CN101072789A - 肽的o－连接的糖基化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含不存在于野生型肽中的O－连接的糖基化位点的多肽。本发明的多肽包括糖缀合物，在所述缀合物中，种类例如可溶于水的聚合物、生物分子的治疗剂通过完整的O－连接的糖基残基共价地连接至多肽。也提供了制备本发明的肽的方法和制备含有所述肽的药物组合物的方法，和通过施用足以达到想要的反应的量的本发明的肽来在哺乳动物中治疗、减轻或预防疾病的方法。

Description

肽的O-连接的糖基化
               相关申请的交叉引用
本发明涉及2004年1月8日提交的美国临时专利申请号60/535,284，2004年2月12日提交的美国临时专利申请号60/544,411；2004年2月20日提交的美国临时专利申请60/546,631，2004年3月23日提交的美国临时专利申请60/555,813；2004年5月12日提交的美国临时专利申请60/570,891；各申请以其全文在此引用作为参考。
发明领域
本发明涉及O-连接的糖基化的糖肽，特别是包含在野生型肽中不存在的O-连接的糖基化位点的治疗性肽和肽突变体。
产生特定生理反应的糖基化和未糖基化肽的施用在医疗领域是熟知的。例如，纯化的和重组的hGH都用于治疗由于缺乏hGH而引起的病症和疾病，例如，儿童中的侏儒症，干扰素具有已知的抗病毒活性，粒细胞集落刺激因子刺激白细胞的产生。
限制治疗性肽的主要因素是在对表达系统进行基因工程改造以表达野生型肽的糖基化模式中固有的困难。如本领域已知的，不恰当或不完全糖基化的肽可具有免疫原性，导致肽的中和和/或导致过敏应答的产生。通过重组产生的糖肽的其他缺陷包括亚最优的潜能和快速的清除速率。
解决糖基化肽治疗剂生产中的固有问题的一个方法是在肽表达后在体外对其进行修饰。表达后体外修饰已用于修饰多糖结构和在新位点上引入聚糖。已经可以获得重组真核生物糖基转移酶的综合工具箱，这使得可能在体外酶促合成具这样的哺乳动物糖缀合物，即其具有按定制设计的糖基化模式和糖基结构。参见，例如美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577和WO/9831826；US2003180835和WO 03/031464。
除了控制多肽上糖基的结构外，还可用一种或多种非糖修饰性基团，例如可溶于水的聚合物制备糖肽。已被缀合至肽上的示例性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。已证明使用PEG衍生肽治疗剂可降低肽的免疫原性。例如，美国专利号4,179,337(Davis等人)公开了无免疫原性的多肽例如和聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。除了减少免疫原性外，由于所述多肽的PEG缀合物的大小增加，延长了其在循环中的清除时间。
PEG和其衍生物附着至多肽的基本模式是通过肽氨基酸残基的非特异性键合(参见例如，美国专利号4,088,538、美国专利号4,496,689、美国专利号4,414,147、美国专利号4,055,635和PCT WO87/00056)。将PEG附着至肽的另外的模式是通过糖肽上的糖基残基的非特异性氧化(参见例如，WO94/05332)。
在这些非特异性的方法中，以随机、非特异性的方式将聚(乙二醇)加到肽主链上的反应性残基上。当然，PEG分子的随机加入具有其缺点，包括缺少终产物的均一性，和可能降低肽的生物学或酶活性。因此，为了产生治疗性肽，导致特异性标记、可容易地表征、基本上均一的产物的形成的衍生策略是优选的。
可通过酶的作用在体外产生特异性标记、均一的肽治疗剂。和将合成的聚合物或其他标记物附着至肽上的典型的非特异性方法不同，基于酶的合成法具有区域选择性和立体选择性的有利方面。用于被标记的肽的合成的两种主要类型的酶是糖基转移酶(例如，唾酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖氨基转移酶)和糖苷酶。这些酶可用于糖的特异性附着，所述糖随后可被修饰，从而包含治疗性部分。可选择地，糖基转移酶和经修饰的糖苷酶可直接用于将经修饰的糖转移至肽主链(参见例如，美国专利6,399,336、美国专利申请公开号20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，其各在此引用作为参考)。将化学和酶促合成的组分结合的方法也是已知的(参见例如，Yamamoto等人Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和美国专利申请公开号20040137557，其在此引用作为参考)。
以几种方法将糖附着至糖肽上，在所述方法中，通过N连接的天冬酰胺和粘蛋白型的O连接的丝氨酸和苏氨酸是与重组糖蛋白治疗剂最密切相关的。不巧的是，并非所有的多肽都包含作为其一级氨基酸序列的部分的N或O-连接的糖基化位点。在其他情况下，已存在的糖基化位点可能不便于将修饰性基团(例如，水溶性或不溶于水的聚合物，治疗性部分(moiety)和/或生物分子)附着至多肽，或这些部分在该位点的附着可导致多肽生物学活性的不想要的降低。因此，在本领域存在对这样的方法的需要，即其允许糖基化位点的精确生成和精确地指导这些位点的修饰的能力。
                      发明概述
本发明发现酶促糖缀合反应可被特异性地靶向O-连接的糖基化位点和附着至O-连接的糖基化位点的糖基残基。被靶向的O连接的糖基化位点可以是野生型肽的天然位点，或可选择地，可通过突变将其导入肽。因此，本发明提供了包含适合O-连接的糖基化的突变位点的多肽和其药物组合物。此外，本发明提供了制备这些多肽和使用这些多肽和/或其药物组合物进行治疗的方法。
因此，在第一方面，本发明提供了包含突变的肽序列的分离的多肽，其中所述突变的肽序列编码不存在于对应的野生型多肽中的O-连接的糖基化位点。
在一个实施方案中，所述分离的多肽是G-CSF多肽。
在一个实施方案中，G-CSF多肽包含具有式M1XnTPLGP或M1B0PZmXnTPLGP的突变的肽序列。在该实施方案中，上标文字1表示野生型G-CSF序列(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的第一个位置，下标n和m是选自0至3的整数，而X和B中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，并且当X和B中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分本身是独立地选择的。也是在该实施方案中，Z选自谷氨酸，任何不带电荷的氨基酸或二肽组合，包括MQ、GQ和MV。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自MVTPLGP、MQTPLGP、MIATPLGP、MATPLGP、MPTQGAMPLGP、MVQTPLGP、MQSTPLGP、MGQTPLGP、MAPTSSSPLGP、和MAPTPLGPA的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式M1TPXBOrP的突变的肽序列。在该实施方案中上标1表示野生型G-CSF序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的第一个位置，下标r是选自0至3的整数，X、B和O中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，当X、B和O中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分的身份(identity)是独立选择的。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自MTPTLGP、MTPTQLGP、MTPTSLGP、MTPTQGP、MTPTSSP、M1TPQTP、M1TPTGP、M1TPLTP、M1TPNTGP、MTPLGP、M1TPVTP、M1TPMVTP和MT1P2TQGL3G4P5A6S7的突变的肽序列。
在其他实施方案中，G-CSF多肽包含具有式LGX53BoLGI的突变的肽序列，其中上标表示野生型G-CSF氨基酸序列中氨基酸的位置，X是组氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸或酪氨酸，B是苏氨酸或丝氨酸，O是0至3的整数。在其他实施方案中，G-CSF多肽包含选自LGHTLGI、LGSSLGI、LGYSLGI、LGESLGI和LGSTLGI的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式P129ZmJqOrXnPT的突变的肽序列，其中上标表示野生型G-CSF氨基酸序列中氨基酸的位置，Z、J、O和X独立地选自苏氨酸或丝氨酸，m、q、r和n是独立地选自0至3的整数。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自P129ATQPT、P129TLGPT、P129TQGPT、P129TSSPT、P129TQGAPT、P129NTGPT、PALQPTQT、P129ALTPT、P129MVTPT、P129ASSTPT、P129TTQP、P129NTLP、P129TLQP、MAP129ATQPTQGAM和MP129ATTQPTQGAM的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式PZmUsJqP61OrXnBoC的突变的肽序列，其中上标表示野生型G-CSF氨基酸序列中氨基酸的位置，Z、J、O和U中至少一个选自苏氨酸或丝氨酸，当Z、J、O和U中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，其各是独立地选择的，X和B是任何不带电荷的氨基酸或谷氨酸，m、s、q、r、n和o是独立地选至0至3的整数。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自P61TSSC、P61TSSAC、LGIPTAP61LSSC、LGIPTQP61LSSC、LGIPTQGP61LSSC、LGIPQTP61LSSC、LGIPTSP61LSSC、LGIPTSP61LSSC、LGIPTQP61LSSC、LGTPWAP61LSSC、LGTPFAP61LSSC、P61FTP和SLGAP58TAP61LSS的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式ΦaGpJqOrP175XnBoZmUsΨt的突变的肽序列，其中上标表示SEQ ID NO：3中氨基酸的位置，Z、U、O、J、G、Φ、B和X中至少一个是苏氨酸或丝氨酸，并且当Z、U、O、J、G、Φ、B和X中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，其是独立选择的。Φ任选地是R，G任选地是H。符号Ψ表示任何不带电荷的氨基酸残基或谷氨酸，a、p、q、r、n、o、m、s和t是独立地选自0至3的整数。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自  RHLAQTP175、RHLAGQTP175、QP175TQGAMP、RHLAQTP175AM、QP175TSSAP、QP175TSSAP、QP175TQGAMP、QP175TQGAM、QP175TQGA、QP175TVM、QP175NTGP和QP175QTLP的突变的肽序列。
在其他实施方案中，G-CSF多肽包含选自P133TQTAMP139、P133TQGTMP、P133TQGTNP、P133TQGTLP和PALQP133TQTAMPA的突变的肽序列。
在其他实施方案中，分离的多肽是hGH多肽。
在一个实施方案中，hGH多肽包含具有式P133JXBOZUK140QTYS的突变的肽序列，其中上标表示氨基酸在(SEQ ID NO：20)中的位置；J选自苏氨酸和精氨酸；X选自丙氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸；B选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸；O选自酪氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；Z选自异亮氨酸和甲硫氨酸；U选自苯丙氨酸和脯氨酸。在其他实施方案中，hGH多肽包含选自PTTGQIFK、PTTAQIFK、PTTLQIFK、PTTLYVFK、PTTVQIFK、PTTVSIFK、PTTNQIFK、PTTQQIFK、PTATQIFK、PTQGQIFK、PTQGAIFK、PTQGAMFK、PTIGQIFK、PTINQIFK、PTINTIFK、PTILQIFK、PTIVQIFK、PTIQQIFK、PTIAQIFK、P133TTTQIFK140QTYS和P133TQGAMPK140QTYS的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，hGH多肽包含具有式P133RTGQIPTQBYS的突变的肽序列，其中上标表示氨基酸在SEQ ID NO：20中的位置；B选自丙氨酸和苏氨酸。在其他实施方案中，hGH多肽包含选自PRTGQIPTQTYS和PRTGQIPTQAYS的突变的肽序列。
在其他的实施方案中，hGH多肽包含具有式L128XTBOP133UTG的突变的肽序列，其中上标表示SEQ ID NO：20中的氨基酸的位置；X选自谷氨酸、缬氨酸和丙氨酸；B选自谷氨酰胺、谷氨酸和甘氨酸；O选自丝氨酸和苏氨酸；U选自精氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸。在另外的实施方案中，hGH多肽包含选自LETQSP133RTG、LETQSP133STG、LETQSP133ATG、LETQSP133LTG、LETETP133R、LETETP133A、LVTQSP133RTG、LVTETP133RTG、LVTETP133ATG和LATGSP133RTG的突变的肽序列。
在另外的实施方案中，hGH多肽包含具有式M1BPTXnZmOPLSRL的突变的肽序列，其中上标1表示SEQ ID NO：19中的氨基酸的位置；B选自苯丙氨酸、缬氨酸和丙氨酸或其组合；X选自谷氨酸、缬氨酸和脯氨酸，Z是苏氨酸；O选自亮氨酸和异亮氨酸；当X是脯氨酸时，Z是苏氨酸；其中n和m是选自0和2的整数。在其他的实施方案中，hGH多肽包含选自M1FPTE IPLSRL、M1FPTV LPLSRL和M1APTPTIPLSRL的突变的肽序列。
在其他的实施方案中，hGH多肽包含下列突变的肽序列：M1VTPTIPLSRL。
在其他的实施方案中，hGH多肽包含选自M1APTSSPTIPL7SR9和DGSP133NTGQIFK140的突变的肽序列。
在其他实施方案中，分离的多肽是IFNα多肽。
在一个实施方案中，INFα多肽具有包含突变氨基酸序列的肽序列，所述肽序列对应于INFα2的区域，所述区域具有SEQ NO：22所示的序列，其中突变氨基酸序列在对应于INFα2的T106的位点上含有突变。在其他实施方案中，IFNα多肽选自IFNα、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNα8、IFNα10、IFNα14、IFNα16、IFNα17和IFNα21。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVMQEERVTETPLMNADSIL118、99CVMQEEGVTETPLMNADSIL118和99CVMQGVGVTETPLMNADSIL118的突变氨基酸序列的IFNα多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMKEDSIL118的突变氨基酸序列的INFα4多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CMMQEVGVTDTPLMNVDSIL118、99CMMQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CMMQGVGVTDTPLMNVDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα5多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVMQEVWVTGTPLMNEDSIL118、99CVMQEVGVTGTPLMNEDSIL118和99CVMQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα6多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDFIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDFIL118的突变氨基酸序列的IFNα7多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVMQEVGVTESPLMYEDSIL118和99CVMQGVGVTESPLMYEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα8多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα10多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα14多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVTQEVGVTEIPLMNEDSIL118、99CVTQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVTQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα16多肽。在其他实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGMTETPLMNEDSIL118、99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGMTETPLMNEDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα17多肽。在一个实施方案中，IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNVDSIL118的突变氨基酸序列的IFNα21多肽。
在第二方面，本发明提供了编码包含突变的肽序列的多肽的核酸，其中所述突变的肽序列编码不存在于对应的野生型多肽中的O-连接的糖基化位点。在一个实施方案中，表达盒包含编码包含突变的肽序列的多肽的核酸。在其他相关的实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸的细胞。
在第三方面，包含突变的肽序列(编码在对应的野生型多肽中不存在的O-连接的糖基化位点)的分离的多肽具有选自下列的式，
其中AA是氨基酸侧链，该侧链包含存在于突变的多肽序列内的羟基部分；X是修饰性基团或糖基部分。在一个实施方案中，X包含选自唾液酸基(sialyl)、半乳糖基和Gal-Sia部分的基团，其中所述唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia中的至少一个包含修饰性基团。
在其他实施方案中，X包含下列部分：
Figure A20058000647400192
其中D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1是这样的部分，即其包含选自含有直链或分枝的聚(乙二醇)残基的部分的成员；L是这样的连接体，即其是选自键取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基的成员，这样当D是OH时，G是R1-L-，而当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
在其他实施方案中，X包括结构：
其中L是取代的或未取代的烷基或取代的或未取代杂烷基基团；n选自从0至大约500的整数。
在其他实施方案中，X包含结构：
其中s选自从0至20的整数。
在第四方面，本发明提供了制备分离的多肽的糖缀合物的方法，所述分离的多肽包含编码在对应的野生型多肽中不存在的O-连接的糖基化位点的突变的肽序列，其包括步骤：
(a)重组产生突变的多肽，和
(b)通过酶的作用用经修饰的糖在所述O-连接的糖基化位点糖基化所述突变的多肽。
在第五方面，本发明提供了包含突变的肽序列的分离多肽的药物组合物，其中所述突变的肽序列编码在相应的野生型多肽中不存在的O-连接的糖基化位点。
在一个实施方案中，药物组合物包含有效量的用经修饰的糖进行糖缀合的本发明的G-CSF多肽。在相关的实施方案中，经修饰的糖用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员进行修饰。
在其他实施方案中，药物组合物包含有效量的用经修饰的糖进行糖缀合的本发明的hGH多肽。在相关的实施方案中，所述经修饰的糖用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员进行修饰。
在其他实施方案中，药物组合物包含有效量的用经修饰的糖进行糖缀合的本发明的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子多肽。在相关的实施方案中，所述经修饰的糖用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员进行修饰。
在其他实施方案中，药物组合物包含有效量的用经修饰的糖进行糖缀合的本发明的IFNα多肽。在相关的实施方案中，所述经修饰的糖用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员进行修饰。
在第六方面，本发明提供了为需要所述疗法的受试者提供治疗的方法，其中所述方法包括，给所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物。在一个实施方案中，提供的疗法是G-CSF疗法。在其他实施方案中，提供的疗法是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子疗法。在其他实施方案中，提供的治疗法是干扰素α疗法。在其他实施方案中，提供的治疗法是生长激素疗法。
从下面详细的描述中可明显地看出本发明的其他方面，有利方面和目的。
                       附图简述
图1.是NSF-60细胞增殖测定法中未经修饰的G-CSF和糖-PEG化的类似物的吸收率对GCSF浓度的曲线。
图2.是使用放射性碘标记的G-CSF和其糖-PEG化的衍生物的大鼠药物动力学研究的每分钟计数(CPM)对时间的曲线图。
图3.是使用放射性碘标记的G-CSF和其糖-PEG化的衍生物的大鼠药物动力学研究的血液中μg/mL G-CSF对时间(h)的曲线图。
图4.是显示使用未经修饰的G-CSF和化学地-和糖-PEG化的G-CSF在小鼠中诱导白细胞的曲线图。
图5.是在用Bolton-Hunter试剂放射性碘化后，聚集测定法的结果的曲线图。
图6.是糖-PEG化G-CSF的加速稳定性研究的结果的曲线图。
图7.是图6的展开图。
图8.是使用Bolton-Hunter放射性标记方法进行(经沉淀的血浆蛋白)的大鼠IV pK研究的结果的曲线图。
图9.是通过ELISA检测的使用未标记的G-CSF，化学-和糖-PEG化的G-CSF进行的大鼠IV pK研究的结果的曲线图。
图10.显示用于本发明的代表性唾酸转移酶。
                    发明详述
缩写
PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖氨基；Glc，葡糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖氨基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖氨基乙酸；Sia，唾液酸；和NeuAc，N-乙酰神经氨酸基(acetylneuraminyl)。
定义
除非另外定义，所有此处使用的技术和科学术语通常具有和本发明所属的领域内的技术人员一般理解的意思相同的意思。一般地，此处使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学及杂交中的实验室方法是在本领域中熟知和普遍使用的方法。使用标准的技术合成核酸和肽。一般按照本领域的常规方法和各种参考资料(通常参见，Sambrook等人MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，其在此处引用作为参考)的常规方法进行所述技术和方法，所述参考资料由该文献提供。此处使用的命名法和下面描述的分析化学和有机合成中的实验室方法是本领域熟知和普遍使用的方法。标准的技术或其修饰用于化学合成和化学分析。
所有此处描述的寡糖的名称或缩写如下：非还原性糖(即，Gal)，其后为糖苷键(α或β)的构型、环键(1或2)、参与键的还原性糖的环位置(2，3，4，6或8)，然后是还原性糖(即，GlcNAc)的名称或缩写。各糖优选地是吡喃糖。关于标准的糖生物学命名法的综述，参见，Essentials of Glycobiology Varki等人(编者)CSHL Press(1999)。
无论在还原性末端的糖事实上是否是还原性糖，都认为寡糖具有还原性末端和非还原性末端。按照接受的命名法，此处在左边用非还原末端而在右边用还原性末端来描述寡糖。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其多聚体。除非明确地限制，所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸和参照核酸具有相似的结合特性并且以和天然发生的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，特定的核酸序列也隐含包括其经保守地修饰的变体(例如，简并密码子替代物)、等位基因、直向同源物(ortholog)、SNPs和互补序列以及明确指明的序列。特别地，简并密码子替代物可通过产生这样的序列获得，即在所述序列中，一个或多个被选择的(或所有的)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可和基因、由基因编码的cDNA和mRNA互换使用。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA的区段。其可包括在编码区之前和之后的区域(前导序列和非转录尾区)以及各编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
术语“分离的”，当用于核酸或蛋白时，是指基本上不含在天然状态下与其相联的其他细胞成分的核酸或蛋白。其优选地以均一状态存在，尽管其可以无水的形式或水溶液形式存在。通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定纯度和均一性。作为制剂中存在的最主要的种类的蛋白是基本纯化的。特别地，分离的基因与开放阅读框分离，所述阅读框侧翼连接所述基因和编码除了目的基因的蛋白。术语“纯化的”是指核酸或蛋白在电泳凝胶上基本上产生一条带。特别地，其是指核酸或蛋白至少达到85％的纯度，更优选地达到至少95％的纯度，和最优选地达到至少99％的纯度。
术语“氨基酸”是指天然发生的和合成的氨基酸，以及以和天然发生的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，和以后经修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指和天然发生的氨基酸具有相同基本结构(即，和氢、羧基、氨基以及R基团连接的α碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、二甲亚砜甲硫氨酸(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基锍(methioninemethyl sulfonium)。这些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持和天然发生的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有和氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以和天然发生的氨基酸相同的方式起作用的化合物。
本领域有各种已知的允许非天然氨基酸衍生物或类似物以位点专一性的方式整合入多肽链中的方法，参见，例如，WO 02/086075。
氨基酸在此处通过普遍已知的三字母符号表示或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过其普遍接受的单字母代码表示。
“保守地修饰的变体”用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，“保守地修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能性一致的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子确定丙氨酸的每一个位点上，可将密码子改变成所述的对应密码子中的任意一个而不改变被编码的肽。这些核酸变异是“沉默变异”，其是保守性修饰的变异中的一种。此处每一个编码多肽的核酸序列也描述了每一种可能的核酸的沉默变异。本领域技术人员认识到可修饰核酸中的每一个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能性相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异蕴含在各描述的序列中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员承认在被编码的序列中改变、加入或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个替代、缺失或加入是“经保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替代。提供功能上相似的氨基酸的保守替代的目录在本领域是熟知的。这些经保守修饰的变体是对本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，但不排除它们。
下列8组，各组包含相互间保守替代的氨基酸：
1)  丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)  天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)  天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)  精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)  异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)  苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)  丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)  半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。
此处氨基酸也可由其普遍已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样核苷酸可由其普遍接受的单字母代码表示。
在本申请中，根据氨基酸残基与未经修饰的野生型多肽序列的最N端的残基(被编号为1)相对位置对其进行编号。
“肽”是指这样的多聚体，即在所述多聚物中，单体是氨基酸，单体通过酰胺键连接起来。本发明的肽在大小上可发生变化，例如从两个氨基酸至成百或上千个氨基酸，可选择地其称作多肽。此外，也包括非天然的氨基酸，例如，β丙氨酸、苯丙氨酸和高精氨酸。非基因编码的氨基酸也可用于本发明。此外，经修饰从而包含反应性基团、糖基化位点、聚合物、治疗性部分、生物分子等的氨基酸也可用于本发明。用于本发明的所有氨基酸可以是D型或L型异构体。L型异构体通常是优选的。另外，其他肽模拟物也用于本发明。如此处所用的，“肽”是指糖基化的和未糖基化的肽。肽也包括这样的肽，即其被表达该肽的系统不完全地糖基化。关于综述，参见，Spatola，A.F.，inCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES ANDPROTEINS，B.Weinstein，(编者)，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
在本发明中，按照氨基酸残基和肽序列中N末端例如最左端残基(被编号为1)的相对位置对其进行编号。
术语“突变型多肽”或“突变蛋白”是指这样的肽形式，即其不同于其对应的野生型形式或天然存在的形式。突变型肽可包含一种或多种导致突变型肽的突变，例如替代、插入、缺失等。
术语“肽缀合物”，是指本发明的种类，其中，肽被此处所示的经修饰的糖缀合。在代表性例子中，肽是具有在野生型肽中不存在的O-连接的糖基化位点的突变型肽。
此处使用的“接近脯氨酸残基”是指氨基酸离脯氨酸残基少于大约10个氨基酸，优选地离脯氨酸残基少于大约9、8、7、6或5个氨基酸、更优选地离脯氨酸大约少于4、3、2或1个残基。“接近脯氨酸残基”的氨基酸可以在脯氨酸残基的C端或N端一侧。
术语“唾液酸”是指9碳羧基化的糖的家族的任何成员。唾液酸家族的最普通的成员是N-乙酰-神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-galactononulopyranos-1-酮酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。家族的第二成员是N-乙醇酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N乙酰基被羟化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonicacid(KDN)(Nadano等人，(1986)J：Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等人，J Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸例如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见，例如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R. Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。在1992年10月1日公开的国际公开号WO 92/16640中公开了唾液酸化方法中的唾液酸化合物的合成和用途。
如此处所用的，术语“经修饰的糖”是指在本发明的方法中通过酶的作用加到肽上的氨基酸或糖基残基上的天然发生的或非天然发生的糖。经修饰的糖选自许多酶的底物，其包括但不限于糖核苷酸(单、二和三磷酸)、经活化的糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸)和既非活化的也非核苷酸的糖。“经修饰的糖”被“修饰性部分”共价官能化。有用的修饰性基团包括但不限于可溶于水的聚合物、治疗性部分、诊断部分、生物分子等。修饰性部分优选地不是天然发生的或未经修饰的糖。选择用修饰性部分官能化的位置以使其不阻碍“经修饰的糖”通过酶的作用被加到肽上。
术语“可溶于水的”是指在水中具有某种可检测程度的溶解度的部分。检测和/或定量水溶解度的方法在本领域是熟知的。示例性可溶于水的聚合物包括肽、糖类、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可具有混合序列或由单一氨基酸组成，例如聚(赖氨酸)。示例性多糖是聚(唾液酸)。示例性聚(醚)是聚(乙二醇)，例如，m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，应当理解其他相关的聚合物也适合用于本发明的实践中并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用在该方面是包含性的而不是排他性的。术语PEG包括以任何形式存在的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、分叉PEG(forked PEG)、分枝PEG(branched PEG)、悬挂PEG(pendent PEG)(即具有一个或多个悬挂于聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)、或在其上具有可降解的键的PEG。
聚合物主链可以是线性的或分枝的。分枝的聚合物主链通常在本领域是已知的。一般地，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心连接的线性聚合物链。PEG通常以这样的分枝形式使用，该分枝形式可通过向多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇中加入氧化乙烯进行制备。中心分枝部分也可来源于几种氨基酸例如赖氨酸。分枝聚(乙二醇)可用通式R(-PEG-OH)m表示，其中R表示核心部分例如甘油或季戊四醇，m表示臂的数目。多臂PEG分子，例如美国专利号5,932,462中描述的分子(在此以其全文引用作为参考)，也可用作聚合物主链。
许多其他的聚合物也适合用于本发明。具有2至大约300个末端的非肽和水溶性的聚合物主链特别适用于本发明。合适的聚合物的例子包括，但不限于，例如美国专利号5,629,384(此处以其全文引用作为参考)中描述的，其他聚(亚烷基二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)，和其共聚物、三元共聚物和混合物。尽管各聚合物主链的分子量可发生变化，其一般在大约100Da至大约100,000Da、但通常在大约6,000Da至大约80,000Da的范围内变化。
此处使用的术语“糖缀合”是指通过酶促介导的经修饰的糖类至多肽(例如本发明的突变的人生长激素)的氨基酸或糖基残基的缀合。“糖缀合”的下位概念是“糖-PEG化”，其中经修饰的糖的修饰性基团是聚(乙二醇)和其烷基衍生物(例如，m-PEG)或反应性衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
术语“大规模”和“工业规模”可交换使用，并且是指在单个反应循环中产生至少大约250mg、优选地至少大约500mg和最优选地至少大约1克的糖缀合物的反应循环。
此处所使用的术语“糖基连接性基团”是指修饰性基团(例如，PEG部分、治疗性部分、生物分子)共价附着的糖基残基；糖基连接性基团将修饰性基团连接至缀合物的其余部分。在本发明的方法中，“糖基连接性基团”共价地附着至糖基化的或未糖基化的肽上，从而将试剂连接至肽上的氨基酸和/或糖基残基上。通常通过将“经修饰的糖”经酶的作用附着至肽的氨基酸和/或糖残基，从而从所述“经修饰的糖”产生“糖基连接性基团”。糖连接性基团可以是来源于糖的结构，该结构在修饰性基团-经修饰的糖盒的形成过程(例如，氧化→希夫碱形成→还原)中被降解，或者糖基连接性基团可以是完整的。“完整的糖基连接性基团”是指这样的连接性部分，即其来源于糖基部分，其中连接修饰性基团并将其连接至缀合物的其余部分的糖单体不被降解，例如，被例如偏过碘酸钠氧化。通过加入糖基单位或从从亲本糖结构除去一个或多个糖基单位，本发明的“完整的糖基连接性基团”可来源于天然发生的寡糖。
此处所用的术语“靶向性部分”，是指选择性地位于身体的特定组织或区域的种类。定位是通过分子决定簇的特异性识别、靶向性试剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等来介导的。将试剂靶向特定的组织或区域的其他机制对本领域技术人员来说是已知的。示例性靶向性部分包括抗体、抗体片段、运铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、EPO等。
如此处所用的，“治疗性部分”是指用于治疗的任何试剂，其包括但不限于，抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性试剂。“治疗性部分”包括生物活性剂的前药、其中超过一个治疗性部分和载体结合的构建体，例如，多价试剂。治疗性部分也包括蛋白和包含蛋白的构建体。示例性蛋白包括，但不限于，促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子  (GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(例如，干扰素-α、-β、-γ)、白细胞介素(例如，白细胞介素II)、血清蛋白(例如，因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成激素(LH)以及抗体融合蛋白(例如肿瘤坏死因子受体((TNFR)/Fc结构域融合蛋白))。
如此处所用的，“抗肿瘤药物”是指任何用于抗癌的试剂，包括但不限于，细胞毒素和试剂例如抗代谢物、烷化剂、  蒽环霉素、抗生素、抗有丝分裂的药物、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、干扰素和放射性药物。术语“抗肿瘤药物”也包括具有抗肿瘤活性的肽例如TNF-α的缀合物。缀合物包括，但不限于本发明的治疗性蛋白和糖蛋白之间形成的缀合物。代表性的缀合物是PSGL-1和TNF-α之间形成的缀合物。
如此处使用的，“细胞毒素或细胞毒剂”是指对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、嗅乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、dihydroxyanthracinedione、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌罗霉素和其类似物或同源物。其他毒素包括，例如，蓖麻毒蛋白、CC-1065和类似物，duocarmycins。其他毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如，眼镜蛇毒)。
如此处所用的，“放射性试剂”包括在诊断或破坏肿瘤中有效的任何放射性同位素。例子包括，但不限于，铟-111、钴-60。此外，天然发生的放射性元素例如通常表现为放射性同位素的混合物的铀、镭和钍，是放射性试剂的合适例子。通常用有机螯合部分螯合金属离子。
许多有用的螯合基团、冠醚、穴状配体等在本领域是已知的并且可被整合入本发明的化合物(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等和其磷酸盐类似物例如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等)中。参见，例如，Pitt等人，“The Design of Chelating Agents for the Treatmentof Iron Overload，”In，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY ANDMEDICINE；Martell，Ed.；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，以及其中所引用的参考文献。
此外，本领域技术人员可获得可使螯合剂、冠醚和环糊精附着至其他分子的许多途径。参见，例如，Meares等人，“Properties ofIn Vivo Chelate-Tagged  Proteins and Polypeptides.”In，MODIFICATION OF PROTEINS：FOOD，NUTRITIONAL，ANDPHARMACOLOGICAL ASPECTS；″Feeney，等人，(编者)，AmericanChemical Society，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Bioconjugate Chem.，9：108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.，8：249-255(1997)。
如此处所用的，“药物可接受载体”包括任何这样的材料，即当其和缀合物组合时，保持所述缀合物的活性并且和受试者的免疫系统是非反应性的。例子包括，但不限于，任何一种标准的药物载体例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液例如油/水乳液，和各种类型润湿剂。其他载体也可包括无菌溶液、片剂，包括经包被的片剂和胶囊剂。通常这些载体包含赋形剂例如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、二元醇或其他已知的赋形剂。这些载体也可包括香料和颜色添加剂或其他成分。通过熟知的常规方法配制包含这些载体的组合物。
如此处所用的，“施用”是指口服施用、作为栓剂、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内或皮下施用、通过吸入或缓释装置例如微型渗透泵的植入给受试者施用。施用可通过任何途径进行，包括肠胃外和经粘膜(例如，经口、经鼻、经阴道、经直肠或经皮肤)，特别是吸入施用。肠胃外施用包括，例如，静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。此外，当注射用于治疗肿瘤例如诱导凋亡时，可直接对肿瘤和/或围绕肿瘤的组织进行施用。其他递送方式包括，但不限于，使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。
术语“改善”是指病理学或病症治疗上成功的任何标志，包括任何客观或主观参数例如症状的消除、缓解或减轻或患者的身体或心理健康的改善。症状的改善可以基于客观或主观参数；包括体检和/或精神病学鉴定的结果。
术语“治疗”是指疾病或病症的“医治”或“治疗”，包括预防在动物发生疾病或病症(预防性治疗)(所述动物是易于感染疾病但还未经历或表现疾病的症状的动物)、抑制疾病(减缓或阻止其发展)、减轻症状或疾病的负作用(包括姑息治疗)和缓和疾病(使疾病减退)。
术语“有效量”或“对......有效的量”或“治疗上有效的量”或任何语法上等同的术语是指这样的量，即以所述量当给动物施用以治疗疾病时，其足以对该疾病产生有效的治疗。
术语“分离的”是指这样的物质，即其大致上或基本上不含有用于产生所述物质的组分。对于本发明的肽缀合物，术语“分离的”是指基本上或大致上不含有这样的组分的物质，即所述组分通常在用于制备所述肽缀合物的混合物中伴随着所述物质。“分离的”和“纯化的”可相互交换使用。一般地，本发明的分离的肽缀合物具有优选地以范围表示的纯度水平。对于肽缀合物，纯度变化范围的下限是大约60％、大约70％或大约80％，纯度范围的上限是大约70％、大约80％、大约90％或超过大约90％。
当肽缀合物超过大约90％的纯度时，其纯度也优选以范围表示。纯度的范围的下限是大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。纯度的范围的上限是大约92％、大约94％、大约96％或大约98％或大约100％的纯度。
