· * * Φ >
> fc Φ »« ο « »Φ χ« Φ Φ Φ Φ φ * χν«χ χ> »·*# χ4» inaktiválásában. szerepet játszó aktív komponens. A vírus elpusztításának ellenőrzéséhez mintákat veszünk az eljárás kontrollálásához. Az inaktiválás 24-72 órát vesz igénybe.
Inaktiválás után <1 fertőző részecske lehet 10000 literben,
Vírusinaktiválás után a BEI semlegesítése céljából hozzáadunk nátrium-tiosznlfátot 5-25 mm.ol/1 koncentrációban, és a pH-fc 5,7-6/3—ra állítjuk.. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez. Az inaktívéit és semlegesített antigénoldatot átvisszük 1 és/vagy 5 1-es zsákokba és < -2Ö°:C-on tároljuk,
4. Példa formázásra
Felolvasztjuk a lefagyasztott antigén-oldatot 22-28°Con és SF900Il-veI vagy PBS~eI hígítjuk, 50 μσ antigén/mire. Baktériumellenes ágensként hozzáadunk 100 pg/ml tiomerzált. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez. Ezt az oldatot (azaz az első vizes fázist) 2-8eC-on tároljuk, 3 napnál nem hosszabb ideig, Időközben elkészítjük az olajfázist Marcol .52 és Mo.nta.nide 80 (9:1) összekeverésével. Ezt az oldatot is 2-8°C~on tároljuk, 3 napnál nem hosszabb ideig. Az olaj-fázist sterilre szűrjük 0,22 um-es steril szűrőn. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez. Végül elkészítjük a második vizes fázist úgy, hogy összekeverünk foszfát-pufférőit sőoldatot (PBS-t) vagy SF900II-tápközeget Montanox 80-a1 (98:2), és hozzáadunk tiomerzált 100 ug/ml végkoncentráclóban. Ezt az oldatot is 2-8°C-on tároljuk felhasználásig (3 napnál nem hosszabb ideig). Felhasználás előtt az első vizes fázist .sterilre szűrjük. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez, Elkészítjük az első emulziót úgy, hogy összekeverjük az első vizes fázist az olajfázíssal (1:1,1). Ezt az oídacot 2-8cC-on tárolhatjuk 3 napnál nem hosszabb ideig. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez. Elkészítjük a dupla-viz-olajban-emulziót úgy# hogy az első emulziót összekeverjük a második vizes fázissal (2,1:1). A dupla emulziót 2-8°C-on tároljuk karanténtárolóhélyiségben, amíg edényekbe töltjük. Mintákat veszünk az eljárás ellenőrzéséhez.
5. Példa töltésre és kupakolásra
A dupla emulziós oldatot sterilen, „A^-osztályba sorolt zónában, tiszta helyiségben töltjük. A töltési térfogat 51, 102 vagy 255 mi: 50, 100 vagy 250 mi-es edényekbe, sorrendben. A töltési térfogatot folyamatosan követjük a betöltött térfogat tömegének ellenőrzésével. Közvetlenül a töltés után az edényeket bedugaszoljuk és kupakotjuk. Végül az edényeket karantén-tárolóhelyiségben tároljuk 2-80C-on, miután megkezdődik a minőségellenőrzés.
Példaként szolgáló folyamatábra S2-alegységvakcina előállítására 50 literes fermentációs térfogatból
SF 21 termelő sejttenyészet (PCS) előállítása Felolvasztunk zü-SO^C-ra (a) lefagyasztott edény (eke) t, melyekben 1,5 ml 4-10 x 10” sejt/ml SF21 működő sejtoltóanyag (WC.S-) van.
Átvisszük egy 15 ml~es falcon-cső-be, amely 8,5 ml szérum32 mentes táp köz eget ÁSFüööIIj tartalma zf és f elszusspendá.1
1UX«
Centrifugáljuk 10 percig, 100-200 x g-n.
— A tápközeget kidobjuk.
Az üledéket felszuszpendáljuk 4-6 ml SFOQÖII-ben. és átviss szűk 100 ml-es, 10 ml SFOOOTI-t tartalxaazó rázolombíkba,
Tenyésztjük a sejteket 3-7 napig, 26~3ö°C~on, amíg 1,-0--6, £ x 10s sejt/ml-t elérnek.
A sejteket átvísszük két 500 ml-es, 100 ml SF9001I~t tartalmazó rázóloiafoikba. (azaz 10-szeresére hígítjuk) ,
Tenyésztjük a sejteket 3-7 napig, 26-30'3C-on, amíg 1,0-6,5 x 10” sejt/ml-t elérnek.
i l
10-szeresére hígítjuk a sejteket, és átvisszük a sejteket hat-tizenegy, 100 ml SF900II-t tartalmazó rázőlomhikfoa.
Tenyésztjük a sejteket 3-7 napig, 26~30öG~on, amíg 1,0-0, £ x lö* sejt/ml-t elérnek.
500 ml-t átviszünk egy 5 1-es rermentorba, amely körüibeiü 4,5 1 SFOÖOII-t tartalmas, vagy 1000 ml-t egy 10 1-es
Termen torba, amely körülbelül 9 1 SF90öI.T.~t tartalmaz. 'Tenyésztjök a sejteket 3-7 napig, 26-3G°C-on, amíg 2.,0-6,5 x lö11, sejt /ml ~t elérnek.
Át visszük egy 50 l-es fermentorba, amely körülbelül 40 1 SF9G0Il~t tartalmaz. Tenyésztjük a sejteket 26-30öC-on, amíg 5-15 x 1θ'! seít/ml-t elérnek.
E2-antigén előállítása t
Iczzáadunk + 107 TClbS0/ml-t tartalmazó, 1-10 ml működő vírus-oltóanyagot (WSV) .
28°C-on ínkubáijuk (3-8 napig) , amíg a sejtek 50-100%-a ,4.
itopatikus hatást (CPE) nem mutat.
Míkroszűréssel elkülönítjük a sejteke
Kidobjuk a töményített biomasszát.
Sterilre szúrunk.
4°C~on tároljuk az antigénoldatot
Vírus-inkát!válás
A vírus inaktiválása céljából hozzáadunk k-brőmetil smmoníum-b romi. dót (BEA),
8-12 mmol/I koncentrációban.
X « *
A pH-t 8,2-8,7-rs állítjuk, és 24-72 óra hosszáig ínkubáíjuk 3Í-39°C~on.
A BEI semlegesítése céljából hozzáadunk 0,8 mol/i nátriuatioszulfátot, 5-25 mól/1 koncentrációban.
A pH-t 5,7-6,3-ra állítjuk. Ellenőrizzük az inaktiválást, ás s emleg e s1test.
Az ínaktivált és semlegesített antigén-oldatot átvisszük 1 és/vagy 5 1-es zsákokba és < ~20öC~on tároljuk.
Formázás
Olaj-fázis készítünk Mar col. 52 és Montanide 80 (3; 1) összekeverésével. A keveréket sterilre szűrjük {0,22 μ®}. z-S^Con tároljuk.
Felolvasztjuk a lefagyasztott antigén-oldatot 2.2-28®C-on.
Elkészítjük az első vizes fázis; úgy, hogy összekeverjük s felolvasztott antigén-oldatot SFSOOII-vel, 50 antigén/rai-re. Hozzáadunk 100 pg/mi tiomerzált. 2-8°C-on tároljuk.
Elkészítjük a második vizes fázist úgy, hogy összekeverünk PBS-t Montanox 80-al !0,38:0,02?, és hozzáadunk tíomerzáit 100 gg/ml végkoncentrációban. A fázist sterilre szűrjük (0,22 unj. 2-8°C-on tároljuk.
Elkészítjük az első emulziót úgy, hogy összekeverjük az oiaj-iazist és az első vizes fázist (1.,1:1} . 2~8*C-on tároljuk, í
Elkészítjük a kettős emulziót úgy, hogy az első emulziót összekeverjük -a második vizes fázissal (2,1:1).
- 8 °C - os t a rο 1 j u'k,
Töltés és kupakolás
51, 102 vagy 255 ml oldatot sterilen. Síi, 100 vagy 250 mi-e. edényekbe *öltünk
Kupakolás j
E2~alegységva.kcina, betöltött termék.
- 8®C-οn t ároÍjuk.
S. Példa £2 stabilitási kísérletre
Cél
Az E2-fehérje stabilitását kettőzött (HOI*0, 0001} sejttenyészetben, egyébként normál körülményeket alkalmazva, meghosszabbított tenyésztés után vizsgáltuk. A baeulovírus sejtfeenyészetben végbemenő fertőző folyamatának litifeus természete következtében proteázok szabadulhatnak ki a tápközegbe a fertőzési ciklus késői szakaszában. Akár ez, akár «» »« · κ ♦ * f ♦ » »·♦ · ** * ** · m&s eredményezi az Ez—fenérje lebomlását, és ezá.itai az E2— fehérje volumetríkus mennyiségének csökkenését, ezt ebben a kis érle tfoen viz sgálj uk.
Anyagok és módszerek
Ha SFüűOII-tápközeget említünk, akkor 0,2¾ Pluronic F68-al kiegészített SF9001X-tápközeget értünk.
SF2i-sej tékát tartalmazó edényeket felolvasztunk és 10 ml SFOOOII-at tartalmazó, 100 ml-es rázólombikfoan tenyésztjük, körkörös mozgást biztosító (orbitáiis) rázófcáicával ellátott inkub-átor-rázógépben.. Amikor a sejttenyészet eléri a szükséges sejt-sűrűséget, a sejteket tízszeresére hígítjuk, 100 ml-re, 500 ml-es rázolodóikban. Amikor ez a sejttenyészet is eléri a szükséges sejt-sűrűséget, újra passsáijuk tízszeresére, 100 ml-re hígítva. A feleslegben maradt sejteket kidobjuk. Amikor ez a sej ttenyészet is eléri a szükséges sejt-sűrűséget, a sejteket tízszeresére hígítjuk 500 ml-es rázólombikokban, amelyek egyenként 100 ml térfogatot tartalmaznak. A feleslegben maradt anyagot kidobjuk. A rázólombikokat 1KS orbitáiis rázótálcára helyezzük, 70 rpm-en rázatjuk 26°C-os inkubátorban.
