JP5743368B2 - ペプチドのo結合型グリコシル化 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年1月8日に出願された米国仮出願第60/535284号、2004年2月12日に出願された米国仮出願第60/544411号、2004年2月20日に出願された米国仮出願第60/546631号、2004年3月23日に出願された米国仮出願第60/555813号、2004年5月12日に出願された米国仮出願第60/570891号に関連する。あらゆる目的のためにこれら各文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
(式中、AAは、変異ポリペプチド配列の内部にある、ヒドロキシル部分を含むアミノ酸側鎖であり、Xは、修飾基またはサッカリル部分である。)一実施形態では、Xは、シアリル、ガラクトシル、およびGal−Sia部分から選択される基を含み、前記シアリル、ガラクトシル、およびGal−Siaのうちの少なくとも1つは、修飾基を含む。
(式中、Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択されるメンバーであり、Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、R1は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Lは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である。)
(式中、Lは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、nは、0〜約500の整数から選択される。)
(式中、sは、0〜20の整数から選択される。)
(a)組換えによって変異ポリペプチドを作製するステップと、
(b)前記O結合型グリコシル化部位において、修飾された糖でその変異ポリペプチドを酵素的にグリコシル化するステップとを含む方法を提供する。
PEG、ポリエチレングリコール;m−PEG、メトキシポリエチレングリコール;PPG、ポリプロピレングリコール;m−PPG、メトキシポリプロピレングリコール;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N−アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N−アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、マンノサミニルアセタート;Sia、シアル酸;NeuAc、N−アセチルノイラミニル。
別段の定めが無い限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には標準技術が使用される。これらの技術および手順は、本明細書の全体を通じて提供される、当技術分野の従来の方法および様々な一般的参考文献(一般には、参照により本明細書に組み込むSambrook他、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、第2版、(1989年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと)に従って一般に実施される。本明細書で使用する命名法、ならびに後述する分析化学および有機合成における実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。標準技術またはその改変法が、化学合成および化学的分析に使用される。
1)アラニン(A)、グリシン(G)
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)
4)アルギニン(R)、リシン(K)
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
7)セリン(S)、トレオニン(T)、および
8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton、Proteins(1984年)を参照のこと)。
本発明は、修飾された糖部分が、ペプチド上のO結合型グリコシル化部位に直接的または間接的に(例えば、介在するグリコシル残基によって)結合している、糖ペプチドのコンジュゲートを提供する。また、本発明のコンジュゲートを作製するための方法も提供される。
(式中、AAは、ヒドロキシル部分を含む側鎖を有するアミノ酸である。)例示的なヒドロキシアミノ酸は、トレオニンおよびセリンである。GalNAc部分は、ヒドロキシル部分の酸素原子を介してAAに結合している。AAは、野生型ペプチド中に存在するものでもよく、あるいは、野生型ペプチドの配列を変異させることによって追加または移動させたものでもよい。Xは、修飾基、サッカリル部分、例えば、シアリル、ガラクトシル、Gal−Sia基、あるいは、サッカリル部分および修飾基である。Xがサッカリル部分である例示的な実施形態では、本明細書で説明するように、Xは修飾基を含む。グリコシル化されるアミノ酸は、ペプチド配列のNもしくはCペプチド末端にあっても、ペプチド配列の内部にあってもよい。
(式中、Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択されるメンバーであり、Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、R1は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Lは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である。)
(式中、Lは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、nは、0〜約2500の整数から選択される。)さらに別の例示的な実施形態では、Xは、以下の構造体を含む。
(式中、sは、0〜20の整数から選択される。)
本発明は、O結合型グリコシル化ペプチド、これらの化学種のコンジュゲート、および選択されたアミノ酸配列(「O結合型グリコシル化部位」)を含むO結合型グリコシル化ペプチドを形成させるための方法を提供する。対応する野生型ペプチドには存在しないO結合型グリコシル化部位を含む変異ペプチドが特に興味深い。O結合型グリコシル化部位は、修飾基を有するグリコシル残基が付加するための部位である。
本発明によって提供されるペプチドは、1種または複数の野生型または変異GalNacトランスフェラーゼによってGalNAc受容体として認識されているアミノ酸配列を含む。このペプチドのアミノ酸配列は、O結合型グリコシル化部位を含むペプチドの場合の野生型、非天然のO結合型グリコシル化部位を導入される変異配列、または、天然および非天然のO結合型グリコシル化部位の双方を含むポリペプチドである。本発明を実施するのに用いる例示的なペプチドとしては、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、例えば、175アミノ酸および178アミノ酸の野生型(N末端メチオニン残基があるものとないもの)、インターフェロン(例えば、インターフェロンα、例えばインターフェロンα2bもしくはインターフェロンα2a)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、ヒト成長ホルモン、およびインターロイキン(例えば、インターロイキン2)が挙げられる。G−CSF、GM−CSF、およびIFN−α2βに関する以下の考察を強調するのは、例示を明確にするためである。アミノ酸の上付き文字の任意の数字は、そのポリペプチドのN末端メチオニンに対するそのアミノ酸の位置を示す。ポリペプチドのN末端がメチオニン無しで始まる場合は、N末端メチオニンが無いことを示すようにこれらの数字を容易に調整することができる。例示的なペプチドのN末端は、メチオニンで始まることもメチオニン無しで始まることもできることが理解されよう。さらに、野生型ペプチドおよび変異ペプチドのO結合型の複合糖質を形成された類似体を調製するための本発明で説明する戦略は、任意のペプチドに適用可能であることも当業者には理解されよう。
配列番号:141(178アミノ酸からなる野生型)
配列番号:159(N末端メチオニンを含む、192アミノ酸からなる野生型の脳下垂体由来hGH)
LEDGSPTTGQIFKQTYS(配列番号:161)、LEDGSPTTAQIFKQTYS(配列番号:162)、LEDGSPTATQIFKQTYS(配列番号:163)、LEDGSPTQGAMFKQTYS(配列番号:164)、LEDGSPTQGAIFKQTYS(配列番号:165)、LEDGSPTQGQIFKQTYS(配列番号:166)、LEDGSPTTLYVFKQTYS(配列番号:167)、LEDGSPTINTIFKQTYS(配列番号:168)、LEDGSPTTVSIFKQTYS(配列番号:169)、LEDGSPRTGQIPTQTYS(配列番号:170)、LEDGSPRTGQIPTQAYS(配列番号:171)、LEDGSPTTLQIFKQTYS(配列番号:172)、LETETPRTGQIFKQTYS(配列番号:173)、LVTETPRTGQIFKQTYS(配列番号:174)、LETQSPRTGQIFKQTYS(配列番号:175)、LVTQSPRTGQIFKQTYS(配列番号:176)、LVTETPATGQIFKQTYS(配列番号:177)、LEDGSPTQGAMPKQTYS(配列番号:178)、およびLEDGSPTTTQIFKQTYS(配列番号:179)
配列番号180(野生型IFN2bに由来)
一般的な組換え技術
本発明は、組換え遺伝学の分野の慣用技術を利用する。本発明で有用な一般的方法を開示している基本的な教科書としては、Sambrook and Russell、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(第3版、2001年)、Kriegler、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990年)、およびAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biology(1994年)が挙げられる。
野生型ペプチドをコードしている多数のポリヌクレオチド配列が決定されており、商業的な供給業者から入手可能である。例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ジェンバンクアクセッション番号NM000515、NM002059、NM022556、NM022557、NM022558、NM022559、NM022560、NM022561、およびNM022562である。
コード性のポリヌクレオチド配列から、野生型ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。続いて、このアミノ酸配列を改変して、アミノ酸配列中の様々な位置に追加のグリコシル化部位を導入することにより、タンパク質のグリコシル化パターンを変えることができる。
特定の宿主の好ましいコドン使用に合致するように、変異ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列をさらに改変することができる。例えば、細菌細胞のある系統の好ましいコドン使用を利用して、本発明の変異ペプチドをコードし、この系統にとって好ましいコドンを含むポリヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用頻度は、その宿主細胞によって発現されている多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均することによって算出することができる(例えば、算出サービスは、かずさDNA研究所(Kazusa DNA Research Institure)(日本)のウェブサイトから利用可能である)。この解析は、好ましくは、宿主細胞によって高発現されている遺伝子に限定される。例えば、米国特許第5824864号は、双子葉植物および単子葉植物によって示されている高発現遺伝子によるコドン使用頻度を提供している。
配列を確認した後、組換え遺伝学の分野の慣用技術により、本明細書で開示するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を使用して、本発明の変異ペプチドを作製することができる。
本発明の変異ペプチドをコードしている核酸の高レベルな発現を得るためには、一般に、転写を指示する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、および翻訳を開始するためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中に、変異ペプチドをコードしているポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、SambrookおよびRussellの前掲書、ならびにAusubel他の前掲書に記載されている。野生型ペプチドまたは変異ペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、大腸菌(E.coli)、バチルス種(Bacillus sp)、サルモネラ属(Salmonella)、およびコーロバクター属(Caulobacter)において利用可能である。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系が当技術分野で周知であり、同様に、市販されている。一実施形態では、真核細胞用発現ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