通过任何本领域公认的分析方法(例如，银染凝胶上的条带密度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC或相似的方法)确定纯度。
此处使用的“群体的基本上每一个成员”描述了本发明的肽缀合物的群体的特征，在所述肽缀合物的群体中，将所选择的百分比的被加到肽上的经修饰的糖加到肽上的多个、一致的受体位点。“群体的基本上每一个成员”是指肽上的缀合至经修饰的糖的位点的“均一性”，是指本发明的缀合物，其具有至少大约80％、优选地至少大约90％和更优选地至少大约95％的均一性。
“均一性”是指和经修饰的糖缀合的受体部分的整个群体的结构一致性。因此，在本发明的肽缀合物中(在所述肽缀合物中，各经修饰的糖部分缀合至受体位点，所述受体位点具有和每一个其他经修饰的糖缀合的受体位点的结构相同的结构)，肽缀合物具有大约100％的均一性。均一性通常以范围表示。肽缀合物的均一性范围的下限是大约60％、大约70％或大约80％，纯度的范围的上限是大约70％、大约80％、大约90％或超过大约90％。
当肽缀合物超过或等于大约90％的均一性时，其均一性也优选地以范围表示。均一性范围的下限是大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。纯度范围的上限是大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约100％的均一性。一般通过本领域技术人员已知的一种或多种方法例如液相色谱质谱(LC-MS)、基质辅助的激光解析质量飞行时间质谱(MALDITOF)、毛细管电泳等来确定肽缀合物的纯度。
“基本上一致的糖形式”或“基本上一致的糖基化模式”，当涉及糖肽种类时，是指被目的糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体部分的百分比。
例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况下，如果基本上所有的(如下面所定义的)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸基化的类似物在本发明的肽缀合物中被岩藻糖基化，那么存在基本上一致的岩藻糖基化模式。本领域技术人员理解，起始物质可含有糖基化的受体部分(例如，岩藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算的糖基化百分比将包括由本发明的方法糖基化的受体部分和在起始物质中已经糖基化的受体部分。
在上面“基本上一致”的定义中的术语“基本上”通常是指对于特定的糖基转移酶，至少大约40％、至少大约70％、至少大约80％、或更优选地至少大约90％和更优选地至少大约95％的受体部分被糖基化。
当通过其常规的化学式(从左至右书写)表示取代基团时，其同样包括化学上相同的取代基，其通过从右向左书写结构来表示，例如，-CH2O-也用于表示-OCH2-。
除非另外指出，术语“烷基”，其自身或作为另外的取代基的部分是指直链或支链，或环状烃基，或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，可以包括二和多价具有指明的碳原子数目(即C1-C10表示1至10个碳原子)的基团。饱和烃基的例子包括，但不限于这样的基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、其同系物和异构体例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的例子包括，但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，和高级同系物和异构体。术语“烷基”，除非另外指出，也包括下面更详细地定义的烷基的衍生物，例如“杂烷基”。限定于烃基团的烷基称为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”，其自身或作为另外的取代基的部分是指来源于烷的二价基，例如，但不限于，-CH2CH2CH2CH2-，其还包括在下面被描述为“杂亚烷基”的基团。通常，烷基(或亚烷基)具有1至24个碳原子，具有10个或更少的碳原子的基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是具有更短链的烷基或亚烷基，其通常具有8个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)使用其常规的意思，指分别通过氧原子、氨基基团或硫原子附着至分子的其余部分的烷基。
除非另外说明，术语“杂烷基”，其自身或其与其他术语、意义的组合，是指由指明数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子构成的稳定的直链或支链、或环状烃基、或其组合，其中氮和硫原子可任选地被氧化，氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N和S和Si可被置于杂烷基的任何内部位置或置于这样的位置，即在该位置上烷基附着至分子的其余部分。例子包括，但不限于，-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。可以高达两个连续的杂原子，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”，其自身或作为其他取代基的部分是指来源于杂烷基的二价基团，例如，但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。
对于杂亚烷基，杂原子也可以占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接性基团，连接性基团的式的书写方向并不表示连接性基团的方向性。例如，式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
除非另外说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”，其自身或与其他术语组合，分别表示“烷基”和“杂烷基”的环形形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据在这样的位置，即在该位置上杂环附着至分子的其余部分。环烷基的例子包括，但不限于，环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括，但不限于，1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外说明，术语“卤代”或“卤素”，其自身或作为其他取代基的部分，是指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语例如“卤烷基”是指包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”是指包括，但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另外说明，术语“芳基”是指多不饱和、芳香族的取代基，所述取代基可以是单环或可以是稠合在一起或通过共价键连接的多环(优选地1至3个环)。术语“杂芳基”是指含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。可通过杂原子将杂芳基附着至分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限定性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-_唑基、4-_唑基、2-苯基-4-_唑基、5-_唑基、3-异_唑基、4-异_唑基、5-异_唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2、3-二氢苯并[1、4]二噁烯-6-基、苯并[1、3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上面指出的各芳基和杂芳基环系统的取代基选自下面描述的可接受的取代基。
为了简洁，术语“芳基”，当与其他术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、烷芳基)联用时，包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”包括这样的基团，即在该基团中芳基附着至烷基(例如，苯基、苯乙基、吡啶甲基等)，所述烷基包括这样的烷基，即其中的碳原子(例如，亚甲基)已被例如氧原子取代(例如，苯氧甲基、2-吡啶氧甲基1、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上面术语中的每一个术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括指定的基团的取代的和未取代形式。下面提供各类型基团的优选的取代基。
烷基和杂烷基的取代基(包括通常称作亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)通常称作“烷基取代基”，其可以是一种或多种数目在从0至(2m’+1)范围内变化的多种这样的基团，即所述基团选自，但不限于：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其中m’是该基团的碳原子总数。R′、R″、R_和R″″各优选地独立地是指氢原子、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基，例如用1-3个卤素取代的芳基、取代的或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。例如，当本发明的化合物包括超过一个R基团时，各R基团是独立地选择的，正如各R′、R″、R_和R″″基团一样(当存在超过一个这些基团时)。当R′和R″附着至相同的氮原子上时，其可与氮原子一起形成5-、6-、或7-元环。例如，-NR′R″包括，但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上面取代基的描述，本领域技术人员理解，术语“烷基”包括这样的基团，即其包含和除了氢原子基团以外的基团结合的碳原子，例如卤烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
和描述的烷基的取代基相似，芳基和杂芳基基团的取代基通常称作“芳基取代基”。所述取代基选自，例如：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，其数目在0至芳香环系统上的开放价(open valences)的总数范围内变化；其中R′、R″、R_和R″″优选地独立地选自氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。例如，当本发明的化合物包括超过一个R基团时，各R基团是独立地选择的，正如当存在超过一个R′、R″、R_和R″″基团时对这些基团的选择一样。在下面的示意图中，符号X表示如上描述的“R”。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基任选地可被式为-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，q是0至3的整数。可选择地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基任选地可被式-A-(CH2)r-B-替代，其中A和B独立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，r是1至4的整数。所形成的新环的单键中的一个可任选地由双键替代。可选择地，芳基或杂芳环的相邻原子上的两个取代基任选地可被式-(CRR′)s-X-(CR″R_)d-替代，其中s和d独立地是从0至3的整数，X是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR′-。取代基R、R′、R″和R_优选地独立地选自氢或取代的或未取代的(C1-C6)烷基。
如此处所用的，术语“杂原子”包括氧原子(O)、氮原子(N)、硫原子(S)和硅原子(Si)。
导言
本发明提供了糖肽的缀合物，其中，经修饰的糖部分直接或间接地(例如，经由间隔糖基残基)附着至肽上的O-连接的糖基化位点。也提供了用于产生本发明的缀合物的方法。
O-连接的糖基化位点通常是天然氨基酸(例如，丝氨酸，苏氨酸)或非天然氨基酸(例如，5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)的羟基侧链。示例性O-连接的糖残基包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖。
本发明的方法可用于任何具有O-连接的糖基化位点的肽。例如，所述方法用于产生这样的O-连接的糖缀合物，即在所述O-连接的糖缀合物中，糖基部分附着至在野生型肽中存在的O-连接的糖基化位点。因此，本发明提供了包含O-连接的糖基化位点的野生型肽的糖缀合物。这方面的示例性肽包括G-CSF、GM-CSF、IL-2和干扰素。
在示例性实施方案中，本发明也提供了新的突变型肽，该肽包含一个或多个在相应的野生型肽中不存在的O-连接的糖基化位点。在一个实施方案中，所述突变型肽是G-CSF多肽。在其他示例性实施方案中，突变型多肽是hGH多肽、IFNα多肽或GM-CSF多肽。还提供了突变型肽的O-连接的糖基化形式和制备O-连接的糖基化突变型肽的方法。其他方法包括O-连接的糖基残基和N连接而非O-连接的糖基残基的加工(elaboration)、修剪回(trimming back)和/或修饰。
在示例性方面，本发明提供了具有下式的突变型肽：
其中AA是具有包含羟基部分的侧链的氨基酸。示例性羟基氨基酸是苏氨酸和丝氨酸。GalNAc通过羟基部分的氧原子和AA相连。AA可存在于野生型肽中或，可选择地，可通过对野生型肽序列进行突变将其加入或重新定位。X是修饰性基团，糖基部分，例如，唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia基团，或糖基部分和修饰性部分。在示例性实施方案中(其中X是糖基部分)，其包括修饰性部分，如此处所描述的。糖基化氨基酸可以在N-或C-肽末端或在肽序列的内部。
在示例性实施方案中，X包含选自唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia部分的基团，其中所述唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia中的至少一个包含修饰性基团。在其他示例性实施方案中，X包含下面部分：
Figure A20058000647400391
其中D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1是这样的部分，即其包含选自含有直链或分支的聚(乙二醇)残基的部分的成员；L是选自键、取代的或未取代的烷基以及取代的或未取代的杂烷基的成员，这样当D是OH时，G是R1-L-，而当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
在其他示例性实施方案中X包含下面结构：
Figure A20058000647400392
其中L是取代的或未取代的烷基或取代的或未取代的杂烷基；n选自从0至大约2500的整数。在其他示例性实施方案中，X包含下面结构：
Figure A20058000647400401
其中s选自从0至20的整数。
在其他示例性实施方案中，AA位于突变型肽的富含脯氨酸的区段和/或其靠近脯氨酸残基。通过查询短肽(含有一个或多个假定的O-连接的糖基化位点)的酶促O-连接的糖基化可容易地确定形成O-连接的糖基化位点的合适序列。
在肽和不同的种类例如可溶于水的聚合物、治疗性部分、诊断性部分、靶向性部分等之间形成本发明的缀合物。也提供了包含两个或多个通过连接臂连接在一起的肽的缀合物，即多功能性缀合物；至少一种肽是O-糖基化的或包含突变型O-连接的糖基化位点。本发明的多功能性缀合物可包含两个或多个相同肽的拷贝或具有不同结构和/或特性的不同肽的集合。在本实施方案的示例性缀合物中，两个肽之间的连接体通过O-连接的糖基残基(例如O-连接的糖基的完整的糖基连接基团)附着至至少一个肽上。
通过酶作用将经修饰的糖附着至糖基化或未糖基化的肽上来形成本发明的缀合物。将经修饰的糖直接加至O-连接的糖基化位点，或加至直接或间接(例如，通过一个或多个糖基残基)地附着至O-连接的糖基化位点的糖基残基上。本发明也提供了O-连接的糖基化肽的缀合物，在所述缀合物中，经修饰的糖被直接地附着至N-连接位点，或附着至直接或间接地附着至N-连接糖基化位点上的糖残基上。
经修饰的糖，当置于肽(或糖残基)和糖上的修饰性基团之间时，成为此处称作“完整的糖连接性基团”的基团。通过使用酶例如糖基转移酶的精确的选择性，本方法提供了在一个或多个特定的位点上携带想要的基团的肽。因此，根据本发明，将经修饰的糖直接附着至肽链上的选择的位置上，或可选择地，将经修饰的糖添加在糖肽的糖部分。下面的肽也在本发明的范围之内，即在所述肽中，经修饰的糖被结合至糖肽的糖上和直接地结合至肽主链的氨基酸残基上。
和已知的化学和酶促肽加工策略相反，本发明的方法使得能够组装具有基本均一的衍生模式的肽和糖肽；用于本发明的酶通常对于肽的特定氨基酸残基或氨基酸残基的组合是有选择性的。所述方法也用于经修饰的肽和糖肽的大规模生产。因此，本发明的方法提供了用于具有预先选择的一致的衍生模式的糖肽的大规模生产的实践方法。所述方法特别适用于治疗性肽的修饰，所述治疗性肽包括但不限于，在培养细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物中进行生产的期间被不完全糖基化的糖肽。
本发明的方法也提供了这样的糖基化和未糖基化肽的缀合物，即该缀合物由于例如降低的清除速率、或减少的被免疫或网状内皮组织系统(RES)吸收的速率而具有增加的治疗半衰期。此外，本发明的方法提供了用于屏蔽肽上的抗原决定簇的方法，从而减少或消除了针对所述肽的宿主免疫应答。使用合适的经修饰的糖选择性地将靶向性试剂附着至肽也可用于将肽靶向对于所述特定的靶向性试剂是特异性的特定组织或细胞表面受体。此外，还提供了用通过糖基连接性基团缀合的治疗性部分进行特异性修饰的肽类。
O-糖基化
本发明提供了O-连接的糖基化肽、这些肽类的缀合物以及用于形成O-连接的糖基化肽的方法，所述肽包含选择的氨基酸序列(“O-连接的糖基化位点”)。包含不存在于相应的野生型肽中的O-连接的糖基化位点的突变型肽是特别有益的。O-连接的糖基化位点是具有修饰性基团的糖残基的附着位点。
在所有真核细胞的分泌糖蛋白和与细胞表面结合的糖蛋白中发现粘蛋白型O-连接的糖基化，其是蛋白糖基化的最丰富的形式中的一种。在由O-连接的糖基化产生的结构上存在大量的多样性(数百种潜在的结构)，所述结构是通过存在于高尔基体复合体中的数百种糖基转移酶的催化活性产生的。在聚糖结构的水平上和在O-聚糖与蛋白主链的附着位点上存在多样性。尽管高度的潜在多样性，但很明显O-连接的糖基化是在多细胞生物中显示高度保守性的受到高度调控的过程。
粘蛋白型O-连接的糖基化中的第一步由一个或多个UDP-GalNAc：多肽N乙酰半乳糖氨基转移酶(GalNAc-转移酶)(EC 2.4.1.41)大家族的成员催化，所述转移酶将GalNAc转移至丝氨酸和苏氨酸受体位点(Hassan等人，J.Biol.Chem.275：38197-38205(2000))。目前已鉴定和表征了12个哺乳动物GalNAc-转移酶家族的成员(Schwientek等人，J.Biol.Chem.277：22623-22638(2002))，通过基因组数据库的分析已预测了几个另外的该基因家族的假定成员。GalNAc-转移酶的同种型具有不同的动力学特性和显示时空上的差异表达，暗示着其具有不同的生物学功能(Hassan等人，J.Biol.Chem.275：38197-38205(2000))。GalNAc-转移酶的序列分析导致这样的假说，即这些酶含有两个不同的亚基：中心催化单位，和与植物凝集素篦麻毒蛋白具有序列相似性的C末端单位，称作“凝集素结构域”(Hagen等人，J.Biol.Chem.274：6797-6803(1999)；Hazes，Protein Eng.10：1353-1356(1997)；Breton等人，Curr.Opin.Struct.Biol.9：563-571(1999))。前面的涉及选择的保守性残基的定点诱变的实验确定：催化结构域中的突变消除了催化活性。相反地，“凝集素结构域”中的突变对GalNAc-转移酶同种型GalNAc-T1的催化活性没有显著的影响(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)：47088-96(2002))。因此，据信C末端“凝集素结构域”是无功能的，对GalNAc-转移酶的酶促功能不起作用(Hagen等人，J.Biol.Chem.274：6797-6803(1999))。
然而，近来的证据表明一些GalNAc-转移酶表现出对部分GalNAc-糖基化的糖肽的独特活性。至少三种GalNAc-转移酶同种型GalNAc-T4、-T7和-T10的催化作用选择性地对对应于粘蛋白串联重复结构域的糖肽产生作用，其中只有一些成簇的潜在糖基化位点已被其他GalNAc转移酶GalNAc糖基化(Bennett等人，FEBS Letters460：226-230(1999)；Ten Hagen等人，J.Biol.Chem.276：17395-17404(2001)；Bennett等人，J.Biol.Chem.273：30472-30481(1998)；Ten Hagen等人，J.Biol.Chem.274：27867-27874(1999))。GalNAc-T4和-T7识别不同的GalNAc-糖基化肽并催化GalNAc至除了前面使用的位点以外的受体底物位点的转移。据预测该GalNAc-转移酶活性的其中一个功能是控制具有高密度O-连接的糖基化的粘蛋白样糖蛋白和粘蛋白中O-聚糖的占有密度。
该情况的一个例子是癌症关联粘蛋白MUC1的糖基化。MUC1含有20个残基(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA)(其具有5个潜在的O-连接的糖基化位点)的串联重复糖基化区域。GalNAc-T1、-T2和-T3可起始MUC1串联重复的糖基化并且只在三个位点(HGV TSAPDTRPAPG STAPPA，GalNAc附着位点通过下划线标示)上整合。GalNAc-T4的独特性在于其是迄今为止所鉴定的可将O-连接的聚糖全部附着至乳腺癌关联粘蛋白MUC1的20个氨基酸的串联重复序列中的所有五个受体位点上的唯一的GalNAc-转移酶同种型。GalNAc-T4将GalNAc转移至GalNAc4TAP24糖肽( TAPPAHGV TSAPDTRPAPG STAPP，独特的GalNAc-T4附着位点用斜体标示)上的至少两个没有被其他GalNAc-转移酶同种型使用的位点上(Bennett等人，J.Biol.Chem.273：30472-30481(1998)。活性例如由GalNAc-T4表现的活性似乎是产生由癌细胞表达的MUC1的糖形式所必需的，在所述糖形式中所有潜在的位点都被糖基化(Muller等人，J.Biol.Chem.274：18165-18172(1999))。来自正在哺乳的乳腺的正常MUC1中每个重复具有大约2.6个O-连接的聚糖(Muller等人，J.Biol.Chem.272：24780-24793(1997)，而来源于癌细胞系T47D的MUC1具有每个重复4.8个O-连接的聚糖(Muller等人，J.Biol.Chem.274：18165-18172(1999))。因此，MUC1的癌症关联形式与O-连接的聚糖占据的高密度关联，并且这可通过和GalNAc-T4相同或相似的GalNAc-转移酶活性来实现。
不表现明显的GalNAc-糖肽特异性的多肽GalNAc-转移酶也似乎被其假定的凝集素结构域调节(PCT WO01/85215 A2)。近来发现，类似于前面在GalNAc-T4中所分析的情况(Hassan等人，J.Biol.Chem.275：38197-38205(2000))，GalNAc-T1假定的凝集素结构域中的突变以和GalNAc-T4相似的方式修饰酶的活性。因此，尽管野生型GalNAc-T1给具有多个受体位点的肽底物加上了多个连续的GalNAc残基，但突变的GalNAc-T1却不能给相同的底物加入超过一个GalNAc残基(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)：47088-96(2002))。
因为已经表明GalNAc转移酶可用于产生和由野生型酶产生的糖基化模式不同的糖基化模式，因此使用一种或多种突变的GalNAc转移酶制备本发明的O-连接的糖基化肽在本发明的范围之内。
具有O-连接的糖基化位点的突变肽
本发明提供的肽包含被一种或多种野生型或突变型GalNAc转移酶识别为GalNAc受体的氨基酸序列。对于包含O-连接的糖基化位点的肽，肽的氨基酸序列是野生型的序列、其中导入了非天然发生的O-连接的糖基化位点的突变序列，或是包含天然发生的和非天然发生的O-连接的糖基化位点的多肽。用于本发明实践的示例性肽包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，例如，175和178个氨基酸的野生型(具有或不具有N端甲硫氨酸残基)、干扰素(例如，干扰素α，例如干扰素α2b，或干扰素α2a)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人生长激素和白细胞介素(例如，白细胞介素2)。下列对G-CSF、GM-CSF和IFN-a2β的讨论侧重于示例的阐明。氨基酸的上标中的任何数字表示相对于多肽的N末端甲硫氨酸的氨基酸位置。如果示例性肽起始处无甲硫氨酸，可容易地调整这些数字以反映N末端甲硫氨酸的缺失。要理解示例性肽的N端可以或可不以甲硫氨酸起始。此外，本领域技术人员理解此处所提出的用于制备野生型和突变型肽的O-连接的糖缀合类似物的策略可用于任何肽。
在示例性实施方案中，肽是具有生物学活性的G-CSF突变体，其在选自N末端、与H53、P61、P129、P133和P175相邻或包含H53、P61、P129、P133和P175的位点上包含一个或多个突变。本发明的具有生物学活性的G-CSF突变体包括任何G-CSF多肽，所述G-CSF多肽可以是部分或全长，具有一个或多个这样的突变，即当通过任何本领域技术人员已知的适合的功能测定法测量其生物学活性时，所述突变不导致其生物学活性的显著丧失或完全丧失。在一个实施方案中，本发明的具有生物学活性的G-CSF突变体内的突变位于不在野生型G-CSF中天然发生的一个或多个O-连接的糖基化位点之内。在其他实施方案中，本发明的具有生物学活性的G-CSF突变体内的突变位于G-CSF突变体的一个或多个O-连接的糖基化位点之内或之外。
代表性的野生型和突变型G-CSF多肽具有选自下面的序列：
SEQ.ID NO.1(178个氨基酸的野生型)
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklvseca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.2(无N末端甲硫氨酸的178个氨基酸的野生型)
tplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklvseca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.3(175个氨基酸的野生型)
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.4(无N末端甲硫氨酸的175个氨基酸的野生型)
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.5
mvtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.6
mvtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghtlgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.7
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghtlgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.8
mvtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllgsslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.9
mqtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp；
SEQ.ID NO.10
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllghslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqptqgamp；and
SEQ.ID NO.11
mtplgPasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel
vllgsslgip waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp
elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam pafasafqrr
aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp
SEQ ID NO：12
maitplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg
ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg
vlvashlqsflevsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：13
mgvtetplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk
lchpeelvll ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq
alegispelg ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf
asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：14
maptplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg
ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg
vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：15
Mtptqglgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg
ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg
vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：16
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg
ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapatqptqgampaf asafqrragg
vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：17
Mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipftp lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg
ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapaL qptqgampaf asafqrragg
vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
SEQ ID NO：18
mtplgpasslpqsfllkcleqvrkiqgdgaalqeklcatyklchpeelvllghslgi
pwaplsscpsqalqlagclsqlhsglflyqgllqalegispelgptldtlqldvadfa
ttiwqqmeelgmapalqptqtampafasafqrraggvlvashlqsflevsyrvlr
hlaqp.
在其他示例性实施方案中，肽是具有生物学活性的hGH突变体，所述hGH突变体在选自N末端或与P133相邻或包含P133的位点上包含一个或多个突变。本发明的具有生物学活性的hGH突变体包括任何hGH多肽，所述hGH多肽可以是部分或全长，具有一个或多个这样的突变，即当通过任何本领域技术人员已知的合适的功能测定法测量其生物学活性时，所述突变不导致其生物学活性的显著丧失或完全丧失。在一个实施方案中，本发明的具有生物学活性的hGH突变体内的突变位于不在野生型hGH中天然存在的一个或多个O-连接的糖基化位点之内。在其他实施方案中，本发明的具有生物学活性的hGH突变体内的突变位于hGH突变体的一个或多个O-连接的糖基化位点之内或之外。
代表性野生型和突变型hGH多肽具有选自下面的序列：
SEQ ID NO：19(来源于垂体的包含N末端甲硫氨酸的192个氨基酸的野生型hGH)
mfptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfse
siptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllk
dleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdm
dkvetflrivqcrsvegscgf
SEQ ID NO：20(来源于垂体的缺少N末端甲硫氨酸的191个氨基酸的野生型hGH)
fptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesi
ptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkd
leegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmd
kvetflrivqcrsvegscgf
SEQ ID NO：21(野生型)
MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYI
PKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLE
LLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVY
DLLKDLEEGIQTLMGR LEDGSPRTGQIFKQTYSKFDT
NSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCR
SVEGSCGF
下列是对应于野生型SEQ ID NO：21中下划线标示的区域的代表性的突变肽序列：            LEDGSPTTGQIFKQTYS，
LEDGSPTTAQIFKQTYS，LEDGSPTATQIFKQTYS，LEDGSPTQGAMFKQTYS，
LEDGSPTQGAIFKQTYS，LEDGSPTQGQIFKQTYS，LEDGSPTTLYVFKQTYS，
LEDGSPTINTIFKQTYS，LEDGSPTTVSIFKQTYS，LEDGSPRTGQIPTQTYS，
LEDGSPRTGQIPTQAYS，LEDGSPTTLQIFKQTYS，LETETPRTGQIFKQTYS，
LVTETPRTGQIFKQTYS，LETQSPRTGQIFKQTYS，LVTQSPRTGQIFKQTYS，
LVTETPATGQIFKQTYS，LEDGSPTQGAMPKQTYS，和LEDGSPTTTQIFKQTYS.
在其他示例性实施方案中，肽是具有生物学活性的IFNα突变体，所述突变体在对应于INFα2的T106的位点(例如和INFα野生型中氨基酸位点相邻或包含INFα野生型的氨基酸位点的位点，所述氨基酸位点相应于INFα2的T106或者与所述T106对齐)上包含一个或多个突变。本发明的具有生物学活性的INFα包括任何这样的INFα多肽，即所述INFα多肽可以是部分或全长，具有一个或多个这样的突变，即当通过任何本领域技术人员已知的合适的功能测定法测量其生物学活性时，所述突变不导致其生物学活性的显著或完全丧失。在一个实施方案中，本发明的具有生物学活性的INFα突变体内的突变位于不在野生型INFα中天然存在的一个或多个O-连接的糖基化位点之内。在其他实施方案中，本发明的具有生物学活性的INFα突变体内的突变位于INFα突变体的一个或多个O-连接的糖基化位点之内或之外。
下面显示野生型和突变型INFα多肽：
SEQ ID NO：22(来自野生型IFN 2b)
98CVIQGVGVTETPLMKEDSIL117
可通过制备包含假定的O-连接的糖基化位点的多肽并将该多肽接受合适的O-连接的糖基化条件，以确定其作为GalNac转移酶的受体的能力从而来确定G-CSF和除了G-CSF以外的肽的其他合适的O-连接的糖基化序列。此外，对本领域技术人员来说很明显的是，包含一个或多个突变的肽在本发明的范围之内。设计突变以使能够调节肽的想要的特性，例如，活性和肽上的O-连接的和/或N-连接的糖基化位点的数目和位置。
肽编码序列的获得
一般重组技术
本发明基于重组遗传学领域内的常规技术。公开用于本发明的一般方法的基础教科书包括Sambrook和Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)表示。根据琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、根据经测序的核酸或根据公开的DNA序列来估计核酸大小。对于蛋白，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目表示。根据凝胶电泳、经测序的蛋白、推导的氨基酸序列或公开的氨基酸序列来估计蛋白质大小。
如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984)中所描述的，可根据例如由Beaucage&Caruthers，Tetrahedron Lett.22：1859-1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪化学地合成不能商购获得的寡核苷酸。也可化学地合成完整的基因。使用任何本领域公认的策略，例如使用在Pearson&Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中描述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC进行寡核苷酸的纯化。
在克隆后可使用例如Wallace等人，Gene 16：21-26(1981)的用于双链模板测序的链终止法确定克隆的野生型肽基因、编码突变型肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列。
野生型肽编码序列的克隆和亚克隆
大量的编码野生型肽的多核苷酸已被确定并且可从商业提供商获得，例如，人生长激素，例如，GenBank目录号NM 000515、NM 002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM 022560、NM 022561和NM 022562。
人类基因组研究的快速进展使得可能进行这样的克隆方法，在所述方法中，可搜寻人DNA序列数据库以获得与已知的核苷酸序列例如编码前面鉴定的肽的核苷酸序列具有某个百分比序列同源性的任何基因区段。然后通过化学合成和/或聚合酶链式反应(PCR)技术例如重叠延伸方法可获得所鉴定的任何DNA序列。对于短序列，可以完全地从头合成；而要获得更大的基因则必需使用合成的探针从人cDNA或基因组文库中进一步分离全长编码序列。
可选择地，使用标准的克隆技术例如聚合酶链式反应(PCR)可从人cDNA或基因组DNA文库中分离编码肽的核酸序列，在所述方法中基于同源性的引物通常可来源于已知的编码肽的核酸序列。在标准教科书例如sambrook和Russell(同上)中描述了用于该目的的最常用的技术。
可商购获得或可构建适合用于获得编码野生型肽的编码序列的cDNA文库。分离mRNA、通过逆转录制备cDNA、将cDNA连接入重组载体、转染重组宿主以进行繁殖、筛选和克隆的一般方法是熟知的(参见，例如，Gubler和Hoffman，Gene，25：263-269(1983)；Ausubel等人，同上)。在通过PCR获得核苷酸序列的扩增片段后，可将该片段进一步用作探针以从cDNA文库中分离编码野生型肽的全长多核苷酸序列。可在Sambrook和Russell(同上)中找到合适的方法的概述。
可进行类似的方法以从人基因组文库中获得编码野生型肽的全长序列，例如上面提到的GenBank目录号中的任意一个全长序列。人基因组文库可商购获得或可根据各种本领域公认的方法进行构建。一般地，为构建基因组文库，首先从可能发现肽的组织中提取DNA。然后通过机械剪切DNA或酶降解DNA产生长度大约为12-20kb的片段。然后通过梯度离心将所述片段从不想要的大小的多核苷酸片段中分离出来并将其插入λ噬菌体载体中。体外包装这些载体和噬菌体。通过Benton和Davis，Science，196：180-182(1977)中描述的噬菌斑杂交法分析重组噬菌体。如Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：3961-3965(1975)所描述的进行集落杂交。
基于序列同源性，可设计简并寡核酸作为引物组并可在合适的条件下进行PCR(参见，例如，White等人，PCR Protocols：CurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCRTechnology，CRC Press Inc.1994)以从cDNA或基因组文库扩增核苷酸序列的片段。使用扩增的片段作为探针，获得编码野生型肽的全长核酸。
在获得编码野生型肽的核酸序列后，可将所述编码序列亚克隆入载体，例如表达载体，从而可从所得的构建体中产生重组野生型肽。然后可对野生型肽编码序列进行进一步修饰，例如，核苷酸替换，以改变所述分子的特性。
将突变导入肽序列
根据编码性多核苷酸序列可确定野生型肽的氨基酸序列。随后，可通过将额外的糖基化位点导入所述氨基酸序列中的不同位置来修饰该氨基酸序列，从而改变蛋白的糖基化模式。
几种类型的糖基化位点在本领域是熟知的。例如，在真核细胞中，N-连接的糖基化发生在一致序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬酰胺上，其中Xaa是除了脯氨酸外的任意氨基酸(Kornfeld等人，Ann RevBiochem 54：631-664(1985)；Kukuruzinska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2145-2149(1987)；Herscovics等人，FASEB J7：540-550(1993)；和Orlean，Saccharomyces第3卷(1996))。O-连接的糖基化发生在丝氨酸或苏氨酸残基上(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.906：81-91(1987)；和Hounsell等人，Glycoconj.J13：19-26(1996))。通过将糖基磷脂酰肌醇连接至蛋白的羧基端羧基上来形成其他的糖基化模式(Takeda等人，Trends Biochem.Sci.20：367-371(1995)；和Udenfriend等人，Ann.Rev.Biochem.64：593-591(1995))。基于该知识，可将合适的突变导入野生型肽序列以形成新的糖基化位点。
尽管对肽或多肽序列内的氨基酸残基进行直接的修饰可适合于引入新的N-连接的或O-连接的糖基化位点，但更常用地，通过对编码肽的多核酸序列进行突变来实现新的糖基化位点的引入。这可通过使用已知的诱变方法中的任何一种获得，其中一些方法在下面进行描述。对G-CSF肽的示列性修饰包括在SEQ ID NO：5-18中举例说明的修饰。
在本领域建立和描述了许多产生突变的方案。参见，例如，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4504-4509(1997)；和Stemmer，Nature，370：389-391(1994)。可分别地或组合地使用所述方法产生一组核酸的变体，从而产生被编码的多肽的变体。用于诱变的试剂盒、文库构建和其他产生多样性的方法可商购获得。
产生多样性的突变方法包括，例如，定点诱变(Botstein和Shortle，Science，229：1193-1201(1985))、使用含有尿嘧啶的模板的诱变  (Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82：488-492(1985))、寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，10：6487-6500(1982))、经硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人，Nucl.Acids Res.，13：8749-8764和8765-8787(1985))和使用有缺口的双链DNA的诱变(Kramer等人，Nucl.Acids Res.，12：9441-9456(1984))。
用于产生突变的其他方法包括点错配修复法(Kramer等人，Cell，38：879-887(1984))、使用修复缺陷型宿主株系的诱变法(Carter等人，Nucl.Acids Res.，13：4431-4443(1985))、缺失诱变法(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl.Acids Res.，14：5115(1986))、限制性选择和限制性纯化法(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317：415-423(1986))、通过总的基因合成的诱变法(Nambiar等人，Science，223：1299-1301(1984))、双链断裂修复法(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986))、通过使用多核苷酸链终止法的诱变法(美国专利号5,965,408)和易错PCR法(Leung等人，Biotechniques，1：11-15(1989))。
修饰核酸以获得宿主生物中的偏爱密码子利用