0,612 x 10* sejt/ml sejt-sűrűségnél a 2. és 3. számú rázőlombíkba 63 μΐ, 10 x hígított vírus-szuszpenziót adunk. Az 1. számú lombikot rázafva tartjuk mint nem fertőzött vakot. A tenyészeteket fertőző MOI:
(ö, 063x0, 01x0, 8x10 j / (100x0, 612xi0u-0, 00003.
Az alkalmazott, 100 x hígított vírus-szuszpenziót az alábbiak szerint preparáljuk. A 253. MSV-edényt a QC felolvasztja, és 100 x hígítják 10%. FSS-el kiegészített TClöő* ♦ X « «
tápkozegben ílot.sz. 97-QCŰ139) , és ~7ö°C~cn tároljuk 0,5 ml—es adagokban.
Szabályos időközönként mintákat veszünk mind a fertőzött rázölorbikos tenyészetekből, mind a nem fertőzött lombikból, a nejttenyészet állapotának meghatározása céljából. A mintavétel az alábbiak szerint történik;
Körülbelül 1,1 ml sejttenyészetet lécéntrlfágálunk 15 íal~es Falcon-csővekben, 1EC Centra GF8R-cent.ri fugában, 6 percig, 1000 rpm~en. Azután a felülúszót átszűrjük 0,45 pm~ ss Gelman Aexodlsc, injekciós tűre illeszthető szűrőn, a még esetleg jelenlévő sejtek eltávolítása céljából. 0,4 mles mintákat balgene íagyasztőedenyekben, -VO^C-on tárolunk későbbi vizsgálatokhoz.
Eredmények és követkeltetések
Az 1. ábrán bemutatott adatok és a 2. ábrán bemutatott görbék alapján látható, hogy a sejt növekedési görbéi a 2. és 3. Lombikban többé--kevésbé hasonlóak. 19.1 hpi után sejteket nem számoltunk, mivel látszólag valamennyi sejt elpusztult és fertőzött volt. A 2. lombikból származó, 139 hpi mintát kihagytuk a görbéből·. A sejtszám ebben a mintában sokkal magasabb volt, mint az előző és az azt követő mintában, egyaránt. Ez azt mutatja, hogy valószínűleg némi. kicsapódás fordult elő a mintavétel előtt vagy után, amely minta pontatlan eredményhez vezetett a trypan-blue-oldattai való összekeverésnél. Ezt a feltevést igazolja az a tény is, hogy mind az életképesség, mind a százalékos fertőzöttség összhangban volt a várt eredményekkel. Ez azt jelenti, hogy semmi szokatlan nem történt magában a fertőzött tényé»χ ΦΦ
ΦΦΧ Φ κ Φ .* f « Φ* X* * ♦·* · szetben. Ez a pontatlan mintavétel nagyon valószínű, hogy nincs hatással a mintában. lévő E2-koncentrációra# mivel az S2 a tápközegben van jelen és, na intracelluXárisan.·
A 2. lombikban lévő E2-koncentráció igán gyorsan emelkedik >190 pg/ml-es maximumig körülbelül 139 hpi-nél, és azután lassan csökken 170 ug/au-ig 215 hpi-nél, Azután az E2~tartalom ennél gyorsabban leesik <100 pg/ml végső szintre 306,5 hpi-nél.
A 3. lombikban lévő lefutás töfebé-kevésbé ugyanaz,. Az £.2-fehérje mennyiségének maximumát szintén 139 hpi körül éri el, de kissé magasabb, mint a 2, lombikban. Az E2koncentráció lassan csökken 233 gg/ml-ről (13-3· hpi-nél) 212 ug/ml-re (191 hpi-re), ezután a koncentráció gyorsan leesik 141 ^g/ml-re 215 hpi-nél. A 2. és 3. lombikban végbemenő folyamat jő összhangban van.
Az 1. számú lombik, a vak tartalmát t~44#25 hpi-nél szintén megszámol tűk. Az élű sejtek sűrűsége 2,435 x 10* sejt/ml volt, az elpusztult sejtek sűrűsége 0,190 x 10* sejt/ml volt és az összes sejt sűrűsége 2,625 x 10s sejt/ml volt, amely 92,0%-os életképességet adott. Az élő sejtek sűrűsége szignifikánsan magasabb volt, mint a 2. és 3. lombikban egyaránt, ami azt mutatta, hogy a fertőzés már lelassította a sejtnövekedést.. Ezt követően a vak-tenyészetet passzáltuk.
Az alábbi táblázatban, bemutatjuk az immunobiot vizsgálati eljárás eredményeit# melyeket a 2, .lombikból vett minták szelektálásánál végeztünk..
* Κ φ ♦
jelentése: ne® detektálható; jelentése: detektálható
A táblázatban látható/ hogy V3- és V8-epitőpok még nem detektálhatők ‘3 és 44 hpi-nél vett mintákban. Ez összhangban van az E2-ELISA eredményeivel. Később, 1.15 hpi-nél vett mintákban intakt E2 detektálható, mivel mind V3, mind V8 detektálható az E2-csíkban.
Később, 191 hpi-néi egy második csík. látható a gélben, amely egy kisebb fehérjétől származik. V3-al és V8-al végzett immunobiottal két külön blotban kimutattuk, hogy a lebomlási termék tartalmazza a V3-epitópot, viszont nem. tartalmazza a Y8~epítöpot. V8 sehol máshol nem volt detektálható a bloton, csak az intakt E2-csíkban. Ez a vizsgálati eljárás világosan kimutatta, hogy az E2-fehérje lebomlása proteáz-ok jelenléte miatt következik be. Valójában ez lehet felelős az £2~fehérjetartsionban bekövetkezett csökkenésért, amely a nagy mennyiségi („búik! E:2-antigén-oldat mikroszűrési lépése alatt figyelhető meg, Ebben a feldolgozási lépésben a sejteket elkülönítjük, mielőtt a vírusinaktiválás elkezdődne.
Ennélfogva a legvalószínűbb, hogy proteázok jelenléte okoz za az. £ 2-féhérj e 1 ebom 1 ás át.
7. Példa MO1 -kísérletre
Cél
Tovább vizsgáljuk a MG1 (fertőzési egység, azaz sejtenként! vírusok S2.áiaa) és a maximális sejt-sűrűség illetve a volumetríkus £2-tartalom közötti összefüggést. Egyrészt a teljes sejtpopuláció fertőzésének be kell fejeződnie, mielőtt a tápközeg kimerül, másrészt azonban az összpopuláció fertőzése alacsony sej tko-ncentráci-óban az optimálisnál alacsonyabb fehérjehozamot eredményez.
Anyagok és módszerek
A „tápközeg kifejezésen a leírásban S£90011-tápközeget értünk.
6 mi sejtszuszpe-nziót hígítunk 1000 ml-es edényben lévő 444 mi SEOOÖlI-ben, és gyengéden összekeverjük. Az élő sejtek sűrűsége közvetlenül a tenyészet hígítása előtt 3,41 k 10t; sejt/ml volt, az elpusztult sejtek sűrűsége 0,190 x 10’ sejt/ml volt, amely 94,8%-~os életképességet adott. A hígításnak +5 x ICP sejt/mi sejt-sűrűséget kell adnia.
Továbbá gentamicint adagoltunk 10 pg/ml végkoncentráció-ban. A sejtszüszpenzíót elosztottuk kilenc, 50- mi-es adagra., 250 ml-es rázólomfoikgkfoan, és a feleslegben maradt anyagot kidobtuk. Az első 50 ml-t az 1. rázólombikba vittük, az utolsó 50 mi~t az 5. rázólombikba vittük.
az 1. és a 6. sz. lombik: MOI-O (vak), »<* X : $ *
| s. z v és | & | 7. sz. lombik: | KOI-O,OÖÖOOl |
| a 3 > és | 3. | 8. sz. lombik: | MOI-Ö, OÖÖOÍ, |
| a 4, és | cl | 9. sz. lombik: | MOX=ö,0001, |
| az 5. s | lombik: MO1-0, | 001, |
Ví.rus-törzsoidatot az alábbiak szerint készítünk. Hígítás! sort hozunk létre lOöx hígított vírus-szuszpenziót tartalmazó edényből (.az edény 0,8 x lö:' plakkformáló egységet, rövidítve pfn~t tartalmaz ml-ként) . Ezt a löö x hígított virus-törssoidatot az alábbiak, szerint készítjük el.
Vírus tőrzsoldatot felolvasztunk és 1ÖÖ x hígítjuk 10% FBS-el kiegészített TClOÓ-tápközegben, és ~70°C-on tároljuk 0,5 ml - es adagokban.
Ebből a 100 x hígított vírus oldatból 0,4 ml-t hígltunk
3,6 ml SF9ÖGII-tápközeggel, amely IQ5 hígít ás i faktort eredményez. Ebből az oldatból 1 ml-t hozzáadunk 9 ml tápközeghez, amely 10“~ hígítás! faktort eredményez, ebből az oldatból 1 ml-t hozzáadunk 9 ml tápközsghes, amely 104 hígítás! faktort eredményez és ebből az oldatból 1 ml-t 10 x hígítunk, amely !Q~4 hígítás! faktort eredményes. Hozzáadunk 3,1 ml tápközeget az 1. és 6. (vak) rásólombikokhoz, amelyek sejttenyészetet tartalmasnak. Hozzáadunk 3,1 ml, 10~s, IQ4 és 10~'! faktorral, hígított vírus-oldatot a 4. és 9., 3. és 8. valamint a 2. és ?. rásólgmbíkokhoz, sorrendben. Ezek a rázőiombikok már tartalmaztak sejttenyészetet.
A 3,1 ml, 1Ö~2 faktorral hígított vírus-oldatban 3,1 x !G~a x 3,1 x 10'® -2,5 x 1GJ pfu van. 50 ml sejtszuszpenzlóf tartalmazó, rázólombikban 0, S x χ 30 ~2,5 x 10' sejt van. így 3,1 ml, 1G~2 faktorral hígított vírus-oldat hozzá42 adása 50 ml sejtszuszpenzióhoz 2,5 x 10V2, 5 x 10'
MOI-t eredményez.