標準のトランスフェクション法を用いて、大量の変異ペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫の細胞系を作製し、次いで、それら変異ペプチドを標準技術によって精製する(例えば、Colley他、J:Biol.Chem.264:17619〜17622頁(1989年)、Guide to Protein Purification、Methods in Enzymology、182巻(Deutscher編、1990年)を参照のこと)。標準技術に従って、真核細胞および原核細胞の形質転換を実施する(例えば、Morrison、J Bact.132:349〜351頁(1977年)、ならびにClark−CurtissおよびCurtiss、Methods in Enzymology 101:347〜362頁(Wu他編、1983年)を参照のこと)。
適切な宿主細胞中に発現ベクターを導入した後、変異ペプチドの発現を促進する条件下で、トランスフェクトされた細胞を培養する。次に、標準技術によって続いて培養物から回収される組換えポリペプチドの発現について細胞をスクリーニングする(例えば、Scopes、Protein Purification:Principles and Practice(1982年)、米国特許第4673641号、Ausubel他の前掲書、およびSambrookおよびRussellの前掲書を参照のこと)。
トランスフェクトされた宿主細胞における組換え変異ペプチドの発現を確認した後、次いで、組換えポリペプチドを精製するために、適切なスケールで宿主細胞を培養する。
一般にはプロモーター導入後、形質転換された細菌により、本発明の変異ペプチドが組換えによって大量に作製されるとき、発現は構成的となり得るが、それらのタンパク質は不溶性の凝集体を形成することがある。タンパク質封入体を精製するのに適したいくつかのプロトコールがある。例えば、タンパク質凝集体(以下、封入体と呼ぶ)の精製は、一般に、細菌細胞を破壊することにより、例えば、約100〜150μg/mlのリゾチームと非イオン系界面活性剤の0.1% Nonidet P40を含む緩衝液中でのインキュベーションにより、封入体を抽出、分離、および/または精製することを伴う。細胞懸濁液は、ポリトロン(Polytron)粉砕機(Brinkman Instruments社製、ウェストベリー(Westbury)、ニューヨーク州)を用いて粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することもできる。細菌を溶解する代替方法は、Ausubel他の前掲書、ならびにSambrookおよびRussellの前掲書に記載されており、当業者には明らかであろう。
組換えポリペプチド、例えば本発明の変異ペプチドが可溶型で宿主細胞において発現されるとき、その精製は、後述する標準のタンパク質精製手順に従うことができる。
しばしば最初の工程として、また、タンパク質混合物が複雑な場合に、最初に塩分画を行って、不必要な宿主細胞タンパク質(または細胞培養培地に由来するタンパク質)の多くを、目的の組換えタンパク質、例えば、本発明の変異ペプチドから分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に低減させることによって、タンパク質を沈殿させる。そのとき、タンパク質は、溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿が起こる可能性が高い。一般的なプロトコールは、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が20〜30%になるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを加えるものである。これにより、大半の疎水性タンパク質は沈殿すると考えられる。(目的タンパク質が疎水性ではない場合は)この沈殿物を廃棄し、目的タンパク質を沈殿させることが分かっている濃度になるまで、上清に硫酸アンモニウムを加える。次に、緩衝液中で沈殿物を可溶化し、必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションによって過剰な塩を除去する。低温エタノールによる沈殿などタンパク質の溶解性に依拠する他の方法は、当業者には周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するのに使用することができる。
計算された分子量に基づき、限外ろ過により様々なポアサイズの膜(例えば、Amicon社製またはMillipore社製の膜)を通して、サイズのより大きなタンパク質およびサイズのより小さなタンパク質を単離することができる。第1の工程として、目的タンパク質、例えば、変異ペプチドの分子量より低分子量のカットオフ値を有するポアサイズの膜を用いてタンパク質混合物を限外ろ過する。次に、目的タンパク質の分子量より大きな分子カットオフ値を有する膜を用いて限外ろ過の濃縮液を限外ろ過する。組換えタンパク質は、膜を通過してろ液に溶出すると考えられる。次に、このろ液を後述するようにクロマトグラフィーにかけることができる。
(本発明の変異ペプチドなどの)目的タンパク質は、サイズ、正味の表面電荷、疎水性、またはリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、ペプチドに対して産生させた抗体を、カラムのマトリックスに結合させ、ペプチドを免疫精製することもできる。これらの方法はすべて、当技術分野で周知である。
組換え変異ペプチドの産生を確認するために、イムノアッセイが、サンプル中でポリペプチドの発現を検出するのに有用となり得る。イムノアッセイは、組換えホルモンの発現レベルを定量するのにも有用となり得る。変異ペプチドに対する抗体が、これらのイムノアッセイを実施するのに必要である。
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者には公知である(例えば、Coligan、Current Protocols in Immunology Wiley/Greene、ニューヨーク、1991年、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク、1989年、Stites他(編)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications、ロスアルトス(Los Altos)、カリフォルニア州、ならびにその中で引用されている参考文献、Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press、ニューヨーク市、ニューヨーク州、1986年、ならびにKohlerおよびMilstein Nature 256:495〜497頁、1975年を参照のこと)。このような技術は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体ライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製を含む(Huse他、Science 246:1275〜1281頁、1989年、およびWard他、Nature 341:544〜546頁、1989年を参照のこと)。
本発明の変異ペプチドに対して特異的な抗体が利用可能になった後、サンプル中のポリペプチド、例えば、細胞溶解産物の量は、当業者に質的および定量的結果を与える様々なイムノアッセイ法により測定することができる。一般的な免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の総説については、例えば、Stitesの前掲書、米国特許第4366241号、米国特許第4376110号、米国特許第4517288号、米国特許第4837168号を参照のこと。
イムノアッセイは、抗体および標的タンパク質によって形成された結合複合体に特異的に結合し、それを標識する標識物質をしばしば利用する。標識物質は、それ自体が、抗体/標的タンパク質複合体を含む部分のうちの1つでもよく、あるいは、別の抗体など、抗体/標的タンパク質複合体に特異的に結合する第3の部分でもよい。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能なものでよい。例としては、それだけには限らないが、磁性ビーズ(例えば、「Dynabeads(登録商標)」)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアナート、テキサスレッド(Texas red)、ローダミンなど)、放射性同位体(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAで一般に使用される他の酵素)、およびコロイド金や有色のガラスもしくはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズなどの比色標識物質が挙げられる。
サンプルから標的目的タンパク質(例えば、ヒト成長ホルモン変異体)を検出するためのイムノアッセイは、競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイは、捕捉された標的タンパク質の量が直接測定されるアッセイである。1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、標的タンパク質に特異的な抗体を固体基板に直接結合させ、その基板上でその抗体を固定化してよい。次に、その抗体は、試験サンプル中の標的タンパク質を捕捉する。次に、このようにして固定化された抗体/標的タンパク質複合体に、標識を有する前述したような二次抗体や三次抗体などの標識物質を結合させる。
代表的な態様では、本発明は、ペプチドと選択された修飾基の間の複合糖質であって、その修飾基が、グリコシル結合基、例えば、完全なグリコシル結合基を介してペプチドに結合されている複合糖質を提供する。グリコシル結合基は、ペプチド上のO結合型グリコシル化部位に直接結合しており、あるいは、1つまたは複数の追加のグリコシル残基を介して、O結合型グリコシル化部位に結合している。コンジュゲートの調製方法は、本明細書、ならびに米国特許第5876980号、米国特許第6030815号、米国特許第5728554号、米国特許第5922577号、WO98/31826号、US2003180835号、およびWO03/031464号において説明されている。
式中、記号a、b、c、d、およびsは、ゼロではない正の整数を表し、tは0または正の整数である。「作用物質」は、治療薬、生理活性物質、検出可能な標識、水溶性部分などである。「作用物質」は、ペプチド、例えば、酵素、抗体、抗原などでもよい。リンカーは、下記の多彩な結合基のうちの任意のものでよい。あるいは、リンカーは、一重結合または「ゼロ次のリンカー」でもよい。ペプチドのアイデンティティには制限はない。
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。さらに、本発明は、ある疾患を発症する危険にさらされている対象またはその疾患を罹患している対象に本発明のコンジュゲートを投与することによって、疾患状態を予防、治癒、または改善する方法も提供する。さらに、本発明は、身体の特定の組織または領域に本発明のコンジュゲートを標的化させるための方法も提供する。
(式中、Gは、コンジュゲート中の完全なグリコシル結合基に変換される、活性化糖部分(例えば、糖ヌクレオチド)上のグリコシル残基である。)sが0より大きいとき、Lは、GalNAcやGalNAc−Galなどのサッカリル結合基である。
修飾されたグリコシル供与体種(「修飾された糖」)は、好ましくは、修飾された糖ヌクレオチド、活性化された修飾された糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もされていない単純糖である修飾された糖から選択される。本発明の方法を用いて、所望の任意の糖構造体をペプチドに付加することができる。一般には、この構造体は単糖と考えられるが、本発明は、修飾された単糖の使用に限定されない。すなわち、オリゴ糖および多糖も同様に有用である。
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明を実施するのに有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖(例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、ヘパラン、ヘパリンなど);ポリアミノ酸、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸;核酸;合成ポリマー(例えば、ポリアクリル酸、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール);ペプチド、タンパク質などの化学種を包含する。本発明は、任意の水溶性ポリマーを用いて実施してよく、唯一の制約は、そのポリマーが、コンジュゲートの残りの部分が結合され得る箇所を含んでいなければならないことである。