可进一步改变编码突变型肽的多核苷酸序列以符合特定宿主的偏爱密码子利用。例如，细菌细胞的一个株系的偏爱密码子利用可用于产生编码本发明的突变型肽和包含该株系偏爱的密码子的多核苷酸。可通过在由宿主细胞表达的大量基因中对偏爱密码子利用的频率进行平均来计算由宿主细胞表现的偏爱密码子利用的频率(例如，可从Kazusa DNA Research Institute，Japan的网址上获得计算服务)。该分析优选地限定于由宿主细胞高度表达的基因。例如，美国专利号5,824,864提供了由双子叶植物和单子叶植物表现的高度表达基因的密码子利用的频率。
在修饰完成时，通过测序确定突变型肽的编码序列，然后将其亚克隆入合适的表达载体以和野生型肽相同的方式进行重组生产。
突变型肽的表达和纯化
确定序列后，可基于此处公开的编码多肽的多核苷酸序列，使用重组遗传学领域内的常规技术产生本发明的突变型肽。
表达系统
为获得编码本发明的突变型肽的核酸的高水平表达，通常将编码突变型肽的多核苷酸亚克隆入这样的表达载体中，即所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子在本领域是熟知的并且描述于例如Sambrook和Russell(同上)和Ausubel等人(同上)中。在例如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属(Caulobacter)可获得用于表达野生型或突变型肽的细菌表达系统。用于这些表达系统的试剂盒可商购获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核细胞表达系统在本领域是熟知的并且也可商购获得。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子依赖于特定的应用。任选地启动子和异源转录起始位点的距离和其与其天然座位上的转录起始位点的距离相等。然而，如在本领域已知的，可允许该距离上的一些改变而不丧失启动子功能。
除了启动子外，表达载体通常包含含有所有在宿主中表达突变型肽所必需的其他元件的转录单位或表达盒。因此，典型的表达盒包含有效地连接至编码突变型肽的核酸序列的启动子和转录本有效聚腺苷酰化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止区。编码肽的核酸序列通常被连接至可切割的信号肽序列上以促进转化细胞分泌所述肽。除其他以外，这些信号肽包括来自组织纤维溶酶原激活物、胰岛素和神经生长因子以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。表达盒的其他元件可包括增强子，如果基因组DNA用作结构基因，还包含具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列外，表达盒应当还包含结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区和启动子序列可获自相同的基因或可获自不同的基因。
用于将遗传信息转运入细胞的特定表达载体不是特别重要。可使用在真核细胞或原核细胞中用于表达的常规载体中的任何一种载体。标准的细菌表达载体包括质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统例如GST和LacZ。也可向重组蛋白中加入表位标签例如c-myc以提供便利的分离方法。
含有来自真核细胞病毒的调控元件的表达载体通常用于真核细胞表达载体，例如，SV40载体、乳头状瘤病毒载体和来源于EB病毒的载体。其他示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和使得能够在这样的启动子指导下表达蛋白的任何其他载体，所述启动子是SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中有效表达的启动子。
在一些示例性实施方案中，表达载体选自在2004年4月9日提交的共同拥有的美国专利申请(此处引用作为参考)中公开的pCWin1、pCWin2、pCWin2/MBP、pCWin2-MBP-SBD(pMS39)和pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。可选择地，不参与基因扩增的高产量表达系统也是适合的，例如在昆虫细胞中的杆状病毒载体，其具有在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子指导下的编码突变型肽的多核苷酸序列。
表达载体通常包含的元件也包括在大肠杆菌中发挥作用的复制子、编码抗生素抗性以允许选择含有重组质粒的基因，和允许真核序列插入的质粒的非必需区域中的独特的限制性位点。选择的特定抗生素抗性基因不是至关重要的，许多本领域已知的抗性基因中的任何一种都是合适的。如果需要，任选地选择原核序列，使得其不干扰真核细胞中的DNA复制。
当想要重组蛋白(例如，本发明的hgh突变体)的周质表达时，表达载体还包含编码分泌信号的序列，例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白)分泌信号或其经修饰的形式，所述序列直接地连接至要表达的蛋白的编码序列的5’。该信号序列指导在胞质中产生的重组蛋白通过细胞膜进入周质空间。表达载体还可包含信号肽酶1的编码序列，当重组蛋白进入周质空间时，该酶能够酶促切割信号序列。可在例如Gray等人，Gene 39：247-254(1985)，美国专利号6,160,089和6,436,674中找到关于重组蛋白的周质生产的更详细的描述。
如上面所讨论的，本领域技术人员认识到可对任何野生型或突变型肽或其编码序列进行各种保守替代而仍保持所述肽的生物学活性。此外，也可进行多核苷酸编码序列的修饰以在特定的表达宿主中提供偏爱密码子利用而不改变所得的氨基酸序列。
转染方法
使用标准的转染方法产生表达大量突变肽的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准的技术(参见，例如，Colley等人，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide to ProteinPurification，in Methods in Enzymology，第182卷(Deutscher，ed.，1990))对所述突变蛋白进行纯化。按照标准技术(参见，例如，Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等人，(编者)，1983)进行真核和原核细胞的转化。
可使用任何熟知的将外源核苷酸序列导入宿主细胞的方法。这些包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体(plasma vectors)、病毒载体和任何其他已知用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遗传物质导入宿主细胞的方法(参见，例如，Sambrook和Russell，同上)。唯一必要的是，使用的特定的基因工程方法能够成功地将至少一个基因导入能够表达突变型肽的宿主细胞中。
突变型肽在宿主细胞中的表达的检测
在将表达载体导入合适的宿主细胞后，在有利于突变型肽表达的条件下培养转染细胞。然后就重组多肽的表达筛选细胞，接着使用标准的技术(参见，例如，Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice(1982)；美国专利号4,673,641，Ausubel等人，同上；和sambrook和Russell，同上)从培养物中回收重组多肽。
用于筛选基因表达的几种一般方法在本领域技术人员中是熟知的。首先，可在核酸水平上检测基因表达。通常使用各种使用核酸杂交技术的特定DNA和RNA测量的方法(例如，Sambrook和Russell，同上)。一些方法包括电泳分离(例如用于检测DNA的Southern印迹法和用于检测RNA的Northern印迹法)，但也可不用电泳来进行DNA或RNA的检测(例如通过斑点印迹)。转染细胞中编码突变型肽的核酸的存在也可通过使用序列特异性的引物的PCR或RT-PCR来检测。
第二，可在多肽水平上检测基因的表达。本领域技术人员常规地使用各种免疫测定法测量基因产物的水平，特别是使用特异性地和本发明的突变型多肽(例如具有SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列的多肽)反应的多克隆或单克隆抗体(例如，Har low和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975))。这些技术需要抗体制剂，所述抗体制剂是通过选择具有对于突变型肽或其抗原性部分是特异性的抗体来制备的。已很好地建立了产生多克隆和单克隆抗体的方法，其描述可在文献中找到，参见，例如，Harlow和Lane，同上；Kohler和Milstein，Eur.J Immunol.，6：511-519(1976)。在后面部分提供了制备抗本发明的突变型肽的抗体和进行检测突变型肽的免疫学测定法的更详细的描述。
重组产生的突变型肽的纯化
在确定转染宿主中重组突变型肽的表达后，接着以合适的规模培养宿主细胞以纯化所述重组多肽。
1.来自细菌的重组产生的突变型肽的纯化
当本发明的突变型肽由转染细菌大量重组地产生时(尽管表达可以是组成型的，但通常在启动子诱导后表达)，所述蛋白可形成不溶性的团聚体。存在几种适合用于纯化蛋白包含体的方案。例如，团聚蛋白(在下文中称为包含体)的纯化通常包括例如将细菌细胞在大约100-150μg/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40(非离子去垢剂)中温育以破坏细菌细胞来提取、分离和/或纯化包含体。可使用Polytron研磨机(Brinkman Instruments，Westbury，NY)研磨细胞悬浮物。可选择地，可在冰上对细胞进行超声处理。裂解细菌的可选择的方法描述于Ausubel等人与Sambrook和Russell，两者同上，并且对于本领域技术人员来说是显然的。
通常对细胞悬浮液进行离心，并将含有包含体的沉淀重悬浮于不溶解包含体但可洗涤包含体的缓冲液，例如20mM Tris-HCl(pH 7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl和2％Triton-X 100(非离子去垢剂)中。重复洗涤步骤以除去尽可能多的细胞碎片可能是必需的。可在合适的缓冲液(例如，20mM磷酸钠，pH6.8，150mM NaCl)中重悬浮剩余的包含体沉淀。其他合适的缓冲液对本领域技术人员来说是显而易见的。
在洗涤步骤后，加入既是强氢受体又是强氢供体的溶剂(或各具有这些性质中的一个性质的溶液的混合物)溶解包含体。然后通过用相容性缓冲液进行稀释或透析来使形成包含体的蛋白复性。合适的溶剂包括，但不限于，尿素(大约4M至大约8M)、甲酰胺(至少大约80％，基于体积/体积)，和盐酸胍(大约4M至大约8M)。一些能够溶解形成团聚体的蛋白的溶剂例如SDS(十二烷基硫酸钠)和70％甲酸，由于可能导致蛋白的不可逆变性，伴随免疫原性和/或活性的丧失，因此可能不适合用于该方法。尽管盐酸胍和类似的试剂是变性剂，但该变性不是不可逆的并且在除去(例如通过透析)或稀释变性剂后可发生复性，从而允许目的蛋白质的免疫性和/或生物学活性的重新形成。在溶解后，通过标准的分离技术可从其他细菌蛋白中分离所述蛋白。关于从细菌包含体中纯化重组肽的其他描述，参见，例如，Patra等人，Protein Expression and Purification 18：182-190(2000)。
可选择地，可能从细菌周质中纯化重组多肽例如突变型肽。当重组蛋白被向外运入细菌的周质时，除了本领域技术人员已知的其他方法外，可用渗透压冷激法(cold osmotic shock)分离细菌的周质部分(参见，例如，Ausubel等人，同上)。为从周质中分离重组蛋白，对细菌细胞进行离心，形成沉淀。将所述沉淀重悬浮于含有20％蔗糖的缓冲液中。为裂解细胞，对细菌进行离心并将沉淀重悬浮于冰冷的5mM MgSO4中并在冰上保持大约10分钟。对细胞悬浮液进行离心，倒出上清液并保存。通过本领域技术人员熟知的标准分离技术将存在于上清液中的重组蛋白从宿主蛋白中分离出来。
2.用于纯化的标准的蛋白分离技术
当重组多肽例如本发明的突变型肽以可溶的形式在宿主细胞中表达时，其纯化可按照下面描述的标准的蛋白纯化方法进行。
i.溶度分级分离
通常作为起始步骤，当蛋白混合物较复杂时，起始的盐分级分离可将许多不想要的宿主细胞蛋白(或来自细胞培养基的蛋白)和目的重组蛋白例如本发明的突变型肽分离开。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减少蛋白混合物中的水量来沉淀蛋白。然后蛋白基于其溶解度进行沉淀。蛋白的疏水性越强，其在低硫酸铵浓度下越可能沉淀。常用的方案是向蛋白溶液中加入饱和的硫酸铵，从而使所得的硫酸铵浓度在20-30％之间。这将沉淀大部分疏水性蛋白。除去沉淀(除非目的蛋白是疏水性的)并将硫酸铵加入上清液，达到已知的沉淀目的蛋白的浓度。然后在缓冲液中溶解沉淀，如果需要可通过透析或渗滤除去过量的盐。基于蛋白溶解性的其他方法，例如冷乙醇沉淀法对本领域技术人员来说是熟知的，并且可用于分级分离复杂的蛋白混合物。
ii.大小差异性过滤(size differential filtration)
基于计算的分子量，使用通过不同孔径大小的滤膜(例如，Amicon或Millipore滤膜)的超滤可分离更大和更小的蛋白。作为第一步骤，用具有比目的蛋白例如突变型肽的分子量更低的分子量截止值的孔径大小的滤膜对蛋白混合物进行超滤。然后将超滤的滞留物(rententate)对具有比目的蛋白的分子量更大的截止值的滤膜进行超滤。重组蛋白将通过滤膜进入滤液。然后如下所述对滤液进行层析。
iii.柱层析
也可基于目的蛋白的大小、静表面电荷、疏水性或对配体的亲和性将目的蛋白(例如本发明的突变型肽)从其他蛋白中分离出来。此外，可将用肽产生的抗体缀合至柱子的基质上，从而对肽进行免疫纯化。所有这些方法在本领域是熟知的。
对本领域技术人员来说显然的是，可以任何规模和使用来自许多不同厂商(例如Pharmacia Biotech)的设备进行层析技术。
用于突变型肽表达的检测的免疫测定法
为确定重组突变型肽的产生，可使用免疫学测定法在样品中检测多肽的表达。免疫学测定法也可用于对重组激素的表达水平进行定量。抗突变型肽的抗体是进行这些免疫学检测法所必需的。
抗突变型肽的抗体的产生
用于产生和目的抗原特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Coligan，CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene，NY，1991；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY，1989；Stites等人(编著)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的参考文献；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice(第2版)Academic Press，New York，NY，1986；和Kohler和Milstein Nature 256：495-497，1975)。这些技术包括通过从噬菌体或相似的载体的重组抗体文库中筛选抗体来制备抗体(参见，Huse等人，Science 246：1275-1281，1989；和Ward等人，Nature 341：544-546，1989)。
为了产生含有具有想要的特异性的抗体的抗血清，可用目的多肽(例如，本发明的突变型肽)或其抗原性片段免疫合适的动物，例如，小鼠、兔或灵长类动物。可按照标准的免疫方案使用标准的佐剂例如弗氏佐剂。可选择地，可将来源于特定多肽的合成的抗原性肽缀合至载体蛋白上，然后将其用作免疫原。
通过进行检测性放血和确定对目的抗原的反应性的滴度来监控动物对免疫原制剂的免疫应答。当获得合适高的针对抗原的抗体的滴度时，从动物中收集血液并制备抗血清。进一步分级分离抗血清以富集和抗原起特异性反应的抗体，然后纯化所述抗体，参见，Harlow和Lane(同上)，上面提供了蛋白纯化的一般描述。
使用本领域技术人员熟悉的各种技术获取单克隆抗体。一般地，通过和骨髓瘤细胞融合将来自用想要的抗原免疫过的动物的脾细胞永生化(参见，Kohler和Milstein，Fur.J.Immunol.6：511-519，1976)。可选择的永生化的方法包括，例如使用EB病毒、癌基因或逆转录病毒的转化，或本领域熟知的其他方法。就对抗原具有想要的特异性和亲和力的抗体的产生来筛选产生自单个永生化细胞的集落，可通过各种技术(包括向脊椎动物宿主腹腔内进行注射)增加由这些细胞产生的单克隆抗体的产量。
此外，也可在鉴定编码具有想要的特异性的抗体或该抗体结合片段的核酸序列后(按照由Huse等人(同上)提出的一般方案筛选人B细胞cDNA文库)，重组地产生单克隆抗体。上面描述的重组多肽产生的一般原理和方法可用于通过重组方法进行的抗体生产。
当想要时，可就其和野生型肽的交叉反应性对能够特异性识别本发明的突变型肽的抗体进行检测，从而将其与抗野生型蛋白的抗体区分开。例如，可将获自用突变型肽免疫过的动物的抗血清通过其上固定有野生型肽的柱子。通过柱子的抗血清的部分只识别突变型肽而不识别野生型肽。类似地，也可就其只识别突变型而非野生型肽的专一性筛选抗突变型肽的单克隆抗体。
通过例如将样品和固定在固体支持物上的突变型肽特异性的多克隆或单克隆抗体一起温育，将只特异性地识别本发明的突变型肽而非野生型肽的多克隆或单克隆抗体用于从野生型蛋白中分离出突变型蛋白。
用于检测突变型肽表达的免疫检测法
在获得对于本发明的突变型肽是特异性的抗体后，可通过各种为本领域技术人员提供定性和定量结果的免疫测定法测量样品例如细胞裂解物中的多肽的量。关于免疫学和免疫测定法的综述，一般参见，例如，Stites，同上；美国专利号4,366,241、4,376,110、4,517,288和4,837,168。
免疫测定法中的标记
免疫测定法通常使用标记性试剂特异性地结合并标记由抗体和靶蛋白形成的结合复合物。标记性试剂其自身可以是包含抗体/靶蛋白复合物的部分中的一部分，或可以是第三部分，例如特异性结合抗体/靶蛋白复合物的其他抗体。标记物可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学和或化学方法进行检测。例子包括，但不限于，磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他通常在ELISA中使用的酶)、和比色标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
在一些情况下，标记试剂是具有可检测标记物的第二抗体。可选择地，第二抗体可缺少标记物，但反过来，其可被这样的经标记的第三抗体结合，所述第三抗体对第二抗体所源自的种类的抗体是特异性的。可用可检测的部分例如生物素修饰第二抗体，第三经标记的分子例如酶标记的链霉亲和素可特异性结合所述可检测的部分。
能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白，例如A蛋白或G蛋白，也可用作标记试剂。这些蛋白是链球菌细胞壁的正常组分。其表现出较强的和来自不同物种的免疫球蛋白恒定区的非免疫原性反应性(通常参见，Kronval，等人J.Immunol.，111：1401-1406(1973)；和Akerstrom，等人，J.Immunol.，135：2589-2542(1985))。
免疫测定形式
用于从样品中检测目的靶蛋白(例如，突变型人生长激素)的免疫测定法可以是竞争或非竞争性的。非竞争性免疫测定法是这样的测定法，在所述测定法中，直接测定被捕获的靶蛋白的量。例如，在一种优选的“三明治”测定法中，可将对于靶蛋白是特异性的抗体直接与固定所述抗体的固体基质结合。然后其捕获受试样品中的靶蛋白。然后如上所述，用标记性试剂例如携带标记物的第二或第三抗体结合如此固定的抗体/靶蛋白复合物。
在竞争性测定法中，通过测量被置换的(或竞争掉的)加入的(外源)靶蛋白的量来间接测量样品中靶蛋白的量，所述加入的靶蛋白是被存在于样品中的靶蛋白从对于该靶蛋白是特异性的抗体中置换的。在该测定法的典型例子中，固定抗体并标记外源靶蛋白。因为和抗体结合的外源靶蛋白的量和样品中存在的靶蛋白的浓度成反比，因此根据和抗体结合从而被固定的外源靶蛋白的量可确定样品中靶蛋白的水平。
在一些情况下，使用Western印迹(免疫印迹)分析法检测和定量样品中突变型肽的存在。该技术通常包括通过凝胶电泳基于分子量来分离样品蛋白，将分离的蛋白转移至合适的固体支持物(例如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙滤膜)并将样品和特异性结合靶蛋白的抗体一起温育。可直接标记这些抗体或可选择地随后使用特异性结合抗突变型肽的抗体的标记性抗体(例如经标记的绵羊抗小鼠抗体)检测这些抗体。
其他测定形式包括脂质体免疫测定法(LIA)，该测定法使用经设计结合特异性分子(例如，抗体)和释放被封装的反应物或标记物的脂质体。然后根据标准的技术(参见，Monroe等人，Amer.Clin.Prod.Rev.，5：34-41(1986))检测被释放的化学物质。
缀合物
在代表性方面，本发明提供了肽和选择的修饰性基团之间的糖缀合物，在所述缀合物中，通过糖基连接性基团例如完整的糖基连接性基团将修饰性基团缀合至肽上。糖基连接性基团直接与肽上的O-连接的糖基化位点结合，或可选择地，其通过一个或多个额外的糖残基和O-连接的糖基化位点结合。在此处和美国专利号5,876,980、6,030,815、5,728,554、5,922,577、WO98/31826、US2003180835和WO03/031464中提供了制备缀合物的方法。
示例性肽包含通过GalNAc转移酶的作用和O-连接的糖基化位点结合的O-连接的GalNAc残基。GalNAc自身可以是完整的糖基连接性基团。也可通过例如Gal或Sia残基进一步加工GalNAc，Gal或Sia可作为完整的糖基连接性基团起作用。在代表性实施方案中，O-连接的糖基残基是  GalNAc-X、GalNAc-Gal-Sia-X、或GalNAc-Gal-Gal-Sia-X，其中X是修饰性基团。
在示例性实施方案中，肽是包含在野生型肽中不存在的O-连接的糖基化位点的突变型肽。所述肽优选地在突变位点上用GalNAc残基糖基化。刚才在前面关于糖基部分的结构的描述在此也是适用的。
肽和被选择的部分之间的连接包含置于所述肽和修饰性部分之间的完整的糖基连接性基团。如此处所描述的，被选择的部分基本上可以是能够附着至糖单位，产生被合适的转移酶识别的“经修饰的糖”的任何种类，所述酶将经修饰的糖附着至肽上。经修饰的糖的成分，当置于肽和选择的部分之间时，成为“完整的糖基连接性基团”。从任何单糖或寡糖形成糖基连接性基团，所述单糖或寡糖在用选择的部分修饰后成为合适的转移酶的底物。
本发明的缀合物通常对应于通用结构：
Figure A20058000647400661
其中符号a、b、c、d和s表示正的、非0整数；t是0或正整数。“试剂”是治疗剂、生物活性剂、可检测的标记、可溶于水的部分等。“试剂”可以是肽，例如，酶、抗体、抗原等。连接体可以是下文中任何广泛的连接基团。可选择地，连接体可以是单键或“0级连接体(zero order linker)”。肽本身没有限制。
在示例性实施方案中，经选择的部分是可溶于水的聚合物，例如，PEG、m-PEG、PPG、m-PPG等。通过糖基连接性基团，可溶于水的聚合物共价地附着至肽上。糖基连接性基团共价地附着至肽的氨基酸残基或糖残基上。可选择地，糖基连接性基团附着至糖肽的一个或多个的糖基单位上。本发明也提供了这样的缀合物，即在所述缀合物中糖基连接性基团(例如GalNAc)附着至氨基酸残基(例如，Thr或Ser)上。
在示例性实施方案中，蛋白是干扰素。干扰素是在人中在用病毒或双链RNA诱导后由人初级成纤维细胞分泌的抗病毒糖蛋白。干扰素作为治疗剂例如抗病毒剂(例如，B型和C型肝炎)、抗肿瘤剂(例如，肝细胞癌)和在多发性硬化症的治疗中是有益的。关于干扰素α的参考文献，参见，Asano等人，Eur.J.Cancer，27(Suppl 4)：S21-S25(1991)；Nagy等人，Anticancer Research，8(3)：467-470(1988)；Dron等人，J.Biol.Regul.Homeost.Agents，3(1)：13-19(1989)；Habib等人，Am.Surg.，67(3)：257-260(3/2001)；和Sugyiama等人，Eur.J. Biochem.，217：921-927(1993)。有关描述干扰素β的参考文献，参见，例如，Yu等人，J. Neuroimmunol.，64(1)：91-100(1996)；Schmidt，J.，J. Neurosci. Res.，65(1)：59-67(2001)；Wender  等人，Folia Neuropathol.，39(2)：91-93(2001)；Martin等人，Springer Semin.Immunopathol.，18(1)：1-24(1996)；Takane，等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，294(2)：746-752(2000)；Sburlati等人，Biotechnol.Prog.，14：189-192(1998)；Dodd等人，Biochimica et Biophysica Acta，787：183-187(1984)；Edelbaum等人，J.Interferon Res.，12：449-453(1992)；Conradt等人，J.Biol.Chem.，262(30)：14600-14605(1987)；Civas等人，Eur.J：Biochem.，173：311-316(1988)；Demolder等人，J.Biotechnol.，32：179-189(1994)；Sedmak等人，J.Interferon Res.，9(Suppl 1)：S61-S65(1989)；Kagawa等人，J.Biol.Chem.，263(33)：17508-17515(1988)；Hershenson等人，美国专利号4,894,330；Jayaram等人，J.Interferon Res.，3(2)：177-180(1983)；Menge等人，Develop.Biol.Standard.，66：391-401(1987)；Vonk等人，J.Interferon Res.，3(2)：169-175(1983)；和Adolf等人，J. Interferon Res.，10：255-267(1990).
在示例性干扰素缀合物中，干扰素α，例如干扰素α2b和2a通过完整的糖基连接体缀合至可溶于水的聚合物上。
在其他示例性实施方案中，本发明提供了人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的缀合物。G-CSF是刺激neutropoietic组细胞的增殖、分化和活化形成功能性的成熟中性粒细胞的糖蛋白。注射的G-CSF被从体内快速地清除。参见，例如，Nohynek等人，Cancer Chemother.Pharmacol.，39：2 59-266(1997)；Lord等人，Clinical CancerResearch，7(7)：2085-2090(07/2001)；Rotondaro等人，MolecularBiotechnology，11(2)：117-128(1999)；和B_nig等人，BoneMarrow Transplantation，28：259-264(2001)。
本发明包括用于GM-CSF的修饰的方法。GM-CSF作为由经激活的T细胞、巨噬细胞、内皮细胞和基质成纤维细胞产生的细胞因子在本领域是熟知的。GM-CSF主要对骨髓产生作用，从而增加炎性白细胞的产量，并进一步作为内分泌激素起作用以起始炎性作用期间消耗的嗜中性粒细胞的补充。另外GM-CSF是巨噬细胞激活性因子并且促进Lagerhans细胞分化为树突细胞。和G-CSF一样，GM-CSF在化疗后在骨髓置换中也具有临床应用。
除了提供通过酶促加入的完整的糖基连接性基团形成的缀合物外，本发明还提供了其替代模式高度均一的缀合物。使用本发明的方法，可能形成这样的肽缀合物，其中基本上所有经修饰的糖部分(即本发明的整个缀合物群体中的经修饰的糖部分)附着至结构一致的氨基酸或糖残基上。因此，在第二方面，本发明提供了具有可溶于水的聚合物部分群体的肽缀合物，所述可溶于水的聚合物部分通过完整的糖基连接性基团与肽共价结合。在本发明的其他缀合物中，基本上群体的每一个成员通过糖基连接性基团和肽的糖残基结合，糖基连接性基团附着的每一个肽的糖残基都与相同的结构附着。
还提供了这样的缀合物，即所述缀合物具有通过糖基连接性基团共价地结合至其上的可溶于水的聚合物部分的群体。在其他实施方案中，可溶于水的聚合物部分的群体的基本上每一个成员通过完整的糖基连接性基团和肽的氨基酸残基结合，并且具有附着至其上的完整的糖基连接性基团的各氨基酸残基具有相同的结构。
本发明还提供了和上面描述的缀合物类似的缀合物，在所述缀合物中，肽通过糖基连接性基团缀合至治疗性部分、诊断部分、靶向性部分、毒素部分等。上述部分中的每一个可以是小分子、天然的聚合物(例如，多肽)或合成的聚合物。
在其他实施方案中，本发明提供了这样的缀合物，该缀合物由于作为所述缀合物的成分的靶向性试剂存在的原因而选择性地定位于特定的组织中。在示例性实施方案中，靶向性试剂是蛋白。示例性蛋白包括运铁蛋白(脑、血)、HS-糖蛋白(骨、脑、血)、抗体(脑、具有抗体特异性抗原的组织、血)、凝血因子V-XII(被损伤的组织、血凝块、癌、血)、血清蛋白例如，α-酸糖蛋白、胎球蛋白、α-胎儿蛋白(脑、血)、β2-糖蛋白(肝脏、动脉粥样硬化斑、脑、血)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO(免疫刺激、癌、血、红细胞过量产生、神经保护)、白蛋白(半衰期增加)、IL-2和IFN-α。
在示例性被靶向的缀合物中，干扰素α2β(IFN-α2β)通过双功能连接体缀合至运铁蛋白上，所述连接体在PEG部分的各末端包含完整的糖基连接性基团(示意图1)。例如，用附着至运铁蛋白的完整的唾液酸连接体功能化PEG连接体的一个末端，而用附着至IFN-α2β的完整的O-连接的GalNAc连接体功能化另一末端。
本发明的缀合物可包含为单价或多价(例如，触角结构)的糖基连接性基团。因此，本发明的缀合物包括这样的两种缀合物，在所述缀合物中，选择的部分通过单价糖基连接性基团附着至肽。本发明也包括这样的缀合物，在所述缀合物中，超过一个选择的部分通过多价连接性基团附着至肽上。
方法
除了上述的缀合物外，本发明还提供了用于制备这些和其他缀合物的方法。此外，本发明提供了通过给可能发生疾病的受试者或患有疾病的受试者施用本发明的缀合物来预防、治疗或改善疾病状态的方法。另外，本发明提供了将本发明的缀合物靶向身体的特定组织或区域的方法。
因此，本发明提供了在选择的部分和肽之间形成共价缀合物的方法。在示例性实施方案中，在可溶于水的聚合物、治疗性部分、靶向性部分或生物分子和糖基化或未糖基化的肽之间形成缀合物。聚合物、治疗性部分或生物分子通过糖基连接性基团附着至肽上，所述糖基连接性基团置于肽和修饰性基因(例如，可溶于水的聚合物)之间并通过共价键与二者连接。所述方法包括将肽和含有经修饰的糖和糖基转移酶的混和物接触，所述经修饰的糖是所述糖基转移酶的底物。在适合经修饰的糖和肽之间形成共价键的条件下进行所述反应。经修饰的糖的糖部分优选地选自核苷酸糖、被活化的糖和既非核苷酸又未被活化的糖。
受体肽(O-糖基化或非糖基化的)一般通过从头合成，或在原核细胞(例如，细菌细胞，例如大肠杆菌)或真核细胞例如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中进行重组表达。所述肽可以是全长蛋白或片段。此外，所述肽可以是野生型肽或突变型肽。在示例性实施方案中，所述肽包含向肽序列中加入一个或多个N或O-连接的糖基化位点的突变。
在示例性实施方案中，以下列方式用可溶于水的聚合物O-糖基化和功能化肽。产生具有可获得的氨基酸糖基化位点的肽，或如果肽被糖基化，修剪糖基化部分以暴露氨基酸。例如，将GalNAc加到丝氨酸或苏氨酸上并用ST6Gal-1和唾液酸-修饰性基团盒唾液酸化该半乳糖基化的肽。可选择地，使用Core-1-GalT-1半乳糖基化经半乳糖基化的肽并用ST3GalT1和唾液酸-修饰性基团盒唾液酸化所述产物。本方法的示例性缀合物具有下列键合：Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia*，其中Sia*是唾液酸-修饰性基团盒。
在本发明的方法例如上面所示的方法中，通过使用多个酶和糖基供体，可分开进行各个糖基化的步骤，或在“单釜(single pot)”反应中组合进行。例如，在上面所示的三个酶的反应中，可在单个容器中混合GalNAc转移酶、GalT和SiaT以及其供体。可选择地，可单独地进行GalNAc反应并可将GalT和SiaT以及合适的糖基供体以单个步骤加入。进行所述反应的其他模式包括按顺序加入各酶和合适的供体并以“单釜”形式进行反应。上述各方法的组合用于制备本发明的化合物。
在本发明的缀合物中，Sia-修饰性基团盒可以α-2，6或α-2，3键连接至Gal。
例如，在一个实施方案中，在哺乳动物系统中表达G-CSF并通过唾液酸酶的处理来修饰G-CSF，从而修剪出末端唾液酸残基，然后使用ST3Gal 3和PEG-唾液酸供体进行PEG化。
本发明的方法也提供了重组产生的不完全糖基化的肽的修饰。许多重组产生的糖蛋白是不完全糖基化的，暴露出可具有不想要的特性(例如免疫原性、被RES识别)的糖残基。通过在本发明的方法中使用经修饰的糖，可同时用例如可溶于水的聚合物、治疗剂等进一步糖基化肽和衍生肽。经修饰的糖的糖部分可以是在完全糖基化的肽中正确地缀合至受体的残基，或可以是具有想要的特性的其他糖部分。
通过本发明的方法修饰的肽可以是合成的或野生型肽或其可以是通过本领域已知的方法例如定点诱变产生的突变型肽。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的糖基化。示例性的N-连接的糖基化是将经修饰的糖附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸)是糖部分通过酶促反应附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一序列的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将一个糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GIcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)附着至羟基氨基酸优选地丝氨酸或苏氨酸(尽管也可使用非常用的或非天然氨基酸，例如，5-羟脯氨酸或5羟-赖氨酸)的羟基侧链。
此外，除了肽以外，本发明的方法还可使用其他生物结构(例如，含有O-连接的糖基化位点的糖脂、脂、鞘氨脂(sphingoids)、神经酰胺、全细胞等)。
通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个糖基化位点来方便地实现将糖基化位点加入肽或其他结构中。(对于O-连接的糖基化位点)也可通过将一种或多种提供-OH基团的氨基酸残基(优选地丝氨酸或苏氨酸残基)整合入肽的序列来进行加入。可通过突变或通过完全的肽化学合成来完成加入。优选地通过DNA水平上的变化，特别是通过在预先选择的碱基上对编码肽的DNA进行突变从而产生可翻译成想要的氨基酸的密码子来改变肽的氨基酸序列。优选地使用本领域已知的方法进行DNA突变。
在示例性实施方案中，通过改组多核苷酸来加入糖基化位点。可用DNA改组方案调整编码候选肽的多核苷酸。DNA改组是递归重组(recursive recombination)和突变的方法，其通过关联基因的文库的随机片段化，然后通过类似聚合酶链式反应的方法重新装配片段来进行。参见，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmet，Nature 370：389-391(1994)；和美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
本发明也提供了这样的方法，即给肽加入(或除去)一个或多个选择的糖基残基，然后将经修饰的糖缀合至至少一个选择的肽的糖基残基上。本实施方案是在例如想要将经修饰的糖缀合至选择的糖残基(所述糖残基是肽上不存的或不以想要的量存在的糖残基)上时使用。因此，在将经修饰的糖偶联至肽上之前，将选择的糖残基通过酶促或化学偶联缀合至肽上。在其他实施方案中，在经修饰的糖的缀合之前通过从糖肽上除去糖残基来改变糖肽的糖基化模式。参见，例如WO98/31826。
存在于糖肽上的任何糖部分的加入或除去可通过化学或酶促的方法来实现。优选地通过将多肽变体暴露于化合物三氟甲基磺酸或等同的化合物来产生化学去糖基化。该处理导致除了连接性糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖的断裂，但肽保持完整。化学去糖基化描述于Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118：131(1981)。多肽变体上的糖部分的酶促断裂可通过使用由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)描述的内切和外切糖苷酶来实现。
通过任何本领域公认的方法来进行糖基部分的化学加入。优选地通过使用此处提供的方法的改进方法来实现糖部分的酶促加入，以天然的糖基单位来替代本发明中使用的经修饰的糖。在美国专利号5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中公开了加入糖部分的其他方法。
选择的糖残基的示例性附着位点包括，但不限于：(a)N-连接的糖基化的一致位点，和O-连接的糖基化的位点；(b)作为糖基转移酶的受体的末端糖残基；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离硫氢基，例如半胱氨酸的硫氢基；(f)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(g)芳香残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香基；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。用于本发明的示例性方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330中和描述于Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中。
在一个实施方案中，本发明提供了用于通过连接性基团连接两个或多个肽的方法。连接性基团是任何有用的结构，可选自直链和分枝的链的结构。优选地，附着至肽上的连接体的各末端，包含经修饰的糖(即，新产生的完整的糖基连接性基团)。
在本发明的示例性方法中，通过包含PEG连接体的连接体部分将两个肽连接在一起。结构符合上面草图中提供的一般结构。如此处所描述的，本发明的结构包含两个完整的糖基连接性基团(即，s+t＝1)。侧重于包含两个糖基的PEG连接体是为进行说明而不应当解释为限定用于本发明的实施方案中的连接体臂的特征。
因此，在第一末端用第一糖基单位并在第二末端用第二糖基单位官能化PEG部分。第一和第二糖基单位优选地是不同转移酶的底物，使得第一和第二肽分别正交(orthogonal)地附着至第一和第二糖基单位。在实践中，将(糖基)1-PEG-(糖基)2连接体与第一肽和其底物是第一糖基单位的第一转移酶接触，从而形成  (肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然后任选地从反应混合物中除去转移酶和/或未反应的肽。将第二肽和其底物为第二糖基单位的第二转移酶加入至(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2缀合物，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；糖残基中至少一个是直接或间接O-连接的。本领域技术人员认识到通过例如，使用分枝的PEG、树状分子(dendrimer)、聚(氨基酸)、多糖等，上述方法也可用于在超过两个多肽之间形成缀合物。
在示例性实施方案中，通过双功能连接体将干扰素α2β(IFN-α2β)缀合至运铁蛋白，所述双功能连接体在PEG部分的各末端(示意图1)包含完整的糖基连接性基团。由于所述INF缀合物的更大的分子大小的原因，其具有增加的超过单独的INF的体内半衰期。此外，IFN与运铁蛋白的缀合用于选择性地将缀合物靶向脑。例如，用CMP唾液酸官能化PEG连接体的一个末端和用UDP GalNAc官能化另一端。在GalNAc转移酶存在的情况下，连接体与IFN组合，导致连接体臂的GalNAc附着至IFN上的丝氨酸和/或苏氨酸。
示意图1
Figure A20058000647400741
视需要，上述方法可进行多个循环，所述方法不限于用单个连接体在两个肽之间形成缀合物。此外，本领域技术人员认识到，可同时在同一反应容器中发生用肽在PEG(或其他物质)的末端官能化完整的糖基连接性基团的反应，或其可以分步的方式进行。当以分步的方式进行反应时，任选地在各步骤中从一个或多个反应成分(例如，酶、肽)中纯化出产生的缀合物。
示意图2提供了其他示例性的实施方案。示意图2展示制备将选择的蛋白例如GM-CSF靶向骨并增加所选择的蛋白的循环半衰期的缀合物的方法。
示意图2
其中G是被活化的糖部分(例如，糖核苷酸)上的糖残基，其在缀合物中被转变成完整的糖基连接性基团。当s大于0时，L是糖基连接性基团例如GalNAc或GalNAc-Gal。
PEG(或其他连接体)的反应性衍生物的用途(即将一个或多个肽部分附着至连接体)在本发明的范围之内。本发明不限定于反应性PEG类似物的身份。可商购获得和通过文献获得聚(乙二醇)的许多活化衍生物。选择和(如果需要)合成合适的活化的PEG衍生物在本领域技术人员的能力范围之内，所述活化的PEG衍生物用于制备在本发明使用的底物。参见，Abuchowski等  Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，252：3582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165：114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111：659-667(1983))，甲磺酸酯(Nilsson等人，Methods Enzymol.，104：56-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12：119-128(1990))；N-羟基琥珀酰亚胺衍生的活性酯(Buckmann等人.，Makromol.Chem.，182：1379-1384(1981)；Joppich 等人.，Makromol.Chem.，180：1381-1384(1979)；Abuchowski等人.，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Katre等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：1487-1491(1987)；Kitamura等人.，Cancer Res.，51：4310-4315(1991)；Boccu等人.，Z.Naturforsch.，38C：94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等人.，)POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人.，Biotechnol.Appl.Biochem.，15：100-114(1992)；Veronese等人.，Appl.Biochem.Biotech.，11：141-152(1985))，咪唑形式(Beauchamp等人.，Anal.Biochem.，131：25-33(1983)；Berger等人.，Blood，71：1641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等人.，Bioconjugate Chem.，4：314-318(1993))，异氰酸酯(Byun等人.，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和环氧化物(美国专利号4,806,595，属于Noishiki等人.，(1989)。其他连接性基团包括氨基和活化的PEG之间的氨基甲酸乙酯键。参见，Veronese，等人.，Appl.Biochem.Biotechnol.，11：141-152(1985)。
在其他使用反应性PEG衍生物的示例性实施方案中，本发明提供了通过将肽缀合至合成的或天然的聚合物来延长被选择的肽的血液循环半衰期、基本上将所述肽靶向血池的方法，其中所述合成的或天然的缀合物的大小足以阻滞肾小球对蛋白(例如，白蛋白)的过滤。参见，示意图3。在示意图中举例说明了本发明的实施方案，其中通过PEG连接体使用化学和酶促组合修饰将G-CSF缀合至白蛋白。
示意图3
Figure A20058000647400761
因此，如示意图3中所示，用反应性PEG衍生物例如X-PEG-(CMP-唾液酸)修饰白蛋白的残基(例如，氨基酸侧链)，其中X是活化性基团(例如，活性酯、异硫氰酸酯等)。将PEG衍生物和G-CSF混合并将其和其底物为CMP-唾液酸的转移酶接触。在其他说明性实施方案中，将赖氨酸的ε-氨基和PEG连接体的N羟基琥珀酰亚胺酯反应以形成白蛋白缀合物。通过酶促作用将连接体的CMP-唾液酸缀合至GCSF上的合适残基例如Gal或GalNAc上，从而形成缀合物。本领域技术人员认识到上述方法不限于所示的反应成员(reaction partners)。此外，所用方法可用于通过例如，使用具有超过两个末端的分枝连接体来形成包含超过两个蛋白部分的缀合物。
经修饰的糖
经修饰的糖基供体种类(“经修饰的糖”)优选地选自经修饰的糖核苷酸、活化的经修饰的糖和这样的经修饰的糖(即其是简单的既非核苷酸又非活化的糖)。使用本发明的方法可向肽上加入任何想要的糖结构。一般地，所述结构是单糖，但本发明不限于使用经修饰的单糖；也使用寡糖和多糖。
通过酶促方法、化学方法或其组合将修饰性基团附着至糖部分，从而产生经修饰的糖。在允许修饰性部分附着、同时仍允许糖用作酶的底物的任何位点上替代所述糖，其中所述酶用于将经修饰的糖连接至肽上。在其他实施方案中，当唾液酸是糖时，在丙酮酰基(pyruvyl)侧链上的9位上或在胺部分上的5位上用修饰性基团取代唾液酸，所述位点在唾液酸中通常被乙酰化。
在本发明的某些实施方案中，使用经修饰的糖核苷酸将经修饰的糖加至肽上。以其修饰形式用于本发明的示例性糖核苷酸包括核苷单、双或三磷酸或其类似物。在其他实施方案中，经修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP糖苷。更优选地经修饰的糖核苷酸选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也用于本发明的方法。
本发明也提供了通过使用经修饰的糖例如经修饰的半乳糖、岩藻糖、GalNAc和唾液酸合成经修饰的肽的方法。当使用经修饰的唾液酸时，在这些方法中可使用唾酸转移酶或反式唾液酸酶(trans-sialidase)(只针对α2，3-连接的唾液酸)。
在其他实施方案中，经修饰的糖是活化的糖。用于本发明的活化的经修饰的糖通常是这样的糖苷，即其已通过合成的方法被改变，从而包含被活化的离去基团。如此处所用的，术语“被活化的离去基团”是指在由酶调节的亲核取代反应中容易被取代的部分。许多活化的糖在本领域是已知的。参见，例如，Vocadlo等人，In CARBOHYDRATECHEMISTRY AND BIOLOGY，第2卷，Ernst等人Ed.，Wiley-VCH Verlag：Weinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.34：6419(1993)；Lougheed，等人，J.Biol.Chem.274：37717(1999)).