0,0001
| Ehhez | ha s oni6 s zámítás oka · | t elvégezve a | többi | vírus- |
| hígításra | , 0, 00001 és 0,000001 | MOí-t kapunk, | ha 103 | és .IÖ~4 |
| faktorral | hígított vírus-oldat | okát adunk 50 | ml sej | ttenyé- |
| szerhez. | Végül, 2,85 ml, 10Λ | f a k tor r a1 hígí to 1t | oIdatót | |
| adunk az | 5. s z. r á zó1ombíkho z, | amely 0,00092 | Möl~fe | eredmé- |
se j r~ jtm~es amenyez 0,001 bel
Az egyes rázólombikokból kivessünk 3,1 ml mintát közvetlenül a vírus hozzáadása után. A mintákban lévő· sejteket lecentrifugál juk ISO Centra GP8R centrifugában, 15 m.l-es Falcou-csövekfoen (10 percig, 1000 rpxa-n) . A mintavételt úgy végezzük, hogy az alacsony Möl felől haladunk a magas Möl felé, hogy meggátoljuk vírus átvitelét magas MOI-val fertőzött .sejtszuszpenzlóból alacsony MOI-val fertőzött szuszpenzióba. Centrifugálás után a mintákat 0,45 szűrőn átszűrjük (azon sejtek eltávolítása céljából, iyek még jelen lehetnek a felülúszóban),· és elosztjuk 3 Maigene fagyasztőedénybe, és -?S°C-on tároljuk későbbi tesztelésig.
Közvetlenül a vírus hozzáadása után meghatároztuk az 1. és 5. rázólombikban lévő sejt-sűrűséget. Ez az első és az utolsó rázőlomfoik, amelyet sejtekkel oltottunk. Mivel a sejtsűrűség majdnem azonos volt, feltételeztük, hogy valamennyi rázólombikfoan ugyanakkora sejt~sűrűség van, mint a két sejtszám átlaga. Az élő sej'ek kezdeti sűrűsége 0,423 x lös sejt/ml, míg az elpusztult sejtek sűrűsége 0,012 x Kk sejt/ml volt, amely 07,3 %-os életképességet adott.
Φ 9
X * ♦
Valamennyi rázólombikot Lahotech 300, crbitálís rázótálcával ellátott rázógépbe helyeztük, körülbelül ?5 rpm-el rázatfcunk, 28°C-on.
Az összes rázőlombikból mintákat vettünk 23, SS, 125, 144, 173 és 194 hpi-nél (a fertőzés után eltelt órák száma) . A sejt-sűrűség meghatározására vett minták térfogata
3,3 ml-es volt, amelyből 0,2 mi-t használtunk fel a sejtsűrűség meghatározására. A maradék 3,1 ml-t a fentebb, a t-0-ra leírtak szerint kezeltük. Azok a tenyészet-minták, amelyekből számlálást nem végeztünk, 3,1 ml-esek voltak. 191 hpi-nél meghatároztuk a sejt-sűrűséget, és a kísérletet befejeztük. A maradék sejtszusapenziőt (körülbelül 30 ml) 3, 1 ml-es részletben tároltuk Nalgene fagyasztóedényekben, és 4, körülbelül 6 ml-es részletben 15 ml-es Falconcsövekben,
Eredmények és következtetések
A eredmények azt mutatják, hogy jő összefüggés van a Möl és az optimális se jt-sűrűség között, és ami. jelentősebb, hogy a Möl és az E2-fehérje hozama között. Ez azon a görbén látható, ahol. 0,001 MST-val fertőzött tenyészetek maximális voiumetríkus £2~fehérjehozama 100%. A görbe azt mutatja, hogy a voiumetríkus E2-fehérjehozam növekszik a Möl csökkentésével. 0,0001 MQ2-ig a tenyészet fertőződik,
| mielőtt a maximálisan | elérhet | o sejt-s | űrűséget elé |
| 0,00001 vagy kevesebb M01 | alkalma: | zása olyan fertőzést er | |
| menyez, amelyben a tápké | >zeg kimé | írül, miéi | lőtt a tenyés |
| fertőzése bekövetkezne, | amely az | op t imái 1 | snál alacsony |
| fehérjehozamot eredményez |
Tehát azt a következtetést vonhatjuk le, hogy minél alacsonyabb 'MOI-t alkalmazunk, annál magasabb az £2-fehérje hozama, feltéve, hogy a táp-közeg ne® merül ki a fertőzési folyamat előtt és az E2~termelés befejeződik.
bFSHa-fc és/vagy bHSF^-t expresszálo, rekomfoináns baculovírusok
Előállítottunk pDW-Al .fa-9.1- és pDW-Béta-3.1-jelű transzfervektorokat. Sf£i~sejteket kotranszf©kiáltunk pDWAlfa-S.l-el vagy pDW-Béfca-3 >.l-el. és vad típusú (wt) AcNPV/Μθ21- DKS-el, ®e1yet extráce 1.1 u1áris vírusrészec s kek~ bői izoláltunk {PCT nemzetközi közzétételi, irat száma: Wö 96/25696) ., .β-galakfozidázt expre-sszáló, polihedrin-pozitiv plakkokat izoláltunk, és analizáltunk bESHa-ra vagy bFS^-ra a tenyészet tápköz egének ELJSA-vizsgálatával. Egy plakktisztított bFSHa-virust {AoNPVa.3. 4) és egy plakk-tisztított bF.SHP-virus:t t&eWVpl, 4} alkalmaztunk vírus-törzsoldat preparálására, körülbelül 10' és 108 TCXD50 alkalmazásával, sorrendben. FS.H~t a fentebb leírt eljárás szerint termeltettünk, amely 17 és 32 gg/mi között, változó mennyiségű termelést eredményezett.
PDs>s“kisérlet
Ahhoz szükséges E2-dőzis íp<J meghatározása, amely elegendő egy vakcináoió után beoltott sertések 95%~os védelmére (PD3S), virulens CSFV Brescia-törzs 100 LD«jO fertőzése ellen.
Huszonhat specifikusan patogén-mentes ÍSFF}, 6-7 hetes sertéseket megérkezésük után randoa elosztottunk három# nyolc állatból álló csoportba (A-C) és agy# két állatból álló csoportba (D) . Az állatokat B18# B19# B20 és B21 istállókban, nagymértékben elszigetelten#· ID-DLO-létesitményekben tartottuk. Az állatokat három napig hagytuk ak.kl.i~ matízálódni. Az állatokat naponta egyszer etettük komplett táppal (Hope Farms) vályúból# és vizet, ad libitum: ihattak egy szopokából.
Vakcinácxó és fertőzés
Három dupla-viz-olaj·, adjuvánst tartalmazó vakcinaformát preparáltunk a fentebb leírtak szerint, amelyek különböző koncentrációban tartalmaztak E2-antigént; dózisonként 32,0, 8,0 és 2,0 pg-ot. A sertéseket egyszer oltottuk intramuszkulárísan# valamennyi sertés egy dózist kapott, 2 cm-re. a bal füle mögé (A: 2 μσ E2, B: 8 jxg E2, C: 32 pg E2# D: 0 pg E2) . A ,,D kontroll csoportot csak DO-E-adjuvánssal oltottuk# és a szentinel sertéseket egyáltalán nem oltottunk. Három héttel az egyes állatok vakcinádé ja után fa szentinelek kivételével), inr&nazálisan fertőztük azokat 100 5ü% letális dózis {« 100 Va LDM) 456610- jelű CSFV
Brescia-törzzsel. Közvetlenül az oltás előtt a szentinel sertéseket elkülönítettük csoportjuktól.# és 24 órával később visszavittük. Az oltóanyag vírustartalmát titrálássa1 határoztuk meg abból a mintából, amelyet az istállóba való visszavitel után vettünk.
Ζί. íj φ φ φ ♦ ΦΦ * * β φ Φ » Φ ♦ <·Φ Φ * * ♦ Γ • «φ » X ♦* * * * ♦-* *
Klinikai megfigyelések
Ά sertéseket naponta ellenőrizték az állatgondozók, az abnormális jelenségeket feljegyezték,· és szükséges -esetben felügyelő állatorvost hívtak. Minden egyes csoportot legalább 15 percig figyeltünk naponta, -az etetési idő· alatt és az istálló takarítása alatt.
A csoport vagy egy egyedi állat táplálékfelvételének csökkenését feljegyeztük.
A testhőmérsékletet (rektá-lisj a vakcináéiő után kilenc napon át és a fertőzés után 20 napon át feljegyeztük.
Vér analízise a fertőzés után
ED-ΤΑ-vérmintákat vettünk a fertőzés utáni 0., 2., 4.,
7., 10. és 14.. napon a 1-eukooifca- és trombo oltasz ám változásainak követésére. A l-eukocitaszám (leukopénia)- és a tro-mbocítaszám (trombocitopénia) csökkenése a vérben a CSF egyik tipikus jele. Fehérvérsejtek és trombocíták szokásosan elfogadott, normál sejt száma sertésekre 11-2.3 x 10s/l illetve .320-7.20- x 10’/l tartományban van, sorrendben. SPFsertésekre ezek az értékek kicsit alacsonyabbak; 6-1.2 x lő9/! illetve 300-700 x Í09/l között vannak. Mindkét említett tartomány változhat az egyes sertésekben. A vérsejtanalizise-ket Medonic® CA 570 „couiter sejtszámlálóval végeztük. Leukopéniát és tromhocitopéniát úgy definiáltunk, hogy a sejfc/vörösvértest-szám, előnyösen egy napnál tovább alacsonyabb volt, mint a fentebb említett minimum-szám..
Vírus tarjedésa/kíválasztása ás virusdetakció
A hőmérsékletet., a leukocita- és trombocitaszámot és a szentinelek szerokorverzléját használtuk fel olyan páráméX* * * ♦ ·♦ * ** 1 » »«'♦·* * ♦ * .A * ; ** *♦* *♦♦ tarként, amelyek a vírus átvitelének detektálását szolgálta a fertőzött állatokról a szentínelekre. Pusztulás «tán vett szövetmintákat vettünk az. alábbi szövetekből: mandula, lép, vese és csipőbélbő-1 (ileum) , és direkt immunfluoreszcens technikával teszteltük azokat vírusantigén jelenlétére. Ezen szövetmintákból fagyasztva, készített metszeteket (4 pm vastagságúak, szervenként kettőt) fixáltunk, és po-iiklonális, sertésben termeltetett, FITC-vel konjugált, antipestivírus-szérummal xnkubáltuk. A metszetek mosása után fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk azokat. Az eredményeket pozitívként (~ van fiuoreszcenia) vagy negatívként {- nincs fluoreszcencia) fejeztük ki.