(式中、R8は、H、OH、NH2、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、例えば、アセタール、OHC−、H2N−(CH2)q−、HS−(CH2)q、または−(CH2)qC(Y)Z1である。添字「e」は、1〜2500の整数を表す。添字b、d、およびqは、それぞれ独立に整数0〜20を表す。記号ZおよびZ1は、それぞれ独立に、OH、NH2、脱離基、例えば、イミダゾール、p−ニトロフェニル、HOBT、テトラゾール、ハライド、S−R9、活性化エステルのアルコール部分;−(CH2)pC(Y1)V、または−(CH2)pU(CH2)sC(Y1)Vを表す。記号Yは、H(2)、=O、=S、=N−R10を表す。記号X、Y、Y1、A1、およびUは、それぞれ独立に、O、S、N−R11部分を表す。記号Vは、OH、NH2、ハロゲン、S−R12、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添字p、q、s、およびvは、整数0〜20からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。記号R9、R10、R11、およびR12は、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールをそれぞれ独立に表す。)
(式中、R8およびR8’は、R8に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。A1およびA2は、A1に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。添字e、f、o、およびqは、前述したとおりのものである。ZおよびYは、前述したとおりのものである。X1およびX1’は、S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH、およびNHC(O)O、OC(O)NHからそれぞれ独立に選択されるメンバーである。)
(式中、e、f、およびf’は、それぞれ独立に選択された1〜2500の整数であり、q、q’、およびq’’は、それぞれ独立に選択された1〜20の整数である。)
ならびに、以下のものなどこれらの化学種のカルボナートおよび活性エステルを含む。
(式中、XaはOまたはSであり、rは、1〜5の整数である。添字eおよびfは、1〜2500からそれぞれ独立に選択される整数である。)
糖部分が水溶性ポリマーで修飾されている、水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖種が、本発明において有用である。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して修飾されている糖基を有する。修飾された糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体も、本発明の方法において有用である。例えば、(修飾基の付いていない)サッカリルアミンをペプチド(または他の化学種)に酵素的に結合させ、続いて、その遊離なサッカリルアミン部分を所望の修飾基に結合させることができる。あるいは、修飾された糖ヌクレオチドが、基質、例えば、ペプチド、糖ペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などにあるサッカリル受容体に修飾された糖を転移させる酵素の基質として機能することもできる。
(式中、X4は、結合またはOであり、Jは、SまたはOである。)
(式中、X4は、Oまたは結合であり、Jは、SまたはOである。)
(式中、X4は、結合またはOであり、Jは、SまたはOであり、yは0または1である。)
(式中、Jは、SまたはOである。)
別の実施形態では、前述のものと類似して、修飾された糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートは、1種または複数の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された方式で治療用ペプチドを送達するのに用いられるビヒクルとしてコンジュゲートを使用することによって例示される。高分子薬物の送達システムは、当技術分野で公知である。例えば、Dunn他編、POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS、ACS Symposium Series 469巻、American Chemical Society、ワシントン、D.C.1991年を参照のこと。実質上どの公知の薬物送達システムも本発明のコンジュゲートに適用可能であることが、当業者には理解されよう。
別の実施形態では、修飾された糖は、生体分子を有する。さらに別の実施形態では、生体分子は、機能タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸(例えば、単一のヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびに1本鎖および多重鎖の核酸)、レクチン、レセプター、またはそれらの組合せ物である。
別の実施形態では、修飾された糖は、治療効果を有する部分を含む。治療効果を有する部分と生体分子の部類の間には重複があることが、当業者には理解されよう。多くの生体分子は、治療効果を有する諸特性または治療効果を有する可能性を有している。
一般に、糖部分または修飾基は、反応性基の使用を通じて相互に結合され、それらは通常、結合プロセスによって、新しい有機官能基または非反応性化学種に変換される。糖の反応性官能基は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明を実施する際に有用な反応性基および反応の種類は、通常、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。反応性の糖部分を用いて利用可能な反応の現時点で好ましい種類は、比較的緩和な条件下で進行する反応である。これらには、それだけには限らないが、求核置換反応(例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応)、求電子置換反応(例えば、エナミン反応)、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加反応(例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー付加)が含まれる。これらおよび他の有用な反応は、例えば、March、ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY、第3版、John Wiley&Sons、ニューヨーク、1985年;Hermanson、BIOCONJUGATE TECHNIQUES、Academic Press、サンディエゴ(San Diego)、1996年;およびFeeney他、MODIFICATION OF PROTEINS;Advances in Chemistry Series、198巻、American Chemical Society、ワシントンD.C.、1982年で論じられている。
(a)それだけには限らないが、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、p−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族エステルを含めて、カルボキシル基および様々なその誘導体、
(b)例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
(c)例えば、アミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基でハライドが後に置換され、それによって、ハロゲン原子の官能基位置に新しい基を共有結合させることができるハロアルキル基、
(d)ディールス−アルダー反応に参加することができる求ジエン体の基、例えば、マレイミド基、
(e)例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、もしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、または、グリニャール付加やアルキルリチウム付加などの機序を介して、その後に誘導体化することが可能であるようなアルデヒド基またはケトン基、
(f)例えば、スルホンアミドを形成するために、その後でアミンと反応させるためのスルホニルハライド基、
(g)例えば、ジスルフィドに変換させ、またはハロゲン化アシルと反応させることができる、チオール基、
(h)例えば、アシル化、アルキル化、または酸化することができる、アミン基またはスルフヒドリル基、
(i)例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン、ならびに、
(j)例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
(式中、Xは、−O−、−N(H)−、−S、CH2−、および−N(R)2(各Rは、R1〜R5からそれぞれ独立に選択されるメンバーである)から好ましくは選択される、結合基である。記号Y、Z、A、およびBはそれぞれ、Xのアイデンティティに関して前述した群から選択される基を示す。X、Y、Z、A、およびBは、それぞれ独立に選択され、したがって、同じものでも異なるものでもよい。記号R1、R2、R3、R4、およびR5は、H、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子、またはその他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子、またはその他の部分に結合しているリンカーを表す。)
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製は、糖残基に修飾基を付加し、グリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物を形成させることを含む。糖および修飾基は、ゼロ次または高次の架橋剤によって結合させることができる。修飾基を糖部分に結合させるのに使用することができる例示的な二官能化合物としては、それだけには限らないが、二官能性ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。糖を他の分子に結合させるための一般的手法は、文献で公知である。例えば、Lee他、Biochemistry 28:1856頁(1989年);Bhatia他、Anal Biochem.178:408(1989年);Janda他、J.Am.Chem.Soc.112:8886頁(1990年)、およびBednarski他、WO92/18135号を参照のこと。以下の考察では、反応性基は、新生の修飾された糖の糖部分上で好都合に処理される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。この考察は、修飾基上の反応性基にも同様に関連していることが、当業者には理解されよう。
1.アミノ反応性基
一実施形態では、架橋剤上の部位は、アミノ反応性基である。アミノ反応性基の有用な非限定的例としては、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、イミドエステル、イソシアナート、ハロゲン化アシル、アリールアジド、p−ニトロフェニルエステル、アルデヒド、および塩化スルホニルが挙げられる。
別の実施形態では、これらの部位は、スルフヒドリル反応性基である。スルフヒドリル反応性基の有用な非限定的例としては、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルジスルフィド、およびチオフタルイミドが挙げられる。
別の実施形態では、水にも有機溶媒にも可溶性のカルボジイミドが、カルボキシル反応性試薬として使用される。これらの化合物は、遊離のカルボキシル基と反応して、利用可能なアミンとその後に結合してアミド結合を生じることができるプソイド尿素を形成し、これはカルボキシル基をカルボジイミドでどのように修飾するかを教示している(Yamada他、Biochemistry 20:4836〜4842頁、1981年)。
部位特異的な反応性部分の使用に加えて、本発明は、修飾基に糖を結合するための非特異的な反応性基の使用も企図する。
1.第1級アミンと反応するホモ2官能性架橋剤
アミン反応性の架橋剤の合成、諸特性、および用途は、商業的に文献で記載されている(架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと)。多くの試薬が入手可能である(例えば、Pierce Chemical社、ロックフォード、イリノイ州;Sigma Chemical社、セントルイス(St.Louis)、ミズーリ州;Molecular Probes社、ユージーン(Eugene)、オレゴン州)。
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている(架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと)。これらの試薬のうちの多くが市販されている(例えば、Pierce Chemical社、ロックフォード、イリノイ州;Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリ州;Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州)。