活化性基团(离去基团)的例子包括氟、氯、溴、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲基磺酸酯等。用于本发明的优选的活化的离去基团是对糖苷至受体的酶促转移没有显著空间位阻的基团。因此，活化的糖苷衍生物的优选的实施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸，糖基氟化物是特别优选的。在糖基氟化物中，α-半乳糖基氟化物、α-甘露基氟化物、α-葡糖基氟化物、α-岩藻糖基氟化物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸基氟化物、α-N-乙酰葡糖氨基氟化物、α-N-乙酰半乳糖氨基氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡糖基氟化物、β-岩藻糖基氟化物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸基氟化物，β-N-乙酰葡糖氨基氟化物和β-N-乙酰半乳糖氨基氟化物是最优选的。
作为举例说明，可首先通过乙酰化糖，然后用HF/吡啶处理其来从游离的糖制备糖基氟化物。这样产生了热力学上最稳定的受保护的(乙酰化的)糖基氟化物的端基异构体(即，α-糖基氟化物)。如果想要较不稳定的端基异构体(即，β-糖基氟化物)，可通过用HBr/HOAc或用HC l转化经全乙酰化的(peracetylated)糖以产生端基异构的溴化物或氯化物来制备其。将该中间体与氟化盐例如氟化银反应，从而产生糖基氟化物。乙酰化的糖基氟化物可通过在甲醇(例如，NaOMe/MeOH)中和温和的(起催化作用的)碱反应进行去保护。此外，许多糖基氟化物可商购获得。
可使用本领域技术人员已知的常规方法制备其他活化的糖基衍生物。例如，通过用甲磺酰氯处理完全苯甲基化的糖的半缩醛形式，然后通过催化氢化作用除去苯甲基来制备糖基甲磺酸。
在其他示例性实施方案中，经修饰的糖是具有触角(antennary)结构的寡糖。在其他实施方案中，触角的一个或多个末端具有修饰性部分。当超过一个修饰性部分附着至具有触角结构的寡糖时，所述寡糖用于“扩增”修饰性部分；缀合至肽的各寡糖将多拷贝的修饰性基团附着至所述肽上。上面附图中所示的本发明的典型缀合物的一般结构包含多价种类，所述种类是通过使用触角结构制备本发明的缀合物产生的。许多触角糖结构在本领域是已知的，其可用于本方法而不受限制。
下面公开示例性的修饰性基团。可就其给肽提供一个或多个想要的特性而对修饰性基团进行选择。示例性特性包括，但不限于，增加的药物动力学、增加的药效学、改善的生物分布、提供多价种类、提高的水溶解度、增加的或减少的亲脂性，和组织靶向性。
可溶于水的聚合物
许多可溶于水的聚合物对本领域技术人员来说是已知的并且用于实践本发明。术语可溶于水的聚合物包括这样的聚合物例如糖(例如，葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚(唾液酸)、类肝素、肝素等)；聚(氨基酸)，例如，聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成的聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(醚)，例如，聚(乙二醇)；肽、蛋白等。任何可溶于水的聚合物可用于本发明，唯一的限制是所述聚合物必须包含缀合物的其余部分可附着的位点
可在WO 94/17039、美国专利号5,324,844、WO 94/18247、WO94/04193、美国专利号5,219,564、美国专利号5,122,614、WO90/13540、美国专利号5,281,698和WO 93/15189中找到活化聚合物的方法，以及用于活化的聚合物和肽例如凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、氧携带性分子(美国专利号4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))之间缀合的方法。
优选的可溶于水的聚合物是这样的聚合物，即其中，聚合物样品中大多数聚合物分子具有大致相同的分子量；这些聚合物是“单分散的(homodisperse)”。
用聚(乙二醇)缀合物来进一步说明本发明。可获得有关PEG的官能化和缀合的几篇综述和专著。参见，例如，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，57：5-29(2002)。使用反应性分子制备反应性PEG分子和形成缀合物的方法在本领域是已知的。例如，美国专利号5,672,662公开了聚合物酸的活性酯的可溶于水和可分离的缀合物，所述聚合物酸选自线性的或分枝的聚环氧烷、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)和聚(丙烯吗啉)。
美国专利号6,376,604提供了通过使聚合物的末端羟基和二(1-苯并三唑基)碳酸酯在有机溶剂中反应来制备可溶于水的和非肽的聚合物的可溶于水的1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性酯用于和生物学活性剂例如蛋白或肽形成缀合物。
WO 99/45964描述了包含生物学活性剂和活化的可溶于水的聚合物的缀合物，所述聚合物包含这样的聚合物主链，即其具有至少一个通过稳定的键连接至所述聚合物主链的末端，其中至少一个末端包含这样的分枝部分，即所述分枝部分具有连接至该分枝部分的近端反应性基团，其中生物学活性剂连接至近端反应性基团中的至少一个。其他的分枝聚(乙二醇)描述于WO 96/21469，美国专利号5,932,462描述了用分枝的PEG分子形成的缀合物，所述分枝的PEG分子包含含有反应性官能团的分枝末端。游离的反应性基团可和生物活性剂例如蛋白或肽反应，从而在聚(乙二醇)和生物活性剂之间形成缀合物。美国专利号5,446,090描述了双功能PEG连接体和其在形成缀合物中的用途，所述缀合物在每一个PEG连接体末端具有肽。
包含可降解的PEG键的缀合物描述于WO 99/3483 3和WO 99/14259以及美国专利号6,348,558。这些可降解的键可用于本发明。
上面所示的本领域公认的活化聚合物的方法在本发明背景中用于形成此处所示的分枝聚合物和用于将这些分枝的聚合物缀合至其他种类物质例如，糖、糖核苷酸等。
用于本发明的示例性聚(乙二醇)分子包括，但不限于具有下式的分子：
其中R8是H、OH，NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂烷基例如乙缩醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q或-(CH2)qC(Y)Z1。指数“e”表示从1至2500的整数。指数b、d和q各自独立表示从0至20的整数。符号Z和Z1独立地表示OH、NH2、离去基团，例如，咪唑、对硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R9、活化的酯的醇部分、-(CH2)pC(Y1)V、或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符号Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符号X、Y、Y1、A1和U独立地表示部分O、S、N-R11。符号V表示OH、NH2、卤素、S-R12、活化的酯的醇组分、活化的酰氨的胺组分、糖核苷酸和蛋白。指数p、q、s和v是独立地选自从0至20的整数的成员。符号R9、R10、R11和R12独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烷基以及取代或未取代的杂芳基。
在其他实施方案中，聚(乙二醇)分子选自下列：
Figure A20058000647400821
用于形成本发明的缀合物的聚(乙二醇)是线性的或分枝的。适合用于本发明的分枝的聚(乙二醇)分子包括，但不限于，由下式描述的聚乙二醇：
Figure A20058000647400822
其中R8和R8′是独立地选自上面定义为R8的基团。A1和A2是独立地选自上面定义为A1的基团。指数e、f、o和q是如上描述的指数。Z和Y是如上描述的符号。X1和X1’是独立地选自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH的成员。
在其他示例性实施方案中，分枝的PEG基于半胱氨酸、丝氨酸或二赖氨酸核心。因此，其他示例性分枝PEGs包括：
在其他实施方案中，分枝PEG部分基于三赖氨酸肽。所述三赖氨酸可以是单、双、三或四PEG化的。本实施方案的示例性分枝PEG具有式：
Figure A20058000647400841
其中e、f和f’独立地选自1至2500的整数；q、q’和q”独立地选自1至20的整数。
在本发明的示例性实施方案中，PEG是m-PEG(5kD、10kD或20kD)。示例性分枝PEG种类是丝氨酸-或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG是20kD的m-PEG。
对本领域技术人员来说显而易见的是，用于本发明的分枝的聚合物在上述方面示意图中可包含变化。例如上面所示的二赖氨酸-PEG缀合物可包含三个多聚亚基，结合在α-氨基的第三个亚基显示为未经修饰。类似地，用三或四个多聚亚基官能化的三赖氨酸的用途在本发明的范围之内。
本发明的特定实施方案包括：
Figure A20058000647400842
和这些物质种类的碳酸酯和活性酯，例如：
Figure A20058000647400851
适合活化用于制备此处所示的化合物的线性PEGs的其他活化性或离去基团包括，但不限于下列：
Figure A20058000647400852
在WO 04/083259中提供了用这些和其他基团种类活化的PEG分子以及制备活化的PEG的方法。
本领域技术人员认识到，一个或多个分枝聚合物的m-PEG臂可被具有不同末端例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等的PEG部分替代。此外，通过在α碳原子和侧链的官能团之间插入烷基连接体(或除去碳原子)可容易地修饰上述结构。因此，“同级(homo)”衍生物和更高级的同源物以及更低级的同源物在用于本发明的分枝PEGs的核心的范围之内。
通过方法例如下面描述的方法可容易地制备此处所示的分枝PEG种类：
Figure A20058000647400861
其中Xa是O或S，r是从1至5的整数。指数e和f独立地选自1至2500的整数。
因此，根据该示意图，将天然的或非天然的氨基酸和活化的m-PEG衍生物(在该情况下是甲苯磺酸)接触，通过烷基化侧链杂原子Xa形成1。将单官能化的m-PEG氨基酸和反应性m-PEG衍生物接受N乙酰化条件，从而组装出分枝的m-PEG2。本领域技术人员认识到，甲苯磺酸离去基团可用任何合适的离去基团例如卤素、甲磺酸、三氟甲基磺酸等替代。类似地，用于酰化胺的反应性碳酸酯可用活性酯例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯等替代，或可使用脱水剂例如二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑等原位活化酸。
在示例性实施方案中，修饰性基团是PEG部分，然而，可通过合适的键将任何修饰性部分，例如可溶于水的聚合物、不溶于水的聚合物、治疗性部分等整合入糖基部分。通过酶促的方法、化学方法或其组合形成经修饰的糖，从而产生经修饰的糖。在示例性实施方案中，在这样的位点上用活化的胺取代糖，所述位点允许修饰性部分附着，同时允许糖用作能够将经修饰的糖偶联至G-CSF肽的酶的底物。在示例性实施方案中，当半乳糖胺是经修饰的糖时，胺部分附着至位点6上的碳原子上。
经可溶于水的聚合物修饰的种类
本发明使用经可溶于水的聚合物修饰的核苷酸糖种类，其中用可溶于水的聚合物修饰糖部分。示例性经修饰的糖核苷酸具有通过糖上的胺部分修饰的糖基团。经修饰的糖核苷酸，例如，糖核苷酸的糖-胺衍生物，也用于本发明的方法中。例如，可通过酶促作用将糖胺(无修饰性基团)缀合至肽(或其他种类)，然后将游离的糖胺部分缀合至想要的修饰性基团。可选择地，经修饰的糖核苷酸可用作酶的底物，所述酶将经修饰的糖转移至底物例如肽、糖肽、脂质、糖苷配基、糖脂等上的糖基受体。
在糖核心是半乳糖或葡萄糖的实施方案中，R5是NHC(O)Y。
在示例性实施方案中，经修饰的糖基于6-氨基-N-乙酰糖基部分。如下针对N-乙酰半乳糖胺所示的，通过标准的方法容易地制备6-氨基糖部分。
Figure A20058000647400871
在上面的示意图中，指数n表示从1至2500，优选地从10至1500，更优选地从10至1200的整数。符号“A”表示活化性基团，例如，卤素、活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的组分、碳酸酯(例如对硝基苯碳酸酯)的成分等。本领域技术人员认识到，通过该方法和类似的方法可容易地制备其他PEG-酰胺核苷酸糖。
在其他示例性实施方案中，酰胺部分由基团例如氨基甲酸乙酯或脲替代。
在其他实施方案中，R1是分枝的PEG，例如，上述这些种类中的一种。本实施方案的说明性化合物包括：
Figure A20058000647400881
其中，X4是键或O，J是S或O。
此外，如上所述，本发明提供了通过使用核苷酸糖形成的肽缀合物，所述核苷酸糖用可溶于水的直链或分枝聚合物进行修饰。例如，具有下面所示的式的化合物在本发明的范围之内：
Figure A20058000647400891
其中X4是O或键，J是S或O。
类似地，本发明提供了肽缀合物，所述肽缀合物是使用这样的经修饰的糖种类的核苷酸糖形成的，在所述经修饰的糖种类中，位点6上的碳被修饰：
其中X4是键或O，J是S或O，y是0或1。
还提供了包含本发明的组分的肽和糖肽、脂质和糖脂的缀合物。
例如，本发明提供了具有下式的缀合物：
其中J是S或O。
不溶于水的聚合物
在其他实施方案中，类似于上面所述的，经修饰的糖包含不溶于水的聚合物，而不包含可溶于水的聚合物。本发明的缀合物还可包含一个或多个不溶于水的聚合物。通过缀合物作为以受控方式递送治疗性肽的载体的用途来举例说明本发明的该实施方案。聚合物药物递送系统在本领域是已知的。参见，例如，Dunn等(编者)POLYMERIC DRUGSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员认识到，基本上任何已知的药物递送系统可用于本发明的缀合物。
代表性的不溶于水的聚合物包括，但不限于，聚磷腈(phosphazines)、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚尿烷、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙基异丁烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(己基异丁烯酸酯)、聚(异丁烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(苯基异丁烯酸酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)、聚(十八烷基丙烯酸酯)聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯对苯二酸酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普流罗尼类(pluronics)和聚乙烯基苯酚和其共聚物。用于本发明的缀合物的经合成修饰的天然聚合物包括，但不限于，烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝酸纤维素。经合成修饰的天然聚合物大类的特别优选的成员包括，但不限于，甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素、硫酸纤维素钠盐以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的共聚物。
此处所述的这些和其他聚合物可容易地从商业来源购得，商业来源是例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或通过使用标准技术从获自这些厂商的单体合成。
用于本发明的缀合物的代表性可生物降解的聚合物包括，但不限于，聚丙交酯、聚乙醇酸交酯和其共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(丁酸)、聚戊酸、聚(丙交酯-共聚-己内酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、其混合物和共聚物。特别适用的是形成凝胶的组合物，例如包括胶原、普朗尼克类等的组合物。
用于本发明的聚合物包括“杂合”聚合物，所述杂合聚合物包含这样的不溶于水的物质，所述物质在其结构的至少部分内具有生物可再吸收的分子。这样的聚合物的例子是包含不溶于水的共聚物的聚合物，所述聚合物在每个聚合物链上具有生物可再吸收区域、亲水性区域和多个可交联的官能团。
根据本发明，“不溶于水的物质”包括在水或含水的环境中基本上不溶解的物质。因此，尽管共聚物的片段或某些区域可以是亲水或甚至是可溶于水的，但聚合物分子作为整体基本上不溶于水。
根据本发明，术语“生物可再吸收的分子”包含能够被身体代谢或分解和再吸收和/或通过正常的排泄途径清除的区域。这些代谢物或分解产物优选地基本上对身体无害。
生物可再吸收的区域可以是疏水的或亲水的，只要作为整体的共聚物不溶于水。因此，根据聚合物作为整体保持不溶于水的原则选择生物可再吸收的区域。因此，选择相关特性，即，所含的官能团的种类、生物可再吸收区域和亲水性区域的相对比例，以确保有用的生物可再吸收的组合物保持不溶于水。
示例性可再吸收的聚合物包括，例如，通过合成产生的聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧化烯)的可再吸收嵌段共聚物(参见，Cohn等人，美国专利号4,826,945)。这些共聚物是不交联的并且溶于水，从而身体可排泄降解的嵌段共聚物组分。参见，Younes等人，J.Biomed.Mater.Res.21：1301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。
目前优选的生物可再吸收的聚合物包括选自聚(酯)、聚(羟酸)、聚(内酯)、聚(酰胺)、聚(酯-酰胺)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(硫酯类)、多糖和其混合物。更优选地，生物可吸收的聚合物包含聚(羟基)酸成分的一个或多个组分。在聚(羟基)酸中，聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸和其混合物和共聚物是优选的。
除了形成在体内被吸收的(“生物再吸收的”)片段外，用于本发明的方法的优选的聚合物包衣也可形成可排泄的和/或可代谢的片段。
更高级的共聚物也可用于本发明。例如，Casey等人，1984年3月20日发布的美国专利号4,438,253公开了从聚(乙醇酸)和以羟基结尾的聚(亚烷基二醇)的酯交换反应产生的三嵌段共聚物。这些组合物被公开用作可再吸收的单丝缝线。通过将原碳酸芳香酯(aromatic orthocarbonate)例如四对甲苯基原碳酸酯整合入共聚物结构来控制这些组合物的灵活性。
也可使用其他基于乳酸和/或乙醇酸的聚合物。例如，1993年4月13日公布的Spinu的美国专利号5,202,413公开了可生物降解的三嵌段共聚物，所述共聚物具有顺序排列的聚丙交酯和/或聚乙醇酸的嵌段，所述聚丙交酯和/或聚乙醇酸是通过丙交酯和/或乙醇酸在寡聚二醇或二胺残基上开环聚合形成，然后通过双功能化合物，例如，二异氰酸酯、二酰氯或二氯甲硅烷进行链延伸产生的。
可将用于本发明的包衣的生物可再吸收区域设计成可水解和/或可酶促断裂的。根据本发明，“可水解断裂的”是指共聚物，特别是生物可再吸收区域在水或含水的环境中易于水解的倾向。类似地，此处所用的“可酶促断裂的”是指共聚物，特别是生物可再吸收区域，易于被内源或外源酶断裂的倾向。
当在体内时，亲水性区域可被加工成可排泄的和/或可代谢的片段。因此，亲水性区域可包括，例如，聚醚、聚环氧烷、多元醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(烷基_唑啉)、多糖、糖、肽、蛋白和其共聚物和混合物。此外，亲水性区域也可以是例如聚环氧烷。这些聚环氧烷可包括例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和其混合物和共聚物。
作为水凝胶成分的聚合物也用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大量的水的聚合物材料。水凝胶形成性化合物的例子包括，但不限于，聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、角叉菜聚糖和其他多糖、羟基亚乙基甲基丙烯酸(HEMA)和其衍生物等。可产生稳定的、可生物降解的和生物可再吸收的水凝胶。此外，水凝胶组合物可包含表现这些特性的一种或多种的亚基。
可通过交联控制其完整性的生物相容性水凝胶组合物是已知的，目前优选地将其用于本发明的方法中。例如，1995年4月25日公布的Hubbell等人的美国专利号5,410,016和1996年6月25日公布的5,529,914公开了可溶于水的系统，所述系统是交联的嵌段共聚物，所述共聚物具有夹在两种水解不稳定的延伸物(extension)之间的可溶于水的中心嵌段片段。此外，这些共聚物还在末端加上可光聚合的丙烯酸(酯)官能团。当这些系统交联时，其变成水凝胶。这些共聚物的可溶于水的中心嵌段可包含聚(乙二醇)；而水解不稳定的延伸物可以是聚(α-羟酸)，例如聚羟基乙酸或聚乳酸。参见，Sawhney等人，Macromolecules 26：581-587(1993)。
在其他实施方案中，所述凝胶是热致可逆的凝胶。包括组分，例如普朗尼克类、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨酯水凝胶、聚氨酯-脲水凝胶和其组合的热致可逆的凝胶在本发明中是优选的。
在其他示例性实施方案中，本发明的缀合物包含脂质体的成分。可根据本领域技术人员已知的方法，例如，1985年6月11日公布的Eppstein等人的美国专利号4,522,811中描述的方法制备脂质体。例如，可通过将合适的脂(例如硬脂酰磷酯酰乙醇胺、硬脂酰磷酯酰胆碱、花生酰磷酯酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后蒸发溶剂，从而在容器表面留下无水脂质的薄膜，从而制备脂质体制剂。然后将活性化合物或其药物可接受盐的水溶液加入容器。然后用手抹拭容器使脂质材料从容器的侧壁脱离并使脂质团聚体分散，从而形成脂质体悬浮液。
上述微粒和制备所述微粒的方法作为示例提供，其并不限定用于本发明的微粒的范围。对本领域技术人员很明显的是，本发明可使用通过不同方法制备的许多微粒。
上述在可溶于水的聚合物的情况下讨论的结构(包括直链和分枝的)通常也用在不溶于水的聚合物的情况下。因此，例如，半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸分枝性核心可用两种不溶于水的聚合物部分进行官能化。用于产生这些聚合物种类的方法通常和用于产生可溶于水的聚合物的方法非常类似。
也可用PEG部分例如聚乙二醇(PEG)增加治疗性糖肽的体内半衰期。例如，PEG对蛋白的化学修饰(PEG化)增加其分子大小，从而减少其表面和官能团的可接近性，其表面和官能团可接近性依赖于附着至蛋白的PEG的大小。这导致血浆半衰期和蛋白水解稳定性的提高，导致免疫原性和肝吸收的降低(Chaffee等人，J.Clin.Invest.89：1643-1651(1992)；Pyatak等人，Res. Commun. Chem.PatholPharmacol.29：113-127(1980))。已报道白细胞介素2的PEG化增加了其在体内抗肿瘤的能力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：1487-1491(1987))，来源于单克隆抗体A7的F(ab’)2的PEG化已提高了其肿瘤定位性(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，在其他实施方案中，相对于非衍生肽的体内半衰期，通过本发明的方法用PEG部分衍生的肽的体内半衰期获得了增加。
肽的体内半衰期的增加最好表示为在该量上的百分比增加范围。百分比增加范围的下限为大约40％、大约60％、大约80％、大约100％或大约150％或大约200％。百分比增加范围的上限为大约60％、大约80％、大约100％或大约150％或超过大约250％。
生物分子
在其他实施方案中，经修饰的糖具有生物分子。在其他实施方案中，所述生物分子是功能性蛋白、酶、抗原、抗体、肽、核酸(例如，单核苷酸或核苷、寡核苷酸、多核苷酸和单链和更多链的核酸)、凝集素、受体或其组合。
优选的生物分子基本上是无荧光的，或发射如此少量的荧光，以至于其不适合在测定中用作荧光标记。此外，使用非糖的生物分子通常是优选的。该优选性的例外是使用通过其他实体(例如，PEG、生物分子、治疗性部分、诊断部分等)的共价附着修饰的天然发生的糖。在示例性实施方案中，通过本发明的方法将作为生物分子的糖部分缀合至连接体臂，然后将糖-连接体臂缀合至肽上。
用于实践本发明的生物分子可来源于任何来源。可从天然来源分离或通过合成的方法产生所述生物分子。肽可以是天然肽或突变的肽。可通过化学诱变、定点诱变或其他本领域技术人员已知的诱导突变的方法进行突变。用于实践本发明的肽包括，例如，酶、抗原、抗体和受体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体；完整的抗体或抗体片段。所述肽任选地是定向进化程序的产物。
天然来源和合成的肽以及核酸都可用于本发明的缀合物；可通过任何可获得的反应性基团将这些分子附着至糖残基组分或交联剂上。例如，肽可通过反应性胺、羧基、巯基或羟基基团被附着。所述反应性基团可存在于肽的末端或肽链内部的位点上。可通过碱基上的反应性基团(例如，外向环氨基(exocyclic amine))或可获得的糖部分上的羟基(例如，3′-或5′-羟基)附着核酸。可在一个或多个允许合适的反应性基团附着至链上的位点上进一步衍生肽和核酸链。参见，Chrisey等人，Nucleic Acids Res.24：3031-3039(1996)。
在其他实施方案中，选择生物分子以将经本发明的方法修饰的肽导向特定的组织，从而相对于被递送至所述组织的未衍生的肽的量，增强了所述经修饰的肽至该组织的递送。在其他实施方案中，通过衍生，在选择的时间段内被递送至特定组织的经衍生的肽的量增加至少大约20％、更优选地至少大约40％、更优选地至少大约100％。目前，优选的用于靶向应用的生物分子包括抗体、激素和细胞表面受体的配体。
在其他示例性实施方案中，提供了具有生物素的缀合物。因此，例如，通过附着携带一个或多个修饰性基团的抗生物素蛋白或链霉亲和素部分来产生选择性生物素化的肽。
治疗性部分
在其他实施方案中，经修饰的糖包含治疗性部分。本领域技术人员认识到，治疗性部分和生物分子的分类之间具有重叠；许多生物分子具有治疗性特性或潜能。
治疗性部分可以是已被临床应用所接受的药剂或其可以是其用途尚在实验阶段的药物，或其活性或作用机制仍在研究之中的药物。治疗性部分可以是对给定的疾病状态具有已证实的作用，或可以仅仅是假定对给定的疾病状态表现想要的作用。在其他实施方案中，治疗性部分是就其和选择的组织相互作用的能力对其进行筛选的化合物。用于实践本发明的治疗性部分包括来自广泛的具有各种药物学活性的药物种类的药物。优选的治疗性部分基本是非荧光的，或发射出如此微量的荧光以至其不适合在测定中用作荧光标记。此外，通常优选地使用非糖的治疗性部分。该优选性的例外是使用通过其他实体例如，PEG、生物分子、治疗性部分、诊断部分等的共价附着而修饰的糖。在其他示例性实施方案中，通过本发明的方法将治疗性糖部分缀合至连接体臂，然后将糖-连接体臂缀合至肽上。
将治疗和诊断剂缀合至各种其他种类分子的方法对于领域技术人员来说是熟知的。参见，例如Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人(编者).POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在示例性实施方案中，通过键将治疗性部分附着至经修饰的糖上，所述键在选择的条件下被断裂。示例性条件包括，但不限于，选择的pH(例如，胃、肠、内吞噬泡)、具有活性的酶的存在(例如，酯酶、还原酶、氧化酶)、光、热等。许多可断裂的基团在本领域是已知的。参见，例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761：152-162(1983)；Joshi等人，J. Biol. Chem.，265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，143：1859-1867(1989)。
有用的治疗性部分的种类包括，例如，非类固醇类消炎药(NSAIDS)。例如，NSAIDS可选自下列种类：(例如，丙酸衍生物、乙酸衍生物、芬那酸(fenamic acid)衍生物、二苯基羧酸衍生物和oxicam)；类固醇类消炎药物，包括氢化可地松等；抗组胺药(例如，氯苯那敏、苯丙烯啶)；镇咳药(例如，右美沙芬、可待因、氨环戊酯和咳必清)；止痒药(例如，甲地嗪和阿利马嗪)；抗胆碱能药(例如，东莨菪碱、阿托品、后马托品、左旋多巴)；止吐药和止恶心药(例如，赛克利嗪、氯苯甲嗪、氯普吗嗪、布可立秦、)；减食欲的药(例如，苄非他明、苯(叔)丁胺、氯苯丁胺、氟苯丙胺)；中枢兴奋剂药品(例如，安非他明、甲基苯丙胺、右旋苯丙胺和苯哌啶醋酸甲酯)；抗心律失常药(例如，心得安、普鲁卡因胺、吡二丙胺、奎尼丁、恩卡胺)；β-肾上腺素阻断药(例如，美多心安、醋丁洛尔、倍他洛尔、拉贝洛尔和噻吗洛尔)；强心药(例如，米利酮、氨吡酮和多巴酚丁胺)；抗高血压药(例如，恩纳普利、可乐定、肼屈嗪、米诺地尔、胍那决尔、胍乙啶)；利尿剂(例如，盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪)；血管舒张剂(例如，地尔硫卓、胺碘酮、苯氧丙酚胺、苄丙酚胺、妥拉苏林和维拉帕米)；血管收缩药(例如，氢化麦角胺、氢化麦角胺和甲基麦角碱)；抗溃疡药(例如雷尼替丁和西米替丁)；麻醉剂(例如，利多卡因、布比卡因、氯普鲁卡因、狄布卡因)；抗抑郁药(例如，米帕明、地昔帕明、阿米替林、去甲替林)；镇定剂和镇静剂(例如，甲氨二氮卓、benacytyzine、苯喹酰胺、氟胺安定、安他乐、洛沙平和丙嗪)；抗精神病药(例如，氯普噻吨、氟奋乃静、氟派啶醇、吗茚酮、甲硫达嗪和三氟拉嗪)；抗微生物药(抗菌药、抗真菌药、抗原虫药和抗病毒药物)。
优选地被整合入本组合物中的抗微生物药物包括，例如，β-内酰胺药物、喹诺酮药、环丙沙星、氟哌酸、四环素、红霉素、阿米卡星、二氯苯氧氯酚、脱氧土霉素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、地霉素、克林霉素、乙胺丁醇、己脒定、异硫代硫酸盐、甲硝唑、喷他眯、庆大霉素、卡那霉素、lineomycin、甲烯土霉素、乌洛托品、米诺环素、新霉素、netilmycin、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、咪康唑和金刚烷胺的药物可接受盐。
用于实践本发明的其他药物部分包括抗肿瘤药(例如，抗雄激素物质(例如，亮丙瑞林或氟他米特)、杀细胞剂(例如，亚德里亚霉素、多柔比星、紫杉酚、环磷酰胺、白消安、顺铂、β-2-干扰素)抗-雌激素(例如，三苯氧胺)、抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、甲氨喋呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤)。该类药物还包括用于诊断和治疗的基于放射性同位素的药物，和经缀合的毒素，例如蓖麻毒蛋白、格尔德霉素、mytansin、CC-1065、the duocarmycins、Chlicheamycin和其相关的结构和类似物。
治疗性部分也可以是激素(例如，甲羟孕酮、雌二醇、亮丙瑞林、甲地孕酮、善得定或生长激素抑制素)；肌肉驰缓剂(例如，桂麻黄碱、环苯扎珠、黄酮哌酯、邻甲苯海拉明、罂粟碱、甲苯凡林、异达维林、利托君、地芬诺酯、硝苯呋海因和阿珠莫林)；镇痉剂；骨活性药物(例如，二磷酸盐和膦酰基烷基膦酸药物复合物)；内分泌调节药(例如，避孕药(例如，ethinodiol、乙炔雌二醇、炔诺酮、甲氢龙、地索高诺酮、甲羟孕酮)；糖尿病调节剂(例如，格列本脲或氯磺丙脲)；anabolics，例如睾内酯或康力龙、雄激素(例如，甲睾酮、睾丸素或氟氢甲睾酮)、抗利尿剂(例如，去氨基精加压素)和降钙素)。
也用于本发明的是雌激素(例如，二乙基己烯雌酚)、糖皮质激素(例如，去炎松、倍他米松等)和孕激素，例如炔诺酮、炔诺醇、炔诺酮、乙羟基二降孕甾烯炔酮；甲状腺试剂(例如，碘甲腺氨酸钠或左旋甲状腺素)或抗甲状腺试剂  (例如，甲巯咪唑)；antihyperprolactinemic药(例如，卡麦角林)；激素抑制剂(例如，达那唑或戈舍瑞林)、催产药(例如，甲基麦角新碱或缩宫素)和前列腺素，例如mioprostol、前列地尔或地诺前列腺。
其他有用的修饰性基团包括免疫调节药物(例如、抗组胺剂、肥大细胞稳定剂，例如洛多酰胺和/或色甘酸钠、类固醇(例如，去炎松、beclomethazone、可的松、地塞米松、去氢氢化可的松、甲基氢化泼尼松、倍氯米松或氯氟美松)，组胺H2拮抗药(例如，法莫替丁、西米替丁、雷尼替丁)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、环孢霉素)等。也使用具有消炎活性的药物例如sulindac，依托度酸，酮洛芬和酮咯酸。用于本发明的缀合物的其他药物对于本领域技术人员来说是显然的。
经修饰的糖的制备
一般地，通过使用反应性基团将糖部分和修饰性基团连接在一起，所述反应性基团一般通过连接方法转化成新的有机官能团或非反应性类型。糖反应性官能团位于糖部分上的任何位置。用于实践本发明的反应性基团和反应种类通常是生物缀合物化学领域内熟知的。目前可获得的和反应性糖部分反应的有利的反应类型是在相对温和条件进行的反应类型。这些类型包括，但不限于亲核取代反应(例如，胺和具有酰卤的醇、活性酯的反应)、亲电取代反应(例如，烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子多键的加成反应(例如，Michael反应，Diels-Alder加成反应)。在例如，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中描述了这些反应和其他有用的反应。
附着在糖核心或修饰性基团上的有用的反应性官能团包括，但不限于：
(a)  羧基和其各种衍生物，包括，但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯；
(b)  羟基，其可转变成例如，酯、醚、醛等。
(c)  卤烷基，其中卤化物以后可被亲核基团例如，胺、羧酸盐阴离子、巯基阴离子、负碳离子、或醇盐离子置换，从而在卤素原子的官能团上产生新基团的共价附着；
(d)  亲双烯基例如马来酰亚胺基，其可用于Diels-Alder反应；
(e)  醛基或酮基，这样通过形成羰基衍生物例如，亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过这些机制例如Grignard加成反应或烷基锂加成反应可能进行随后的衍生化；
(f)  随后和胺反应形成例如氨磺酰的磺酰卤；
(g)  硫醇基，其可被转化成例如二硫化物或可与酰卤反应；
(h)  胺或巯基，其可被例如酰化、烷化或氧化；
(i)  烯，其可进行例如环加成反应、酰化反应、Michael加成反应等；和
(j)  环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应。
可选择反应性官能团以使其不参与，或不干扰装配反应性糖核心或修饰性基团所必需的反应。可选择地，保护性基团的存在可使反应性官能团不参与反应。本领域技术人员知道保护特定官能团以使其不干扰所选择的成套反应条件的方法。有关有用的保护性基团的例子，参见，例如Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