Szeroiógxai válasz
Szérumot gyűjtöttünk valamennyi sertésből a vakcináció utáni <5., 2. és 3. héten, valamint amikor elpusztultak.
A mintákat -SCX-on tároltuk, és vírus-semlegesítő tesztben (WT) valamint Ceditesg® eljárásban (ELISA CSFspecifíkus ellenanyag detektálására) vizsgáltuk azo-kat. A szérumban lévő CSFV-semlegesitő ellenanyagok titereit mikrotiter-rendszeröen határoztuk meg. A szérum felező b.ígításí sorát összekevertük azonos térfogatú, 30-300 TCID50~et tartalmazó CSFV-szuszpenziőva.1 (Brescia-törzs) . Egy óra hosszáig imkufeáltuk 37®C~on, s.Zk.n-díoxxd-inkubátorban, majd hozzáadtunk körülbelül 25000 PKlő-sejtet mérőhelyenként. Négy nap múlva a mikrotítér-tálcákat a fentebb leírtak szerint kezeltük, és míkro-szkópíkusan leolvastuk. A CSFVsemlegesítő titért a legnagyobb, valamennyi vírust semlegesíteni képes hígítás reciprokaként fejeztük ki.
«ΦΦ» φ* ♦* . .ί.
Statisztikai kiértékelés
A 95%-os védettséget nyújtó dózis meghatározása arra a feltevésre -alapult, hogy a CSFV~t .semlegesítő ellenanyagtíter >50 teljes védettséget jelent.
Ebben -a részben az állatok számozása tekintetében az 1.
és 2. táblázatot kell figyelembe venni.
Klinikai megfigyelések vakcináció után
A vakcináció nem fejtett ki semmilyen káros hatást a sertésekre, a táplálkozás- és- a testhőmérséklet normális maradt. Az A és C csoportban enyhe hasmenés, étvágytalanság és depresszió volt látható a vakcináció után 3 nappal. Az A-csoportban az egyik sertés <448. sz.) rendszeresen hányt az egész időszak alatt# és növekedésében lemaradt. A 3csoportban lévő 438. sz. sertés egyszer hányt. A 434. sz. sertés -(C~c söpört, szentinel} hőmérséklete kissé magas., volt, ez az állat sántított a jobb hátsó lábára. A tápanyagfelvétel megnővekenett a vakcináció és a fertőzés közötti időszakban 3- kg/csoport/nap-ró 1 6 kg/c-so-port/.napra.
Klinikai megfigyelések fertőzés után
Nem oltott, kontroll állatok CSF jeleit mutatták három nappal <59. sz.) és hat nappal (60. sz.) a fertőzés után:, láz, összekuporodá.s, hidegrázás, étvágytalanság és depreszszió volt látható az elpusztulásig, amely 10 nappal a fertőzés után következett be. Továbbá, az állatokban cianó-zis, hátsó bénulás (peresis posterior), hasmenés és súlyos há~ nvás alakult ki. Mindkét haldokló állatot elpusztítottuk.
« <9 Φ X *# 9
Valamennyi 2 pg E2-~vel oltott sertésben (A-csoport) kifejlődtek a betegség jelei 2--3 nappal a fertőzés után, amely főleg lázból, összekuporodásböl, depresszióból és étvágytalanságból állt. A láz 2-10 napig tartott, és a maximális hőmérséklet (Tw) 40,7 és 42,2®C között változott. A hetedik naptól kezdve a 443-445. sertésekben a láz megszűnt, és a táplálék'felvétel mennyisége meghaladta a fertőzés előtti mennyiséget. Azonban a 448. sertést elpusztulva találtuk a kilencedik napon, és a 447. sertésben akut CSF fejlődött ki (görcs, hátsó bénulás), és ugyanezen a napon a haldokló állatot elpusztítottuk Mindkét szentinel normális maradt a fertőzés utáni 7-9. napig, amikor akut CSF fejlődött ki bennük, és a 20. napon a haldokló állatokat elpusztítottuk.
A B- és C-csoportfoa tartozó állatokban a betegség klinikai jelei és betegség időtartama enyhébb volt, ahogyan a beadott E2-antigén mennyisége növekedett.
A B-csoportban ('435-439.) a láz a 27. napig tartott, és -a 40,2 és 41,7°C között változott.. A 436. s-z. sertés rezisztens volt a fertőzésre, nagyon enyhe klinikai jelekkel. Egy sertés (440. s-z.) 18 nap múlva elpusztult akut CSF-ben (a haldokló állatot elpusztítottuk). A B-csoportban lévő, maradék öt állat felgyógyult. Mindkét szentinel állat normális maradt a fertőzés utáni 11-12. napig, miután akut CSF fejlődött ki bennük, és elpusztítottuk azokat a .20. napon .
A C-csoportban enyhe lázat tapasztaltunk a hat közül . napokon, és a 40,2 és
431.) állatban a 4-3 két (430.
«φ **
41,7'^C között változott. Klinikai jeleket nem tapasztaltunk, kivéve enyhe depressziót a fertőzés utáni hatodik napon. A 430. sz. állat hányt, akár a fertőzés előtt.
Mindkét szentinel normális maradt a kísérlet végéig.
Vér analízise a fertőzés után
Az A-csoportbói csak egy sertésben (450) , a szentinelben fejlődött ki egyértelmű leukopenia és trombocitopsnia. A 44 5. és 446. számú sertések tremboeltopénikusak voltak a fertőzés utáni 7. illetve 10. napon, a 440. sertés a 10. és 14. napon. A B-csoportban egy sertésben (440.) kifejlődött leukopénia és trombocitopénia, a többiek normálisak maradtak. Mindkét szentinel kifejlődött trombocitopénia jeleit mutatta a 14. napon.. Leukopéniát és trombocitopéulát nem detektáltunk a C-csoportban, beleértve a szentineleket is.
Mindkét kontroll állat (az 59. és 50. számú) tromhooitopénikus lett a 7. nappal később.
Vírus terjedése és virslin antigén detektálása a fertőzés után
As oltóanyag visszatitrálása az istállóból való visszatérés után 2,55 TClDöO/mi-t vlrastifcert adott. CSFV viráiis antigént detektáltunk az A- és B-csoporfchoz tartozó kontrollok és szentinelek valamennyi kiválasztott szövetmintájában. Hat beoltott állat közöl egy pozitív volt az A- és B-csoportban. A C-csoportban egy állat sem volt pozitív, a szentineleket is beleértve.
Szerolögiai válasz
Szerokonverziőt CSFV-re úgy definiáltuk, hogy a ti tér >25 a VNT-ben, A VMT-ben alkalmazott Brescia-virus mennyi51 ségének meghatározása céljából végzett vísszatitrálás eredménye·: 41 TCIDSO/mérőhely volt.
A kontroll (D) vagy szentínéi állatok egyike sem szerokonvertálódott a kísérlet alatt (2. táblázat). Az A-csoporthoz tartozó hat állat közűi kettő szerokonvertáiödott három hét után. De a hat állat közül négyben fokozódott az immunválasz a fertőzés után (2. táblázat). A B- és C-csoport szerokonvertálódott a vakcínáció utáni 21. napra, és valamennyi állatban fokozódott az immunválasz a fertőzés után. Ez utóbbi csak a fertőző· vírus sikeres replíkálődását jelzi az állatban.
Következtetés .Meghatároztuk a PD«s~dőzist állatonként, amely 32 μμ S2 volt egyszer beadott 2 ml DOS-adjuvánsban. Ezzel a dózissal elértük, hogy nagymértékben virulens CSFV-törzzsel való fertőzés után a betegség klinikai jelei minimálisak maradtak, éshem terjedt a vírus az állatok érintkezésekor, öszszegezve, hat-hat sertésből álló négy csoportot. <A-D) oltottunk intramuszkulárisan 32 (A;, 3 <B·), 2 (C) és 0 μ9 Edvei, 2 ml adjuvánsonk.ént (DOS) . Két nem vakcinázott sertést (szentínelek) tartottunk az egyes (A-C) csoportokban abból a célból, hogy detektáljuk a kontakt fertőzés által okozott vírus-kiválasztást. Három hét múlva az állatokat intranazálisan fertőztük 100 LD5.3 nagymértékben virulens CSFV Srescia-törzzsel - Klinikai, virológiái és szerológiaí paramétereket mértünk ezen E2-alegységvakcina hatékonyságának meghatározása céljából. A várakozásoknak megfelelően, a Ccs©portban lévő állatok jobban ellenálltak a fertőzésnek, mint a többi csoportban lévő állatok. Nem detektáltunk virális antigént olyan, állatokból vett szövetmintákban, amelyeket a legmagasabb dózis (32 gg) E2~vel oltottunk, és a betegség nem jelent meg ebben a csoportban. A ?B.:SÍ!-dő£íst azon feltételesés alapján számítottuk ki, hogy > 50 NBLAtiter (a vakcínácíót követő 21. napon) teljes védelmet ad (nem terjed a vírus). Ez eredményezte a 32 pg/állat PD'9s~ dózist.
A vakcínácíót követő 2 és 3 héttel, 100 LDS0 virulens CSW-fertözés elleni védelem mértékének további meghatározása céljából hat sertésből álló, két csoport (A-B) kapott 32 μρ Ε'2-vakcinát intramuszkulárisan, Két nem vakcinázott sertést (szentinelek) tartottunk az egyes (A-S) csoportokban abból a célból, hogy detektáljuk a kontakt fertőzés által okozott vírus-kiválasztást a vakcinát kapott állatokból. Kettő (A) és három (B) hét múlva a vakcinát kapott áliátokat intranazálísan fertőztök >:'1ÖÖ 'LDj,0 nagymértékben virulens CSFV Brescía-törzzsel. Klinikai, virológiái és szeroiőgiai paramétereket mértünk ezen E2-alegységvakcína hatékonyságának meghatározása céljából, a vakcináciőt követő két és három, bét múlva. A várakozásoknak megfelelően, a 3csoportban lévő állatok kevesebb klinikai szimptómával, jobban ellenálltak a fertőzésnek, mint az A-csoportban lévő állatok, A vírus átjutása a szentinelekre csak az Acsoportban fordult elő, és mindkét csoportban lévő valamennyi állat leukofrakciójóban detektáltunk vírust. Csak a B-csoporthoz tartozó, egy állat (414, sz.) szerokonvertálódott a vakcináciőt követő 14. napra. Ugyanebben a csoport53 bán egy állat ne® szerokonvertálódott 21 nap után, de védett volt, csak két napig volt láza, és a fertőzés utáni 11. napra szerokonvertáiódotf. Csak a kontrollokban és az egyik szentinelben (A-csoportban) fejlődött ki leukopénía és trombocitopénía. bem detektáltunk virális antigént az Aés B-csoportban lévő állatokból vett egyik szövetmintában sem,. Következésképpen, valamennyi állat védett volt a fertőzés ellen egyetlen dózis vakcináeiöt követő második és harmadik héten.