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている(架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと)。これらの試薬のうちのいくつかは、市販されている(例えば、Pierce Chemical社、ロックフォード、イリノイ州;Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリ州;Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州)。
1.ピリジルジスルフィド部分を有するアミノ反応性ヘテロ2官能性試薬
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている(架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと)。これらの試薬のうちの多くは市販されている(例えば、Pierce Chemical社、ロックフォード、イリノイ州;Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリ州;Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州)。
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている。マレイミド部分およびアミノ反応性のNHSエステルを有するヘテロ2官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、スクシンイミジルマレイミジルアセタート(AMAS)、スクシンイミジル3−マレイミジルプロピオナート(BMPS)、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)、N−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−GMBS)、スクシンイミジル6−マレイミジルヘキサノアート(EMCS)、スクシンイミジル3−マレイミジルベンゾアート(SMB)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラート(スルホ−SMCC)、スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(SMPB)、およびスルホスクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(スルホ−SMPB)が挙げられる。
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている。ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性のNHSエステルを有するヘテロ2官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、N−スクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート(SIAB)、スルホスクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾアート(スルホ−SIAB)、スクシンイミジル−6−(ヨードアセチル)アミノヘキサノアート(SIAX)、スクシンイミジル−6−(6−((ヨードアセチル)−アミノ)ヘキサノイルアミノ)ヘキサノアート(SIAXX)、スクシンイミジル−6−(((4−(ヨードアセチル)−アミノ)−メチル)−シクロヘキサン−1−カルボニル)アミノヘキサノアート(SIACX)、およびスクシンイミジル−4((ヨードアセチル)−アミノ)メチルシクロヘキサン−1−カルボキシラート(SIAC)が挙げられる。
さらに別の実施形態では、リンカー基は、切断されて糖残基から修飾基を遊離することができる基とともに提供される。多くの切断可能な基が当技術分野では公知である。例えば、Jung他、Biochem.Biophys.Acta761:152〜162頁(1983年)、Joshi他、J.Biol.Chem.265:14518〜14525頁(1990年)、Zarling他、J.Immunol.124:913〜920頁(1980年)、Bouizar他、Eur.J.Biochem.155:141〜147頁(1986年)、Park他、J.Biol.Chem.261:205〜210頁(1986年)、Browning他、J.Immunol.143:1859〜1867頁(1989年)を参照のこと。さらに広範囲にわたる切断可能な2官能性(ホモ2官能性およびヘテロ2官能性の双方)リンカー基が、Pierce社などの製造業者から市販されている。
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素によって、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに結合される。修飾された糖供与体、酵素、受容体ペプチドの濃度は、受容体が使い尽くされるまでグリコシル化が進行するように選択されることが好ましい。以下に論じる考察はシアリルトランスフェラーゼの場合で説明するが、通常、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。
1.グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質もしくは糖脂質、または、伸長中のオリゴ糖の非還元末端に、活性化された糖(供与体のNDP−糖)を段階的に付加する反応を触媒する。N−結合型糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質結合型オリゴ糖供与体Dol−PP−NAG2Glc3Man9によって、ひとまとめの転移とそれに続くコアのトリミングによって合成される。この場合、「コア」の糖の性質は、後続の付加物とはいくらか異なる。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野では公知である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、L−フコースをGDP−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素が挙げられる。ヌクレオチドを含まない糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。
実施形態の別の群では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる(E.C.No.2.4.1.151、例えば、Dabkowski他、Transplant Proc.25:2921(1993年)およびYamamoto他、Nature 345:229〜233頁(1990年)を参照のこと。ウシ由来(Genbank j04989、Joziasse他、J.Biol.Chem.264:14290〜14297頁(1989年))、マウス由来(GenBank m26925;Larsen他、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA86:8227〜8231頁(1989年))、ブタ由来(GenBank L36152;Strahan他、Immunogenetics 41:101〜105頁(1995年))。他の適切なα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼは、B血液型抗原の合成に関与しているものである(EC2.4.1.37、Yamamoto他、J.Biol.Chem.265:1146〜1151頁(1990年)(ヒト))。さらに別の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コアGal−T1である。
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物において有用な別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるCMP−シアル酸も産生すると考えられる。発明で使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ST3Gal III(例えば、ラットまたはヒトのST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II、およびST6Gal NAc IIIが挙げられる(本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Tsuji他、Glycobiology6:5〜14頁(1996年)で記載されているものである)。α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)と呼ばれる例示的なα(2,3)シアリルトランスフェラーゼは、2糖Galβ1→3Glcの非還元末端Galまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Van den Eijnden他、J.Biol.Chem.256:3159頁(1981年)、Weinstein他、J.Biol.Chem.257:13845頁(1982年)、およびWen他、J.Biol.Chem.267:21011頁(1992年)を参照のこと。別の例示的なα2,3−シアリルトランスフェラーゼ(EC 2.4.99.4)は、2糖の非還元末端Galまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Rearick他、J.Biol.Chem.254:4444頁(1979年)およびGillespie他、J.Biol.Chem.267:21004頁(1992年)を参照のこと。別の例示的な酵素としては、Gal−β−1,4−GlcNAc α−2,6シアリルトランスフェラーゼが挙げられる(Kurosawa他、Eur.J.Biochem.219:375〜381頁(1994年)を参照のこと)。
N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明を実施する際、特に、ペプチドのO−結合型グリコシル化部位のアミノ酸にGalNAc部分を結合させるのに有用である。適切なN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、α(1,3)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Nagata他、J.Biol.Chem.267:12082〜12089頁(1992年)およびSmith他、J.Biol Chem.269:15162頁(1994年))、ならびにポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Homa他、J.Biol.Chem.268:12609頁(1993年))が挙げられる。
本発明は、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲネン(carragenen)、および関連化合物などの硫酸化多糖を含めて、硫酸化分子を含むペプチドを作製するための方法も提供する。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチン−6−スルホトランスフェラーゼ(Fukuta他、J.Biol.Chem.270:18575〜18580頁(1995年)によって記載されているニワトリcDNA;GenBankアクセッション番号D49915)、グリコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ1(Dixon他、Genomics 26:239〜241頁(1995年);UL18918)、ならびにグリコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ2(Orellana他、J.Biol.Chem.269:2270〜2276頁(1994年)およびEriksson他、J.Biol.Chem.269:10438〜10443頁(1994年)で記載されているマウスcDNA;GenBankアクセッション番号U2304で記載されているヒトcDNA)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明の方法で使用される酵素は、細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが公知であるが(例えば、米国特許第5032519号を参照のこと)、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と結合するとき、膜結合型である。これまで研究されている膜結合型酵素の多くは、内因性のタンパク質とみなされている。すなわち、それらは、超音波処理によっては膜から遊離されず、可溶化するために界面活性剤を必要とする。表面型のグリコシルトランスフェラーゼが、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の表面で確認されており、これらの表面型トランスフェラーゼは生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面型グリコシルトランスフェラーゼのより知られている機能は、細胞間認識のためのものである(Roth、MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA、1990年)。