在下面的描述中，列出了许多用于实践本发明的经修饰的糖的特定例子。在示例性实施方案中，将唾液酸衍生物用作修饰性基团附着的糖核心。着重对唾液酸衍生物的描述仅仅是为了举例说明，不应当解释为限制本发明的范围。本领域技术人员认识到，可以与提供的使用唾液酸作为例子的方法相似的方法活化和衍生许多其他糖部分。例如，可获得许多方法将半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖修饰成可容易地被本领域公认的方法修饰的一些糖底物。参见，例如，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6：93(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.65：24(2000))。
在示例性实施方案中，通过本发明的方法修饰的肽是糖肽，其产生于原核细胞(例如，大肠杆菌)、真核细胞，包括酵母和哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，或产生于转基因动物，从而其包含未完全唾液酸化的N-和/或O-连接的寡糖链。缺少唾液酸但包含末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可被糖-PEG基化、糖-PPG化或可用经修饰的唾液酸进行修饰。
在示意图4中，用被保护的氨基酸(例如，甘氨酸)衍生物的活化酯来处理氨基糖苷1，将所述糖胺残基转化成对应的被保护的氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理所述加合物以形成α-羟基羧酸2。通过CMP-SA合成酶的作用，将化合物2转化成对应的CMP衍生物，然后催化氢化CMP衍生物，从而产生化合物3。通过甘氨酸加合物的形成所引入的胺用作PEG或PPG附着的位置，通过将化合物3和活化的(m-)PEG或(m-)PPG衍生物反应(例如，PEG-C(O)NHS、PPG-C(O)NHS)实现所述附着，从而分别产生4或5。
示意图4
Figure A20058000647401021
表2提供了用PEG或PPG部分衍生的单磷酸糖的代表性例子。通过示意图4的方法制备表2的某些化合物。通过本领域公认的方法制备其他衍生物。参见，例如，Keppler等人，Glycobiology 11：11R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 10：1049(2000))。其他胺反应性PEG和PPG类似物可商购获得，或其可通过本领域技术人员容易获得的方法制备。
表2
Figure A20058000647401031
用于实践本发明的经修饰的磷酸糖可在其他位点和上述位点被取代。本发明中优选的唾液酸的取代示于式I：
Figure A20058000647401041
其中X是连接性基团，其优选地选自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和-N(R)2，其中各R是独立地选自R1-R5的成员。符号Y、Z、A和B各表示选自上面提供的X所代表的基团。X、Y、Z、A和B是各自独立地选择的，因此，其可以相同或不同。符号R1、R2、R3、R4和R5表示H、可溶于水的聚合物、治疗性部分、生物分子或其他部分。可选择地，这些符号表示和可溶于水的聚合物、治疗性部分、生物分子或其他部分连接的连接体。
附着至此处公开的缀合物上的示例性部分包括，但不限于，PEG衍生物(例如，烷基-PEG、酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG氨基甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，烷基-PPG、酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG氨基甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗性部分、诊断性部分、甘露糖-6-磷酸、  肝素、乙酰肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、Sialyl Lewis X、FGF、VFGF、蛋白、软骨素、角质素、皮肤素、白蛋白、整联蛋白、触角寡糖、肽等。将各种修饰性基团缀合至糖部分的方法对于本领域技术人员来说是容易获得的(POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY：BIOTECHNICAL ANDBIOMEDICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICALAPPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUEs，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，(编者).POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS SymposiumSeries第469卷，，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
交联基团
用于本发明的方法的经修饰的糖的制备包括将修饰性基团附着至糖残基和形成稳定的加合物，所述加合物是糖基转移酶的底物。可通过0级或更高级交联剂将糖和修饰性基团偶联。可用于将修饰性基团附着至糖部分的示例性双功能化合物包括，但不限于，双功能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。用于连接糖和其他分子的一般方法在文献中是已知的。参见，例如，Lee等人，Biochemistry 28：1856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)和Bednarski等人，WO92/18135。在下面的描述中，在新产生的经修饰的糖的糖部分上，温和地处理反应性基团。描述的重点在于举例说明。本领域技术人员认识到，讨论也适用于修饰性基团上的反应性基团。
示例性策略包括使用异双功能交联剂SPDP(正琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯将受保护的巯基整合入糖中，然后对所述巯基去保护以和修饰性基团上的其他巯基形成二硫键。
如果SPDP不利地影响经修饰的糖用作糖基转移酶的底物的能力，那么使用大量的其他交联剂中的一种例如2-亚氨基四氢噻吩或N-琥珀酰亚胺S-乙酰基硫代乙酸(SATA)形成二硫键。2-亚氨基四氢噻吩和伯胺反应，立刻将未受保护的巯基整合到含胺的分子上。SATA也和伯胺反应，但只整合受保护的巯基，然后使用羟胺将其去乙酰化以产生游离的巯基。在各情况下，被整合的巯基很容易地与其他巯基或受保护的巯基如SPDP反应，形成所需的二硫键。
上述策略是示例性的，并不限定用于本发明的连接体。可获得可用于将修饰性基团交联至肽上的不同策略的其他交联剂。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶基)巯基-丙酰肼)和糖部分反应(所述糖部分之前已通过温和的高碘酸盐处理氧化)，从而在交联剂的酰肼部分和由高碘酸盐产生的醛之间形成腙键。TPCH和TPMPH将受2-吡啶基硫酮保护的巯基引入糖中，其可用DTT进行去保护，然后用于缀合反应，例如在组分之间形成二硫键。
如果发现二硫键不适合用于产生稳定的经修饰的糖，可使用在组分间整合更稳定的键的其他交联剂。异双功能交联剂GMBS(N-γ-马来酰亚胺丁酰氧)琥珀酰亚胺)和SMCC(琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷)和伯胺反应，从而将马来酰亚胺基引入组分中。马来酰亚胺基随后可和其他组分上的巯基(所述巯基可通过前面提到的交联剂引入)反应，从而在组分之间形成稳定的硫酯键。如果组分之间的空间位阻干扰了组分的活性或经修饰的糖用作糖基转移酶的底物的能力，那么可使用在组分之间引入长间隔臂的交联剂，其包括一些前面提到的交联剂(即，SPDP)的衍生物。因此，存在大量合适的有用的交联剂；各交联剂的选择依赖于其具有的对最佳肽缀合物和经修饰的糖生产的作用。
许多试剂用于修饰具有分子内化学交联的经修饰的糖的组分(有关交联反应剂和交联方法的综述，参见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，In：ENZYMESAS DRUGS.(Holcenberg，和Roberts，(编者)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17：167-183，1993，所有文献在此引用作为参考)。优选的交联剂来源于各种零长度、同双功能和异双功能交联剂。零长度交联剂包括两个自身的化学基团的直接缀合而无外来材料的引入。催化二硫键形成的试剂属于该类别。其他的例子是诱导羧基和伯胺缩合从而产生酰胺键的试剂，例如碳二亚胺、乙基氯甲酸酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑_-3′-磺酸酯)和羰二咪唑。除了这些化学试剂外，转谷氨酰胺酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨酰基转移酶；EC 2.3.2.13)可用作零长度交联剂。该酶通常使用伯胺作为底物，在蛋白结合的谷氨酰残基的氨甲酰基上催化酰基转移反应。优选的同和异双功能试剂分别包含2个相同的或2个不同的位点，所述位点对氨基、巯基、胍基、吲哚基或非特异性基团具有反应性。
i.交联剂中优选的特异性位点
1.氨基反应性基团
在一个实施方案中，交联剂上的位点是氨基反应性基团。氨基反应性基团的有用的非限定性的例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨酸酯、异氰酸酯、酰卤、芳基叠氮化物、对-硝基苯基酯、醛和磺酰基氯.。
NHS酯优先地和经修饰的糖组分的伯(包括芳香)胺基反应。已知组氨酸的咪唑基和伯胺竞争反应，但反应产物是不稳定的并且容易水解。所述反应包括胺对NHS酯的酸羧基的亲核攻击以形成酰胺，从而释放N-羟基琥珀酰亚胺。因此，原始氨基的正电荷丢失。
亚氨酸酯是和经修饰的糖组分的胺基反应的最特异性的酰化试剂。在pH在7至10之间时，亚氨酸酯只和伯胺反应。伯胺亲核攻击亚胺酸酯，从而产生在高pH下分解成脒的中间物或在低pH下产生新的亚胺酸酯的中间物。新的亚胺酸酯可和其他伯胺反应，从而交联两个氨基，这是个假定的单功能亚胺酸酯发挥双功能作用的情况。和伯胺反应的主要产物是比原始的胺碱性更强的脒。原始的氨基的正电荷从而得到保留。
异氰酸酯(和异硫氰酸酯)和经修饰的糖组分的伯胺反应，形成稳定的键。其和巯基、咪唑以及酪氨酰基的反应产生了相对不稳定的产物。
酰叠氮也用作氨基特异性试剂，其中亲和性组分的亲核胺在弱碱性条件例如在pH8.5下攻击酸性羧基。
芳基卤化物例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯优先地和经修饰的糖组分的氨基和酪氨酸酚基反应，但也和巯基和咪唑基反应。
单和双羧酸的对硝基苯酯也是有用的氨基反应性基团。尽管该试剂的特异性不是非常高，但α和ε氨基似乎反应最快。
醛例如戊二醛和经修饰的糖的伯胺反应。尽管在氨基和醛类的醛基反应后形成不稳定的希夫碱，但戊二醛能够用稳定的交联修饰经修饰的糖。在pH6-8(典型的交联条件pH)，环状聚合物进行脱水从而形成α-β不饱和醛类聚合物。但是，当缀合至其他双键时，希夫碱是稳定的。两个双键的共振相互作用阻止了希夫键的水解。此外，在高局部浓度下的胺可攻击乙烯双键，从而形成稳定的Michael加成产物。
芳族磺酰氯和经修饰的糖组分的多个位点反应，但和氨基的反应最重要，其导致稳定的氨磺酰键。
2.巯基反应性基团
在其他实施方案中，所述位点是巯基反应性基团。有用的、非限定性巯基反应性基团的例子包括马来酰亚胺、烷基卤化物、吡啶二硫化物和硫代苯邻二甲酰亚胺。
马来酰亚胺优先地和经修饰的糖组分的巯基反应以形成稳定的硫醚键。其也以更慢的速率和伯胺基和组氨酸的咪唑基反应。但在pH7下，可认为马来酰亚胺基是巯基特异性基团，因为在该pH下，简单硫醇的反应速率超过对应的胺的速率的1000倍。
烷基卤化物和巯基、硫化物、咪唑和氨基反应。但在中性和弱碱性pH下，烷基卤化物主要和巯基反应形成稳定的硫醚键。在更高的pH下，和氨基的反应占优。
吡啶二硫化物通过二硫化物交换和游离的巯基反应，产生混合的二硫化物。因此，吡啶基二硫化物是最特异的巯基反应性基团。
硫代苯邻二甲酰亚胺和游离的巯基反应形成二硫化物。
3.羧基反应性残基
在其他实施方案中，溶于水和有机溶剂的碳二亚胺用作羧基反应性试剂。这些化合物和游离羧基反应，形成假脲，然后所述假脲可偶联至可获得的胺上，产生酰胺键，教导了用碳二亚胺修饰羧基的方法(Yamada等人，Biochemistry 20：4836-4842，1981)。
ii.交联剂中优选的非特异性位点
除了使用位点特异性反应性部分外，本发明涉及使用非特异性反应性基团将糖连接至修饰性基团。
示例性非特异性交联剂包括可光激活的基团，其在黑暗中是完全惰性的，其在吸收合适的能量的光子后被转化成反应性基团种类。在一个实施方案中，可光激活的基团选自氮宾的前体，其是通过加热叠氮化物或叠氮化物通过光分解产生的。缺电子的氮宾具有极强的反应性，可和各种化学键(包括N-H、O-H、C-H和C＝C)反应。尽管可使用三种类型的叠氮化物(芳基、烷基和酰基衍生物)，但在本发明中使用芳基叠氮化物。光分解后芳基叠氮化物和N-H以及O-H的反应性比和C-H键的反应性好。缺电子芳基氮宾快速展开环形成易于和亲核试剂反应的脱氢氮杂卓，而不是形成C-H插入产物。吸电子取代基例如环上的硝基或羟基的存在可增加芳基叠氮化物的反应性。这些取代基将芳基叠氮化物的最大吸收推至更长的波长。未取代的芳基叠氮化物具有260-280nm范围内的最大吸收，而羟基和硝基芳基叠氮化物显著吸收超过305nm的光。因此，羟基和硝基芳基叠氮化物是最优选的，因为其允许对亲和性组分使用比未取代的芳基叠氮化物毒害更小的光分解条件。
在其他优选的实施方案中，可光激活的基团选自氟化芳基叠氮化物。氟化芳基叠氮化物的光分解产物是芳基氮宾，其都高效地进行该基团的特征反应，包括C-H键插入(Keana等人，J.Org.Chem.55：3640-3647，1990)。
在其他实施方案中，可光激活的基团选自苯酮残基。苯酮试剂通常产生比芳基叠氮化物更高的交联产量。
在其他实施方案中，可光激活的基团选自重氮化合物，其光分解后形成缺电子卡宾。这些卡宾进行各种反应，所述反应包括插入C-H键内、双键的加成反应(包括芳基系统)、吸引氢原子和与亲核中心的配位，从而产生碳离子。
在其他实施方案中，可光激活的基团选自二偶氮丙酮酸。例如，对硝基苯二偶氮丙酮酸的对硝基苯酯和脂肪族胺反应，产生二偶氮丙酮酸酰胺，所述二偶氮丙酮酸酰胺通过紫外光分解形成醛。经光分解的二偶氮丙酮酸修饰的亲和性组分将如甲醛或戊二醛一样进行反应，形成交联。
iii.同双功能试剂
1.和伯胺反应的同双功能交联剂
在文献(关于交联方法和试剂的综述，参见上面)中商业性地描述了胺反应性交联剂的合成、性质和应用。许多试剂可商购获得(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.；Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双功能NHS酯的优选的、非限定性的例子包括二琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)、二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)，双(硫基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS)，二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二硫琥珀酰亚胺酒石酸酯(硫基-DST)、双-2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧)乙基砜(BSOCOES)、双-2-(硫代琥珀酰亚胺氧基羰基氧)乙基砜(硫代-BSOCOES)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸)(EGS)、乙二醇双(硫代琥珀酰亚胺琥珀酸)(硫代-EGS)、二硫代双(琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)、和二硫代双(硫代琥珀酰亚胺丙酸酯(硫代-DSP)。同双功能亚氨酸酯的优选的、非限定性例子包括二甲基丙二酰亚胺酯(DMM)、二甲基琥珀酸亚胺酯(DMSC)、二甲基己二酰亚胺酯(DMA)、二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)、二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)、二甲基-3，3′-氧二丙酸亚胺酯(DODP)、二甲基-3，3′-(亚甲基二氧)二丙酸亚胺酯(DMDP)、二甲基-3′-(二亚甲基二氧)二丙酸亚胺酯(DDDP)、二甲基-3，3′-(四亚甲基二氧)-二丙酸亚胺酯(DTDP)和二甲基-3，3′-二硫代双丙酸亚胺酯(DTBP)。
同双功能异硫氰酸酯的优选的、非限定性的例子包括：对苯二异硫氰酸酯(DITC)和4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸均二苯乙烯(DIDS)。
同双功能异氰酸酯的优选的、非限定性的例子包括：二甲苯-二异氰酸酯、甲苯-2，4-二异氰酸酯、甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二异氰酸酯、2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二异氰酸酯和六亚甲基二异氰酸酯。
同双功能芳基卤化物的优选的、非限定性的例子包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜。
同双功能脂肪族醛的优选的、非限定性的例子包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
同双功能酰化试剂的优选的、非限定性的例子包括二羧酸的硝基苯酯。
同双功能芳族磺酰氯的优选的、非限定性的例子包括苯酚-2，4-二磺酰氯、和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
其他氨基反应性同双功能试剂的优选的、非限定性的例子包括和胺反应生成双氨基甲酸的赤藻糖醇二碳酸酯。
2.和游离巯基反应的同双功能交联剂
这些试剂的合成、性质和用途描述于文献中(关于交联方法和试剂的综述，参见上面)。许多试剂可商购获得(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同双功能马来酰亚胺的优选的、非限定性例子包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺、N，N′-(1，2-亚苯基)双马来酰亚胺、偶氮苯基二马来酰亚胺和双(N-马来酰亚胺甲基)醚。
同双功能吡啶二硫化物的优选的、非限定性例子包括1，4-二-3′-(2′-吡啶二硫基)丙酰胺丁烷(DPDPB)。
同双功能烷基卤化物的优选的、非限定性例子包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘乙酰氨基偶氮苯、α、α’-二碘-对-二甲苯磺酸、α、α’-二溴-对-二甲苯磺酸、N，N′-双(b-溴乙基)苄胺、N，N′-二(溴乙酰基)苯肼和1，2-二(溴乙酰基)氨基-3-苯基丙烷。
3.同双功能可光激活的交联剂
这些试剂的合成、性质和用途描述于文献中(关于交联方法和试剂的综述，参见上面)。其中一些试剂可商购获得(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同双功能可光激活的交联剂的优选的、非限定性例子包括双-β-(4-叠氮唾液酸酰胺)乙基二硫化物(BASED)、二-N-(2-硝基-4-叠氮苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)和4，4′-二硫双苯基叠氮化物。
iv.异双功能试剂
1.具有吡啶基二硫化物部分的氨基反应性异双功能试剂
这些试剂的合成、性质和用途描述于文献中(关于交联方法和试剂的综述，参见上面)。其中许多试剂可商购获得(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
具有吡啶二硫化物部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的、非限定性例子包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺6-3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺己酸酯(LC-SPDP)、硫代琥珀酰亚胺6-3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺己酸酯(硫代-LCSPDP)、4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)和硫代琥珀酰亚胺6-α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯酰胺己酸酯(硫代-LC-SMPT)。
2.具有马来酰亚胺部分的氨基反应性异双功能试剂
这些试剂的合成、性质和用途描述于文献中。具有马来酰亚胺部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的、非限定性例子包括琥珀酰亚胺马来酰亚氨乙酸酯(AMAS)、琥珀酰亚胺3-马来酰亚胺丙酸酯(BMPS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-GMBS)琥珀酰亚胺6-马来酰亚胺基己酸酯(EMCS)、琥珀酰亚胺3-马来酰亚胺基苯甲酸酯(SMB)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-MBS)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)、琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)和硫代琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(硫代-SMPB)。
3.具有烷基卤化物部分的氨基反应性异双功能试剂
这些试剂的合成、性质和用途描述于文献中。具有烷基卤化物部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的、非限定性例子包括N-琥珀酰亚胺-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、硫代琥珀酰亚胺-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(硫代-SIAB)、琥珀酰亚胺-6-(碘乙酰基)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺-6-(6-((碘乙酰基)-氨基)己酰氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亚胺-6-(((4-(碘乙酰基)-氨基)-甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)、和琥珀酰亚胺-4((碘乙酰基)-氨基)甲基环己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基反应性NHS酯和烷基卤化物部分的异双功能试剂的例子是N-羟基琥珀酰亚胺2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。SDBP通过缀合其氨基给亲和性组分引入分子内交联。二溴丙酰部分对伯胺的反应性受反应温度的调控(McKenzie等人，Protein Chem.7：581-592(1988))。
具有烷基卤化物部分和氨基反应性对硝基苯酯的异双功能试剂的优选的、非限定性例子包括对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)。
其他交联剂对于本领域技术人员来说是已知的。参见，例如，Pomato等人，美国专利号5,965,106。选择用于特定用途的合适的交联剂在本领域技术人员的能力范围之内。
v.可切割的连接体基团
在其他实施方案中，为连接体基团提供了可被切割从而从糖残基释放出修饰性基团的基团。许多可切割的基团在本领域是已知的。参见，例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem. 265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.143：1859-1867(1989)。另外，大量可切割的、双功能(同和异双功能的)连接体基团可从厂商例如Pierce获得。
示例性可切割部分可使用光、热或试剂例如硫醇、羟胺、碱、高碘酸等进行切割。此外，某些优选的基团对内吞作出响应而在体内被切割(例如，顺乌头基；参见，Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048(1991))。优选的可切割基团包含这样的可切割部分，所述可切割部分选自二硫化物、酯、酰亚胺、碳酸酯、硝基苯、苯甲酰甲基和安息香基团。
经修饰的糖至肽的缀合
使用合适的酶介导缀合，从而将经修饰的糖缀合至糖基化的或非糖基化的肽。优选地，选择经修饰的供体糖、酶和受体肽的浓度以使糖基化进行至受体被耗尽。下面讨论的考虑因素，尽管是在唾酸转移酶的情况下提出的，通常也可应用于其他糖基转移酶反应。
使用糖基转移酶合成想要的寡糖结构的许多方法是已知的，并且一般可用于本发明。示例性方法描述于，例如WO 96/32491，Ito等人，Pure Appl.Chem. 65：753(1993)和美国专利号5,352,670、5,374,541和5,545,553。
使用单个糖基转移酶或糖基转移酶的组合实践本发明。例如，可使用唾酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在使用超过一种酶的那些实施方案中，酶和底物优选地在起始反应混合物中混合，或在第一酶促反应完成或接近完成时，将进行第二酶促反应的酶和试剂加入至反应介质中。通过在单个容器中按顺序进行两个酶促反应，总产量得到提高，超过其中将中间产物分离的方法。此外，不需要清除和除去额外的溶剂和副产品。
在其他实施方案中，第一和第二酶中的每一种酶都是糖基转移酶。在其他实施方案中，一种酶是内切糖苷酶。在其他实施方案中，使用超过两种酶装配本发明的经修饰的糖蛋白。在将经修饰的糖加入至肽上之前或之后，使用酶在任何位点改变肽上的糖结构。
本发明的缀合物的D-连接的糖基部分一般以附着至肽上的GalNAc部分起始。GalNAc转移酶家族的任何成员可用于将GalNAc部分和肽结合(Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA，和Clausen H(2000).Control of Mucin-Type O-Glycosylation：O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities ofPolypeptide GalNAc-Transferases.(编者，Ernst，Hart和Sinay).Wiley-VCH chapter“Carbohydrates in Chemistry and Biology-aComprehension Handbook”，273-292)。GalNAc部分自身可以是完整的糖基连接体。可选择地，使用超过一种酶和一种或多种合适的该酶的糖基底物构建糖残基，加入经修饰的糖至构建的糖基部分。
在其他实施方案中，所述方法使用一种或多种外切或内切糖苷酶。所述糖苷酶通常是突变体，其通过基因改造用于形成而不是切割糖基键。突变型聚糖酶一般包含活性位点上的酸性氨基酸残基的氨基酸残基替代。例如，当内切聚糖酶是endo-H时，被替代的活性位点一般是位点130上的Asp，位点132上的Glu或其组合。所述氨基酸通常用丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺替代。
突变型酶通常通过和内切聚糖酶水解步骤的逆反应相似的合成步骤催化反应。在这些实施方案中，糖基供体分子(例如，想要的寡糖或单糖结构)含有离去基团，通过进行反应，将供体分子加到肽上的GlcNAc残基上。例如，所述离去基团可以是卤素，例如氟化物。在其他实施方案中，离去基团是Asn，或Asn-肽部分。在其他实施方案中，对糖基供体分子上的GlcNAc残基进行修饰。例如，GlcNAc残基可包含1，2_唑啉部分。
在其他实施方案中，用于产生本发明的缀合物的各酶以催化量存在。特定的酶的催化量根据该酶的底物浓度和反应条件例如温度、时间和pH值的变化而变化。在预先选择的底物浓度和反应条件下确定给定的酶的催化量的方法对本领域技术人员来说是熟知的。
进行上述方法的温度可在从正好零度以上至最敏感的酶变性的温度的范围内变动。优选的温度范围是大约0℃至大约55℃，更优选地大约20℃至大约30℃。在其他示例性实施方案中，使用嗜热性酶在提高的温度下进行本方法的一个或更多个组成部分。
保持反应混合物一段时间，所述时间足以使受体被糖基化，从而形成想要的缀合物。通常可在数小时后检测到一些缀合物，通常在24小时或更短时间内获得可回收的量。本领域技术人员知道，反应速率依赖于许多可变因素(例如，酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)，就选择的系统优化所述因素。
本发明也提供了经修饰的肽的工业大规模生产。如此处所用的，工业规模通常产生至少大约250mg、优选地至少大约500mg、更优选地至少大约1g最终的、纯化的缀合物，优选地其是在单个反应循环后产生的，即所述缀合物不是来自相同的、连续重复的合成循环的反应产物的组合。
在下面的描述中，通过经修饰的唾液酸部分至糖基化肽的缀合例示本发明。用(m-)PEG标记示例性经修饰的唾液酸。下面对经PEG修饰的唾液酸和糖基化肽的使用的重点描述用于举例说明，而不是暗示本发明限定于这两部分的缀合。本领域技术人员理解，所述描述通常可用于非唾液酸的经修饰的糖基部分的添加。此外，所述描述同样可用于用除了PEG以外的试剂(包括其他可溶于水的聚合物、治疗性部分和生物分子)修饰糖基单位。
可使用酶促的方法选择性地将(m-)PEG化或(m-)PPG化的糖引入肽或糖肽。所述方法使用经修饰的含有PEG、PPG或经屏蔽的反应性官能团的糖，并且和合适的糖基转移酶或糖合酶组合。通过选择可产生想要的糖键的糖基转移酶和使用经修饰的糖作为供体底物，可将PEG或PPG直接引入肽主链，引入已存在的糖肽的糖残基或引入已被加至肽上的糖残基。
唾酸转移酶的受体存在于被本发明的方法修饰的肽上，其是作为天然发生的结构或作为通过重组、酶促或化学方法加在肽上的结构存在于肽上的。合适的受体，包括，例如，糖基受体GalNAc、Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本领域技术人员已知的其他受体(参见，例如，Paulson等人，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。
在一个实施方案中，唾酸转移酶的受体存在于在体内合成后被修饰的糖肽上。使用所述方法可唾液酸化这些糖肽而无需所述糖肽的糖基化模式的预先修饰。可选择地，本发明的方法可用于唾液酸化不包含合适的受体的肽；首先通过本领域技术人员已知的方法修饰肽使其包含受体。在示例性实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用将GalNAc残基加至O-连接的糖基化位点。Hassan H、Bennett EP、Mandel U、Hollingsworth MA和Clausen H(2000)。Control of Mucin-TypeO-Glycosylation：O-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases。(编者，Ernst，Hart，和Sinay)。Wiley-VCHchapter“Carbohydrates in Chemistryand Biology-a Comprehension Handbook”，273-292。
在示例性实施方案中，通过将半乳糖残基附着至合适的和肽连接的受体例如GalNAc上来装配半乳糖基受体。该方法包括将待修饰的肽和含有合适量的半乳糖基转移酶(例如，Galβ1，3或Galβ1，4)和合适的半乳糖基供体(例如，UDP-半乳糖)的反应混合物一起温育。使反应进行至基本完成，或可选择地，当预先选择的量的半乳糖残基被加入时终止反应。组装选择的糖受体的其他方法对本领域技术人员来说是显然的。
在其他实施方案中，首先对糖肽连接的寡糖进行整体或部分的“修剪”，从而暴露唾酸转移酶的受体或部分，所述部分是可在其上加入一个或多个合适的残基以获得合适的受体的部分。酶例如糖基转移酶和内切糖苷酶(参见，例如，美国专利号5,716,812)用于附着和修剪反应。
在下面的描述中，通过使用经修饰的糖来示例本发明的方法，所述经修饰的糖具有附着于其上的可溶于水的聚合物。描述的重点在于阐明例子。本领域技术人员认识到所述描述同样适用于这样的实施方案，即在所述实施方案中，经修饰的糖具有治疗性部分、生物分子等。
在示例性实施方案中，O-连接的糖残基在加入经修饰的糖之前被修剪。例如，GalNAc-Gal残基被修剪回GalNAc。将具有可溶于水的聚合物的经修饰的糖缀合至通过“修剪”而暴露的一个或多个糖残基上。在一个示例中，糖肽被“修剪”，通过糖基部分例如缀合至可溶于水的聚合物的Sia、Gal或GalNAc部分将可溶于水的聚合物加至所得的O-侧链氨基酸或糖肽聚糖上。将经修饰的糖基部分附着至“经修剪的”糖肽上的受体位点。可选择地，可将未经修饰的糖基部分，例如，Gal加到O-连接的聚糖的末端。
在另一个示例性实施方案中，通过经修饰的具有半乳糖残基的糖将可溶于水的聚合物加到GalNAc残基上。可选择地，可将未经修饰的Gal加到末端GalNAc残基上。
在其他示例中，使用经修饰的唾液酸将可溶于水的聚合物加至Gal残基上。
在其他示例性实施方案中，将O-连接的糖基残基“修剪”回附着至氨基酸上的GalNAc。在一个实施方案中，通过用聚合物修饰的Gal加入可溶于水的聚合物。可选择地，将未经修饰的Gal加至GalNAc上，接着加入具有附着有可溶于水的聚合物的Gal。在其他实施方案中，将一个或多个未经修饰的Gal加到GalNAc上，然后再加上用可溶于水的聚合物修饰的唾液酸。
上面描述的示例性实施方案提供了此处提供的方法的功能的例证。通过使用本发明的方法，可能“修剪回”和产生几乎所有任何想要的糖残基。可将经修饰的糖加到上面所示的糖部分的末端，或其可以介于肽核心和糖末端之间。
在示例性实施方案中，使用经唾液酸修饰的聚合物将可溶于水的聚合物加到末端Gal残基上。使用合适的唾酸转移酶加入经修饰的唾液酸。所述方法概述于示意图5中。
示意图5
Figure A20058000647401191
在概述于示意图6的其他方法中，被屏蔽的反应性官能团存在于唾液酸上。被屏蔽的反应性基团优选地不受用于将经修饰的唾液酸附着至肽上的条件所影响。在经修饰的唾液酸共价附着至肽后，除去屏蔽剂并用试剂例如PEG、PPG、治疗性部分、生物分子或其他试剂缀合肽。通过其和经修饰的糖残基上的未屏蔽的反应性基团的反应以特异性的方式将试剂缀合至肽上。
示意图6
Figure A20058000647401201
任何经修饰的糖可和其合适的糖基转移酶一起使用，依赖于糖肽寡糖侧链的末端糖(表3)。如上面所描述的，可在表达期间天然地引入糖肽的末端糖，所述糖肽的末端糖是引入PEG化或PPG化的结构所必需的，或所述末端糖可在表达后通过使用合适的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物来产生。
表3
Figure A20058000647401211
  X＝O，NH，S，CH2，N-(R1-5)2.Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.Q＝H2，O，S，NH，N-R.R，R1-4＝H，连接体-M，MM＝目的配体 目的配体＝酰基-PEG，酰基-PPG，烷基-PEG，酰基-烷基-PEG，酰基-烷基-PEG，氨基甲酰基-PEG，氨基甲酰基-PPG，PEG，PPG，酰基-芳基-PEG，酰基-芳基-PPG，芳基-PEG，芳基-PPG，甘露糖-6-磷酸，肝素，类肝素，SLex，甘露糖，FGF，VFGF，蛋白质，软骨素，角质素，皮肤素，白蛋白，整合蛋白，肽等.