A vakcináeiöt követő 3 és δ hónappal, 100 LDS(! virulens CSFV-fertőzés elleni védelem mértékének további meghatározása céljából hat sertésből álló, két csoport (A-8} kapott 32 pg K2-vakcinát intramuszkulárisan. Két nem vakcinázott sertést (szenti.ne.lekj tartottunk az egyes (A~B) csoportokban abból a célból, hogy detektáljuk a kontakt fertőzés által okozott virus-kiváiasztást a. vakcinát kapott állatokból. Három (A) és hat (B) hónap múlva a vakcinát kapott állatokat intranazálísan fertőztük 100 LDso .nagymértékben virulens CSFV Srescia-törzzsel. klinikai, virológiái és szerológiai paramétereket mértünk ezen Ez-aiegységvakeina hatékonyságának meghatározása céljából, ezen időtartam elteltével. Az A- és 8-csoportban lévő valamennyi állat, kisebb klinikai szímpfeőmákkal, ellenállt a fertőzésnek. Csak a kontrollokban fejlődött ki leukopénía és trombocítopénia. A vírus át jutása a szentinelekre nem fordult elő. Csak a Élcsoporthoz tartozó, egy állat (1983. sz.) szerokonvertáló•dott a vakcináeiöt követő 28. napra. Nem detektáltunk virális antigént az A- és B-csoportban. lévő állatokból és a szentinelekhól vett egyik szövetmintában sea. Következésképpen, valamennyi állat védett volt a fertőzés ellen egyetlen dózis vakcinádét követően, három és hat hónap múlva, és a vírus átjutása nem történt meg.
4800., 150022. és 178003. rz. S7DV-törzseket -alkalmaztuk kísérleti E2-alegysé-gvakcinák előállítására. Ezen törzsekből származó E2~génekst foacuiovírust alkalmazó expreszsziós rendszerben e-xpresszáltuk {Halat és mtsai., -J.. Virul. 67, 5435-5442 (1993) ; P. A. van Rijn és mtsai., J. Gén.
Vir-ol. 77, 2737-2745 (1996)). SF21-jeiű Spodoptera frugiperda sejtvonalat alkalmaztunk rekomblnáns baculovirusok szaporítására és E2-fehérjék termeltetésére. SF2Isejt-ek-et 28®C~on, szérummentes SF3öD~tápközegben (GIBCO ERI·) növesztettünk. Egyrétegű, ronfluens SF21-ssj tefcet rekombínáns baculovitussal fertőztünk sejtenként 5 TCIléo (50% szöv-ettenyészet-fertőző dózis) fertőzési egységgel. 45 nap múlva a tenyészetek 80-90%-qs cítopatikus hatást mutattak. A sejteket 10 percig centrifugáltuk 1500g-n, és a b-acul-ovirust és ,E.2-t tartalmazó felülúszót gyűjtöttük, és -20®C-o:n tároltuk. A baculovírus inaktiválása céljából 2brómeti.1-imin-bro.mídos (BEI) kezelést végeztünk standard eljárások szerint. Röviden összefoglalva, 600 μΐ BEI-t és 600 μΐ I M NaOH-t összekevertünk. 30 perc múlva, 2G°G-on hozzáadtunk 150 mi felülúszót, és 24 óra hosszáig kever tettük 2'Ö'eC-on. Azután hozzáadtunk 20 ml, 25%-os tioszulfátot. A baculovírus ínaktiválődását a felülúszó titrálásával igazolt u k S F21 - s e j t e ken
Kísérleti BVDV-vakcinák E2~t. tartalmazó felülúszókfoól állnak, dupla-viz-olaj-emulzíóban, Az olaj 90% Marcol 52-t (Esso) és 10% Montanide 80-at {Seppíc} tartalmaz. A vizes frakció (PS.S+) foszfát puff erőit sóoldatofc, 2% Montanox 80at (Seppic) és 10 ppm tiomerzált tartalmaz. A felülúszót, az olajat és a (FBS+j-t 10:11:10 arányban alkalmazzuk. Először a felülúszót és az olajat emulgeáljuk, és azután, hozzáadunk (PBS+l-t és emulgeáljuk KontrolIvakcínát hasonlóan preparálunk olyan SF21-sejtek íelülúszőjábol, melyeket vad típusú bacuiovírussai fertőztünk. Elkészítés után a vakcinákat sterilnek találtuk.
Előzetesen feltételezésünk nem volt helytálló, vagyis az, hogy a 3 vakcinában az antigén mennyisége hasonló, az expresszált fehérjék összehasonlítható mennyisége következtében. Az ant-ígénmennyiségek különbségét valószínűleg a rovarsejtekben való expresszió mértékének különbsége okozza. A 150022-vakcina 55 pg E2~t tartalmaz dózisonként, és védő hatású volt a magzatra 2 vakcinádé után (0, napon és 21. napon) (Brusche és mtsai., Vaccine nyomtatás alatt (.199?) ], A 4800-vakcina. és a 178003-vak.cina. 12 ug és 17 pg E2-t tartalmaz dózisonként, sorrendben, és nem volt védő hatású a magzatra. Ezen. eredmény alapján feltételezzük, hogy összefüggés van az E2-fehérje mennyisége és a magzati védelem között. Azonban az E2~glíkoproteinek. immuno géni fásában lévő különbségek és az, hogy a fertőző törzsek nem képesek átjutni a méhlepényen, szintén felelős lehet a fertőzés eltérő kimeneteléért.
heterólőg BVDV-fertőzés ellen.
sem védett ♦ φ ♦ Μ * ** «»>« * * * » » * ♦ ♦ * *
A találmány szerinti megoldás eredményei biztatóak BVDV-alegységvakcinák további fejlesztése tekintetében, mivel kimutattuk, hogy el. lehet érni magzati védelmet £2-jelű burok-glíkoproteínt tartalmazó vakcináciővsi. Továbbá ez egy olyan markervakcina, amely lehetővé teszi vakcinát kapott állatok és természetesen előforduló törzzsel fertőzött állatok megkülönböztetését. Ez előnyös a BVDV megszüntetésére irányuló, jövőbeli programok tekintetében.
Diszkusszió
A kifejlesztett termelési eljárás célja optimális mértékű heterolög fehérje termeltetése, melyet rcsvarse j tekhen lévő baculovítusba ínszertált gének kódolnak. A bacuiovirust alkalmazó expressziős rendszer (BEVS) jól alkalmazható különböző rekombináns fehérjék előállítására, mivel a fehérje konformációjának korrekt kialakulása és pontos poszttranszlációs processzálása biológiailag aktív fehérjéket eredményez állati és humán alkalmazásokra, A baculovírus két nem-esszencíáiís gént tartalmaz, amelyek nagyon hatékony promóterek, a plO- és a políhedrin-pro.möter vezérletével Íródnak át. A plO-uén deléciós mutagenezisével [van Qers és mtsai,, J. Gén. Viroí. 74, 563-574 (1993)1 kimutatták, hogy az nem esszenciális virusreplikációhoz sejttenyészetben, azonban a plO a sejtiisisben játszik szerepet, a. plö-promóter hiánya azt okozza, hogy a fertőzött sejtek intaktak maradnak és megakadályozza a poliéder kiszabadulását a fertőzött sejtekből, ezáltal csökkenti az újra fertőzési sebességet, de a fe.rtózőképességet önmagában nem, A gének termékei (PlO vagy f.ibrillin és polihedrin) a < ♦ * * * * . 5 _ . «Φ .<·:♦ ♦ ·« * * fertőzés késői fázisában expresszáiodnak. Ezen gének helyettesítése a kívánt fehérjét kódoló génre (a poiihedrinpromóter esetében) hozamban elméletileg a rovarsejttenyészet osszfehérje-termelésének akár 50%-át is eredményezheti, amely 1 gramm poiihedrin-fehérje expressziós mennyiséget eredményez egy liter tenyészetben [Haíorella és mtsai.# Bio/technology 6, 1406-1410 (1:988)]. A fertőzési egység (MQI, a ml-kénti virus-sűrűség és a ml-kénti sejtsűrűség aránya) a kulcs-paramétere a. fehérjetermelés optima- /) ;:s..sd..?Mx.\.yx..y i lizálásónak, Alacsony fertőzési egységjól való fertőzés /St nyilvánvaló oka, hogy a vírus·-oitó-anyag mennyiségét olyan' alacsonyan tartsuk, amennyire csak lehetséges. Ha 2 millió sejt/ml sejt-sűrűséget fertőzünk 0,1 MOI-val 50 1-es fermentorban, akkor 1 x lö*6 vírusra van szükség. Ehhez körülbelül 1 liter oltóanyagra van szükség. Továbbá egy plusz termelési lépés szükséges ilyen oltóanyag előállításához.