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望の糖ペプチドコンジュゲートの合成に関与している複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインに結合しているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成されるものでよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖を形成するステップを触媒することができ、または、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与している反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与している酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させることができる。得られた融合タンパク質は、次に、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容体分子への糖部分の転移も触媒することができる。融合タンパク質は、1つの発現可能なヌクレオチド配列に結合された2種以上のサイクル酵素になることができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、2種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、5641668を参照のこと。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用することによって、容易に設計し製造することができる(例えば、1999年6月24日にWO99/31224号として公開されたPCT特許出願PCT/CA98/01180号を参照のこと)。
細胞結合型酵素に加えて、本発明は、固体および/または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法による完全なグリコシルリンカーを介してPEGに結合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。PEG−リンカー−酵素コンジュゲートは、場合によっては、固体支持体に結合されている。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物の精密な検査および反応生成物の精製が簡易になり、また、酵素を容易に回収することも可能になる。グリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートは、本発明の方法で利用される。酵素および支持体の他の組合せ物は、当業者には明らかであろう。
上記の方法で作製した生成物は、精製せずに使用することができる。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜ろ過など、グリコシル化された糖を回収するための標準的な周知の技術を使用することができる。以下および本明細書に引用する文献で説明されているように、より好ましくは逆浸透膜による膜ろ過、または、1種もしくは2種のカラムクロマトグラフィー法を回収のために使用することが好ましい。例えば、分子量カットオフ値が約3000〜10,000の膜による膜ろ過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次に、ナノろ過または逆浸透法を用いて、塩類の除去および/または糖生成物の精製を行うことができる(例えば、WO98/15581号を参照のこと)。ナノフィルター膜は、使用する膜に応じて、1価の塩類を通過させるが多価の塩類および約100〜約2000ダルトンより大きい非荷電の溶質は保持する、ある種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な適用例では、本発明の方法によって調製される糖は膜内に保持され、混入している塩は通過すると考えられる。
本発明の方法によって様々なO結合型グリコシル化部位で修飾されたポリペプチドには、広い範囲の医薬用途がある。例えば、修飾されたエリスロポエチン(EPO)は、一般的な貧血、再生不良性貧血、化学療法により誘発された傷害(骨髄傷害など)、慢性腎不全、腎炎、およびサラセミアを治療するのに使用することができる。さらに、修飾されたEPOは、脳/脊椎障害、多発性硬化症、およびアルツハイマー病などの神経障害を治療するのにも使用することができる。
IFNα−2β 4mgに水200μLを加えることによって、インターフェロンα−2βを溶解した。固体が溶解したとき、1.92mLの反応緩衝液(20mM MES、pH6.2、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05%ポリソルベート、および0.05%NaN3)を加えた。次に、UDP−GalNAc(4.16mg;3mM)およびGalNAcT2(80mU;80L)を加え、その反応混合物を低速回転させながら32℃でインキュベートした。MALDI解析によってこの反応を観察した。反応は、72時間後にほぼ完了した。完了後、反応混合物をペプチドマッピングおよび部位占有率の解析にかけた。
製造業者に説明されているようにして、インターフェロンα−2βを溶解した。水50uLをIFNα−2β 50μgに加えた。固体が溶解したとき、50μLの反応緩衝液(20mM MES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05%ポリソルベート、および0.05%NaN3)を加えた。次に、UDP−GalNAc(100μg;3mM)およびGalNAc T2(8mU;8μL)を加え、その反応混合物を低速回転させながら32℃でインキュベートした。MALDI解析によってこの反応を観察した。反応は、約48〜72時間以内に完了することが判明した。
5キロダルトンMWCOのセントリコン(centricon)フィルターカートリッジおよび第2の緩衝液(20mM MES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05%ポリソルベート、および0.05%NaN3)を用いて、1.1(上記)から得たIFN−α−2β−GalNAc(1.0mL、〜2mg、0.1μモル)のバッファー交換(2回)を行った。スピンカートリッジ中のIFN−α−2β−GalNAcを第2の緩衝液を用いて溶解し、CMP−SA−PEG−20キロダルトン(10mg、0.5マイクロモル)とST6GalNAc1(200μL)の双方を反応混合物に加えた。反応混合物を低速回転させながら32℃で96時間インキュベートした。SPセファロースおよびSEC(スーパーデックス(Superdex)75)クロマトグラフィーを用いて、生成物のIFN−α−2β−GalNAc−SA−PEG−20キロダルトンを精製した。MALDI解析によって、シアル酸−PEGの付加を確認した。
MWCO5キロダルトンのセントリコンフィルターカートリッジおよび第2の緩衝液(20mM MES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05%ポリソルベート、および0.05%NaN3)を用いて、前述(pH6.2)のGalNAc付加から得たIFN−α−2β−GalNAc(1.0mL、〜2mg、0.1μモル)のバッファー交換(2回)を行った。CMP−SA−PEG−20キロダルトン(10mg、0.5マイクロモル)、UDP−ガラクトース(1.8mg、3mM)、コア−1−β1,3−ガラクトシル−トランスフェラーゼ(200mU、樹脂上)およびST3Gal2(200mU、α2,3−(O)−シアリトランスフェラーゼ(sialytransferase))を含有する第2の緩衝液1.0mLを用いて、スピンカートリッジ中のIFN−α−2β−GalNAcを溶解した。反応混合物を低速回転させながら32℃で96時間インキュベートした。SPセファロースおよびSEC(スーパーデックス75)クロマトグラフィーを用いて、生成物のIFN−α−2β−GalNAc−Gal−SA−PEG−20キロダルトンを精製した。MALDI解析によって、シアル酸−PEGの付加を確認した。
セル光路長1cm、280nmの固定吸光度の条件で分光光度計を用いて、タンパク質濃度を決定した。対照としての水および緩衝液とともに、試験対象のサンプルに対して3回の読み取りを行った。0.799mL/mgタンパク質の吸光係数を用いて、タンパク質濃度を決定した。
調製用緩衝液は、パイロジェンフリーのPBS、pH6.5、2.5%マンニトール、および0.05%ポリソルベート80を含有し、減圧により脱気し、滅菌ろ過(0.2μm)した。
放射ヨウ素標識したタンパク質を用いて薬物動態学的解析を実施した。標識したインターフェロンをIV 尾静脈注射によってラットに投与した後、72時間後まで指定の間隔で抜き取った血液中の放射能低減としてクリアランス速度を測定した。それぞれの時点に少なくとも5匹のラットを測定した。
2種類のpH、すなわち、中性のpH(7.4)およびわずかに酸性のpH(6.2)でGalNAc−T2の反応速度を測定した。GalNAcによるグリコシル化は、pH6.2でもpH7.4でも、首尾よく進行していた。反応経過のMALDI解析で確認することができるように、反応速度は、pH6.2の場合より、pH7.4の場合の方が速かった。
UFフィルター(5キロダルトン)を用いた限外ろ過(utrafiltration)によって、緩衝液3.2mL中のG−CSF 960μgを濃縮し、1mLの25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)に溶解した。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.24mM)、GalNAc−T2(40μL、0.04U)、および100mM MnCl2(40μL、4mM)を加えて、得られた溶液を室温で48時間インキュベートした。48時間後、MALDIは、反応が完了していることを示した(質量イオンが18800から19023質量単位にシフト)。SEC(スーパーデックス75およびスーパーデックス200)を用いたHPLCによって、反応混合物を精製した。リン酸緩衝化生理食塩水、pH4.9、0.005%Tween80を用いて、カラムを溶出した。G−CSF−GalNAcに対応するピークを回収し、セントリコン 5キロダルトンフィルターを用いて約150μLに濃縮し、PBS(リン酸緩衝化生理食塩水、pH4.9、0.005%Tween80)を用いて体積を1mlに調整した。タンパク質濃度は1mg/mL(A280)であった。
25mM MES緩衝液、pH6.0、1.5mM UDP−GalNAc、10mM MgCl2、および80mU GalNAc−T2を含有する溶液100μLにG−CSF−GalNAc(100μg)を加えた。次に、CMP−SA−PEG−20キロダルトン(0.5mg、0.025μモル)、UDP−ガラクトース75μg(0.125μモル)、コア−1−Gal−T20μL(10mU)を加え、その溶液を32℃で24時間、ゆっくりと揺り動かした。MALDIにより、G−CCSF−GalNAc−GalへのG−CSF−GalNAcの完全な変換が示唆された。
2.3a 連続的方法(pH6.2)
タンパク質1mgを含有するG−CSF−GalNAc溶液を25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)中に入れてバッファー交換し、次に、5mg(0.25μモル)のCMP−SA−PEG(20キロダルトン)を加えた。最後に、100mMのMnCl2溶液100μLおよびST6GalNAc−I(100μL)を加え、反応混合物を32℃でゆっくりと揺り動かした。指定の時点(24、48、および72時間)にアリコートを取り出し、SDS−PAGEによって解析した。24時間後には、それ以上の反応は観察されなかった。反応混合物を遠心ろ過(5キロダルトン)によって濃縮し、25mM NaOAc(pH4.9)でバッファー交換し、1mLに濃縮した。イオン交換(SP−セファロース、25mM NaOAc、pH4.9)およびSEC(スーパーデックス75;PBS−pH7.2、0.005%tween80、1ml/分)を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して0.5mLにし、4℃で保存した。
遠心ろ過(5キロダルトン)によって、3.2mLの生成物調製緩衝液中に溶解した960μgのG−CSFタンパク質を0.5mLに濃縮し、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)中に溶解して、全体積を約1mLにし、またはタンパク質濃度を1mg/mLにした。溶解後に、UDP−GalNAc(6mg、9.21μmol)、GalNAc−T2(80μL、80mU)、CMP−SA−PEG−20キロダルトン(6mg、0,3μmol)、およびマウス酵素ST6GalNAc−I(120μL)を加えた。32℃で48時間、溶液を揺り動かした。反応後、標準のクロマトグラフィー条件を用いて前述のSP−セファロースおよびSECで生成物を精製した。合計0.5mgのタンパク質(A280)が得られ、全収率は約50%であった。MALDIおよびSDS−PAGEの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。