在可选择的实施方案中，通过使用已知能将糖残基转移至肽主链的O-连接的糖基化位点上的糖基转移酶来将经修饰的糖直接加到肽主链上。示意图7提供了该示例性实施方案。用于实践本发明的示例性糖基转移酶包括，但不限于，GalNAc转移酶(GalNAc T1-20)、GIcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶等。该方法的使用可使经修饰的糖直接加到缺少任何糖的肽上，或可选择地，加到已存在的糖肽上。在两种情况下，经修饰的糖的加入发生在由糖基转移酶的底物特异性确定的肽主链上的特定位点，而不是如在用化学方法修饰蛋白的肽的过程中发生的以随机的方式加入经修饰的糖。通过基因工程将合适的氨基酸序列导入多肽链中可将许多试剂导入缺少糖基转移酶底物肽序列的蛋白或多肽中。
示意图7
Figure A20058000647401221
在上面提供的每一个示例性实施方案中，在将经修饰的糖缀合至肽上后，可使用一个或多个额外的化学或酶促修饰步骤。在示例性实施方案中，使用酶(例如，岩藻糖基转移酶)将糖基单位(例如，岩藻糖)附着至末端的经修饰的糖上，所述经修饰的糖附着至肽上。在其他实施方案中，利用酶促反应给经修饰的糖不能缀合的位点“加帽”(例如，唾液酸化)。可选择地，使用化学反应改变缀合的经修饰的糖的结构。例如，将缀合的经修饰的糖和稳定或去稳定其与肽组分的连接的试剂反应，所述肽组分是所述经修饰的糖附着的肽。在其他实施方案中，在将经修饰的糖缀合至肽后对其组分进行去保护。本领域技术人员认识到，存在许多酶促和化学方法，所述方法在将经修饰的糖缀合至肽后的阶段用于本发明的方法。其他经修饰的糖-肽缀合物的加工在本发明的范围之内。
在其他示例性实施方案中，将糖肽缀合至靶向性试剂，例如运铁蛋白(将肽递送穿过血脑屏障，递送至内吞小体)、肉碱(将肽递送至肌肉细胞；参见，例如，LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.59：1357-63(2000)和膦酸酯，例如双膦酸化合物(将肽靶向骨和其他含钙组织；参见，例如，Modern Drug Discovery，August 2002，page 10)。用于靶向的其他试剂对本领域技术人员来说是很明显的。例如，葡萄糖、谷氨酰胺和IGF也用于靶向肌肉。
通过任何此处描述的或本领域已知的方法缀合靶向性部分和治疗性肽。本领域技术人员认识到，也可如此处所示的，衍生除了上面提到的肽以外的肽。在2001年10月10日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时专利申请号60/328,523所附的附录中列出了示例性肽。
在示例性实施方案中，通过连接体部分偶联靶向性试剂和治疗性肽。在该实施方案中，根据本发明的方法通过完整的糖基连接性基团将至少一种治疗性肽或靶向性试剂偶联至连接体部分。在示例性实施方案中，连接体部分包含聚(醚)例如聚(乙二醇)。在其他实施方案中，连接体部分包含至少一个这样的键，即其在将缀合物递送至身体的被靶向的组织或区域后在体内被降解，从而从靶向性试剂释放出治疗性肽。
在其他示例性实施方案中，通过改变治疗性部分上的糖形式而不将治疗性肽缀合至靶向性部分来改变治疗性部分在体内的分布。例如，可通过用唾液酸(或其衍生物)给糖基的末端半乳糖部分加帽来使治疗性肽避开网状内皮系统的吸收。
i.酶
1.糖基转移酶
糖基转移酶可以逐步的方式催化活化的糖(供体DNP-糖)加到蛋白、糖肽、脂或糖脂上，或加到正在生长的寡糖的非还原性末端。通过糖基转移酶和脂连接的寡糖供体Dol-PP-NAG2Glc3Man9的模块转移(enblock transfer)以及随后修剪核心来合成N-连接的糖肽。在该情况下，“核心”糖的性质和随后的附着物有些不同。大量的糖基转移酶在本领域是已知的。
用于本发明的糖基转移酶可以是任何酶，只要其可利用经修饰的糖作为糖供体。这些酶的例子包括Leloir途径糖基转移酶，例如半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、岩藻糖基转移酶、唾酸转移酶、甘露糖基转移酶、木糖基转移酶、葡糖醛酸基转移酶(glucurononyltransferase)等。
为进行包括糖基转移酶反应的酶促糖合成，可克隆糖基转移酶，或从任何来源分离其。许多克隆的糖基转移酶是已知的，其多核苷酸序列也同样是已知的。参见，例如，“The WWW Guide To ClonedGlycosyltransferases，”(http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)。可在各种公开可获得的数据库(包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等)中找到糖基转移酶氨基酸序列和编码糖基转移酶的核苷酸序列，糖基转移酶的氨基酸序列可从所述核苷酸序列中推导出来。
可用于本发明的方法的糖基转移酶包括，但不限于，半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、唾酸转移酶、甘露糖基转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖基转移酶。合适的糖基转移酶包括从真核和原核细胞中获得的糖基转移酶。
可通过化学合成，通过筛选来自合适的细胞或细胞系培养物的mRNA的逆转录物，通过筛选来自合适细胞的基因组文库，或通过这些方法的组合获得编码糖基转移酶的DNA。可用从糖基转移酶基因序列产生的寡核苷酸探针对mRNA或基因组DNA进行筛选。可根据已知的方法用可检测的基团例如荧光基团、放射性原子或化学发光基团标记探针，所述探针可用于常规的杂交测定法中。在另一选择中，使用从糖基转移酶基因序列产生的PCR寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)方法可获得糖基转移酶基因序列。参见，属于Mu11is等人的美国专利号4,683,195和属于Mullis的美国专利号4,683,202。
可在用含有编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞中合成糖基转移酶。使用载体扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码糖基转移酶的DNA序列有效地连接至能够在合适的宿主中影响糖基转移酶表达的合适的控制序列上。对这些控制序列的需要视选择的宿主和选择的转化方法变化而变化。一般地，控制序列包括转录启动子、任选的控制转录的操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。所需要的只是在宿主中复制的能力和帮助识别转化子的选择性基因，所述复制能力通常是由复制起始位点提供的。
在示例性实施方案中，本发明使用原核细胞的酶。这些糖基转移酶包括参与脂寡糖(LOS)合成的酶，其是由许多革兰氏阴性细菌产生的  (Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)：139-180(1996))。这些酶包括，但不限于，这些种类例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的rfa操纵子的蛋白，其包括β1，6半乳糖基转移酶和β1，3半乳糖基转移酶(参见，例如，EMBL检索号M80599和M86935(大肠杆菌)；EMBL检索号S56361(鼠伤寒沙门氏菌))、葡糖基转移酶(Swiss-Prot检索号P25740(大肠杆菌)、β1，2-葡糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot检索号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot检索号P19817(鼠伤寒沙门氏菌))、和β1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶(rfaK)(EMBL检索号U00039(大肠杆菌)。其他氨基酸序列已知的糖基转移酶包括由操纵子例如rfaB编码的酶(其已在生物例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、Mycobacteriumleprosum得到表征)和由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操纵子编码的酶。
参与产生这样的结构的糖基转移酶也适合用于本发明，所述结构含有已在粘膜病原体淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS(Scholten等人，J Med.Microbiol.41：236-243(1994))中被鉴定的乳-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰-D-葡糖氨基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖和pk血型三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β1，4-D-葡萄糖。已从脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突变型F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中鉴定了来自脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的编码参与这些结构生物合成的糖基转移酶的基因。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，由三个基因lgtA、lgtB和lg E构成的基因座编码将最后三个糖加入乳-N-新四糖链中所需的糖基转移酶(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271：19166-73(1996))。最近证实了lgtB和lgtA基因产物的酶促活性，为其假定的糖基转移酶功能提供了直接的证据(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)：28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，存在两个另外的基因，将β-D-GalNAc加到乳-N-新四糖结构的末端半乳糖的3位置上的lgtD和将末端α-D-Gal加到截短的LOS的乳糖成分上的lgtC，从而产生Pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)，同上)。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，分开的免疫型L1也表达Pk血型抗原并已显示携带lgtC基因(Jennings等人，(1995)，同上)。奈瑟氏球菌糖基转移酶和相关基因也描述于USPN 5,545,553(Gotschlich)。也已表征来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶的基因(Martin等人，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni)的糖基转移酶也用于本发明(参见，例如，http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
a)岩藻糖基转移酶
在一些实施方案中，用于本发明的方法的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶对本领域技术人员来说是已知的。示例性岩藻糖基转移酶包括将L岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至受体糖的羟基位置的酶。将非核苷酸糖转移至受体的岩藻糖基转移酶也用于本发明。
在一些实施方案中，受体糖是，例如，寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAc基团中的GlcNAc。该反应的合适的岩藻糖基转移酶包括从人奶(参见，Palcic等人，Carbohydrate Res.190：1-11(1989)；Prieels，等人，J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)；和Nunez，等人，Can.J Chem. 59：2086-2095(1981))中首次被表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)和在人血清中被发现的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，即唾酸基α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶也已被表征。也已表征了Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶的重组体形式(参见，Dumas，等人，Bioorg.Med.Letters 1：425-428(1991)和Kukowska-Latallo，等人，Genes and Development 4：1288-1303(1990))。其他示例性岩藻糖基转移酶包括，例如α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。通过Mollicone，等人，Eur.J.Biochem.191：169-176(1990)或美国专利号5,374,655中描述的方法可进行酶促岩藻糖基化。用于产生岩藻糖基转移酶的细胞也包括用于合成GDP-岩藻糖的酶系统。
b)半乳糖基转移酶
在其他实施方案中，糖基转移酶是半乳糖基转移酶.示例性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见，例如，Dabkowski等人，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等人，Nature 345：229-233(1990)、牛(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989))、鼠类(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA86：8227-8231(1989))、猪(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41：101-105(1995))。其他合适的α1，3半乳糖基转移酶是参与血型B抗原合成的半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人))。其他示例性半乳糖基转移酶是核心Gal-T1。
β(1，4)半乳糖基转移酶也适合用于本发明的方法，其包括，例如，EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989))、人(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))、鼠类(Nakazawa等人，J.Biochem.104：165-168(1988))以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38：234-242，(1994))。其他合适的半乳糖基转移酶包括，例如，α1，2半乳糖基转移酶(来自，例如，粟酒裂殖糖酵母(Schizos accharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。
α1，3-半乳糖基转移酶的可溶形式例如Cho，S.K.和Cummings，R.D.(1997)J.Biol.Chem.，272，13622-13628报道的形式也适合于本发明的实践。
c)唾酸转移酶
唾酸转移酶是用于本发明的重组细胞和反应混合物的其他类型的糖基转移酶。产生重组唾酸转移酶的细胞也产生CMP-唾液酸，所述CMP-唾液酸是唾酸转移酶的唾液酸供体。适合用于本发明的唾酸转移酶的例子包括ST3Gal III(例如，大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6Gal NAc I、ST6Gal NAcII和ST6Gal NAc III(此处使用的唾酸转移酶命名系统描述于Tsuji等人，Glycobiology 6：v-xiv(1996))。称作α(2，3)唾酸转移酶(EC 2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾酸转移酶将唾液酸转移至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原性末端Gal上。参见，VandenEijnden等人，J Biol.Chem.256：3159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845 (1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)。其他示例性α2，3唾酸转移酶(EC 2.4.99.4)将唾液酸转移至二糖或糖苷的非还原性末端Gal上。参见，Rearick等人，J.Biol.Chem.254：4444(1979)和Gillespie等人，J.Bioi.Chem.267：21004(1992)。其他示例性酶包括Gal-β-1，4-GicNAc α-2，6唾酸转移酶(参见，Kurosawa等人，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
优选地，为了糖基化糖肽的糖，唾酸转移酶要能够将唾液酸转移至序列Galβ1，4GlcNAc-上，所述序列是在完全唾液酸化的糖结构上的末端唾液酸下的最普遍的次末级序列(penultimate)(参见，表5)。
表5：使用Galβ1，4GIcNAc序列作为受体底物的唾酸转移酶
 唾酸转移酶 来源   形成的序列     Ref.
 ST6Gal I 哺乳动物   NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc-     1
 ST3Gal III 哺乳动物   NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-     1
 ST3Gal IV 哺乳动物   NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-     1
 ST6Gal II 哺乳动物   NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc
 ST6Gal II 发光细菌   NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc-     2
 ST3Gal V 脑膜炎奈瑟氏球菌淋病奈瑟氏球菌   NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-     3
1)Goochee等人，Bio/Technology 9：1347-1355(1991)
2)Yamamoto等人，J.Biochem.120：104-110(1996)
3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.271：28271-28276(1996)
用于所述方法的唾酸转移酶的例子是ST3GalIII，其也被称为α(2，3)唾酸转移酶(EC 2.4.99.6)。该酶催化唾液酸至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的转移(参见，例如，Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：3159(1991))和负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。随着两个糖之间的α键的形成，唾液酸被连接至Gal。糖之间的结合(键)是在NeuAc的2位和Gal的3位之间。可从大鼠肝(Weinstenin等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa&Paulson(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)中分离该特定酶，其基因组DNA序列(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)是已知的，这有利于通过重组表达生产该酶。在其他实施方案中，所述唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
用于本发明的其他示例性唾酸转移酶包括从空肠弯曲杆菌空肠亚种分离的唾酸转移酶，包括α(2，3)。参见，例如，WO99/49051。
表5中所列之外的其他唾酸转移酶也用于商业上重要的糖肽的唾液酸化的经济和有效的大规模加工中。作为发现这些其他酶的用途的简单检测法，将不同量的各酶(1-100mU/mg蛋白)和无唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反应以将目的唾酸转移酶唾液酸化糖肽的能力和牛ST6Gal I、ST3Gal III或这两种唾酸转移酶的该能力进行比较。可选择地，其他糖肽，或通过酶作用从肽主链上释放的N-连接的寡糖可用于替代用于本评估法的无唾液酸-α1AGP。具有比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-连接的寡糖的能力的唾酸转移酶用于肽唾液酸化的实际大规模加工(如在本公开内容中对ST3Gal III举例说明的那样)。其他示例性唾酸转移酶示于图10中。
d)GalNAc转移酶
将N-乙酰半乳糖胺基转移酶用于实践本发明，特别是用于将GalNAc部分结合至肽的O-连接的糖基化位点的氨基酸上。合适的N-乙酰半乳糖胺基转移酶包括，但不限于，α(1，3)N-乙酰半乳糖胺基转移酶、β(1，4)N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol.Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。
通过基因工程从克隆的基因生产蛋白例如酶GalNAc TI-XX是熟知的。参见，例如，美国专利号4,761,371。一个方法包括收集足够的样品，然后通过N末端测序确定酶的氨基酸序列。然后将该信息用于分离编码全长(膜结合的)转移酶的cDNA克隆，所述cDNA在昆虫细胞系Sf9中表达后能够合成全长活性酶。然后在16个不同的蛋白中对围绕在已知的糖基化位点周围的氨基酸进行半定量分析，接着通过合成的肽的体外糖基化研究来确定该酶的受体特异性。该研究已表明某些氨基酸残基过度存在于(overrepresented)糖基化的肽片段中并且表明围绕糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基的特定位点上的氨基酸残基比其他氨基酸残基对受体的效率影响更显著。
2.磺基转移酶
本发明也提供了产生包含硫酸化的分子的肽的方法，所述硫酸化分子包括，例如硫酸化的多糖例如肝素、硫酸乙酰肝素、角叉藻聚糖和相关化合物。合适的磺基转移酶包括，例如，软骨素-6-磺基转移酶(由Fukuta等人，J.Biol.Chem.270：18575-18580(1995)描述的鸡cDNA；GenBank目录号D49915)、糖胺聚糖N-乙酰糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Dixon等人，Genomics 26：239-241(1995)；UL18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-去乙酰酶/N-磺基转移酶2(Orellana等人，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等人，J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)中描述的鼠类cDNA；GenBank目录号U2304中描述的人cDNA)。
3.细胞结合的糖基转移酶
在其他实施方案中，用于本发明的方法的酶是细胞结合的糖基转移酶。尽管许多可溶性糖基转移酶是已知的(参见，例如，美国专利号5,032,519)，当与细胞结合时，糖基转移酶通常以膜结合形式存在。目前研究的许多膜结合蛋白被认为是内在蛋白；即，其不能通过超声处理从膜上释放，其需要去垢剂进行溶解。在脊椎和无脊椎动物细胞的表面已鉴定了表面糖基化转移酶，并且认识到这些表面糖基转移酶在生理条件下保持催化活性。然而，细胞表面糖基转移酶的更受认可的功能是细胞间的识别(Roth，MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA，1990)。
已发展了用于改变由细胞表达的糖基转移酶的方法。例如，Larsen等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：8227-8231(1989)，报道了分离克隆的cDNA序列的遗传学方法，所述cDNA序列决定细胞表面寡糖结构和其相关糖基转移酶的表达。将从已知表达UDP半乳糖：.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠细胞系分离的mRNA产生的cDNA文库转染至COS-1细胞中。然后培养经转染的细胞并就α-1，3-半乳糖基转移酶活性对其进行测定。
Francisco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992)公开了将β-内酰胺酶锚定在大肠杆菌外表面的方法。产生由(i)外膜蛋白的信号序列、(ii)外膜蛋白的跨膜部分和(iii)完全成熟的β-内酰胺酶序列构成的三重融合蛋白，从而得到具有活性的表面结合的β-内酰胺酶分子。然而，Francisco方法只限定于原核细胞系统而且正如作者所承认的，要正常地发挥功能需要完整的三重融合物。
4.融合蛋白
在其他示例性实施方案中，本发明的方法利用融合蛋白，所述融合蛋白具有超过一个参与想要的糖肽缀合物合成的酶促活性。所述融合蛋白可包含例如糖基转移酶的催化活性结构域，所述催化活性结构域被连接至辅助酶(accessory enzyme)的催化活性结构域。辅助酶的催化活性结构域可催化例如，作为糖基转移酶的供体的核苷酸糖的形成中的步骤，或催化涉及糖基转移酶循环的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可按阅读框连接至编码参与核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。然后所得的融合蛋白不仅可催化核苷酸糖的合成，也可催化糖部分至受体分子的转移。所述融合蛋白可以是两个或多个连接成一个可表达的核苷酸序列的循环酶。在其他实施方案中，所述融合蛋白包含两个或多个糖基转移酶的催化活性结构域。参见，例如，5,641,668。可使用各种合适的融合蛋白容易地设计和生产本发明经修饰的糖肽(参见，例如，1999年6月24日以WO99/31224公布的PCT专利申请PCT/CA98/01180)。
5.固定化酶
除了细胞结合的酶以外，本发明也提供了被固定在固体和/或可溶性支持物上的酶的用途。在示例性实施方案中，提供了根据本发明的方法通过完整的糖基连接体被缀合至PEG的糖基转移酶。任选地将PEG-连接体-酶缀合物附着在固体持物上。在本发明的方法中，固体支持的酶的使用简化了反应混合物的建立和反应产物的纯化，并且也使酶更容易回收。在本发明的方法中使用糖基转移酶缀合物。酶和支持物的其他组合对本领域技术人员说是很明显的。
肽缀合物的纯化
可使用通过上述方法产生的产物而无需纯化。然而，通常优选地要回收产物。可使用标准的、熟知的用于糖基化的糖的回收的方法，例如薄层或厚层层析、柱层析、离子交换层析或膜过滤。优选地使用膜过滤，更优选地使用反渗透膜，或一种或多种如在下文中和在此处引用的文献中描述的用于回收的柱层析技术。例如，可用其中膜具有大约3000至大约10,000的分子量截止值的膜过滤除去蛋白例如糖基转移酶。然后可用纳米过滤(nanofiltration)或反渗透法除去盐和/或纯化产物糖(参见，例如，WO98/15581)。纳米滤膜是这种类型的反渗透膜，即依赖于所使用的膜，其可通过单价盐但保留多价盐和大于大约100至大约2000道尔顿的不带电荷的溶质。因此，在典型的应用中，通过本发明的方法制备的糖将被保留在膜上而把污染性盐滤过膜。
如果经修饰的糖蛋白在细胞内产生，第一步骤，通过例如离心或超滤除去微粒碎片，宿主细胞或裂解片段；任选地，可用商购获得的蛋白浓缩过滤器浓缩蛋白，然后通过一个或多个选自下列的方法的步骤将多肽变体从其他杂质中分开，所述方法包括免疫亲和层析、离子交换柱分级分离(例如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺酸丙基的基质上)、在Blue Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、扁豆外源凝集素-Sepharose、WGA-Sepharose、ConA-Sepharose、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl、SP-Sepharose、或A蛋白Sepharose上的层析、SDS-PAGE层析、硅土层析、层析聚焦(chromatofocusing)、反相HPLC(例如，具有附着的脂族基团的硅胶)、使用交联葡聚糖分子筛或大小排阻层析的凝胶过滤、在选择性结合多肽的柱子上的层析、和乙醇或硫酸铵沉淀。
通常通过从细胞、酶等的初步提取，然后通过一步或多步浓缩、盐析、水中的离子交换或大小排阻层析例如SPSepharose步骤来分离产生于培养物中的经修饰的糖肽。此外，可通过亲和层析纯化经修饰的糖蛋白。也可将HPLC用于一个或多个纯化步骤。
也可在前述步骤中使用蛋白酶抑制剂例如甲基磺酰氟(PMSF)来抑制蛋白质水解，并可使用抗生素抑制偶生污染物(adventitiouscontaminant)的生长。
在其他实施方案中，首先用商购可获得的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单位浓缩上清液，所述上清液来自产生本发明的经修饰的糖肽的系统。在浓缩步骤后，可将浓缩物加到合适的纯化基质上。例如，合适的亲和基质可包含结合在合适的支持物上的肽的配体、凝集素或抗体分子。可选择地，可使用阴离子交换树脂，例如，具有附着的DEAE基团的基质或底物。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或普遍用于蛋白纯化的其他类型物质。可选择地，可使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不溶性的包含磺丙基或羧甲基的基质。磺丙基是特别优选的。
最后，可使用一步或多步利用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有附着的甲基或其他脂族基团的硅胶)的RP-HPLC步骤进一步纯化多肽变体组分。也可使用以各种组合形式存在的一些或所有前述纯化步骤来提供均一的经修饰的糖肽。
可通过与Urdal等人，J.Chromatog.296：171(1984)公开的方法相似的方法纯化由大规模发酵产生的本发明的经修饰的糖肽。该参考资料描述了用于在制备级HPLC柱上纯化重组人IL-2的两个连续的RP-HPLC步骤。可选择地，可使用技术例如亲和层析来纯化经修饰的糖蛋白。
药物组合物
根据本发明的方法在各种O-连接的糖基化位点被修饰的多肽具有广泛的药物用途。例如，可使用经修饰的促红细胞生成素(EPO)治疗一般性贫血、再生障碍性贫血症、化学诱导的损伤(例如对骨髓的损伤)、慢性肾衰竭、肾炎和地中海贫血。经修饰的EPO可进一步用于治疗神经疾病例如脑/脊柱损伤、多发性硬化症和阿尔茨海默氏病。
第二例子是干扰素α(IFN-α)，其可用于治疗AIDS和B或C型肝炎，由各种病毒例如人乳头状瘤病毒(HBV)、冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的病毒感染、癌症例如毛细胞性白血病、AIDS相关的卡波西肉瘤、恶性黑色素瘤、滤泡性非何杰金淋巴瘤、Philladephia染色体(Ph)-阳性、慢性期髓细胞性白血病(CML)、肾癌、骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病、头和颈的癌症、骨癌以及宫颈发育异常和中枢神经系统(CNS)的病症例如多发性硬化。此外，根据本发明的方法修饰的IFN-α用于治疗其他疾病和病症类型例如Sjogren′s综合症(自身免疫疾病)、Behcet′s疾病(自身免疫炎性疾病)、纤维肌痛(肌骨骼疼痛/疲劳病症)、口疮性溃疡(口疮)、慢性疲劳综合症和肺纤维化。
另一个例子是干扰素β，其用于治疗CNS病症例如多发性硬化(复发性/缓和性或慢性进行性)、AIDS和B型或C型肝炎、由各种病毒例如人乳头状瘤病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的病毒感染、耳传染、肌骨骼的传染、和癌症(包括乳腺癌、脑癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、头颈癌、基底细胞癌、宫颈发育异常、黑色素瘤、皮肤癌和肝癌)。根据本发明的方法修饰的IFN-β也用于治疗其他疾病和病症例如移植排斥(例如，骨髓移植)、亨廷顿舞蹈病、结肠炎、脑炎、肺纤维化、黄斑变性、肝硬化和角膜结膜炎。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是另外的例子。根据本发明的方法修饰的G-CSF在治疗癌症的化疗中可用作辅助手段，和用于预防或减轻病症或与某些医疗方法关联的并发症例如化学诱导的骨髓损伤、白细胞减少症(普通)、化学-诱导的热性嗜中性白血球减少症、和骨髓移植关联的嗜中性白血球减少症以及严重的、慢性嗜中性白血球减少症。经修饰的G-CSF也可用于移植；用于外周血细胞动员；用于在即将接受骨髓清除或骨髓抑制剂化疗的患者中收集的外周血干细胞的动员；和用于减少白细胞减少症、发烧、抗生素使用、在急性骨髓白血病(AML)的诱导性/和巩固治疗后的住院的持续时间。其他可用经修饰的G-CSF治疗的疾病或病症包括哮喘和过敏性鼻炎。
作为一个其他的例子，根据本发明的方法修饰的人生长激素(hGH)可用于治疗和生长相关的病症例如侏儒症、儿童和成人中的身材矮小症、恶病质/肌肉消瘦、全身肌萎缩和性染色体异常(例如，特纳综合征)。可使用经修饰的hGH治疗的其他病症包括：短肠综合征、脂肪营养障碍、骨质疏松症、尿毒症、烧伤、女性不育、骨再生、普通糖尿病、II型糖尿病、骨关节炎、慢性闭塞性肺部疾病(COPD)和失眠症。此外，经修饰的hGH也可用于促进各种过程，例如，全身组织再生、骨再生和伤口愈合或作为疫苗佐剂。
因此，在另一方面，本发明提供了药物组合物。所述施用方式包含药物可接受的稀释剂和非天然发生的、可溶于水的聚合物、治疗性部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的肽之间的共价缀合物。通过介于肽和聚合物、治疗性部分或生物分子之间并且与两者共价连接的完整的糖基连接性基团，聚合物、治疗性部分或生物分子被缀合至肽上。
本发明的药物组合物适合用于各种药物递送系统。在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版，(1985)中可找到用于本发明的合适制剂。关于用于药物递送的简要综述，参见，Langer，Science 249：1527-1533(1990)。
可配制用于任何合适的施用方式的药物组合物，所述施用方式包括例如，局部、经口、经鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内施用。对于肠胃外施用，例如皮下注射，载体优选地包含水、盐、乙醇、脂肪、石蜡或缓冲液。对于经口施用，可使用上面载体或固体载体中的任一种，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可使用生物可降解的材料，例如小球体(例如，聚乳酸聚甘醇酸酯)作为本发明的药物组合物的载体。在例如美国专利号4,897,268和5,075,109中公开了合适的生物可降解的小球体。
一般地，皮下或肠胃外例如静脉内施用药物组合物。因此，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，其包含溶解在或悬浮于可接受的载体(优选地是水性载体，例如，水、经缓冲的水、盐水、PBS等)中的化合物。所述组合物也可包含去垢剂例如Tween 20和Tween 80；稳定剂例如甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖；和防腐剂例如EDTA和间甲酚。因为要求接近生理状况，所以药物组合物可包含药物可接受的辅助物质例如pH调节剂和缓冲剂、渗透调节剂、湿润剂、去垢剂等。
可通过常规的灭菌技术灭菌这些组合物，或可将其过滤除菌。可包装所得的水溶液以待直接使用，或冻干后以待使用，在使用前将冻干的制剂和无菌含水载体混合。制剂的pH通常在3和11之间，更优选地在5至9之间，最优选地在7和8之间。
在一些实施方案中，可将本发明的糖肽整合入由标准的囊泡形成性脂形成的脂质体中。可获得各种制备脂质体的方法，如例如，Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)、美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中描述的方法。使用各种靶向性试剂(例如，本发明的唾液酸基半乳糖苷)的脂质体的靶向在本领域是熟知的(参见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。
可使用将靶向性试剂偶联至脂质体的标准方法。这些方法通常包括将脂成分例如磷脂酰乙醇胺整合入脂质体，所述磷脂酰乙醇胺可被活化用于靶向性试剂的附着，或衍生的亲脂性化合物的附着，例如本发明的来源于脂的糖肽。
靶向机制通常要求以这样的方式将靶向性试剂置于脂质体的表面，在该方式中，靶部分可和靶例如细胞表面受体相互作用。在形成脂质体之前，可使用本领域技术人员已知的方法(例如，分别用长链烷基卤化物或脂肪酸烷化或酰化存在于糖上的羟基)将本发明的糖附着至脂分子上。可选择地，可以这样的方式塑造脂质体，即在形成膜的时候首先将连接体部分整合入膜中。连接体部分必须具有亲脂性部分，该部分被稳固地包埋和锚定在膜中。其必须还具有反应性部分，该部分在脂质体的水性表面是化学可获得的。选择所述反应性部分以使其在化学上适合与以后加入的靶向性试剂或糖形成稳定的化学键。在一些情况下，可能将靶向性试剂直接附着至连接体分子，但在大多数情况下，使用第三分子作为化学桥接，从而将膜中的连接体分子和靶向性试剂或在三维空间上延伸出膜泡表面的糖连接起来。
由本发明的方法制备的化合物也可用作诊断性试剂。例如，可使用经标记的化合物在怀疑患有炎症的患者中定位炎症或肿瘤转移的区域。为了该用途，可用125I、14C或氚来标记所述化合物。
提供下列实施例以说明本发明的缀合物和方法，但不限定所述发明。
实施例
实施例1
1.1a干扰素α-2β-GalNAc(pH6.2)的制备
将200μL水加到4mg IFNα-2β中来重构干扰素α-2β。在固体溶解后，加入1.92mL反应缓冲液(20mM MES、pH6.2、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05％polysorbate和0.05％NaN3)。然后加入UDP-GalNAc(4.16mg；3mM)和GalNAc T2(80mU；80μL)，并将该反应混合物在32℃下进行慢速旋转温育。使用MALDI分析法监控反应，72小时后基本完成反应。反应完成后，将反应混合物接受肽作图和位点占据分析。
1.1b干扰素α-2β-GalNAc(pH 7.4)的制备
按照厂商所描述的方法重构干扰素α-2β。将50μL水加入50μgIFNα-2β中。当固体溶解时，加入50μL反应缓冲液(20mM MES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05％polysorbate和0.05％NaN3)。然后加入UDP-GalNAc(100μg；3mM)和GalNAc T2(8mU；8μL)，并将该反应混合物在32℃下在慢速旋转条件下进行温育。使用MALDI分析法监控反应，在大约48至72小时内基本完成反应。
1.2使用CMP-SA-PEG和ST6GalNAcI制备干扰素α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa
使用5kDa的MWCO Filter Centricon筒和第二缓冲液(20mMMES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05％polysorbate和0.05％NaN3)对来自1.1(上面)的干扰素α-2 β-GalNAc(1.0mL，～2mg，0.1μM)进行缓冲液交换(2X)。使用1.0mL第二缓冲液从离心筒中重构干扰素α-2β-GalNAc，并向反应混合物中加入CMP-SA-PEG-20kDa(10mg，0.5μM)和ST6GalNAcl(200μL)。在32℃下在慢速旋转条件下温育反应物96小时。使用SP Sepharose和SEC(Superdex 75)层析纯化反应物干扰素α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa。使用MALDI分析法确认唾液酸-PEG的加入。
1.3.使用CMP-SA-PEG、核心-1-β1，3-半乳糖基-转移酶和ST3Gal2制备干扰素α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa
使用5kDa的MWCO Filter Centricon筒和第二缓冲液(20mMMES、pH7.4、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM MnCl2、0.05％polysorbate和0.05％NaN3)对上述添加了GalNAc的干扰素α-2β-GalNAc(1.0mL，～2mg，0.1μM)(pH6.2)进行缓冲液交换(2X)。使用1.0mL含有CMP-SA-PEG-20kDa(10mg，0.5μM)、UDP-半乳糖(1.8mg，3mM)、核心-1-β1，3-半乳糖基-转移酶(200mU，存在于树脂上)和ST3Gal2(200mU，α2，3-(O)-唾酸转移酶)的第二缓冲液从旋转筒中重构干扰素α-2β-GalNAc。在32℃下在慢速旋转条件下温育反应混合物96小时。使用SP Sepharose和SEC(Superdex 75)层析纯化反应物干扰素α-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa。使用MALDI分析法确认唾液酸-PEG的加入。
1.9蛋白浓度测定
使用分光光谱仪，用路径长度为1cm的小室在280nm的固定吸光率下确定蛋白浓度。以水和缓冲液作为对照对受试样品进行三次重复读数测量。使用0.799mL/mg蛋白的消光系数确定蛋白浓度。
1.10终产物的配制
制剂缓冲液含有无致热原的PBS，pH6.5，2.5％甘露醇和0.05％通过真空和无菌过滤(0.2μm)的polysorbate 80。
使用用5倍柱床体积的制剂缓冲液(PBS，pH6.5，2.5％甘露醇和0.05％polysorbate80)平衡的Detoxi-GelTM除去内毒素。通过重力将流速控制在～0.3mL/分钟。将产物样品加到凝胶上，使用制剂缓冲液洗脱产物。用另外的制剂缓冲液调整收集的产物的体积以提供大约100μg/mL的蛋白浓度。
对肽制剂进行过滤除菌(0.2μm)并将流出物以1mL等分分配至2.0mL无致热原的小瓶中。此外，对等分进行内毒素和蛋白分析。所有产物在4℃下贮存。
1.13药物动力学研究
使用放射性碘标记的蛋白进行药物动力学研究。在通过尾静脉注射IV将标记的干扰素给大鼠施用后，以在72小时内在一定的时间间隔上抽取的血液中的放射性活性的降低来测量清除速率。各时间点测量至少5只大鼠。
1.14结果
在两个pH，即中性pH(7.4)和弱酸性pH(6.2)下，测量GalNAc-T2的反应速度。在pH6.2和pH7.4上都成功地进行了使用GalNAc的糖基化。如可在反应进程的MALDI分析中所看到的，在pH7.4下，反应速率比在pH6.2下更快。
在pH6.2或pH7.4下定量地将GalNAc-T2和GalNAc加到干扰素α-2β中。用MALDI监控反应。在酶促反应期间，形成新的干扰素α物质离子(IFN-α-2β19,281Da和IFN-α-2β-GalNAc，19,485Da)。
对在pH6.2下的反应产物IFN-α-2β-GalNAc进行分析以确定GalNAc在蛋白上的取代位点。肽作图和位点占据作图用于该目的。使用LC-MS/MS的TIC和干扰素α-2β的GluC降解进行的肽作图产生了质量为1018.69的肽片段。含有GalNAc的质量为1018.69的肽质量离子的MS/MS肽氨基酸测序表明糖附着至T106上。
使用ST6GalNAc-1和CMP-SA-PEG-20kDa检查IFN-α-2β-GalNAc的唾液酸基-PEG化。IFN-α-2β-GalNAc的反应产生PEG化的蛋白，可通过SDS PAGE观察到所述PEG化的蛋白。一般地，在32℃下进行反应96小时。通过SDS PAGE监控反应。SDS PAGE表明大约70％的IFN-α-2β-GalNAc转化为IFN-α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa。新带的MALDI分析显示41,500Da的质量离子，即IFN-α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa。
也产生含有GalNAc-Gal-SA-PEG结构的糖基化干扰素α-2β的糖形式。使用上述条件进行反应。通过SDS PAGE检测想要的产物。将单釜、两步法反应用于产生想要的产物，IFN-α-2β-GalNAc和核心-1-β3-半乳糖基转移酶-1、ST3Gal2、UDP-半乳糖和CMP-SA-PEG-20kDa开始进行反应。在32℃下温育反应物96小时。通过SDS PAGE监控反应。24小时后，反应大约完成70％。产物的MALDI分析显示41,900Da的质量离子，其来源于想要的IFN-α-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa产物。
使用两步法纯化PEG化的干扰素α-2β产物的两种糖形式。在第一步骤中，使用SP Sepharose进行离子交换层析。该步骤除去未反应的PEG材料和提供一些其他蛋白的分离。离子交换步骤之后，在SEC上进行分离。使用Superdex 75柱除去剩余的更小的蛋白，其包括糖基转移酶和未PEG化的干扰素α。纯化干扰素α的两种PEG化的糖形式，使纯度超过90％，如SDS PAGE所显示的。
抗病毒数据显示PEG化的糖形式A和B保持其抗病毒效果。
通过其尾静脉将经放射性碘标记的PEG化的蛋白注射入大鼠，两种蛋白的AUC比未PEG化的干扰素α-2β高5-7倍。糖形式A(IFN-α-2β-GalNAc-SA-PEG-20kDa)和B(IFN-α-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa)都具有生物活性。
实施例2
2.1G-CSF-GalNAc(pH6.2)的制备
使用UF过滤器(5kDa)超滤浓缩3.2mL缓冲液中的960μg G-CSF并用1mL 25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN3)重构。然后加入UDP-Gal NAc(6mg，9.24mM)、GalNAc-T2(40μL，0.04U)和100mM MnCl2(40μL，4mM)并将所得的溶液在室温下温育48小时。48小时后，MALDI显示反应完成(质量离子从18800偏移至19023的质量单位)。使用SEC(Superdex 75和Superdex 200)通过HPLC纯化反应混合物。使用磷酸缓冲盐溶液，pH4.9和0.005％Tween 80洗脱柱子。收集对应于G-CSF-GalNAc的峰，并使用Centricon 5kDa滤器将其浓缩至大约150μL，使用PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH4.9和0.005％Tween 80)将体积调整至1mL；蛋白的浓度是1mg/mL A280。
2.2G-CSF-GalNAc-Gal(pH6.0)的制备
将G-CSF-GalNAc(100μg)加入至含有25mM MES缓冲液，pH6.0，1.5mM UDP-GalNAc，10mM MgCl2和80mU GalNAc-T2的溶液中。然后加入CMP-SA-PEG-20kDa(0.5mg，0.025μmole)、UDP-半乳糖75μg(0.125μmole)、核心-1-Gal-T 20μL(10mU)并将溶液在32℃下慢速摇动24小时。MALDI显示G-CSF-GalNAc完全转化成G-CCSF-GalNAc-Gal。
2.3 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20kDa(C)的制备
2.3a顺续加工(pH6.2).
将含有1mg蛋白的G-CSF-GalNAc溶液的缓冲液换成25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN3)，然后加入5mg，(0.25μmole)CMP-SA-PEG(20kDa)。最后，加100μL 100mM MnCl2溶液和ST6GalNAc-I(100μL)并将反应混合物在32℃下缓慢摇动。在时间点(24、48和72小时)上取出等分样品并用SDS-PAGE分析。24小时后，没有再观察到进一步反应。将反应混合物进行离心过滤(5kDa)浓缩，将缓冲液更换为25mM NaOAc(pH4.9)并浓缩至1mL。使用离子交换(SP-Sepharose，25mM NaOAc，pH4.9)和SEC(Superdex 75；PBS-pH7.2，0.005％tween80，1ml/分钟)纯化产物。收集想要的级分，浓缩至0.5mL并在4℃贮存。
2.3b使用ST6GalNAc-I(pH6.0)的单釜方法
将溶解在3.2mL产物制剂缓冲液中的960μg G-CSF蛋白通过离心过滤(5kDa)浓缩至0.5mL并在25mM MES缓冲液(pH6.0，0.005％NaN3)中重构成约1mL的总体积，或1mg/mL的蛋白浓度。重构后，加入UDP-GalNAc(6mg，9.21μM)、GalNAc-T2(80μL，80mU)、CMP-SA-PEG-20kDa(6mg，0,3μmol)和小鼠的酶ST6GalNAc-I(120μL)。将溶液在32℃下摇动48小时。反应后，使用标准的层析条件在上述的SP-Sepharose和SEC上纯化产物。获得总共0.5mg的蛋白(A280)，大约50％的总产率。通过MALDI和SDS-PAGE分析确定产物结构。
2.4G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa(D)的制备
2.4a从G-CSF-GalNAc开始
将UDP-半乳糖(4mg，6.5μmole)、核心-1-Gal-T1(320μL，160mU)、CMP-SA-PEG-20kDa(8mg，0.4μmole)、ST3Gal2(80μL，0.07mU)和80μL 100mM MnCl2直接加入至获自实施例2.1(上面)的粗制的1.5mL的25mM MES缓冲液(pH6.0)中的G-CSF-GalNAc(1.5mg)反应混合物。将所得的混合物在32℃下温育60小时，但反应在24小时后完成。对反应混合物进行离心并使用超滤(5kDa)将溶液浓缩成0.2mL，然后重新溶解在25mM NaOAc(pH4.5)中直至终体积为1mL。使用SP-Sepharose纯化产物，使用离心过滤(5kDa)浓缩峰级分并使用SEC(Superdex 75)进一步纯化残留物。在使用离心过滤(5kDa)浓缩后，使用由PBS，2.5％甘露醇，0.005％polysorbate，pH6.5构成的制剂缓冲液稀释蛋白至1mL，配制成每mL 850μg蛋白的蛋白浓度(A280)。总产率为55％。MALDI分析显示于图28。
2.4b从G-CSF开始
通过离心过滤(5kDa)浓缩960μg G-CSF(3.2mL)并用25mM MES缓冲液(pH6.0，0.005％NaN3)重构。将G-CSF溶液的总体积调整至大约1mg/mL，并加入UDP-GalNAc(6mg)、GalNAc-T2(80μL)、UDP-半乳糖(6mg)、核心-1-Gal-T1(160μL，80μU)、CMP-SA-PEG(20kDa)(6mg)、ST3Gal-2(160μL，120μU)和MnCl2(40μL 100mM溶液)。将所得的混合物在32℃下温育48小时。
2.5 SP Sepharose HPLC层析
如实施例1.4中所描述的进行SP Sepharose。
2.6大小排阻层析
如实施例1.5中所描述的进行SEC。将纯化的样品在4℃下贮存。
2.6a疏水相互作用层析(HIC)
在第一步层析后，可使用HIC作为第二纯化步骤除去除了未PEG化的G-CSF外的污染物。因此，可获得用于纯化糖PEG化的G-CSF的方法，所述糖PEG化的G-CSF已通过在凝胶渗透柱上的初始纯化。
2.7 SDS PAGE分析
如实施例1.6中所述进行SDS PAGE。
2.8 MALDI分析
如实施例1.7中所述进行MALDI分析
2.9肽作图分析
如实施例1.8中所说明的进行蛋白作图分析。
2.10蛋白浓度测定
如在实施例1.9中所描述的确定蛋白浓度。
2.11产物配制
如实施例1.10中所示配制产物。
2.12内毒素的确定
如实施例1.11中所示确定内毒素。
2.13细胞增殖测定
按照标准的方法进行使用NFS-60细胞系和Tf-1细胞系的G-CSF增殖测定法。将细胞在不同浓度的G-CSF(51nM，25.5nM，12.75nM，3.2nM，1.6nM，0.8nM，0nM)、通过化学方法PEG化的G-CSF类似物、和来自实施例2.3(上面)的PEG化的G-CSF(C)以及来自实施例2.4(上面)的PEG化的G-CSF(D)存在的情况下以25000个细胞/ml涂布在96孔板中。将细胞在37℃下温育48小时。使用MTT显色定量分析法确定细胞的存活。
2.14体内活性：大鼠中的白细胞(WBC)生成
使用小鼠对C、G-CSF和通过化学方法PEG化的G-CSF中每一种的两种药物剂量(50μg/kg，250μg/kg)进行检查。在2小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时和96小时的时间点上抽取血液，测量WBC和中性粒细胞计数(图14)。
2.15增加的稳定性的研究
使用pH8.0、被加热至40℃的缓冲液进行PEG化的G-CSF(来自实施例2.3的C)和PEG化的G-CSF(来自实施例2.4的D)的增加的稳定性的研究。用制剂缓冲液(PBS，2.5％甘露醇，0.005％polysorbate80)将72μg PEG化的G-CSF(C)稀释至8mL。用16mL制剂缓冲液稀释1mg PEG化的G-CSF(D)。用NaOH将两种溶液调整至pH8.0并将所得的溶液无菌过滤至无致热原的管中。将样品在40℃下缓慢摇动并在0小时、72小时和168小时的时间点上进行等分取样(0.8mL)。如上所述使用SEC(Superdex 200)进行分析(图6和图7)。
2.16蛋白的放射性标记
使用Bolton Hunter试剂放射性标记G-CSF。在pH 7.4下进行该反应15分钟，然后用SEC(Superdex 200)进行纯化。纯化后，将制剂缓冲液pH调节至5.0并通过A280确定蛋白浓度。
2.17 ELISA测定
使用Elisa测定法对大鼠血浆中的G-CSF衍生物进行定量。药物动力学结果显示于图9。
2.18药物动力学研究
进行两种药物动力学研究。对于第一种药物动力学研究，放射性标记蛋白并通过尾静脉注射将其给大鼠施用。以在48小时内在一定的时间间隔上抽取的血液中的放射性活性的降低来测量清除速率。在各时间点测量至少5只大鼠。
特别地，每只动物注射10μgG-CSF衍生物(～1μg标记的蛋白和9μg未标记的蛋白)。除了如上所述被抽取和计数的血液外，也收集血浆并将蛋白酸沉淀。然后也对蛋白沉淀进行放射性活性计数。这些研究的数据显示于图2、图3和图8。
在第二药物动力学研究中，通过尾静脉注射将未标记的G-CSF衍生物(每只动物30μg)给大鼠施用。然后在指定的时间点上抽取血液样品并用G-CSF ELISA测定法分析样品。数据显示于图9。
2.19结果
人GalNAc T2使用UDP-GalNAc作为供体将GalNAc转移至在大肠杆菌中表达的G-CSF。如通过MALDI所确定的，依赖于反应缓冲液的pH，一个或两个GalNAc部分被加到G-CSF上。第二GalNAc的加入进行较慢，达到总产物的大约10-15％。通过将反应溶液的pH调节至6.0-6.2可选择性地将一个GalNAc加到G-CSF上，达到超过90％的转化率。当反应在pH为大约7.2和7.4之间进行时，产生第二个GalNAc的加入。Co+2和Mn+2都是反应中有用的二价金属离子。反应产物的肽作图表明反应的主要产物是GalNAc加到苏氨酸133上的产物，所述位点是哺乳动物系统中O-连接的糖基化的天然位点。在G-CSF的氨基端肽片段上观察到第二GalNAc，并假定其在苏氨酸2上产生。
G-CSF-GalNAc和ST6GalNAc-1(鸡或小鼠)以及CMP-SA-PEG-20kDa的反应提供了产物G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20kDa，其通过MALDI进行验证，如SDS-PAGE所确定的，具有大约50％的转化率。也可使用核心-1-Gal-T和UDP-半乳糖进一步延长G-CSF-GalNAc，从而完全转化为G-CSF-GalNAc-Gal。然后用ST3Gal2以及CMP-SA-PEG-20kDa糖PEG化该中间体提供了总体产率大约为50％的产物G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa。从G-CSF或其糖基化的中间体开始，在单釜中按顺序进行这些反应或在单釜中同时进行这些反应。在这些研究中，使用任一种方法在总产率方面观察到极小的差异或没有观察到差异。
使用离子交换和SEC的组合纯化糖基化或糖-PEG化反应的产物。离子交换步骤除去未反应的G-CSF或其糖基化的中间体(GalNAc或GalNAc-Gal)以及任何未反应的CMP-SA-PEG-20kDa。SEC步骤除去残余的未反应的G-CSF和来自用于该方法的糖基转移酶的其他蛋白污染物。通过使用这些纯化方法，含有GalNAc-SA-PEG-20kDa或GalNAc-Gal-SA-PEG-20kDa的G-CSF’s具有一致的特性和保留时间。终产物具有如所显示的典型特征。
纯化后，在含有2.5％甘露糖和0.005％Tween 80的PBS缓冲液中配制PEG化的蛋白。一开始，在制剂中使用pH6.5但考虑到糖-PEG化的蛋白的聚集(见下面)，因此将制剂缓冲液的pH降低至5.0。文献报道表明通过将溶液pH保持在4-5之间可防止G-CSF聚集。通过使用无菌技术和内毒素清除滤筒除去内毒素。一般将蛋白浓度调整至生物学研究所要求的100ug/mL至1mg/mL之间。通过该方法，内毒素估计一般在3EU/ml之下。将配制的产物在4℃下贮存。
在体外细胞增殖检测法中使用对G-CSF敏感的NSF-60细胞检测产物。观察到GalNAc-SA-PEG-20kDa和GalNAc-Gal-SA-20kDa产物都对启动细胞增殖有效(图1)。
对通过化学方法PEG化的G-CSF和C(G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20kDa)进行增加的稳定性的研究。将制剂缓冲液pH调整至8.0和将温度升高至40℃。在时间0、72和168小时取出各蛋白的样品(图6和图7)。在168小时内，在这些条件下观察到通过化学方法PEG化的G-CSF完全聚集。使用Superdex 200层析的SEC被用于分离聚集物。尽管糖缀合物G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20kDa也形成可使用SEC分离的聚集物，但所述聚集物以低得多的速度发生。
使用Bolton Hunter试剂对糖-PEG-化的G-CSF进行放射性碘标记。在实际放射性标记之前也进行冷标记研究来确定聚集的程度和建立用于除去形成的任何凝聚物的方法。Bolton Hunter试剂(冷的)的使用确实提供了图5中显示的一些聚集物。使用Superdex 200柱的SEC除去了聚集物并提供了单体的标记的材料。使用125I标记的试剂获得类似的结果。制剂的使用使贮存中产生的聚集物减少到最少。通过确定A280的吸光率测量蛋白含量。
整合G-CSF、用化学方法PEG化的G-CSF和用Bolton Hunter试剂标记的PEG-G-CSF的大鼠pK研究的结果显示于图3。在该研究中，在每只大鼠经IV施用10μg G-CSF缀合物后就放射性活性对从血浆中沉淀的蛋白和血液进行计量。血液和血浆蛋白的数据清楚地表明PEG缀合物和以化学方法PEG化的G-CSF具有相同的清除速率(图3和图8)。
然后在小鼠模型中检查G-CSF衍生物起始WBC产生的能力。各受试化合物以单次推注(bolus)经IV进行注射，在一段时间内监控WBC和嗜中性粒细胞的诱导。当以250μg/kg施用时，以化学方法PEG化的G-CSF是最有效的受试蛋白。PEG缀合物(G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20kDa)在250μg/kg下诱导WBC产生的程度几乎和以化学方法PEG化的G-CSF诱导的程度相同，但却远大于以相似浓度的G-CSF诱导的程度。
实施例3
该实施例公开了氨基酸序列的突变将O-连接的糖基化位点即丝氨酸或苏氨酸残基优选地引入到G-CSF的175个氨基酸的野生型序列或任何其经修饰的版本中的含有脯氨酸的位点。作为参照，175个氨基酸的野生型G-CSF的序列显示如下：
MTPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCA
TYKLCHPEEL VLLGHSLGIP WAPLSSCPSQ ALQLAGCLSQ
LHSGLFLYQG LLQALEGISP ELGPTLDTLQ LDVADFATTI
WQQMEELGMA PALQPTQGAM PAFASAFQRR AGGVLVASHL
QSFLEVSYRV LRHLAQP(SEQ ID NO：2)
3.1  N端突变
在N端突变体中，野生型G-CSF的N端，即M1TPLGPA(SEQ ID NO：)被M1XnTPLGPA或M1BoPZmXnTPLGPA置换。其中，n、o和m是选自0至3的整数，X、B和O中的至少一个是Thr或Ser。当X、B和O中超过一个是Thr或Ser时，这些部分是独立地选择的。在出现上标时，上标表示氨基酸在野生型起始序列中的位置。
优选的例子包括：
M1VTPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1QTPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1ATPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1PTQGAMPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1VQTPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1QSTPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1GQTPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1APTSSSPL4GPA(SEQ ID NO：)
M1APTPL4GPA(SEQ ID NO：)
3.2内部突变位点1
在这些突变体中，野生型G-CSF的N端，即M1TPLGP(SEQ ID NO：8)被M1TPXnBoOrP替换。其中，n、o和r是选自0至3的整数，X、B和O中的至少一个是Thr或Ser。当X、B和O中超过一个是Thr或Ser时，这些部分是独立地选择的。在上标出现时，上标表示氨基酸在野生型起始序列中的位置。优选的突变包括：
M1TPTLGP(SEQ ID NO：8)
M1TPTQLGP(SEQ ID NO：8)
M1TPTSLGP(SEQ ID NO：8)
M1TPTQGP(SEQ ID NO：8)
M1TPTSSP(SEQ ID NO：8)
M1TPQTP(SEQ ID NO：8)
M1TPTGP(SEQ ID NO：8)
M1TPLTP(SEQ ID NO：8)
M1TPNTGP(SEQ ID NO：8)
M1TPVTP(SEQ ID NO：8)
M1TPMVTP(SEQ ID NO：8)
MT1P2TQGL3G4P5A6S7(SEQ ID NO：8)
3.3内部突变位点2
该突变被用来保持G-CSF活性。在这些突变体中，含有H53的氨基酸序列LGH53SLGI(SEQ ID NO：)被突变成LGH53BoLGI，其中θ是H、S、R、E或Y，B是Thr或Ser。
优选的例子包括：
LGHTLGI
LGSSLGI
LGYSLGI
LGESLGI
LGSTLGI
3.4内部突变位点3
在该类型突变体中，包含P129的氨基酸序列P129ALQPT(SEQ ID NO：)被突变成P129ZmJqOrXnPT，其中Z、J、O和X独立地选自Thr或Ser，m、q、r和n是选自从0至3的整数。
优选的例子包括：
P129TLGPT
P129TQGPT
P129TSSPT
P129TQGAPT
P129NTGPT
P129ALTPT
P129MVTPT
P129ASSTPT
P129TTQP
P129TLP
P129TLQP
MAP129ATQPTQGAM
MP129ATTQPTQGAM
3.5内部突变位点4
在该类型突变体中，围绕P61的氨基酸序列LGIPWAP61LSSC(SEQ IDNO：)被PZmUsJqP61OrXnBoC取代，其中m、s、q、r、n和o是选自从0至3的整数，Z、J、O、X、B和U中的至少一个选自Thr或Ser，当Z、J、O、X、B和U中超过一个是Thr或Ser时，其各是独立选择的。
优选的例子包括：
P61TSSC
P61TSSAC
LGIPTAP61LSSC
LGIPTQP61LSSC
LGIPTQGP61LSSC
LGIPQTP61LSSC
LGIPTSP61LSSC
LGIPTSP61LSSC
LGIPTQP61LSSC
LGTPWAP61LSSC
LGTPFAP61LSSC
P61FTP
SLGAP58TAP61LSS
3.6 C端突变
在该类型突变体中，野生型G-CSF的C端的氨基酸序列RHLAQP175(SEQ ID NO：)被ΦaGpJqOrP175XnBoZmUsψt替代，其中a、p、q、r、n、o、m、s和t是选自0至3的整数，Z、U、O、J、G、Φ、B和X中的至少一个是Thr或Ser，当Z、U、O、J、G、Φ、B和X中超过一个是Thr或Ser时，其是独立选择的。Φ任选地是R，G任选地是H。符号ψ表示任何不带电荷的氨基酸残基或E(谷氨酸)。
优选的例子包括：
RHLAQTP175
RHLAGQTP175
QP175TQGAMP
RHLAQTP175AM
QP175TSSAP
QP175TSSAP
QP175TQGAMP
QP175TQGAM
QP175TQGA
QP175TVM
QP175NTGP
QP175QTLP
3. 7围绕P133的内部突变
其他的G-CSF突变体包括具有围绕氨基酸P133的内部突变的突变体。例子包括：
P133TQTAMP139
P133TQGTMP
P133TQGTNP
P133TQGTLP
PALQP133TQTAMPA
实施例4
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的氨基酸序列中的突变可引入其他的O-连接的糖基化位点，这样可使用本发明的方法在这些位点对蛋白进行修饰。该实施例提供了本发明的选择的代表性突变体。
4.1 G-CSF(野生型178aa变体)
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklvseca tyklchpeel vllghslgip
waplsscpsq alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma
palqptqgam pafasafqrr aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp(SEQ ID NO：1)
4.2 G-CSF(野生型175aa变体)
mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklca tyklchpeel vllghslgip waplsscpsq
alqlagclsq lhsglflyqg llqalegisp elgptldtlq ldvadfatti wqqmeelgma palqptqgam
pafasafqrr aggvlvashl qsflevsyrv lrhlaqp(SEQ ID NO：3)
4.9 G-CSF突变体1(氨基端突变)
miatplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv
adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf
levsyrvlrh laqp
4.10 G-CSF突变体2(氨基端突变)
mgvtetplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv
adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh
laqp
4.11 G-CSF突变体3(氨基端突变)
maptplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll ghslgipwap
lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv adfattiwqq
meelgmapal qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
4.12 G-CSF突变体4(位点1)
mtp3tqglgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll
ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv
adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh
laqp
4.13G-CSF突变体5(位点3)
Mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll ghslgipwap
lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv adfattiwqq
meelgmap129at qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
4.14G-CSF突变体6(位点4)
Mtplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa lqeklcatyk lchpeelvll ghslgip58ftp
lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq alegispelg ptldtlqldv adfattiwqq
meelgmapaL qptqgampaf asafqrragg vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
实施例5
产生于CHO细胞中的G-CSF的糖PEG化
5a.无唾液酸-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的制备
将CHO细胞中产生的G-CSF以2.5mg/mL溶解在50mM Tris 50mM Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl，5mMCaCl2中并在Centricon Plus20离心过滤器中浓缩至500μL。将溶液和300mU/mL神经氨酸酶II(Vibrio cholera)在32℃下温育16小时。为监控反应，用合适的缓冲液稀释反应物的小等分并进行IEF凝胶。然后将反应混合物加至预先洗涤过的N-(对氨基苯)草氨酸-琼脂糖缀合物(800pL/mL反应体积)中并将经洗涤的小珠在4℃下轻柔地旋转24小时。在10,000rpm下对混合物进行离心，收集上清液。用Tris-EDTA缓冲液清洗小珠3次，一次用0.4mL Tris-EDTA缓冲液，一次用0.2mL Tris-EDTA缓冲液，合并所有上清液。在4℃下将上清液对50mM Tris-HCl pH7.4，1M NaCl，0.05％NaN3进行透析，然后再对50mM Tris-HCl pH7.4，1M NaCl，0.05％NaN3透析两次。然后使用Centricon Plus 20离心过滤器对经透析的溶液进行浓缩并在-20℃下贮存。根据Invitrogen提供的方法和试剂提供IEF凝胶的条件。将天然的和去唾液酸化的G-CSF的样品对水进行透析并通过MALDI-TOF MS对其进行分析。
5b.G-CSF-(α2，3)-唾液酸基-PEG的制备
将去唾液酸化的G-CSF以2.5mg/mL溶解在50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，0.05％NaN3，pH7.2中。将溶液和1mM CMP-唾液酸-PEG以及0.1U/mL ST3Gall在32℃温育2天。为监控唾液酸-PEG的整合，向小等分的反应物中加入CMP-SA-PEG-荧光配体；通过在Toso HaasG3000SW分析柱上使用PBS缓冲液(pH7.1)进行凝胶过滤来将整合入肽中的标记物和游离的标记物分离。使用在线荧光检测器对整合入肽中的荧光标记物进行定量。两天后，使用Toso Haas G3000SW制备柱，用PBS缓冲液(pH7.1)纯化反应混合物，并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的方法和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析法分析反应的产物。将天然的和PEG化的G-CSF的样品对水进行透析并通过MALDI-TOF MS对其进行分析。
5c.G-CSF-(α2，8)-唾液酸基-PEG的制备
将产生于CHO细胞的含有α2，3-唾液酸化的O-连接的聚糖的G-SCF以2.5mg/mL溶解在50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，0.05％NaN3，pH7.2中。将溶液和1mM CMP-唾液酸-PEG以及0.1U/mL CST-II在32℃下温育2天。为监控唾液酸-PEG的整合，向小等分的反应物中加入CMP-SA-PEG-荧光配体；通过在Toso Haas G3000SW分析柱上使用PBS缓冲液(pH7.1)进行凝胶过滤来将整合入肽中的标记物和游离的标记物分离。使用在线荧光检测器对整合入肽中的荧光标记物进行定量。两天后，使用Toso Haas G3000SW制备柱，用PBS缓冲液(pH7.1)来纯化反应混合物并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的方法和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析法分析反应的产物。将天然的和PEG化的G-CSF的样品对水进行透析并通过MALDI-TOF MS对其进行分析。
5d.G-CSF-(α2，6)-唾液酸基-PEG的制备
将只含有O-连接的GalNAc的G-CSF以2.5mg/mL溶解在50mMTris-HCl，0.15M NaCl，0.05％NaN3，pH 7.2中。将溶液和1mM CMP-唾液酸-PEG以及0.1U/mL ST6GalNAcI或II在32℃下温育2天。为监控唾液酸-PEG的整合，向小等分的反应物中加入CMP-SA-PEG-荧光配体；通过在Toso Haas G3000SW分析柱上使用PBS缓冲液(pH7.1)进行凝胶过滤来将整合入肽中的标记物和游离的标记物分离。使用在线荧光检测器对整合入肽中的荧光标记物进行定量。2天后，使用TosoHaas G3000SW制备柱用PBS缓冲液(pH7.1)来纯化反应混合物，并基于UV吸收收集级分。根据Invitrogen提供的方法和试剂使用SDS-PAGE和IEF分析法分析反应的产物。将天然的和PEG化的G-CSF的样品对水进行透析并通过MALDI-TOF MS对其进行分析。
用节杆菌属唾液酸酶处理在CHO细胞中产生的G-CSF，然后通过在Superdex 75上进行大小排阻层析对其进行纯化，用ST3Gall或ST3Gal2对其进行处理，然后再用CMP-SA-PEG 20Kda对其进行处理。通过离子交换和凝胶过滤纯化所得的分子，通过SDS PAGE的分析表明PEG化已完成。这是O-连接的聚糖的糖PEG化的第一个证明。
实施例6
重组GCSF-表达、重折叠和纯化
●通过离心，除去上清液来收集细胞。各种培养基上的生长结果显示于图9。
●重悬浮细胞于10mM Tris pH7.4，75mM NaCl，5mM EDTA-使用10ml/g(裂解缓冲液)
●Microlluidize细胞(也可使用French press)
●在4℃下5,000RPM下离心30分钟，除去上清液
●重悬浮沉淀于裂解缓冲液并如上进行离心
●在25mM Tris pH8，100mM NaCl，1％TX-100，1％NaDOC，5mM EDTA中洗涤IB’s。通过移液器吸打和涡旋重悬浮沉淀。在4℃ 5,000RPM下离心15分钟。再重复该步骤一次(总共洗涤2次)
●在25mM Tris pH8，100mM NaCl，5mM EDTA中洗涤沉淀2次以除去去垢剂，如上进行离心
●将沉淀重悬浮于dH20进行等分并如上进行离心。将沉淀在-20℃冷冻
●使用移液器将IB’s 以20mg/ml重悬浮于6M盐酸胍，5mM EDTA，100mM NaCl，100mM Tris pH8，10mM DTT中，然后在室温下旋转2-4小时
●在室温下在14,000RPM下离心溶解的IB’s1分钟。保留上清液。
●用重折叠缓冲液50mM MES pH6，240mM NaCl，10mM KCl，10mMKCl，0.3mM月桂基麦芽糖苷，0.055％PEG3350，1mM GSH，0.1M GSSG，0.5M精氨酸将上清液按1∶20稀释并将其在4℃下在旋转器上重折叠过夜。
●将重折叠物转移至Pierce蛇皮7kDa MWCO进行透析。透析缓冲液20mM NaOAc pH4，50mM NaCI，0.005％Tween-80，0.1mM EDTA。在4℃下对至少200倍过量的透析液进行总共3次透析。
●透析后将材料通过0.45μM过滤器。
●用透析缓冲液平衡SP-sepharose柱子，加入样品。用透析缓冲液洗涤柱子，用含有高达1M NaCl的盐梯度的透析缓冲液进行洗脱。蛋白通常在300-400mM NaCl处被洗脱。
●在SDS-PAGE上检查材料(参见例如，图10)
实施例7
双釜中的双酶方法
下列实施例举例说明G-CSF-GalNAc-SA-PEG以两个连续步骤制备，其中在各中间产物用于下一步骤之前对其进行纯化。
7a.使用GalNAc-T2从G-CSF和UDP-GalNAc制备G-CSF-GalNAc(pH6.2)。
使用UF过滤器(MWCO5K)通过超滤浓缩3.2mL包装的缓冲液中的G-CSF(960μg)，然后用1mL 25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN3)重构。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.24mM)，GalNAc-T2(40μL，0.04U)和100mM MnCl2(40μL，4mM)，将所得的溶液在室温下温育。
24小时后，MALDI表明反应完成。将反应混合物直接接受使用SEC(Superdex 75和Superdex 200)和含有PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH4.9和0.005％Tween 80)的洗脱缓冲液的HPLC纯化。使用Centricon 5 KDaMWCO过滤器浓缩G-CSF-GalNAc的收集峰至大约150μL并使用PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH4.9和0.005％Tween 80)将体积调整至1ml。蛋白终浓度为1mg/mL(A280)，产率100％。将样品在4℃下贮存。
7b.使用纯化的G-CSF-GalNAc、CMP-SA-PEG(20KDa)和小鼠ST6GalNAc-TI(pH6.2)制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG。
将含有1mg蛋白的G-CSF-GalNAc溶液的缓冲液更换为25mM MES缓冲液(pH6.2，0.005％NaN3)并加入CMP-SA-PEG(20KDa)(5mg，0.25umol)。在溶解后，加入MnCl2(100mcL，100mM溶液)和ST6GalNAc-I(100mcL，小鼠的酶)，将所述反应混合物在32℃下缓慢摇动3天。通过超滤(MWCO5K)浓缩所述反应混合物并将缓冲液更换为25mM NaOAc(pH4.9)一次，然后浓缩至1mL的总体积。然后使用SP-sepharose(A：25mM NaOAc+0.005％tween-80 pH4.5；B：25mM NaOAc+0.005％tween-80pH 4.5+2M NaCl)以13-18分钟的保留时间和使用SEC(Superdex 75；PBS-pH7.2，0.005％Tween 80)以8.6分钟的保留时间(superdex 75，流速1ml/分钟)纯化所述产物。收集想要的级分，并浓缩至0.5mL，在4℃下贮存。
实施例8
以同时加入酶的方式制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG的单釜方法
下列实施例举例说明以同时加入酶的方式在单釜中制备G-CSF-GalNAc-SA-PEG
8a.使用小鼠ST6GalNAc-I(pH6.0)的单釜方法。
通过超滤(MWCO 5K)浓缩G-CSF(溶解在3.2mL的产物制剂缓冲液中的960μg蛋白)至0.5ml并用25mM MES缓冲液(pH6.0，0.005％NaN3)重构至大约1mL的总体积或1mg/mL的蛋白浓度。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.21μmol)、GalNAc-T2(80μL，80mU)、CMP-SA-PEG(20KDa)(6mg，0,3μmol)和小鼠的酶ST6GalNAc-I(120μL)以及100mMMnCl2(50μL)。将所述溶液在32℃下摇动48小时，使用标准的层析条件在SP-sepharose上对其进行纯化。获得总共0.5mg的蛋白(A280)或大约50％的总产率。用MALDI和SDS-PAGE分析来确定产物结构。
8b.使用鸡ST6GalNAc-I(pH6.0)的单釜方法。
将14.4mg的G-CSF浓缩至3mL的终体积，并将缓冲液更换为25mMMES缓冲液(pH6.0，0.05％NaN3，0.004％Tween 80)，将体积调整为13mL。然后加入UDP-GalNAc(90mg，150μmole)、GalNAc-T2(0.59U)、CMP-SA-PEG-20KDa(90mg)、鸡ST6GalNAc-I(0.44U)和100mMMnCl2(600mcL)。将所得的混合物在室温下放置60小时。然后使用UF(MWCO 5K)浓缩反应混合物并进行离心。将残留物(大约2mL)溶解在25mM NaOAc缓冲液(pH4.5)中并再浓缩至5mL终体积。使用SP-sepharose纯化样品大约10-23分钟，进行SEC(Superdex 75，17分钟，流速0.5ml/分钟)和另外的SEC(Superdex 200，23分钟，流速0.5ml/分钟)，产生3.6mg(25％的总产率)的G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20KDa(A280和BCA方法)。
实施例9
以顺次加入酶的方式制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的单釜法
下列实施方案举例说明在单釜中以顺次加入酶的方式制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的方法。
9.1从GalNAc-G-CSF开始
a.使用GalNAc-T2从G-CSF和UDP-GalNAc制备G-CSF-GalNAc(pH6.2)。
使用UF过滤器(MWCO 5K)通过超滤浓缩3.2mL包装的缓冲液中的G-CSF(960mcg)，然后用1mL的25mM MES缓冲液(pH6.0，0.005％NaN3)进行重构。然后加入UDP-GalNAc(6mg，9.24mM)、GalNAc-T2(40μL，0.04U)和100mM MnCl2(40μL，4mM)，将所得的溶液在室温下进行温育。
b.从G-CSF-GalNAc；UDP-半乳糖、SA-PEG-20KDa和合适的酶制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG
将UDP-半乳糖(4mg，6.5μmoles)、核心-1-Gal-T(320μL，160mU)、CMP-SA-PEG-20KDa(8mg，0.4μmole)、ST3Gal2(80μL，0.07mU)和100mM MnCl2(80μL)直接加入至来自上述步骤a的1.5ml 25mM MES缓冲液(pH6.0)中的G-CSF-GalNAc(1.5mg)的粗制反应混合物。将所得的混合物在32℃下温育60小时。对反应混合物进行离心并使用超滤(MWCO 5K)将溶液浓缩至0.2mL，然后用25mM NaOAc(pH4.5)将其重新溶解至终体积1mL。使用SP-sepharose(10-15分钟的保留时间)纯化所述产物，使用离心过滤器(MWCO5K)浓缩峰级分并使用SEC(Superdex 75，10.2分钟的保留时间)进一步纯化残留物。在使用离心过滤器(MWCO5K)浓缩后，使用具有PBS、2.5％甘露醇、0.005％polysorbate、pH6.5的制剂缓冲液稀释蛋白，以每mL 850mcg蛋白(A280)的蛋白浓度配制产物。总产率为55％。
实施例10
以同时加入酶的方式制备G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG的单釜法
a.从G-CSF开始
通过超滤(MWCO 5K)浓缩G-CSF(960mcg，3.2ml)并用25mM Mes缓冲液(pH6.0，0.005％NaN3)进行重构。G-CSF溶液的总体积是大约1mg/ml。加入UDP-GalNAc(6mg)、GalNAc-T2(80μL，～80μU)、UDP-Gal(6mg)、核心1 GalT(160μL，80μU)、CMP-SA-PEG(20K)(6mg)和α2，3-(O)-唾酸转移酶(160μL，120μU)、100mM MnCl2(40μL)。将所得的混合物在32℃下温育48小时。如下面所述使用IEX和SEC进行纯化。使用超滤(MWCO 5K)浓缩含有产物的所得级分并用缓冲液将体积调整至大约1mL。蛋白的浓度在A280被确定为0.392mg/ml，从G-CSF得到40％的总产率。
实施例11
下列实施例举例说明获得大量糖PEG化的G-CSF的可选择的酶促方法。
在大肠杆菌中表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)并按照实施例X(上面)中所公开的方法从包含体中重折叠所述蛋白。
11a.通过GalNAc的加入起动反应
在UDP-GalNAc存在的情况下使用重折叠的GalNAcT2在33℃下在含有1mM MnCl2的50mM Bis-Tris pH6.5缓冲液中进行G-CSF的GalNAc化。该步骤起动了反应，所述反应使GalNAc转移酶和唾酸转移酶在随后的步骤中一起作用以在较短的时间内十分有效地产生最大量的GCSF-PEG。
11b.PEG化方法：
在GalNAc化后2(+/-1)小时，通过直接向起动反应物中加入CMP-SA-PEG(20K)和ST6GalNAcI(鸡或人)开始PEG化。该步骤产生唾酸转移酶的底物(GCSF-O-GalNAc)，从而在更短的时间以比在两步骤反应中获得的速度更快的速度驱动反应，在所述两步骤反应中，首先从UDP-GalNAc和其他反应组分(参见例如，实施例X，上面)中纯化GCSF-O-GalNAc。此外，经起动的单釜反应产生比同时加入所有组分的单釜反应获得的产率更高的产物产率。
事实上，几种单釜反应的比较显示，当同时加入所有组分并温育23小时后，产生的GCSF-PEG达到77％。相反地，当在如上所述的GalNAc化步骤2小时后加入PEG化反应所需的所有酶时，产物产率为85％。因此，按顺序加入反应组分产生比在同时加入所有反应组分时获得的产率高10％的产率。
实施例12
该实施例描述了六个突变体G-CSF蛋白的O-连接的GalNAc化的结果。
12.1.突变的G-CSF蛋白的GalNAc化：
下面列出了突变的G-CSF蛋白的所有序列。在获得这些蛋白后，检查O-连接的糖基化。在和天然的G-CSF糖基化的条件相同的条件下，在体外在25mM MES缓冲液(pH6.0)中使用GalNAc-T2(BV)和UDP-GalNAc。使用MALDI监控反应。蛋白的增加的分子量的测量提供了GalNAc加入的数目。对于一个GalNAc的加入，增加的分子量应当是203Da。基于MALDI的结果，我们发现突变的G-CSF-2、-3、-4接受一个GalNAc；而对于突变的G-CSF-5也观察到一些加入，突变体G-CSF-1接受两个GalNAcs，形成MAPT-G-CSF(GalNAc)2(分子量从18965增加至19369Da)。
表X.突变的G-CSF的GalNAc加入(通过MALDI测量的MW)
肽 MW(完整材料) MW(GalNAc-加合物) GalNAc添加的数量
MutantG-CSF-1(MAPT-G-CSF)     18965  19369     2
MutantG-CSF-2     18766  19029     1
MutantG-CSF-3     18822  19026     1
MutantG-CSF-4     19369  19574     1
MutantG-CSF-5     18957  18853     1
MutantG-CSF-6     NT
Native G-CSF     18800  19023     1
使用肽作图和N末端分析法确定MAPT-G-CSF-(GalNAc)2的糖基化位点。在经Glu C-降解的肽作图中发现了G-1+GalNAc峰，表明在G-1序列加入了一个GalNAc。N末端Edman降解分析暗示正常的T丢失，表明GalNAc被入至T残基。
12.2突变的G-CSF序列的糖PEG化
a.突变的G-CSF序列的糖PEG化和缓冲液对MAPT-G-CSF的糖PEG化的影响
进行5个突变体的糖PEG化(20K)的检查。使用三种酶/三种核苷酸系统进行糖PEG化。25mM MES缓冲液(pH6.0)中的(UDP-GalNAc/GalNAc-T2/UDP-Gal/核心GalT/CMP-SA-PEG/O-唾酸转移酶)。所有突变体可被单糖PEG化。通过SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色没有检测到该条件中的可测量的二PEG化。
因为MAPT-G-CSF接受两个GalNAcs，所以该突变体在理论上应当接受两个PEGs。因此，我们检查缓冲液对作为起始材料的MAPT-G-CSF的PEG化的影响。就该反应对四种不同的缓冲液(1.1M MES缓冲液；2.25mM MES缓冲液(pH 6.0)；3.50mM Bis-tris缓冲液(pH6.0)；4.1M HEPS缓冲液(pH7.4))进行了考察。发现，在所有受试缓冲液系统中MAPT-G-CSF可被PEG化。然而，单PEG化产物仍然是主要产物。在使用1M MES和1M HEPS缓冲液的情况下，形成一些二PEG化的产物，表明高浓度的缓冲液提高糖PEG化。
b.通过形成MAPT-G-CSF(GalNAc-SA-PEG)2和MAPT-G-CSF(GalNAc-Gal-SA-PEG)2比较糖PEG化效率
为了了解通过不同酶催化的突变体G-CSF-1的糖PEG化的效率，就唾液酸PEG化检测两种酶(St6GalNAcI和O-唾酸转移酶)。因此，将MAPT-G-CSF转变成MAPT-G-CSF(GalNAc)2和MAPT-G-CSF(GalNAc-Gal)2以进行唾液酸PEG化。用CMP-SA-lys-PEG(20K)/St6GalNAcI处理前者，用CMP-SA-PEG(20K)/O-唾酸转移酶处理后者。两个反应都在25mM MES缓冲液(pH 6.0)和1mg/ml蛋白浓度下进行。在SDS-Page凝胶上可看到PEG化的效率。结果显示，在受试条件下，两个酶在使用CMP-SA-Lys-PEG(20KDa)进行该蛋白的糖PEG化上非常相似。
c.高蛋白浓度导致MAPT-G-CSF((GalNAc-SA-PEG(20KDa))2作为主要产物形成。
如上所述，在检查酶和缓冲液对糖PEG化的影响后，通过使用ST6GalNAcI作为糖PEG化酶，结合高缓冲液浓度因素考察蛋白浓度对糖PEG化的影响。因此我们在1M MES缓冲液(pH6.0)中使用UDP-GalNAc/GalNAc-T2和CMP-SA-PEG(20KDa)/St6GalNAcI，使用8-10mg/ml蛋白浓度对MAPT-G-CSF进行糖PEG化。结果暗示在该条件下，想要的二PEG化产物成为主要的产物。通过使用更多的CMP-SA-PEG(20K)和酶也获得超过90％的转化率。结合SP-Sepharose和Supderdex 200上的SEC纯化法纯化PEG化的G-CSF产物，即MAPT-G-CSF((GalNAc-SA-PEG(20KDa))2。
12.3.MAPT-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG)2的细胞增殖活性
进行使用NFS-60细胞系和Tf-1细胞系的MAPT-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG)2细胞增殖测定法。使用0ng/ml至1000ng/ml之间的蛋白浓度进行测定。在该测定法中MAPT-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG(20K))2是有活性的。
12.4实验细节
12.4a突变的G-CSF的GalNAc化的一般方法
用MES缓冲液(25mM+0.005％NaN3，pH6.0)更换一定体积的突变的G-CSF溶液(对于100μg蛋白)的缓冲液。将终体积调整至100μg/100μl。向该溶液中加入5μl 100mM MnCl2和GalNAc-T2(1mU)。在室温(rt)下摇动所得的混合物，进行至MALDI或QTOF分析所需要的时间。
12.4b MAPTP-G-CSF-(GalNAc)2)的制备
用MES缓冲液(25mM+0.005％NaN3，pH6.0)更换MAPTP-G-CSF5.4mg(KJ-675-159，0.18mg/ml，0.053μmol)的缓冲液。终体积调整至5.4ml。向该溶液中加入UDP-GalNAc(5mg，0.15μmol)、100mMMnCl2 0.25ml和GalNAc-T2(1.0U/ml，50μl)。将所得的混合物在32℃下摇动24小时。M+(MALDI)：19364(MAPT-G-CSF-(GalNAc)2对18951(MVPTP-G-CSF)。
12.4c通过单釜反应对突变的G-CSF序列的糖PEG化的一般方法
将突变的G-CSF 100μg(突变的G-CSF-1、2、3、4、5)和UDP-GalNAc(0.6mg，0.923μmol)、GalNAc-T2(20μl，8mU)、UDP-Gal(0.6mg，0.923μmol)、核心1 GalT(20μl，10mU)、CMP-SA-PEG(20K)(1mg，0.05μmol)、St3Gal II(20μl，28mU)、100mM MnCl2 3μl在100μl 25mMMES缓冲液(pH6.0+0.005％NaN3)中混合。将所得的混合物在室温下摇动24小时。在糖PEG化后进行SDS-PAGE。
12.4d在各种缓冲液系统中比较突变的G-CSF-1糖PEG化(20KDa)
将GalNAc2-MATP-G-CSF(54μg)的缓冲液更换成下列4种缓冲液体系(1.1M MES缓冲液(pH6.0)；2.25mM MES缓冲液(pH6.0)；3.50mM Bis-Tris缓冲液(pH6.5)；4.1M HEPS缓冲液(pH7.4)。然后加入CMP-SA-PEG(20K)(216μg)ST6GalNAcI(BV，1U/mL，2.5ul)、100mMMnCl2 2.5μ1。将所得的混合物在室温下摇动24小时。用SDS-PAGE监控反应。
12.4e使用ST6GalNAcI和O-唾酸转移酶(Wang787-29和787-40)进行MAPT-G-CSF的糖PEG化的比较
12.4e1使用ST6GalNAcI
第一步：通过超滤(MWCO 5K)在3500g下浓缩30ml KJ-675-159溶液(0.18mg/ml，总共5.4mg蛋白)，然后将缓冲液更换为25mM MES缓冲液(pH6.0)。将终体积在塑料管中调整为5.4ml。加入GalNAc-T2(1.0U/ml，50μl)，然后加入0.25mL MnCl2。将所得的混合物在32℃下摇动24小时。MALDI表明反应完成。通过UF(MWCO 5K)浓缩反应混合物并用25mM MES缓冲液稀释至5ml，然后加入CMP-SA-PEG(20K)(2X25mg)、ST6GalNAc1(BV，1U/ml)、100mM MnCl2 0.25ml。将所得的混合物在32℃下摇动过夜。对反应物使用SDS-PAGE。
12.4e2使用O-唾酸转移酶(St3GalII)：
将200μl 25mM MES缓冲液  (pH6.0)中的200μgGalNAc2-MATP-G-CSF和0.6mg UDP-Gal以及核心GalT(0.2U/ml，10μl)和10μl 100mM MnCl2混合。将所得的混合物在32℃下摇动进行24小时。将所述反应混合物通过UF(MWCO 5K)浓缩并用25mM MES缓冲液稀释至200μl。加入CMP-SA-PEG(800μg)、St3Gal II(1.0U/ml，10μl)、10μl 100mM MnCl2.将所得的混合物在室温下摇动24小时。将所得的混合物在32℃下摇动过夜。反应用SDS-PAGE进行监控。
12.4f来自MAPT-G-CSF-(GalNAc)2的糖PEG化的MAPTP-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG(20K)2(Wang 787-42)
浓缩MAPTP-G-CSF溶液(540μg)，用1M MES缓冲液(pH6.0)更换其缓冲液并调整至50μl。然后加入UDP-GalNAc(100μg，0.15μmol，5eq)、GalNAcT2(5.0U/ml，5μl)和100mM MnCl2(5μl)。将所得的反应混合物在室温下摇动过夜。然后加入CMP-SA-PEG(20K)(2.16mg，0.108μmol)和St6GalNAcI(1.0U/ml，50μl)。将所述溶液在室温下摇动60小时。再加入CMP-SA-PEG(20K)(2.16mg，0.108μmol)和St6GalNAcI(1.0U/ml，50μl)，然后在室温下缓慢旋转24小时。将反应混合物的缓冲液更换为缓冲液A(25mM NaOAc，0.005％polysorbate 80，pH4.5)，然后用100％A的等度洗脱在AmershamSP-FF(5mL)柱上进行10分钟，接着用100％A至20％B的线性梯度以3mL/分钟的流速对反应混合物进行超过20分钟的纯化，其中B＝25mM NaOAc，2M NaCl 0.005％polysorbate 80，pH4.5。汇集保留时间17分钟处的峰并浓缩至0.5ml，在Amersham HiLoad Superdex 200(16×600mm，34μm)上用磷酸缓冲盐溶液以0.4mL/分钟的流速对其进一步纯化。汇集保留时间160分钟处的产物级分，浓缩以提供30μgMAPT-G-CSF(GalNAc-SA-PEG(20K))2(BCA)。没有优化产率。
12.4 g G-CSF突变体的序列
突变型G-CSF-1：
MAPTPLGPAS SLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSL
GIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVAD
FATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVL
RHLAQP(SEQ ID NO：9)
突变型G-CSF-2：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP
WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFAT
TIWQQMEELGMAPATQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHL
AQP(SEQ ID NO：)
突变型G-CSF-3：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP
WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFAT
TIWQQMEELGMAPALQPTQTAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHL
AQP(SEQ ID NO：)
突变型G-CSF-4(C端标签)：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP
WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFAT
TIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHL
AQPTQGAMP(SEQ ID NO：8)
突变型G-CSF-5(N端MI ATP)：
MIATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLG
IPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADF
ATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLR
HLAQP(SEQ ID NO：10)
突变型G-CSF-6(177Mer)：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHS
LGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVA
DFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRV
LRHLAQP(SEQ ID NO：1)
在大肠杆菌中表达的人重组G-CSF
MTPLGPAS SLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIP
WAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDYADFAT
TIWQQMEELGMAPALQPT134QGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLR
HLAQP(SEQ ID NO：2)
实施例13
下列实施例说明了糖PEG化的hGH蛋白的制备。野生型hGH没有天然的糖基化位点，因此通过基因工程改造将新的O-糖基化位点引入突变型hGH中，然后在突变位点用GalNAc转移酶糖基化和唾液酸PEG化所述蛋白。设计5个突变hGH蛋白以将O-糖基化位点整合入氨基末端或蛋白分子的环区域。产生5个突变蛋白，并在Nb2-11细胞增殖测定法中就hGH的活性对各蛋白进行检测。
13.1突变型hGH的氨基酸序列：
包含N末端甲硫氨酸的192个氨基酸的来自垂体的野生型hGH
    MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNP
QTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDS
NVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYC
FRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
缺少N末端甲硫氨酸的191个氨基酸的来自垂体的野生型hGH
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQ
TSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSN
VYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCF
RKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
MVTP突变体：
(M)VTPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFL
QNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGA
SDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGL
LYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
PTQGAMP突变体：
MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNP
QTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDS
NVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPTQGAMPKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLY
CFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
TTT突变体：
           MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNP
QTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDS
NVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPTTTQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYC
FRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
MAPT突变体：
MAPTSSPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSF
LQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYG
ASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYG
LLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO：)
NTG突变体：
MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNP
QTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDS
NVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPNTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLY
CFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
就作为糖基转移酶GalNAcT2的底物的能力对4种hGH突变体进行检测。在这4种hGH突变体中，通过MALDI-MS分析发现2种被GalNAcT2糖基化。
13.2 hGH-(TTT)-GalNAc-SA-PEG-30Kda的制备
对于TTT突变体，GalNAc的加入产生未糖基化的、和1-GalNAc以及2-GalNAc种类的复杂混合物。肽作图实验(胰蛋白酶降解)显示两个GalNAc′s被加入到含有TTT突变的T12肽(L129-K141)中。通过MALDI-MS，(M)VTP突变体显示只有痕量的加入的GalNAc。
用15mL洗涤缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，0.02％NaN3，pH7.4)更换hGH-TTT-突变体(4.0mL，6.0mg，0.27μmoles)的缓冲液2次，并用反应缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，5mM MnCl2，5mM MgCl2，0.02％NaN3，pH7.4)更换一次，然后使用Centricon离心过滤器5 KDaMWCO将其浓缩至2.0mL。
将hGH-TTT突变体和UDP-GalNAc(1.38μmoles，0.90mg)和GalNAc-T2(0.12mL，120mU)混合。将反应物在32℃下温和地摇动19小时。用MALDI-MS分析反应物，观察到GalNAc被部分加入至hGH-TTT突变体(大约40％)。将CMP-SA-PEG-30K(16mg，0.533μmoles)和ST6GalNAcl(0.375mL，375mU)加入到反应混合物产生2.85mL的总体积。将反应物在32℃下温和地摇动进行22小时。在第0小时和第22小时用SDS PAGE监控反应。通过SDS PAGE凝胶确定反应的程度。使用SP Sepharose纯化产物hGH-(TTT)-GalNAc-SA-PEG-30Kda，并通过SDS-PAGE对其进行分析。观察到想要的hGH-(TTT)-GalNAc-SA-PEG-30Kda的产率非常低。
13.3 hGH-(PTQGAMP)-GalNAc-SA-PEG-30Kda的制备
用UDP-GalNAc和GalNAc T2容易地糖基化PTQGAMP突变体，然后使用CMP-SA-PEG-30Kda和ST6GalNAc1以10mg规模对其进行糖PEG化，从而产生1.45mg的纯化的hGH-(PTQGAMP)-GalNAc-SA-PEG-30Kda。肽作图实验(胰蛋白酶降解)将GalNAc定位在含有PTQGAMP突变的胰蛋白酶T12肽(L129-K141)上。
用15mL的清洗缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，0.02％NaN3，pH 7.4)更换hGH-PTQGAMP-突变体(4.55mL，10.0mg，0.45μmoles)的缓冲液两次，用反应缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，5mM MnCl2，0.02％NaN3，pH 7.4)更换一次，然后使用Centricon离心过滤器，5KDaMWCO浓缩至3mL。
将hGH-PTQGAMP突变体和UDP-GalNAc(2.26μmoles，1.47mg)和GalNAc-T2(0.1mL，100mU)混合。将反应物在32℃下温和地摇动22小时。用MALDI-MS分析反应物，观察到GalNAc完全加入至hGH-PTQGAMP突变体中。将CMP-SA-PEG-30K(27mg，0.9μmoles)和ST6GalNAc1(0.350mL，350mU)加入到反应混合物中产生3.4mL的总体积。将反应物在32℃下温和地摇动24小时。在第0小时和第16.5小时用SDS PAGE监控反应。通过SDS PAGE凝胶确定反应的程度。使用  SP Sepharose和SEC(Superdex 200)层析纯化产物hGH-(PTQGAMP)-GalNAc-SA-PEG-30Kda，然后配制所得产物。使用MALDI、肽作图和SDS-PAGE(银染)分析终产物。通过BCA相对BSA标准确定蛋白。基于蛋白，总的分离产率(1.45mg)为12.5％。
实施例14
该实施例提供了本发明的GM-CSF PEG糖缀合物的制备。
14.1(PEG(20K)-SA-Gal-GalNAc)2-GM-CSF和PEG(20k)-SA-Gal-GalNAc-GM-CSF的制备
将GM-CSF(1mg)溶解在25mM MES缓冲液(1mL)(pH6.0，0.005％NaN3)，然后加入UDP-GalNAc(1mg)、GalNAc-T2(200μL，0.38U/mL，0.076U)、100mM MnCl2(80μL)。将所得的混合物在室温下温育72小时。MALDI表明形成了GalNAc2-GM-CSF。
加入UDP-Gal(6mg，9.8mmol)、核心-1-Gal-T1(0.5U/mL，80μL)、CMP-SA-PEG(20kDa)(6mg，0.3μmol)、α-(O)-唾酸转移酶(1U/mL，120μL)、100mM MnCl2(50μL)。将所得混合物在32℃下缓慢旋转48小时。将反应混合物在2rpm下离心5分钟。取出蛋白溶液。将余下的树脂和1mL 25mM MES缓冲液(pH 6.0)混合并震动30秒。将悬浮液再次浓缩；将蛋白溶液合并在一起并浓缩至200mcL。HPLC纯化提供了糖PEG化的GM-CSF。
实施例15
可将类似于干扰素α-2的O-连接的糖基化位点的糖基化位点在相同的相对位置上整合入任何干扰素α蛋白。这可通过将目的氨基酸序列和INF-α-2β序列(10-20个氨基酸长)进行比对并修饰所述氨基酸序列以整合糖基化位点来进行。用任何氨基酸突变、缺失或插入可用于产生所述位点。示例性突变体尽可能在该区域和INF-α-2序列保持高度同源性，特别是在位点106的T上(下面以粗体显示的)。下面显示进行该整合的方法的例子。
NCBI蛋白数据库中干扰素α的比对
GI#        AA#      AA序列            名称
IFN-a-2β  1  CVIQGVGVTETPLMKEDSIL 20  (SEQ ID NO：X)
124449     98 ....................117  IFN-alpha 2(a，b，c)
20178265   99....E...E.....N.....118  IFN-alpha 14
124453     99....E...E.....N.....118  IFN-alpha 10
585316     99....E..ME.....N.....118  IFN-alpha 17
124442     99....E...E.....N..F..118  IFN-alpha 7
124438     99....E...E.....NV....118  IFN-alpha 4
417188     99..M.E...I.S...Y.....118  IFN-alpha 8
20178289   99....E...E.....NV....118  IFN-alpha 21
124457     99.MM.E...ED....NV....118  IFN-alpha 5
124463     99..T.E...E.IA..N.....118  IFN-alpha 16
124460     99..M.E.W.GG....N.....118  IFN-alpha  6
124455     99..M.EER.G.....NA....118  IFN-alpha1/13
糖基化/糖-PEG化发生在T106(IFN-α-2)上。蛋白编号从除去天然表达的前原形式的蛋白前导序列后的第一个氨基酸开始。
干扰素α突变将O-连接的糖基化位点引入缺少该位点的INF-α中。
GI#          AA#      AA序列        名称
IFN-a-2β  1 CVIQGVGVTETPLMKEDSIL 20    (SEQ ID NO：X)
124449     98....................117      IFN-alpha 2(a，b，c)
20178265   99....E...T.....N.....118      IFN-alpha 14(E107T)
20178265   99....G...T.....N.....118      IFN-alpha 14(E103G；E107T)
124453     99....E...T.....N.....118      IFN-alpha 10(E107T)
124453     99....G...T.....N.....118      IFN-alpha  10(E103G；E107T)
585316     99....E..MT.....N.....118      IFN-alpha  17(E107T)
585316     99....E..VT.....N.....118      IFN-alpha  17(ME107VT)
585316     99....G..MT.....N.....118      IFN-alpha  17(E103G；E107T)
124442     99....E...T.....N..F..118      IFN-alpha  7(E107T)
124442     99....G...T.....N..F..118      IFN-alpha  7(E103G；E107T)
124438     99....E...T.....NV....118      IFN-alpha  4(E107T)
124438     99....G...T.....NV....118      IFN-alpha 4(E103G；E107T)
417188     99..M.E...T..S...Y.....118     IFN-alpha  8(1107T)
417188     99..M.G...T.S...Y.....118      IFN-alpha 8(E103G；I107T)
20178289   99....E...T.....NV....118      IFN-alpha  21(E107T)
20178289    99....G...T.....NV....118    IFN-alpha 21(E103G；E107T)
124457      99.MM.E...TD....NV....118    IFN-alpha 5(E107T)
124457      99.MM.E...TE....NV....118    IFN-alpha 5(ED108TE)
124457      99.MM.G...TD....NV....118    IFN-alpha 5(E103G；E107T)
124463      99..T.E...T.IP..N.....118    IFN-alpha 16(E107T；A110P)
124463      99..T.E...T.TP..N.....118    IFN-alpha 16(E107T；IA110TP)
124463      99..T.G...T.TP..N.....118    IFN-alpha 16(E103G；E107T；IA110TP)
124460      99..M.E.W.TG....N.....118    IFN-alpha  6(G107T)
124460      99..M.E.G.TG....N.....118    IFN-alpha  6(W105G；G107T)
124460      99..M.G.G.TE....N.....118    IFN-alpha 6(E103G；W105G；GG108TE)
124455      99..M.EER.T.....NA....118    IFN-alpha1/13(G107T)
124455      99..M.EEG.T.....NA....118    IFN-alpha1/13(R105G；G107T)
124455      99..M.GVG.T.....NA....118    IFN-alpha1/13(EER105GVG； G107T)
上表中的GI编号(除了第一个编号124449外)是指未经修饰的野生型蛋白的编号
通过将T或S置于如上显示的合适的氨基酸位点，可在任何干扰素α的同种型中产生O-连接的糖基化位点。如上表中所显示的，取代是T。各种干扰素α形式之间的氨基酸序列是相似的。可在该区域产生任何氨基酸的突变、插入、缺失，只要T或S在合适的糖基化/糖-PEG化的位点上，所述位点对应于上面显示的比对序列中的P109(INF-α-2)。
尽管本发明已通过特定的实施方案进行公开，但很明显本发明的其他实施方案和改变可由本领域其他技术人员设计而不背离本发明的实际精神和范围。
所有在本申请中引用的专利、专利出版物和其他出版物在此以其全文引用作为参考。

Claims (62)

1.包含突变型肽序列的分离的多肽，其中所述突变型肽序列编码不存在于对应于所述分离的多肽的野生型多肽中的O-连接的糖基化位点。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽是G-CSF多肽。
3.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式M1XnTPLGP或M1BoPZmXnTPLGP的突变型肽序列，其中
上标表示氨基酸在野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中的位置，下标n和m是选自0至3的整数，和
X和B中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，和
当X和B中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分的身份是独立地选择的，和
Z选自谷氨酸或任何不带电荷的氨基酸。
4.权利要求3的突变型G-CSF多肽，其中所述突变型肽序列选自MVTPLGP、MQTPLGP、MIATPLGP、MATPLGP、MPTQGAMPLGP、MVQTPLGP、MQSTPLGP、MGQTPLGP、MAPTSSSPLGP和MAPTPLGPA。
5.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式M1TPXnBoOrP的突变型肽序列
其中
上标表示氨基酸在SEQ ID NO：3中的位置，下标n，o和r是选自0至3的整数，和
X、B和O中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，和
当X、B和O中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分的身份是独立选择的。
6.权利要求5的多肽，其中所述突变型肽序列选自序列：MTPTLGP、MTPTQLGP、MTPTSLGP、MTPTQGP、MTPTSSP、M1TPQTP、M1TPTGP、M1TPLTP、M1TPNTGP、MTPLGP(G-CSF mut#4)、M1TPVTP、M1TPMVTP和MT1P2TQGL3G4P5A6S7。
7.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式LGX53BoLGI的突变型肽序列
其中
上标表示氨基酸在野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中的位置，和
X是组氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸或酪氨酸，和
B是苏氨酸或丝氨酸，和
o是从0至3的整数。
8.权利要求7的多肽，其中所述突变型肽序列选自序列：LGHTLGI、LGSSLGI、LGYSLGI、LGESLGI和LGSTLGI。
9.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式P129ZmJqOrXnPT的突变型肽序列，
其中
上标表示氨基酸在野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.3)中的位置，
Z、J、O和X独立地选自苏氨酸或丝氨酸，和
m、q、r和n是独立地选自0至3的整数。
10.权利要求9的多肽，其中所述突变型肽序列选自序列：P129ATQPT、P129TLGPT、P129TQGPT、P129TSSPT、P129TQGAPT、P129NTGPT、PALQPTQT、P129ALTPT、P129MVTPT、P129ASSTPT、P129TTQP、P129NTLP、P129TLQP、MAP129ATQPTQGAM和MP129ATTQPTQGAM。
11.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式PZmUsJqP61OrXnBoC的突变型肽序列，
其中
上标表示氨基酸在野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.3)中的位置，
Z、J、O和U中至少一个选自苏氨酸或丝氨酸，和
当Z、J、O和U中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，其各是独立地选择的，和
m、s、q、r、n和o是独立地选至0至3的整数。
12.权利要求11的多肽，其中所述突变型肽序列选自序列：P61TSSC、P61TSSAC、LGIPTAP61LSSC、LGIPTQP61LSSC、LGIPTQGP61LSSC、LGIPQTP61LSSC、LGIPTSP61LSSC、LGIPTSP61LSSC、LGIPTQP61LSSC、LGTPWAP61LSSC、LGTPFAP61LSSC、P61FTP和SLGAP58TAP61LSS。
13.权利要求2的多肽，其中所述G-CSF多肽包含具有式ΦaGpJQOrP175XnBoZmUsΨt的突变型肽序列，
其中
上标表示氨基酸在野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中的位置，
Z、U、O、J、G、Ф、B和X中至少一个是苏氨酸或丝氨酸，和
当Z、U、O、J、G、Ф、B和X中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，其是独立选择的，
Ф任选地是R，G任选地是H；符号Ψ表示任何不带电荷的氨基酸残基或谷氨酸，和
a、p、q、r、n、o、m、s和t是独立地选自0至3的整数。
14.权利要求13的多肽，其中所述突变型肽序列选自序列：RHLAQTP175、RHLAGQTP175、QP175TQGAMP、RHLAQTP175AM、QP175TSSAP、QP175TSSAP、QP175TQGAMP、QP175TQGAM、QP175TQGA、QP175TVM、QP175NTGP和QP175QTLP。
15.权利要求2的多肽，其包含选自序列P133TQTAMP139、P133TQGTMP、P133TQGTNP、P133TQGTLP和PALQP133TQTAMPA的突变型肽序列。
16.权利要求1的多肽，其中所述多肽是hGH多肽。
17.权利要求16的多肽，其中所述突变型肽序列包含选自M1APTSSPTIPL7SR9和DGSP133NTGQIFK140的序列。
18.权利要求15的多肽，其中所述hGH多肽包含具有式P133JXBOZUK140QTYS的突变型肽序列，和
其中
上标表示氨基酸在野生型hGH氨基酸序列(SEQ ID NO：20)中的位置，和
J选自苏氨酸和精氨酸；
X选自丙氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸；
B选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸；
O选自酪氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；
Z选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和
U选自苯丙氨酸和脯氨酸。
19.权利要求18的多肽，其中所述突变型肽序列选自PTTGQIFK、PTTAQIFK、PTTLQIFK、PTTLYVFK、PTTVQIFK、PTTVSIFK PTTNQIFK、PTTQQIFK、PTATQIFK、PTQGQIFK、PTQGAIFK、PTQGAMFK、PTIGQIFK、PTINQIFK、PTINTIFK、PTILQIFK、PTIVQIFK、PTIQQIFK、PTIAQIFK、P133TTTQIFK140QTYS和P133TQGAMPK140QTYS。
20.权利要求15的多肽，其中所述hGH多肽包含具有式P133RTGQIPTQBYS的突变型肽序列
其中
上标表示氨基酸在野生型hGH氨基酸序列(SEQ ID NO：20)中的位置；并且
B选自丙氨酸和苏氨酸。
21.权利要求20的多肽，其中所述突变型肽序列选自PRTGQIPTQTYS和PRTGQIPTQAYS。
22.权利要求16的多肽，其中所述hGH多肽包含具有式L128XTBOP133UTG的突变型肽序列，
其中
上标表示氨基酸在野生型hGH氨基酸序列中的位置；和其中
X选自谷氨酸、缬氨酸和丙氨酸；
B选自谷氨酰胺、谷氨酸和甘氨酸；
O选自丝氨酸和苏氨酸；和
U选自精氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸。
23.权利要求22的突变型hGH多肽，其中所述突变型肽序列选自：LETQSP133RTG、LETQSP133STG、LETQSP133ATG、LETQSP133LTG、LETETP133R、LETETP133A、LVTQSP133RTG、LVTETP133RTG、LVTETP133ATG和LATGSP133RTG。
24.权利要求16的多肽，其中所述hGH多肽包含具有式M1BPTXnZmOPLSRL的突变型肽序列
其中
上标表示氨基酸在野生型hGH氨基酸序列(SEQ ID NO：19)中的位置；和
B选自苯丙氨酸、缬氨酸和丙氨酸或其组合；
X选自谷氨酸、缬氨酸和脯氨酸；
Z是苏氨酸；
O选自亮氨酸和异亮氨酸；和
当X是脯氨酸时，Z是苏氨酸；和
其中n和m是选自0和2的整数。
25.权利要求24的多肽，其中所述突变型肽序列选自M1FPTEIPLSRL、M1FPTV LPLSRL和M1APTPTIPLSRL。
26.权利要求24的多肽，其中所述突变型肽序列是M1VTPTIPLSRL，其中上标1表示野生型hGH氨基酸序列(SEQ ID NO：19)中的第一位氨基酸。
27.权利要求15的多肽，其中所述突变型肽序列选自LEDGSPTTGQIFKQTYS，LEDGSPTTAQIFKQTYS，LEDGSPTATQIFKQTYS，LEDGSPTQGAMFKQTYS，LEDGSPTQGAIFKQTYS，LEDGSPTQGQIFKQTYS，LEDGSPTTLYVFKQTYS，LEDGSPTINTIFKQTYS，LEDGSPTTVSIFKQTYS，LEDGSPRTGQIPTQTYS，LEDGSPRTGQIPTQAYS，LEDGSPTTLQIFKQTYS，LETETPRTGQIFKQTYS，LVTETPRTGQIFKQTYS，LETQSPRTGQIFKQTYS，LVTQSPRTGQIFKQTYS，LVTETPATGQIFKQTYS，LEDGSPTQGAMPKQTYS和LEDGSPTTTQIFKQTYS。
28.权利要求1的多肽，其中所述多肽是IFNα多肽。
29.权利要求28的多肽，其中所述INFα多肽具有包含突变型氨基酸序列的肽序列，所述肽序列对应于INFα2的区域，所述区域具有如SEQ ID NO：22中所示的序列，其中所述突变型氨基酸序列在对应于INFα2的T106位点上包含突变成苏氨酸或丝氨酸的突变。
30.权利要求29的多肽，其中所述IFNα多肽选自IFNα、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNα8、IFNα10、IFNα14、IFNα16、IFNα17和I FNα21。
31.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVMQEERVTETPLMNADSIL118、99CVMQEEGVTETPLMNADSIL118和99CVMQGVGVTETPLMNADSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα多肽。
32.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMKEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα4多肽。
33.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CMMQEVGVTDTPLMNVDSIL118、99CMMQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CMMQGVGVTDTPLMNVDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα5多肽。
34.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVMQEVWVTGTPLMNEDSIL118、99CVMQEVGVTGTPLMNEDSIL118和99CVMQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα6多肽。
35.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDFIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDFIL118的突变型氨基酸序列的IFNα7多肽。
36.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVMQEVGVTESPLMYEDSIL118和99CVMQGVGVTESPLMYEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα8多肽。
37.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα10多肽。
38.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα14多肽。
39.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVTQEVGVTEIPLMNEDSIL118、99CVTQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVTQGVGVTETPLMNEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα16多肽。
40.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGMTETPLMNEDSIL118、99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118和99CVIQGVGMTETPLMNEDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα17多肽。
41.权利要求30的多肽，其中所述IFNα多肽是包含选自99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118和99CVIQGVGVTETPLMNVDSIL118的突变型氨基酸序列的IFNα21多肽。
42.编码权利要求1的多肽的分离的核酸。
43.包含权利要求42的核酸的表达盒。
44.包含权利要求42的核酸的细胞。
45.权利要求1的多肽，其具有选自下列的通式：
Figure A2005800064740008C1
和
Figure A2005800064740008C2
其中AA是突变型肽序列内的包含羟基部分的氨基酸侧链；X是修饰性基团或糖基部分。
46.权利要求45的多肽，其中X包含选自唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia部分的基团，其中所述唾液酸基、半乳糖基和Gal-Sia的至少一个包含修饰性基团。
47.权利要求45的多肽，其中X包含下列部分：
Figure A2005800064740009C1
其中
D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；
G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；
R1是这样的部分，即其包含选自含有直链或分枝的聚(乙二醇)残基的部分的成员；和
L是这样的连接体，即其是选自键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基的成员，
从而当D是OH时，G是R1-L-，而当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
48.权利要求45的多肽，其中X包含下列结构：
其中L是取代的或未取代的烷基或取代的或未取代的杂烷基；n选自从0至大约500的整数。
49.权利要求45的多肽，其中X包含下列结构：
Figure A2005800064740010C1
其中s选自从0至20的整数。
50.制备权利要求1的多肽的糖缀合物的方法，其包括步骤：
(a)重组地产生所述多肽，和
(b)用经修饰的糖在所述O-连接的糖基化位点上酶促糖基化所述多肽。
51.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的药物组合物，其包含：有效量的权利要求2的多肽，其中用经修饰的糖糖缀合所述多肽。
52.权利要求51的药物组合物，其中用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员修饰所述经修饰的糖。
53.人生长激素(hGH)的药物组合物，其包含有效量的权利要求16的多肽，其中用经修饰的糖糖缀合所述多肽。
54.权利要求53的药物组合物，其中用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员修饰所述经修饰的糖。
55.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的药物组合物，其包含有效量的含有突变型肽序列的GM-CSF多肽，其中所述突变型肽序列包含不存在于野生型GM-CSF多肽中的O-连接的糖基化位点，其中用经修饰的糖糖缀合所述多肽。
56.权利要求55的药物组合物，其中使用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员修饰所述经修饰的糖。
57.干扰素α-2b的药物组合物，其包含有效量的权利要求28的多肽，其中用经修饰的糖糖缀合所述多肽。
58.权利要求57的药物组合物，其中用选自聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)的成员修饰所述经修饰的糖。
59.给需要所述治疗的受试者提供G-CSF治疗的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求51的药物组合物。
60.给需要所述治疗的受试者提供粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗的方法，所述方法包括：
给所述受试者施用有效量的权利要求55的药物组合物。
61.给需要所述治疗的受试者提供干扰素治疗的方法，所述方法包括：
给所述受试者施用有效量的权利要求57的药物组合物。
62.给需要所述治疗的受试者提供生长激素治疗的方法，所述方法包括：
给所述受试者施用有效量的权利要求53的药物组合物。
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