Két fő hátránya van a kapcsolt tenyészeteknek: a nem hatékony tápközeg-kihasználás és az oxigén-1imitáció. Annak a ténynek következtében, hogy az oxigén oldhatósága vizes folyadékokban viszonylag alacsony, az oxigén lesz a limitáló szubsztrét egyrétegű tenyészetekben lévő sejtek számára. A maximális sejt-sűrűséget meghatározó faktor sztatikus tenyészetekben a rendelkezésre ál-6 felület. Ha a felszínt a sejtek egy rétegben befedik, a sejtnövekedés leáll. Ez körülbelül 1 x 10s sejt/ml tápközeg sejt-sűrűséget eredményez. Szuszpenziós tenyészetekben nincsen oxigén-limitáció, és a rendelkezésre álló más szubsztráfcok lesznek a sejtsűrűség limitáló faktorai. Ez a limitácíó magasabb sejt- 58 .i.
sűrűségnél lép fel,· mint az oxigén-límitáció, és ezért a sejt-sűrűség nagyobb lesz, mint sztatikus tenyészetekben. Az oxigén-1imitációt meg lehet akadályozni az oldott oxigén követésével, oxigén-elektródát alkalmazva. Ha az egy bizonyos érték alá csökken, automatikusan oxigént lehet adagolni a szuszpenzióhoz, akár befűjással, akár a fermentor felső 'terébe juttatva, A szuszpenzió mérsékelt kevertetése homogén tenyészetet garantál, amelyben nem alakul ki szufosztrát-gradiens, és amelyben a sejtek nincsenek kitéve tűi nagymértékű, nyíróerőknek. A kevertetés továbbá hatékony vi— rustranszfert tesz lehetővé fertőzött sejtekről nemfertőzött sejtekre, amely a sejtek vírusfertőzését nagyobb hatékonysággal biztosítja.. Mivel kezdetben a sejteknek csak ő, 1-0,3%-a fertőzött, lehetővé, teszi a sejtek maradék 99,799,9%-ának növekedését ás szaporodását. A fertőzött sejtekben termelődött vírus részecskék a fertőzés után 12-20 órával. szabadulnak ki (Déé, K. U. és Shuler, M. L., Bio-technology Progress 13, 14-24 (1997)] . A kiszabadult vírusrészecskék száma sejtenként 100-2Q0, amelyek képesek megfertőzni a még nem fertőződött sejteket egy üj ciklusban. Számos ciklus lezajlik addig, amíg annyi virusrészecske termelődik, ami képes a tenyészetben lévő, valamennyi sejtet megfertőzni, A cél az, hogy az utolsó fertőzési ciklus fehérjetermelése befejeződjön, mielőtt a tápközeg kimerül, és az összes metabolíkus folyamat leáll. A teljes fértőzöttség elérése szintén nem k.'vánatos szuboptimális sejtsűrűségnél, mivel nem használjuk ki hatékonyan a tápk.öreget# amely a beterológ fehérje alacsony volumetríkus hoza»* ♦ mát eredményezi. A vírusfertőzés teljes folyamatát vizuálisan lehet ellenőrizni annak a ténynek következtében, hogy a poiihedrln-gén még jelen van. á vírusfertőzést úgy lehet megfigyelni, mint sűrű fehérjerészecskéket, amelyek felhalmozódnak a sejtmagban. A nyíróerőkből adódó sejtpusztulás megakadályozása céljából Piuronic F-óS-at adagolnak a tápközeghez 0,2% végköncentrációban. Továbbá, szükséges esetben hozzáadnak „antí f.oa.m A-t a szintén sej tpusztuiást eredményező, túlzott habzás megakadályozása, céljából. 50 literes tenyészethez adott antifoam A átlagosan 20 ml. Ki lehet számítani a sejtek megfertőzéséhez szükséges optimális vírus-sűrűséget. A sűrűség rügg a sejtek növekedési sebességétől, a fertőzés után eltelt időtől, amikor az űj vírusrészecskék kiszabadulnak, és egy fertőzött sejtre vonatkoztatott űj vlrusrészeeskék számától. A találmány szerinti eljárást pestivírusból származó 'S2~fehérje termelésével szemléltetjük. Sár ez a fehérje ismert volt potenciális antigénként, az £2 (íragmens) termelése vakcina vagy diagnosztikai tesztben való alkalmazás céljából nem volt mindig sikeres. Annak ellenére, hogy a FDSO akár 2 pg alacsony is lehet, a probléma az, hogyan lehet elegendő antigénmennylségefc tartalmazó, elegendő mennyiségű vakcinadózist gazdaságilag vonzó módon előállítani, amely lehetővé teszi nagy állatcsoportok védelmét szolgáló vakcinációt, állatonként egyetlen vakcinádéval. Sz különösen CSFV-vakcínáciőra helytálló. Alkalmazása esetén, a CSFV-vakd.nációt általában tömegesen alkalmazzák azon a területen, ahol a CSFV kitört. Ilyenkor nagyszámú állat gyors vakcinádéjára van szükség .λ viszonylag rövid idő alatt. Ilyen tömeges vakcinádéban nagy jelentősége van annak, hogy gyorsan elérjünk kielégítő védelmi szintet {& vad típusú vírusfertőzéssel szemben védett sertések szánta) . Héh.ány hét várakozás egy első vakcináció után egy második vakclnációra a védelem biztosítása céljából nagymértékben gátolja és késlelteti a betegség megfékezését. Különbségek vannak a rekaxshinánsan expresszált E2~fehérje előállítására szolgáló eljárások között, különösen, ha E2 (fragmensek) baculovírusban való expresszálásához hasonlítjuk azokat. A régebben közölt £2fehérje termelésére szolgáló tenyészetekben az E2-£ehérje (fragmensek) hozama 20-9Ö pg/mi között változott [.Hulst és mtsai., J. Virol. 5435-5442 (1993); Hulst és Moormann# Cytotechnology 20, 271-279 (1996)], amelyben további immunoaffínitás-tisztításra volt szükség monoklonális ellenanyagok alkalmazásával, hogy előállítsák a szükséges és releváns E.2 antigenikus tömeget egyetlen adag, injekció formájú vakcínációhoz. Egy másik módszerben (EP 038:9034. sz. európai közzétételi iratban leírtak szerint B2fragmenst alkalmadnak.) rovarsejtek felülússójából izolálnak
E2-t további immunoaffinítás-tisztitás nélkül, amely E2alapű vakcinát eredményez, amelyet kétszer injektálnak, mire kielégítő (védelmet biztosító) immunválaszhoz jutnak. Ezek a problémák többek között a releváns antigenikus anyag, ebben az esetben az B2-fehérje (fragmensek) alacsony koncentrációjának tulajdoníthatók a kiindulási anyagban, például a sejttenyészet felüiúszőjában, amelyből a vakcinát preparáljuk. Elméletileg lehet tovább akkumulálni az antigén!kus anyag mennyiségét szakember által ismert tisztítási és kondenzációs eljárásokkal, azonban ez nem vezet gazdaságilag vonzó vakcina-termeléshez.., viszont a dózison™ kénti költségeket megnöveli. A találmány szerinti eljárást termelési célú fermentációkban alkalmazva, 50 literes fermentorunkban rutinszerűen körülbelül 200-300 pg./ml CSFVE2~fehérjefragemenshez jutottunk, amely elméletileg tenyészetenként 100.ÖÖO állat vakcínációjár.a. elegendő. A sejteket 0,5-1,5 x 10b sejt/sil sűrűségnél. 1 - 10 ml vírusoltóanyaggal fertőzzük, amely körülbelül 10·7 ?C.ID5,e/ml-t tartalmaz.. A tenyésztést, előnyösen akkor fejezzük be, amikor a sejtek >50-80%-a mutat CPE-t. Ez körülbelül 100-150 órával a. fertőzés után következik be. Régebben közölt E2fehérje-termelési tenyészetekben a sejteket, (szinkronizáltan) M01>l-val fertőztek, amely háromszor alacsonyabb fehérje-hozamot eredményezett,- mint a találmány szerint. A találmány szerinti eljárásban egy 50 literes fermentort 5 liter sejtsznszpenzióval oltunk, melyet 5 literes férméntorban növesztettünk, vagy a teljes szuszpenzíó részét .képező- 10 literrel, melyet 10 literes fermentorban növesztettünk. A kezdeti sejt-sűrűség körülbelül 3 x 1OS séjt/ml. A sejteket a számított sejt-sűrűségig növesztjük, mielőtt a vírust hozzáadjuk a szuszpenziöhoz. A feldolgozási eljárás a sejtek és a poliéder eltávolításával kezdődik mikroszűrés alkalmazásával. „Hollow fiber mikroszűrő berendezést csatlakoztatunk a fermentorhos, és az anyagot átnyomjuk 0,22 pm pórusméretű szűrőegységen. A. retentátum-áramlást visszac.írküiál tatjuk a f érmén torba, és a permeátum-áramlást egy 100 »» ♦ »
X χ«»* .η literes edénybe, gyűjtjük. .Amikor a szűrés befejeződött# az antigén-oldatot (amely már sejtmentes# de még tartalmaz fertőző bacuiovírusokat) a 100 literes edényben .inaktiváljak. Általában a szuszpenzióhoz adunk 2-brósietil-amtónx'wabromidot (BEA) 8-12 mM végkoncentráclóban. A pH-t megemeljük körülbelül 5,8-ról 8,2-3,7-re 2 M NaOH hozzáadásával. Ss a pH-állítás a BEA-t BEI-vé (2-brőmeti.l~imin~bromid) alakítja. Ez a DNS-ínaktiváló ágens, A pH-t gondosan követjük és szabályozzuk 6-10 közé, és a hőmérsékletet 34~39*'C~ on tartjuk. 6 őrá inaktiválás után az antigén-oldatot átvisszük egy második inaktivácíős edénybe. Ez biztosítja, hogy az edényben lévő összes anyag érintkezésbe kerüljön BEI-vei# és így inaktíválöőjon, Az első edényben jelen lehetnek olyan folyadékcseppek, amelyek vírust tartalmaznak, de BEI-t nem., a második edényben ilyen nincs. Sertések nem. gazdaszervezetei baouloviru.soknak. Az inaktivált antigéntömeget <-20°C~on tároljuk, ameddig víz-olaj-víz-emulzióban kiszereljük azt. 32 pg E2-tartalmazó, egyetlen dózis (dózis térfogata 2 ml) elegendő klasszikus sertésláz elleni védelemre (>F'D95) , 2 héttői legalább 6 hónapig a vakcinádó után. A termelési eljárást úgy tervezzük, hogy a folyamat méretnövelési lépései közvetlenül kapcsolódjanak, és 250 literes, sőt még nagyobb fermentorokat is lehet alkalmazni. Sztatikus termelő tenyészetek méretnövelésí lépései szintén közvetlenül kapcsolódnak; csak éppen több szövettenyésztő edényt használunk. Azonban az 50 literes femestorban rutinszerűen elért összfehérje-termelés körülbelül 7000 db TI75~lípusú szövettenyésztő edényben lenne lehetséges. A o a φ X » * £ *** sejtnövekedés és fertőzés férméntorban jobban követhető és szabályozható, mível oxigén- és pH~elektröda jelen van.. Ami a szövettenyésztő edényeket illeti, az edények, között valószínűleg különbségek vannak, amit viszont nem lehet meghatározni. Az inaktivációt sokkal. pontosabban lehet követni és szabályozni edényekben, mint amennyire ezt sztatikus tenyésztő termelésben el lehet végezni. BEVS-ben expresszált (intézetünkben), más fehérjék volumetrikus termelési szintje szintén jelentősen javult, ha a sejteket, a találmány szerinti eljárással növesztettük. Például marhaeredetű FSH hozama. 3-4-szeres faktorral növekedett 10 literes fermentor alkalmazásával. Sejteket 0,003-0,003 MCI alkalmazásával koin-f ektáltunk 2 rékombináns bacuiovírussal, 1,1 x 10” sejt/ml sejt-sűrűségnél. BYDV-hől származó, különböző E2fehérjék, valamint BVDV-böl és/vagy CSFV-hől származó £εγ>*fehérjék hozama rázólombikokban végzett szuszpenziős tenyészetekben háromszorosára növekedett. Az eljárás alkalmazható más rékombináns fehérjékre is.
táblásat: V technikával iráli-s antigén detektálása irnunf . különböződ szövetekből származó# készült metszeteken
Luoreszcens fagyasztva
4- ~ detektáltunk fluoreszcenciát
---= nincs adat.