2.4a G−CSF−GalNAcから出発
UDP−ガラクトース(4mg、6.5μモル)、コア−1−Gal−T1(320μL、160mU)、CMP−SA−PEG−20キロダルトン(8mg、0.4μモル)、ST3Gal2(80μL、0.07mU)、および100mM MnCl2(80μL)を、(上記の)実施例2.1から得られる、25mM MES緩衝液(pH6.0)中のG−CSF−GalNAc(1.5mg)の粗製な1.5mLの反応混合物に直接加えた。得られた混合物を32℃で60時間インキュベートした。ただし、反応は24時間後に完了していた。反応混合物を遠心分離し、限外ろ過(5キロダルトン)によって溶液を0.2mLに濃縮し、次に、25mM NaOAc(pH4.5)中に再び溶解させて最終体積を1mLにした。SP−セファロースを用いて生成物を精製し、スピンフィルター(5キロダルトン)を用いてピーク画分を濃縮し、さらにSEC(スーパーデックス75)を用いて残留物を精製した。スピンフィルター(5キロダルトン)を用いて濃縮した後、PBS、2.5%マンニトール、0.005%ポリソルベートからなるpH6.5の調製緩衝液によって、タンパク質を1mLに希釈し、タンパク質濃度が1mL当たり850μgのタンパク質となるように調製した(A280)。全収率は55%であった。MALDI解析の結果を図28に示す。
スピンフィルター(5キロダルトン)によって、960μgのG−CSF(3.2ml)を濃縮し、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)で溶解した。G−CSF溶液の全体積を約1mg/mLに調整し、UDP−GalNAc(6mg)、GalNAc−T2(80μL)、UDP−ガラクトース(6mg)、コア−1−Gal−T1(160μL、80μU)、CMP−SA−PEG(20キロダルトン)(6mg)、ST3Gal−2(160μL、120μU)、およびMnCl2(100mM溶液、40μL)を加えた。得られた混合物を32℃で48時間インキュベートした。
実施例1.4で説明したようにして、SPセファロースを実施した。
実施例1.5で説明したようにしてSECを実施した。精製したサンプルを4℃で保存した。
クロマトグラフィーによるクロマトグラフィーの第1ステップに続いて、PEG化されていないG−CSF以外の混入物を除去するための第2の精製ステップとしてHICを使用することができる。すなわち、ゲル浸透カラムでの最初の精製を通過したグリコペグ化G−CSFを精製するための方法が利用可能である。
実施例1.6で説明したようにして、SDS PAGEを実施した。
実施例1.7で説明したようにしてMALDI解析を実施した。
実施例1.8で例示したようにしてタンパク質マッピング解析を実施した。
実施例1.9で説明したようにしてタンパク質濃度を決定した。
実施例1.10で説明したようにして生成物を調製した。
実施例1.11で説明したようにしてエンドトキシンを測定した。
NFS−60細胞系統およびTf−1細胞系統を用いたG−CSF増殖アッセイを標準手順に従って実施した。様々な濃度のG−CSF(51nM、25.5nM、12.75nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0nM)、化学的にPEG化されたG−CSF類似体、ならびに実施例2.3(上記)から得たPEG化G−CSF Cおよび実施例2.4(上記)から得たPEG化G−CSF Dの存在下で、96ウェルプレート中に25000細胞/mlの密度で細胞を播いた。37℃で48時間、細胞をインキュベートした。比色法のMTTアッセイを使用して細胞生存率を測定した。
マウスを用いて、G−CSF C、および化学的にPEG化されたG−CSFのそれぞれについて2種類の薬物用量(50μg/kg、250μg/kg)を検査した。2時間、12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、および96時間の時点で血液を抜き取り、WBCおよび好中球の総数を測定した(図4)。
実施例2.3から得たPEG化G−CSF Cおよび実施例2.4から得たPEG化G−CSF Dの加速安定性試験を、40℃に加熱したpH8.0の緩衝液を用いて実施した。72μgのPEG化G−CSF Cを調製用緩衝液(PBS、2.5%マンニトール、0.005%ポリソルベート80)で8mLに希釈した。1mgのPEG化G−CSF Dを調製用緩衝液で16mLに希釈した。NaOHを用いて両方の溶液をpH8.0に調整し、得られた溶液を滅菌ろ過してパイロジェンフリーの試験管に入れた。サンプルを40℃で低速回転させ、0時間、72時間、および168時間の時点でアリコート(0.8mL)を取り出した。前述のSEC(スーパーデックス200)を用いて、解析を実施した(図6および図7)。
ボルトンハンター試薬を用いてG−CSFを放射性標識した。pH7.4で15分間、反応を実施し、続いてSEC(スーパーデックス200)による精製を行った。精製した後で、調製用緩衝液のpHを5.0に調整し、タンパク質濃度をA280によって決定した。
Elisaアッセイを利用して、ラット血漿中のG−CSF誘導体を定量した。薬物動態学的な結果を図9に示す。
2つの薬物動態学的研究を実施した。第1の薬物動態学的研究のために、タンパク質を放射性標識し、IV尾静脈注射によってラットに投与した。48時間後までの指定の間隔で抜き取った血液中の放射能低減としてクリアランス速度を測定した。それぞれの時点に少なくとも5匹のラットを測定した。
ヒトGalNAcT2は、UDP−GalNAcを供与体として用いて、大腸菌で発現されるG−CSFにGalNAcを転移させた。反応緩衝液のpHに応じて、1つまたは2つのGalNAc部分がG−CSFに付加されることがMALDIによって測定された。第2のGalNAcの付加は、ゆっくりと進行し、生成物全体の約10〜15%に達した。反応溶液のpHを6.0〜6.2に調整することによって、90%を超える変換率で、1つのGalNAcを選択的にG−CSFに付加することができた。第2のGalNAcの付加は、反応が約7.2〜7.4のpHで行われたときに起こった。Co+2とMn+2のどちらも、反応において有用な2価の金属イオンである。反応生成物のペプチドマッピングは、反応の主な生成物が、トレオニン133、すなわち、哺乳動物系における天然のO結合型グリコシル化部位へのGalNAcの付加物であることを示唆した。第2のGalNAcは、G−CSFのアミノ末端ペプチド断片でみとめられ、トレオニン−2で生じると仮定されている。
MTPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCA
TYKLCHPEEL VLLGHSLGIP WAPLSSCPSQ ALQLAGCLSQ
LHSGLFLYQG LLQALEGISP ELGPTLDTLQ LDVADFATTI
WQQMEELGMA PALQPTQGAM PAFASAFQRR AGGVLVASHL
QSFLEVSYRV LRHLAQP (配列番号:143)
N末端変異体では、野生型G−CSF、M1TPLGPA(配列番号)のN末端が、M1XnTPLGPAまたはM1BoPZmXnTPLGPAで置換されている。n、o、およびmは0〜3から選択される整数であり、X、B、およびOのうちの少なくとも1つはThrまたはSerである。X、B、およびOのうちの複数がThrまたはSerであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。上付き文字がある場合は、それらは、野生型の出発配列におけるアミノ酸位置を示す。
これらの変異体では、野生型GCSF、M1TPLGP(配列番号8)のN末端が、M1TPXnBoOrPで置換されている。式中、n、o、およびrは、0〜3から選択される整数であり、X、B、およびOのうちの少なくとも1つはThrまたはSerである。X、B、およびOのうちの複数がThrまたはSerであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。上付き文字がある場合は、それらは、野生型の出発配列におけるアミノ酸位置を示す。
この変異は、G−CSF活性を維持するために作られる。これらの変異体では、H53を含有するアミノ酸配列、すなわち、LGH53SLGI(配列番号:191)が、LGH53BoLGI(式中、ΘはH、S、R、E、またはYであり、Bは、ThrまたはSerである)に変異している。
このタイプの変異体では、P129の周辺のアミノ酸配列、すなわち、P129ALQPT(配列番号:192)が、P129ZmJqOrXnPT(式中、Z、J、O、およびXは、ThrまたはSerからそれぞれ独立に選択され、m、q、r、およびnは、0〜3から選択される整数である)に変異している。
このタイプの変異体では、P61を含むアミノ酸配列、すなわち、LGIPWAP61LSSC(配列番号:213)が、PZmUsJqP61OrXnBoC(式中、m、s、q、r、n、およびoは、0〜3から選択される整数であり、Z、J、O、X、B、およびUは、ThrまたはSerとして選択される)で置き換えられている。また、Z、J、O、X、B、およびUのうちの複数がThrまたはSerであるとき、各々はそれぞれ独立に選択される。
このタイプの変異体では、野生型G−CSF、すなわち、RHLAQP175(配列番号:193)が、θaGpJqOrP175XnBoZmUsΨt(式中、a、p、q、r、n、o、m、s、およびtは、0〜3から選択される整数であり、Z、U、O、J、G、θ、B、およびXのうちの少なくとも1つはThrまたはSerであり、Z、U、O、J、G、θ、B、およびXのうちの複数がThrまたはSerであるとき、それらはそれぞれ独立に選択される)で置き換えられている。θは場合によってはRであり、Gは場合によってはHである。記号Ψは、任意の非荷電アミノ酸残基またはE(グルタミン酸)を表す。
追加のG−CSF変異体としては、アミノ酸P133の周囲の内部変異を有するものが挙げられる。例としては、以下のものが挙げられる。
4.1 G−CSF(野生型178aa変異体)
4.2 G−CSF(野生型175aa変異体)
4.9 G−CSF変異体1(アミノ末端変異)
4.10 G−CSF変異体2(アミノ末端変異)
4.11 G−CSF変異体3(アミノ末端変異)
4.12 G−CSF変異体4(部位1)
4.13 G−CSF変異体5(部位3)
4.14 G−CSF変異体6(部位4)
5a.アシアロ−顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の調製
CHO細胞で産生されたG−CSFを50mM Tris、50mM Tris−HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mMCaCl2中に2.5mg/mLで溶解させ、Centricon Plus20遠心ろ過機で500μLに濃縮した。その溶液を、300mU/mLのノイラミニダーゼII(ビブリオコレラ(Vibrio cholerae))とともに、32℃で16時間インキュベートした。反応を観察するために、反応物を少量分取して適切な緩衝液で希釈し、ゲルIEFを実施した。次に、反応混合物を予め洗浄したN−(p−アミノフェニル)オキサミド酸−アガロースコンジュゲートに加え(反応体積800μL/mL)、洗浄したビーズを4℃で24時間、穏やかに回転させた。混合物を10,000rpmで遠心分離し、上清を集めた。Tris−EDTA緩衝液で3回、0.4mLのTris−EDTA緩衝液で1回、0.2mLのTris−EDTA緩衝液で1回、ビーズを洗浄し、上清をすべて集めてためた。上清を50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して、次いで、50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対してさらに2回、4℃で透析した。次に、透析した溶液をCentricon Plus20遠心ろ過機を用いて濃縮し、−20℃で保管した。ゲルIEFのための条件は、Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従って実施した。天然のG−CSFおよび脱シアル酸されたG−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析した。
脱シアル酸されたG−CSFを50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05% NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させた。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST3Gal1とともに、32℃で2日間インキュベートした。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析した。
α2,3−シアル酸付加O結合型グリカンを含有する、CHO細胞で産生されたG−CSFを、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させた。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのCST−IIとともに、32℃で2日間インキュベートした。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析した。
O結合型GalNacのみを含有するG−CSFを、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中に2.5mg/mLで溶解させた。その溶液を、1mMのCMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6GalNacIまたはIIとともに、32℃で2日間インキュベートした。シアル酸−PEGの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加えた。PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。2日後、PBS緩衝液(pH7.1)を用いてToso Haas G3000SW分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Invitrogen社によって提供される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のG−CSFおよびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、MALDI−TOF MSによって解析した。
・遠心分離によって細胞を回収し、上清を廃棄する。様々な培地上での増殖の結果を図9に示す。
・10mM Tris pH7.4、75mM NaCl、5mM EDTA(10ml/gで使用、溶解緩衝液)中に細胞沈殿物を再懸濁する。
・細胞を微細な流体にする(Microlluidize)(フレンチプレスも同様に使える)。
・5,000RPM、4℃で30分、遠心分離する。上清を廃棄する。
・沈殿物を溶解緩衝液中に再懸濁させ、上記と同じように遠心分離する。
・25mM Tris pH8、100mM NaCl、1% TX−100、1% NaDOC、5mM EDTA中でIBを洗浄する。ピペッティングおよびボルテックス処理によって、沈殿物を再懸濁させる。5,000RPM、4℃で15分、遠心分離する。このステップをもう1回繰り返す(合計2回洗浄)。
・25mM Tris pH8、100mM NaCl、5mM EDTA中で沈殿物を2回洗浄して界面活性剤を除去する。上記と同じように遠心分離する。
・沈殿物をdH2O中に再懸濁して一定量にし、上記と同じように遠心分離する。沈殿物を−20℃で凍結する。
・ピペットを用いて、6M塩酸グアニジン、5mM EDTA、100mM NaCl、100mM Tris pH8、10mM DTT中に20mg/mlでIBを再懸濁し、続いて、室温で2〜4時間回転させる。
・14,000RPM、室温で1分間、可溶化したIBを遠心分離する。上清を取っておく。
・リフォールディング用緩衝液50mM MES pH6、240mM NaCl、10mMを用いて1:20の比で上清を希釈する。
・KCl、0.3mMラウリルマルトシド、0.055% PEG3350、1mM GSH、0.1M GSSG、0.5Mアルギニン。4℃で一晩、ローテーター上でリフォールディングさせる。
・リフォールディング物を透析用のピアススネークスキン(7kDa MWCO)に移す。透析緩衝液:20mM NaOAc pH4、50mM NaCl、0.005%Tween−80、0.1mM EDTA。少なくとも200倍を超える量に対して、4℃で合計3回透析する。
・透析後、0.45μMフィルターに物質を通す。
・透析緩衝液でSP−セファロースカラムを平衡化し、サンプルを添加する。透析緩衝液でカラムを洗浄し、最大1M NaClの塩勾配を有する透析緩衝液で溶出させる。タンパク質は、通常、300〜400mM NaClで溶出される。
・SDS−PAGEで物質を検査する(例えば、図10を参照のこと)。
以下の実施例は、各中間生成物が次のステップで使用される前に精製される、2つの連続したステップでのG−CSF−GalNAc−SA−PEGの調製を例示する。
UFフィルター(MWCO 5K)を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液3.2mL中のG−CSF(960μg)を濃縮し、次いで、1mLの25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)に溶解した。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.24mM)、GalNAc−T2(40μL、0.04U)、および100mM MnCl2(40μL、4mM)を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
タンパク質1mgを含有するG−CSF−GalNAc溶液を25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)中に入れてバッファー交換し、CMP−SA−PEG(20KDa)(5mg、0.25umol)を加えた。溶解後、MnCl2(100mcL、100mM溶液)およびST6GalNAc−I(100mcL、マウス酵素)を加え、反応混合物を32℃で3日間、ゆっくりと揺り動かした。限外ろ過(MWCO 5K)によって反応混合物を濃縮し、25mM NaOAc(pH4.9)で1回バッファー交換し、次に、濃縮して全体積を1mLにした。次に、保持時間13〜18分のSP−セファロース(A:25mM NaOAc+0.005%tween−80 pH4.5;B:25mM NaOAc+0.005%tween−80 pH4.5+2M NaCl)、保持時間8.6分のSEC(スーパーデックス75;PBS−pH7.2、0.005%Tween80)(スーパーデックス75、流速1ml/分)を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して0.5mLにし、4℃で保存した。
以下の実施例は、酵素の同時添加によるワンポットでのG−CSF−GalNAc−SA−PEGの調製を例示する。
限外ろ過(MWCO 5K)によって、G−CSF(3.2mLの生成物調製緩衝液中に溶解した960μgのタンパク質)を0.5mlに濃縮し、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)で溶解して、全体積を約1mLにし、またはタンパク質濃度を1mg/mLにした。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.21μmol)、GalNAc−T2(80μL、80mU)、CMP−SA−PEG(20KDa)(6mg、0.3μmol)、ならびにマウス酵素ST6GalNAc−I(120μL)および100mM MnCl2(50L)を加えた。32℃で48時間、溶液を揺り動かし、標準のクロマトグラフィー条件を用いてSP−セファロースで精製した。合計0.5mgのタンパク質(A280)が得られ、全収率約50%であった。MALDIおよびSDS−PAGEの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。
14.4mgのG−CSFを濃縮して最終体積を3mLにし、25mM MES緩衝液(pH6.0、0.05%NaN3、0.004%Tween80)でバッファー交換し、また、体積を13mLに調整した。次に、UDP−GalNAc(90mg、150μモル)、GalNAc−T2(0.59U)、CMP−SA−PEG−20KDa(90mg)、ニワトリST6GalNAc−I(0.44U)、および100mM MnCl2(600mcL)を加えた。得られた混合物を室温で60時間放置した。次に、UF(MWCO 5K)および遠心分離によって、反応混合物を濃縮した。残留物(約2mL)を25mM NaOAc緩衝液(pH4.5)中に溶解させ、再度濃縮して最終体積を5mLにした。SP−セファロースを約10〜23分、SEC(スーパーデックス75、17分、流速0.5ml/分)、さらにSEC(スーパーデックス200、23分、流速0.5ml/分)を用いてサンプルを精製して、3.6mg(全収率25%)のG−CSF−GalNAc−SA−PEG−20KDa(A280およびBCA法)を得た。
以下の実施例は、酵素の連続添加によってワンポットでG−CSF−GalNAc−Gal−SA−PEGを作製するための方法を例示する。
a.GalNAc−T2を用いた、G−CSFおよびUDP−GalNAcからのG−CSF−GalNAc(pH6.2)の調製
UFフィルター(MWCO 5K)を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液3.2mL中のG−CSF(960mcg)を濃縮し、次いで、1mLの25mM MES緩衝液(pH6.2、0.005%NaN3)に溶解した。次に、UDP−GalNAc(6mg、9.24mM)、GalNAc−T2(40μL、0.04U)、および100mM MnCl2(40μL、4mM)を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。
UDP−ガラクトース(4mg、6.5μモル)、コア−1−Gal−T(320μL、160mU)、CMP−SA−PEG−20KDa(8mg、0.4μモル)、ST3Gal2(80μL、0.07mU)および100mM MnCl2(80μL)を、上記のステップaから得られる、25mM MES緩衝液(pH6.0)1.5ml中のG−CSF−GalNAcの粗製な反応混合物(1.5mg)に直接加えた。得られた混合物を32℃で60時間インキュベートした。反応混合物を遠心分離し、限外ろ過(MWCO 5K)によって0.2mLに濃縮し、次に、25mM NaOAc(pH4.5)で溶解して最終体積を1mLにした。SP−セファロース(保持時間10〜15分)を用いて生成物を精製し、スピンフィルター(MWCO 5K)を用いてピーク画分を濃縮し、さらにSEC(スーパーデックス75、保持時間10.2分)を用いて残留物を精製した。スピンフィルター(MWCO 5K)を用いて濃縮した後、PBS、2.5%マンニトール、0.005%ポリソルベート、pH6.5の調製緩衝液によって、タンパク質を1mLに希釈し、タンパク質濃度が1mL当たり850mcgのタンパク質となるように調製した(A280)。全収率は55%であった。
a.G−CSFからの出発
限外ろ過(MWCO 5K)によって、G−CSF(960mcg、3.2ml)を濃縮し、25mM Mes緩衝液(pH6.0、0.005%NaN3)で溶解した。G−CSF溶液の全体積は約1mg/mlとした。UDP−GalNAc(6mg)、GalNAc−T2(80μL、〜80μU)、UDP−Gal(6mg)、コア1 GalT(160μL、80μU)、CMP−SA−PEG(20K)(6mg)、およびα2,3−(O)−シアリルトランスフェラーゼ(160μL、120μU)、100mM MnCl2(40μL)を加えた。得られた混合物を32℃で48時間インキュベートした。後述するように、IEXおよびSECを用いて精製を実施した。限外ろ過(MWCO 5K)によって、生成物を含有する得られた画分を濃縮し、緩衝液で体積を約1mLに調整した。タンパク質濃度は、A280により0.392mg/mlと測定され、G−CSFからの全収率は40%となった。
UDP−GalNAcの存在下でリフォールディングされたGalNAcT2を用いて、1mM MnCl2を含有するpH6.5の50mM Bis−Tris緩衝液中、33℃でG−CSFのGalNAc化を実施した。このステップは、最大量のGCSF−PEGを短時間で非常に効率的に生成するようにGalNAcトランスフェラーゼとシアリルトランスフェラーゼの双方が後続のステップで共に作用することを可能にする反応を活性化する。
活性化反応にCMP−SA−PEG(20K)およびST6GalNacI(ニワトリまたはヒト)を直接加えることによって、GalNAc化の2(+/−1)時間後にPEG化を開始した。このステップは、シアリルトランスフェラーゼに対する基質(GCSF−O−GalNAc)を生成して、UDP−GalNAcおよび他の反応成分から最初にGCSF−O−GalNAcを精製する(例えば、上記の実施例Xを参照のこと)2ステップの反応で実現し得る期間より短時間でより速く反応を推進する。さらに、活性化されたワンポット反応は、すべての成分が同時に加えられるワンポット反応よりも、より高収率の生成物を生成する。
変異G−CSFタンパク質のすべての配列を以下に表にする。これらのタンパク質を用いて、O結合型グリコシル化を調べた。天然G−CSFのグリコシル化と同じ条件下で、25mM MES緩衝液(pH6.0)に溶かしたUDP−GalNAcとともに、GalNAc−T2(BV)をin vitroで使用した。MALDIを使用して反応を観察した。タンパク質の分子量増加を測定することにより、GalNAcの付加数が得られた。GalNAcが1つ付加した場合、分子量の増加は203Daになるはずである。本発明者らは、MALDIの結果に基づき、変異G−CSF−2、3、4は、1つのGalNAcを受け入れること、変異G−CSF−5でもいくらかの付加が観察されること、また、変異G−CSF−1は2つのGalNAcを受け入れて、MAPT−G−CSF(GalNAc)2(分子量は18965ダルトンから19369ダルトンに増加)を形成することを発見した。
a.変異G−CSF配列のグリコPEG化およびMAPT−G−CSFのグリコPEG化に対する緩衝液の影響
5種類の変異体のグリコPEG化(20K)の調査を行った。3種類の酵素/3種類のヌクレオチドの系を用いて、グリコPEG化を行った。25mM MES緩衝液(pH6.0)に溶かした(UDP−GalNAc/GalNAc−T2/UDP−Gal/コアGalT/CMP−SA−PEG/O−シアリルトランスフェラーゼ)。すべての変異体をモノグリコPEG化することができた。この条件では、測定できるほどのジPEG化は、SDS−PAGEとクーマシーブルー染色によって検出されなかった。
様々な酵素によって触媒される変異G−CSF−1のグリコPEG化効率を調べるために、2種類の酵素(St6GalNAcIおよびO−シアリルトランスフェラーゼ)をシアリルPEG化について調査した。したがって、シアリルPEG化するために、MAPT−G−CSFをMAPT−G−CSF(GalNAc)2およびMAPT−G−CSF(GalNAc−Gal)2に変換した。前者をCMP−SA−lys−PEG(20K)/St6GalNAcIで処理し、後者をCMP−SA−PEG(20K)/O−シアリルトランスフェラーゼで処理した。いずれの反応も、25mM MES緩衝液(pH6.0)中、1mg/mlのタンパク質濃度で実施した。SDS−PageゲルにおいてPEG化効率を確認することができた。2種の酵素は、試験した条件下でのCMP−SA−Lys−PEG(20KDa)によるこのタンパク質のグリコPEG化において非常に類似しているようであった。
前述したように、グリコPEG化に対する酵素および緩衝液の影響を調査した後で、グリコPEG化酵素としてST6GalNAcIを用いて、高濃度の緩衝液の因子と組み合わせることによって、PEG化に対するタンパク質濃度の影響を調査した。したがって、本発明者らは、MAPT−G−CSFをグリコPEG化するために、1M MES緩衝液(pH6.0)中での反応に対して8〜10mg/mlのタンパク質濃度を用いて、UDP−GalNAc/GalNAc−T2およびCMP−SA−PEG(20KDa)/St6GalNAcIを加えた。この結果により、この条件下では所望のジPEG化生成物が主要生成物となることが示唆された。より多くのCMP−SA−PEG(20K)および酵素を加えることによって、90%を超える変換も実現した。PEG化されたG−CSF生成物、すなわち、MAPT−G−CSF((GalNAc−SA−PEG(20KDa))2をSP−セファロースおよびスーパーデックス200を用いたSEC精製を併用することによって精製した。
NFS−60細胞系統およびTf−1細胞系統を用いたMAPT−G−CSF−(GalNAc−SA−PEG)2の細胞増殖アッセイを実施した。0ng/ml〜1000ng/mlのタンパク質濃度でこのアッセイを実施した。MAPT−G−CSF−(GalNAc−SA−PEG(20K))2は、このアッセイでは活性であった。
12.4a 変異G−CSFのGalNAc化の一般的手順
ある体積の変異G−CSF溶液(100ugのタンパク質)をMES緩衝液(25mM+0.005%NaN3、pH6.0)でバッファー交換した。最終体積を100ug/100ulに調整した。5ulの100mM MnCl2およびGalNAc−T2(1mU)をこの溶液に加えた。MALDIまたはQTOF解析に必要とされる一定期間、室温で、得られた混合物を揺り動かした。
MAPTP−G−CSF 5.4mg(KJ−675−159、0.18mg/ml、0.053umol)をMES緩衝液(25mM+0.005%NaN3、pH6.0)でバッファー交換した。最終体積を5.4mlに調整した。UDP−GalNAc(5mg、0.15umol)、100mM MnCl2 0.25ml、およびGalNAc−T2(1.0U/ml、50ul)をこの溶液に加えた。32℃で24時間、得られた混合物を揺り動かした。M+(MALDI):19364(MAPT−G−CSF−(GalNAc)2)および18951(MVPTP−G−CSF)。
100ulの25mM MES緩衝液(pH6.0+0.005%NaN3)中で、変異G−CSF100ug(変異G−CSF−1、2、3、4、5)を、UDP−GalNAc(0.6mg、0.923umol)、GalNAc−T2(20ul、8mU)、UDP−Gal(0.6mg、0.923umol)、コア1 Gal T(20ul、10mU)、CMP−SA−PEG(20K)(1mg、0.05umol)、St3GalII(20ul、28mU)、100mM MnCl2 3ulと混合した。室温で24時間、得られた混合物を揺り動かした。グリコPEG化に続いてSDS−PAGEを行った。
GalNAc2−MATP−G−CSF(54ug)を、以下の4種の緩衝液系(1.1M MES緩衝液(pH6.0);2.25mM MES緩衝液(pH6.0);3.50mM Bis−Tris緩衝液(pH6.5);4.1M HEPS緩衝液(pH7.4)にバッファー交換した。次に、CMP−SA−PEG(20K)(216ug)ST6GalNAcI(BV、1U/mL、2.5ul)、100mM MnCl2 2.5ulを加えた。室温で24時間、得られた混合物を揺り動かした。SDS−PAGEゲルを用いてこの反応を追跡した。
12.4e1 St6GalNAcIの使用
第1のステップ:3500gで限外ろ過(MWCO5K)することによって30mlのKJ−675−159溶液(0.18mg/ml、タンパク質総量5.4mg)を濃縮し、次いで、25mM MES緩衝液(pH6.0)でバッファー交換した。プラスチック製チューブ中で最終体積を5.4mlに調整した。GalNAc−T2(1.0U/ml、50ul)を加え、続いて、0.25mLのMnCl2を添加した。32℃で24時間、得られた混合物を揺り動かした。MALDIにより、反応が完了したことが示唆された。この反応混合物をUF(MWCO5K)によって濃縮し、25mM MES緩衝液で5mlに希釈し、次に、CMP−SA−PEG(20K)(2×25mg)、ST6GalNAcI(BV、lU/ml)、100mM MnCl2 0.25mlを加えた。32℃で一晩、得られた混合物を揺り動かした。この反応に対してSDS−PAGEを使用した。
200ulの25mM MES緩衝液(pH6.0)に溶かした200ugのGalNAc2−MATP−G−CSFを、UDP−Gal 0.6mgおよびコア GalT(0.2U/ml、10ul)ならびに10ulの100mM MnCl2と混合した。32℃で24時間、得られた混合物を揺り動かした。この反応混合物をUF(MWCO 5K)によって濃縮し、25mM MES緩衝液で200ulに希釈した。CMP−SA−PEG(800ug)、St3GalII(1.0U/ml、10ul))、100mM MnCl2 10ulを加えた。室温で24時間、得られた混合物を揺り動かした。32℃で一晩、得られた混合物を揺り動かした。SDS−PAGEゲルを用いてこの反応を追跡した。
MAPTP−G−CSF溶液(540ug)を濃縮して、1M MES緩衝液(pH6.0)でバッファー交換し、50ulに調整した。次いで、UDP−GalNAc(100ug、0.15umol、5当量)、GalNAcT2(5.0U/ml、5ul)および100mM MnCl2(5ul)を加えた。室温で一晩、得られた混合物を揺り動かした。次に、CMP−SA−PEG(20K)(2.16mg、0.108umol)およびSt6GalNAcI(1.0U/ml、50ul)を加えた。室温で60時間、この溶液を揺り動かした。追加のCMP−SA−PEG(20K)(2.16mg、0.108umol)およびSt6GalNAcI(1.0U/ml、50ul)を加え、次いで、室温で24時間ゆっくり回転させた。反応混合物を緩衝液A(25mM NaOAc、0.005%ポリソルベート80、pH4.5)でバッファー交換し、次に、Amersham社製のSP−FF(5mL)カラムで、100%Aの定組成溶離を10分間、続いて、100%Aから20%B(B=25mM NaOAc、2M NaCl、0.005%ポリソルベート80、pH4.5)までの直線濃度勾配溶離を20分間にわたって流速3mL/分で行い、精製した。保持時間17分でのピーク画分をため、0.5mlに濃縮し、Amersham社製HiLoad Superdex200(16×600mm、34μm)で、リン酸緩衝化生理食塩水、pH5.0、0.005%Tween80を用いて、流速0.4mL/分でさらにそれを精製した。保持時間160分の生成物画分をため、濃縮して30ugのMAPT−G−CSF−(GalNAc−SA−PEG(20K))2(BCA)を得た。収率は最適化されなかった。
変異G−CSF−1
変異G−CSF−2
変異G−CSF−3
変異G−CSF−4(C末端タグ)
変異G−CSF−5(N末端MIATP)
変異G−CSF−6(177Mer)
大腸菌で発現させたヒト組換G−CSF
N末端メチオニンを有する192アミノ酸の脳下垂体由来野生型hGH
N末端メチオニンを欠いた191アミノ酸の脳下垂体由来野生型hGH
MVTP変異体
PTOGAMP変異体
TTT変異体
MAPT変異体
NTG変異体
TTT変異体の場合、GalNAcを付加すると、非グリコシル化種、ならびに1−GalNAcおよび2−GalNAc種の複合混合物が生じた。ペプチドマッピング実験(トリプシン消化)は、2つのGalNAcがTTT変異を含むT12ペプチド(L129〜K141)に付加されていることを示した。MALDI−MSにより、(M)VTP変異体では、ごく微量のGalNAcしか付加していないことが示された。
PTQGAMP変異体は、UDP−GalNAcおよびGalNAcT2によって容易にグリコシル化され、次に、CMP−SA−PEG−30KDaおよびST6GalNAcIによってグリコPEG化され、その際、10mgのスケールで1.45mgの精製hGH−(PTQGAMP)−GalNAc−SA−PEG−30KDaを生じる。ペプチドマッピング実験(トリプシン消化)により、GalNAcは、PTQGAMP変異を有するトリプシンT12ペプチド(L129〜K141)上に配置された。
GM−CSF(1mg)を25mM MES緩衝液(1mL)(pH6.0、0.005%NaN3)中に溶解し、次いで、UDP−GalNAc(1mg)、GalNAc−T2(200μL、0.38U/mL、0.076U)、100mM MnCl2(80μL)を加えた。得られた混合物を室温で72時間インキュベートした。MALDIにより、GalNAc2−GM−CSFが形成されていることが示唆された。
Claims (12)
- 変異ペプチド配列を含む単離されたG−CSFポリペプチドであって、前記変異ペプチド配列が、前記単離されたポリペプチドに対応する野生型ポリペプチドには存在しないO結合型グリコシル化部位を含み、且つ、前記変異ペプチド配列が、GalNAcトランスフェラーゼであるGalNAc−T2にGalNAc受容体として認識される配列であり、前記変異ペプチド配列は、M 1 APTPLGPAであり、
前記O結合型グリコシル化部位は、プロリン残基に隣接している、単離されたG−CSFポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含む発現カセット。
- 請求項2に記載の核酸を含む細胞。
- 以下から選択される式を有する、請求項1に記載のポリペプチド
(式中、AAは、前記変異ペプチド配列の内部にある、ヒドロキシル部分を含むアミノ酸側鎖であり、Xは、修飾基またはサッカリル部分である)。 - Xが、シアリル、ガラクトシル、およびGal−Sia部分から選択される基を含み、前記シアリル、ガラクトシル、およびGal−Siaのうちの少なくとも1つが修飾基を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
- Xが以下の部分
(式中、Dは、−OHおよびR1−L−HN−から選択されるメンバーであり、
Gは、R1−L−および−C(O)(C1〜C6)アルキルから選択されるメンバーであり、
R1は、直鎖状または分枝状のポリ(エチレングリコール)残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Lは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
DがOHであるとき、GはR1−L−であり、Gが−C(O)(C1〜C6)アルキルであるとき、DはR1−L−NH−である)
を含む、請求項5に記載のポリペプチド。 - Xが以下の構造体
(式中、Lは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、nは、0〜500の整数から選択される)
を含む、請求項5に記載のポリペプチド。 - Xが以下の構造体
(式中、sは、0〜20の整数から選択される)
を含む、請求項5に記載のポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドの複合糖質を作製する方法であって、
(a)遺伝子組換えによって請求項1に記載のポリペプチドを生産するステップと、
(b)前記O結合型グリコシル化部位において、修飾された糖で前記ポリペプチドを酵素的にグリコシル化するステップと、を含む方法。 - 修飾された糖と複合糖質を形成している請求項1に記載のポリペプチドを有効量含む、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を含む医薬組成物。
- 前記修飾された糖が、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール(m−PEG)から選択されるメンバーで修飾されている、請求項11に記載の医薬組成物。
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