* ~ az állatokat elpusztítottuk a kísérlet végén, 20 d.p.c.
'·*>
áblézat, Vírus-sealegesítésí teszt eredményei
* * ·' ~
| I 433 | 12 | >' 3 | 3 | — 37 | 400 | |
| | 439 | 13 | <·' Ϊ 9 χ 1 z. , | 5 | 37 | 75 | |
| 440 | 14 | <12, | 5 | <12,5 | 37 | |
| 441(S) | 15 | <12, | 5 | <12,5 | <12,5 | |
| 442{S) | ; 16 | <12, | 5 | «2, 5 | <12,5 | |
| C | 427 | 17 | <12, | 50 | 150 | |
| 32 μ<3' | 428 | 18 | <12? | 5 | 37 | 600 |
| |e2 i 329 | 19 | < 12 f | 5 | >1600 | 1 •is <*, | |
| : j 430 | 20 | <12, | 5 | <1.2,5 | 50 | |
| | 431 | 21 | <12, | <1.2, 5 | 800 | ||
| 432 | 22 | J | <12, 5 | 800 | ||
| 433(S) | 23 | <12, | 5 : | <12,5 | <12,5 | |
| 434 (Sj | <12, | 5 | <12, 5 | <12,5 | ||
| D | 59 | 25 | <12, | r.' | <12,5+ | <12,5 |
| 1 60 | 2 6 | <12, | 0 | <12, 5 | <12,5 |
nincs adat >1600 >1600
600 <12, 5 <12,5 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 <12, 5 <12, 5
Η
Claims (13)
- SZABAITALMl IGÉNYPONTOK snokulummal megfertőzzük a sejteket, <O,Ö1 fertőzési aránnyal, ♦;»
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, assa//ef/meave, hogy a sejteket 21, előnyösebben H) 1, előnyösebben 50; „i»Φ1 növesztési tápközeg, még. előnyösebben 2581 növesztési lápközeg befogadásához elégséges térfogatú tenyésztőedénvben növesztjük.
- 3. Az: 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás,.azzalfed&mezve, begy I s 18’ és SxÍ8tt sejttel közötti, előnyösebben 5x10* és 1,5x10* sejttel közötti sejtsürűségben jelen lévő sejteket fertőzünk,
- 4. Az l.„ 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzá! jellemezve, hogy <0,005 fertőzési aránnyal fertőzzük a sejteket.
- 5. A 4. igénypont szerint} eljárás, aasr«//«&»?csw5 hogy <ő,őÖ3 fertőzési arányt nlkatmsztmk.
- 6,. Az 1-5. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jAeesse, hogy a pestivirusből származó rekombináns E2- vagy E!5K'- fehériét plO-promőier vezérlete alatt expresszálni képes, rekonfeináns baculovínsst szelektálnak.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti el járás, szzsl /eZfemem, hogy a roverset leket szoszpenziőban növesztjük, előnyösen tenyssztbedényhen, például férmeotorban, amelyet (mérsékelten) keverieíai lehet,
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike -szedőit eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns pestivírasbol származó, teansasnerabráa régiótól, mentes Ez-fehépét: termeltetünk,
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike- szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérje végkormenriáciéjakén!. a növesztési Sápkőzegben a vágáskor legalább 1-00 gg/ml-t érünk el,
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása antigenikns anyag termeltetésére.
- 11. Vakcina, amely rekombisáns, tmrsszmsrnhriin réglótől mentes. bacoiovrrus alapú expressziős rendszerben az 1-9, igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított pestivírűsból származó B2- vagy iT’Mehérjét tartalmaz, amely vakcina a sejttenyészet felülúszőjáből, tisztítás nélkül tett előállítva, és védelmet biztosít pesíivírtis-feriözés ellen a PD95-s?,snten, egy dózist tártaimtól. egyetlen vakcináeió után, és amely vakcina rovarsejt-aővesztési tápközeget, is tartalmaz.
- 12. Á i 1. igénypont szerinti vakcina, amely pestívíms-fertőzésként kfesszíktss sertésiáz-feriőzés ellen biztosit védelmet
- 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti vakcina, amely aájuvánst is tartalmaz, amely adjuváss előnyösen dupla-vfe-olaj emnlziót tartalmaz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97203989A EP0924298A1 (en) | 1997-12-18 | 1997-12-18 | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
| PCT/NL1998/000717 WO1999031257A2 (en) | 1997-12-18 | 1998-12-17 | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0101136A2 HUP0101136A2 (hu) | 2001-08-28 |
| HUP0101136A3 HUP0101136A3 (en) | 2010-01-28 |
| HU228122B1 true HU228122B1 (en) | 2012-11-28 |
Family
ID=8229076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0101136A HU228122B1 (en) | 1997-12-18 | 1998-12-17 | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6555346B1 (hu) |
| EP (2) | EP0924298A1 (hu) |
| JP (2) | JP4220126B2 (hu) |
| KR (3) | KR100682171B1 (hu) |
| CN (2) | CN101130073A (hu) |
| AR (1) | AR015499A1 (hu) |
| AT (1) | ATE324456T1 (hu) |
| AU (1) | AU750514B2 (hu) |
| BR (1) | BR9813692B1 (hu) |
| CA (2) | CA2315248C (hu) |
| CO (1) | CO4820445A1 (hu) |
| DE (1) | DE69834346T2 (hu) |
| DK (1) | DK1049788T3 (hu) |
| ES (1) | ES2267203T3 (hu) |
| HK (1) | HK1037670A1 (hu) |
| HU (1) | HU228122B1 (hu) |
| IL (2) | IL136815A0 (hu) |
| NZ (1) | NZ505322A (hu) |
| TW (1) | TWI225094B (hu) |
| UY (1) | UY25315A1 (hu) |
| WO (1) | WO1999031257A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA9811434B (hu) |
Families Citing this family (98)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
| EP0924298A1 (en) | 1997-12-18 | 1999-06-23 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
| EP1035205A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-13 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Non-spreading pestivirus |
| AUPQ233799A0 (en) | 1999-08-19 | 1999-09-09 | Minister For Agriculture, Minister For Land And Water Conservation For And On Behalf Of The State Of New South Wales | Recombinant sub-unit vaccine |
| CN1338310A (zh) * | 2000-08-10 | 2002-03-06 | 清华大学 | 一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法 |
| AU2002248557A1 (en) * | 2001-03-05 | 2002-09-19 | Transtech Pharma, Inc. | High level insect expression of rage proteins |
| US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US7399613B2 (en) * | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
| US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
| US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
| US7173003B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US8008252B2 (en) * | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
| US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
| MXPA04012496A (es) * | 2002-06-21 | 2005-09-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Glicoformos del factor vii pegilados. |
| JP4708027B2 (ja) * | 2002-10-01 | 2011-06-22 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 抗癌組成物および抗感染疾患組成物ならびにこれらを使用する方法 |
| JP2006523211A (ja) * | 2003-03-14 | 2006-10-12 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 分岐水溶性ポリマーとその複合物 |
| SG155777A1 (en) | 2003-04-09 | 2009-10-29 | Neose Technologies Inc | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| WO2004091499A2 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Neose Technologies, Inc. | Intracellular formation of peptide conjugates |
| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| AU2004240553A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-12-02 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
| US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
| US7405198B2 (en) * | 2003-11-24 | 2008-07-29 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| US7842661B2 (en) * | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
| US20080318850A1 (en) * | 2003-12-03 | 2008-12-25 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated Factor Ix |
| US7956032B2 (en) * | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| CA2549409C (en) * | 2003-12-03 | 2013-10-29 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| JP5743368B2 (ja) * | 2004-01-08 | 2015-07-01 | ラショファーム ゲーエムベーハー | ペプチドのｏ結合型グリコシル化 |
| KR20070007086A (ko) | 2004-02-02 | 2007-01-12 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인간의 4 개의 나선형 다발 폴리펩티드 및 이의용도 |
| BRPI0512235A (pt) | 2004-06-18 | 2008-02-19 | Ambrx Inc | polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos |
| EP1771066A2 (en) | 2004-07-13 | 2007-04-11 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1 |
| WO2006031811A2 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
| DK2586456T3 (en) * | 2004-10-29 | 2016-03-21 | Ratiopharm Gmbh | Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF) |
| CA3005835C (en) | 2004-12-22 | 2023-01-31 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| AU2005319518B2 (en) | 2004-12-22 | 2010-09-09 | Ambrx, Inc. | Compositions of aminoacyl-tRNA synthetase and uses thereof |
| NZ555386A (en) | 2004-12-22 | 2011-01-28 | Ambrx Inc | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
| GB2438760A (en) | 2004-12-22 | 2007-12-05 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| CA2594557C (en) | 2004-12-22 | 2016-04-26 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone |
| EP1838332A1 (en) * | 2005-01-06 | 2007-10-03 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugation using saccharyl fragments |
| ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
| WO2006078645A2 (en) * | 2005-01-19 | 2006-07-27 | Neose Technologies, Inc. | Heterologous polypeptide expression using low multiplicity of infection of viruses |
| JP2008538181A (ja) * | 2005-03-30 | 2008-10-16 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 昆虫細胞系において増殖させたペプチドを生産するための製造方法 |
| US9187546B2 (en) * | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US20080255026A1 (en) | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
| SG165353A1 (en) | 2005-06-03 | 2010-10-28 | Ambrx Inc | Improved human interferon molecules and their uses |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| AU2006280932A1 (en) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor VII and factor Vila |
| WO2007056191A2 (en) * | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| WO2007059312A2 (en) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Ambrx, Inc. | Methods and compositions comprising non-natural amino acids |
| CN100497612C (zh) * | 2006-01-25 | 2009-06-10 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种耐高温乳糖酶的制备方法 |
| CU23544A1 (es) | 2006-02-28 | 2010-06-17 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica |
| US20080248959A1 (en) * | 2006-07-21 | 2008-10-09 | Neose Technologies, Inc. | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| AU2007292903B2 (en) | 2006-09-08 | 2012-03-29 | Ambrx, Inc. | Modified human plasma polypeptide or Fc scaffolds and their uses |
| US9133495B2 (en) | 2006-09-08 | 2015-09-15 | Ambrx, Inc. | Hybrid suppressor tRNA for vertebrate cells |
| US20100075375A1 (en) * | 2006-10-03 | 2010-03-25 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
| WO2008060780A2 (en) * | 2006-10-04 | 2008-05-22 | Novo Nordisk A/S | Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides |
| US20080207487A1 (en) * | 2006-11-02 | 2008-08-28 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines |
| KR20140012199A (ko) | 2007-03-30 | 2014-01-29 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도 |
| WO2008124406A2 (en) | 2007-04-03 | 2008-10-16 | Neose Technologies, Inc. | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
| NZ580686A (en) | 2007-05-02 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| US20090053167A1 (en) * | 2007-05-14 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | C-, S- and N-glycosylation of peptides |
| WO2008151258A2 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases |
| EP2170919B8 (en) * | 2007-06-12 | 2016-01-20 | ratiopharm GmbH | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
| CN101152570B (zh) * | 2007-10-19 | 2010-11-24 | 清华大学 | 一种猪瘟病毒表位疫苗及其制备方法 |
| ES2632504T3 (es) | 2007-11-20 | 2017-09-13 | Ambrx, Inc. | Polipéptidos de insulina modificados y sus usos |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| AU2009219232B2 (en) | 2008-02-27 | 2014-02-27 | Novo Nordisk A/S | Conjugated Factor VIII molecules |
| NZ600382A (en) | 2008-07-23 | 2013-11-29 | Ambrx Inc | Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses |
| TWI362416B (en) * | 2008-07-31 | 2012-04-21 | Mao Xing Biolog Technology Co Ltd | Yeast expressed classical swine fever virus glycoprotein e2 and use thereof |
| WO2010036964A2 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Ambrx Inc. | Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses |
| ES2660000T3 (es) | 2008-09-26 | 2018-03-20 | Ambrx, Inc. | Vacunas y microorganismos dependientes de la replicación de aminoácidos no naturales |
| EP2202298A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-06-30 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV |
| CN102753573A (zh) | 2009-12-21 | 2012-10-24 | Ambrx公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
| EP2805965A1 (en) | 2009-12-21 | 2014-11-26 | Ambrx, Inc. | Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| PL2605789T3 (pl) | 2010-08-17 | 2019-11-29 | Ambrx Inc | Zmodyfikowane polipeptydy relaksyny i ich zastosowania |
| TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
| PL2748612T3 (pl) * | 2011-08-24 | 2018-01-31 | Zoetis Services Llc | Ulepszona diagnostyka szczepionkowa |
| CN105392362B (zh) * | 2012-06-12 | 2018-11-09 | 替代基因表达公司 | 用于在宿主昆虫中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件 |
| RU2619161C2 (ru) * | 2012-06-12 | 2017-05-12 | Альтернативе Гене Экспрессион С.Л. | Элементы рекомбинантной днк для экспрессии рекомбинантных белков в клетке-хозяине |
| CA2903811A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Spectrum Brands, Inc. | Electro-mechanical locks with bezel turning function |
| DE102013103336A1 (de) * | 2013-04-03 | 2014-10-09 | B. Braun Avitum Ag | Vorrichtung zur Identifizierung einer Dialysatorvorrichtung oder einer Komponente derselben, und hierfür verwendbare Sensorvorrichtung |
| JP2015015931A (ja) * | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法 |
| US10392603B2 (en) * | 2013-08-30 | 2019-08-27 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method of viral purification |
| CN103882051B (zh) * | 2014-03-20 | 2016-04-06 | 北京市农林科学院 | 一种检测猪瘟病毒抗体的elisa方法及检测试剂盒 |
| CA2965502A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof |
| KR20170083249A (ko) * | 2016-01-08 | 2017-07-18 | 경상대학교산학협력단 | 곤충세포를 이용한 식물 유래 오스모틴 단백질의 대량 생산 방법 |
| MX2019008449A (es) | 2017-02-08 | 2019-09-09 | Bristol Myers Squibb Co | Polipetidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos. |
| AU2019290228A1 (en) | 2018-06-22 | 2021-01-28 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Vectors for gene delivery that persist within cells |
| CN109182380B (zh) * | 2018-08-14 | 2022-06-03 | 浙江大学 | 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用 |
| GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
| IL301955A (en) | 2020-10-07 | 2023-06-01 | Asklepios Biopharmaceutical Inc | Therapeutic delivery of an adeno-related protein-related protein (FKRP) virus for the treatment of dystroglycanopathy disorders, including limb girdle 21 |
| CN112646840B (zh) * | 2020-12-25 | 2022-11-18 | 石河子大学 | 一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的方法及应用 |
| WO2023009968A1 (en) * | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Large scale adeno-associated virus production systems |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA901719B (en) * | 1989-03-19 | 1991-01-30 | Akzo Nv | Hog cholera virus vaccine and diagnostics |
| US5514634A (en) | 1991-11-06 | 1996-05-07 | Mobil Oil Corporation | High activity polyethylene catalysts |
| EP0766740A1 (en) * | 1994-06-17 | 1997-04-09 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Nucleotide sequences of pestivirus strains, polypeptides encoded by these sequences and use thereof for diagnosis and prevention of pestivirus infections |
| DK0772632T3 (da) * | 1994-12-20 | 2001-12-31 | Akzo Nobel Nv | T-celle-stimulerende protein af pestivirus |
| AU720337B2 (en) * | 1995-02-17 | 2000-05-25 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone (REC bFSH) in the baculovirus expression system |
| EP0924298A1 (en) | 1997-12-18 | 1999-06-23 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
-
1997
- 1997-12-18 EP EP97203989A patent/EP0924298A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-12-14 ZA ZA9811434A patent/ZA9811434B/xx unknown
- 1998-12-17 DK DK98962690T patent/DK1049788T3/da active
- 1998-12-17 KR KR1020057022071A patent/KR100682171B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 EP EP98962690A patent/EP1049788B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 CN CNA2006101534938A patent/CN101130073A/zh active Pending
- 1998-12-17 HU HU0101136A patent/HU228122B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 DE DE69834346T patent/DE69834346T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 KR KR1020007006746A patent/KR100699609B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 CN CNB988136848A patent/CN1283801C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 ES ES98962690T patent/ES2267203T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 AU AU17865/99A patent/AU750514B2/en not_active Ceased
- 1998-12-17 AT AT98962690T patent/ATE324456T1/de active
- 1998-12-17 CA CA002315248A patent/CA2315248C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 JP JP2000539155A patent/JP4220126B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 AR ARP980106452A patent/AR015499A1/es active IP Right Grant
- 1998-12-17 NZ NZ505322A patent/NZ505322A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 CA CA002635158A patent/CA2635158A1/en not_active Abandoned
- 1998-12-17 WO PCT/NL1998/000717 patent/WO1999031257A2/en active Application Filing
- 1998-12-17 BR BRPI9813692-5A patent/BR9813692B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 KR KR1020057022070A patent/KR100796871B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 IL IL13681598A patent/IL136815A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 UY UY25315A patent/UY25315A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-12-18 CO CO98075475A patent/CO4820445A1/es unknown
-
1999
- 1999-03-16 TW TW087121320A patent/TWI225094B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-16 US US09/596,105 patent/US6555346B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-10-30 HK HK01107561A patent/HK1037670A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-27 US US10/376,994 patent/US6919085B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-20 IL IL181468A patent/IL181468A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-05-07 JP JP2007122898A patent/JP4336723B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU228122B1 (en) | Protein expression in baculovirus vector expression systems | |
| JPH02502876A (ja) | ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体 | |
| CN113058032B (zh) | 一种猪瘟、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型三联亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| TW200530402A (en) | Recombinant baculovirus and virus-like particle | |
| CN112961224B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用 | |
| CN104561049A (zh) | 一种表达猪细小病毒vp2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用 | |
| EP1420819B1 (en) | Sub-unit vaccine for infectious pancreatic necrosis virus | |
| JPH08228770A (ja) | 魚類膵疾患ウイルス | |
| Moennig | The hog cholera virus | |
| CN102304529B (zh) | 一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法 | |
| CN102321634A (zh) | 一种水貂肠炎细小病毒空衣壳抗原粒子的制备方法 | |
| CN113896773B (zh) | 重组fcv抗原及猫嵌杯病毒基因工程亚单位疫苗 | |
| RU2725952C1 (ru) | Вакцина против hev | |
| CN104651378B (zh) | 一种猪瘟疫苗感染性cDNA及其构建方法和应用 | |
| CN103820398A (zh) | 一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法 | |
| WO2022246449A1 (en) | Sars-coronavirus 2 (sars-cov-2) spike protein subunit vaccines | |
| JPH03504082A (ja) | 昆虫細胞によるプラスモディウム属サーカムスポロゾイト蛋白の発現 | |
| LING | CLONING AND EXPRESSION OF THE SPIKE PROTEIN OF NEPHROPATHOGENIC INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS STRAIN MH5365/95 | |
| LUSK | West Nile Virus Investigations in |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |