KR20060123506A - 펩티드의 오-결합 글리코실화 - Google Patents

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지-광 왕
헨릭 클라우센
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네오스 테크놀로지스, 인크.
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Abstract

본 발명은 야생형 펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 수용성 중합체, 치료제, 또는 생체분자와 같은 종이 온전한 O-결합 글리코실 잔기를 통해서 폴리펩티드에 공유적으로 결합된 글리코콘쥬게이트를 포함한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 제조하는 방법, 및 펩티드를 함유하는 약제학적 조성물, 및 목적하는 반응을 수득하기에 충분한 양의 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 포유동물에서 질병을 치료, 개선 또는 예방하는 방법을 제공한다.
O-결합 글리코실화 글리코펩티드, 글리코콘쥬게이트, 변이체 펩티드 서열, 과립구 집락 자극인자 (G-CSF), 인간 성장 호르몬, 인터페론 알파 폴리펩티드, 변형된 당

Description

펩티드의 오-결합 글리코실화{O-LINKED GLYCOSYLATION OF PEPTIDES}
관련 출원 참조
본 출원은 기술된 전체내용이 본 원에 참고로 포함되는 2004년 1월 8일 출원된 U.S. 가특허 출원 제 60/535,284호; 2004년 2월 12일 출원된 U.S. 가특허 출원 제 60/544,411호; 2004년 2월 20일 출원된 U.S. 가특허 출원 제 60/546,631호; 2004년 3월 23일 출원된 U.S. 가특허 출원 제 60/555,813호; 및 2004년 5월 12일 출원된 U.S. 가특허 출원 제 60/570,891호에 기초한다.
본 발명은 O-결합 글리코실화 글리코펩티드, 특히 야생형 펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 치료 펩티드 및 변이체 펩티드에 관한 것이다.
특정의 생리 반응을 야기하기 위해 글리코실화 및 비-글리코실화 펩티드를 투여하는 것은 의학 업계에 익히 알려졌다. 예를 들어, 정제 및 재조합 hGH가 hGH 결핍에 따른 증상 및 질환, 예컨대 어린이 왜소증을 치료하기 위해 사용되고 있으며, 인터페론은 알려진 항바이러스 활성을 갖고, 과립구 집락 자극인자는 백혈구 생산을 촉진한다.
치료 펩티드의 사용을 제한하는 주요인은 야생형 펩티드의 글리코실화 패턴을 가지는 펩티드를 발현하도록 발현 시스템을 공학적으로 처리하는 것이 근본적으로 어렵다는 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 부적절하게 또는 불완전하게 글리코실화된 펩티드는 펩티드의 중화 및/또는 앨러지 반응을 야기하는 면역원성일 수 있다. 재조합적으로 생산된 글리코펩티드의 다른 문제점으로 차선의 효능 및 신속한 제거율(clearance rate)이 포함된다.
글리코실화 펩티드 치료제의 제조에 내재된 문제를 해결하기 위한 한가지 방법은 펩티드를 발현후 시험관내에서 변형시키는 것이다. 시험관내 변형후 발현은 글리칸 구조를 변형시키고 글리칸을 새로운 자리에 도입하기 위해 사용되고 있다. 재조합 진핵 세포 글리코실트랜스퍼라제의 포괄적인 툴박스로 인해 고객 맞춤형 글리코실화 패턴 및 글리코실 구조가 가능한 포유동물 글리코콘쥬게이트의 시험관내 효소 합성이 가능하게 되었다. 참조예: U.S. 특허 제 5,876,980호; 6,030,815호; 5,728,554호; 5,922,577호; WO 98/31826호; US 2003180835호; 및 WO 03/031464호.
폴리펩티드상의 글리코실 그룹의 구조를 조작하는 것 이외에, 글리코펩티드는 하나 이상의 비-사카라이드 변형 그룹, 예컨대 수용성 중합체로 제조될 수 있다. 펩티드에 콘쥬게이트되는 예시적인 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")이다. 펩티드 치료제를 유도하기 위해 PEG를 사용하는 것은 펩티드의 면역원성을 감소시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어, U.S. 특허 제 4,179,337호(Davis 등)에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 결합된 펩티드 호르몬 및 효 소와 같은 비면역원성 폴리펩티드가 기재되었다. 면역원성 감소이외에, 해당 폴리펩티드의 PEG-콘쥬게이트의 크기 증가로 인해 순환시 제거 시간이 연장된다.
펩티드에 대한 PEG 및 그의 유도체의 주요 결합 모드는 펩티드 아미노산 잔기를 통한 비-특이적 결합이다(참조예: U.S. 특허 제 4,088,538호, U.S. 특허 제 4,496,689호, U.S. 특허 제 4,414,147호, U.S. 특허 제 4,055,635호 및 PCT WO 87/00056). 펩티드에 대한 PEG의 다른 결합 모드는 글리코펩티드상의 글리코실 잔기의 비-특이적 산화에 의한 것이다(참조예: WO 94/05332).
이러한 비-특이적 방법에서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 펩티드 골격상의 반응성 잔기에 비-특이적 방식으로 랜덤하게 부가된다. 물론, PEG 분자의 랜덤 부가는 최종 생성물의 균질성 결여 및 펩티드의 생물학적 또는 효소 활성의 감소 가능성을 비롯한 단점이 있다. 따라서, 치료 펩티드를 생산하기 위해서는, 특이적 표지화, 용이한 특성화, 필수적인 균질성 생성물을 형성하는 유도화 전략이 추구된다.
특이적으로 표지된 균질성 펩티드 치료제는 효소 작용을 통해 시험관내에서 제조될 수 있다. 펩티드에 합성 중합체 또는 다른 표지를 부착시키는 전형적인 비-특이적 방법과 달리, 효소에 기초한 합성은 위치선택성 및 입체선택성이라는 이점을 가진다. 표지화 펩티드를 합성하는데 사용하기 위한 두개의 주요 효소 부류는 글리코실트랜스퍼라제(예: 시알릴트랜스퍼라제, 올리고사카릴트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제) 및 글리코시다제이다. 이들 효소는 당에 특이적인 부착을 위해 사용될 수 있으며, 이후 치료 부분을 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 글리코실트랜스퍼라제 및 변형 글리코시다제가 변형 당을 펩티드 골격에 직접 전달하기 위해 사용될 수 있다(참조예: 각각 본 원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제 6,399,336호 및 U.S. 특허 출원공보 제 20030040037호, 20040132640호, 20040137557호, 20040126838호 및 20040142856호). 두 화학 및 효소 합성 원소들을 배합하는 방법이 또한 공지되었다(참조예: 본 원에 참고로 인용되는 Yamamoto 등의 Carbohydr. Res. 305: 415-422(1998) 및 U.S. 특허 출원공보 제 20040137557호).
탄수화물은 다양한 방법으로 글리코펩티드에 부착되며, 이중에서 아스파라긴에 N-결합되거나 세린 및 트레오닌에 뮤신-타입 O-결합된 글리코펩티드가 재조합 당단백질 치료제와 가장 관련이 깊다. 불행히도, 모든 폴리펩티드가 그의 주 아미노산 서열 부분으로 N- 또는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 것은 아니다. 다른 경우로, 기존의 글리코실화 부위는 폴리펩티드에 변형 그룹(예: 수용성 또는 수불용성 중합체, 치료 부분 및/또는 생체분자)을 부착하는 것이 용이치 않을 수 있거나, 상기 부위에 이러한 부분을 부착하는 것은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 바람직하지 않게 감소시킬 수 있다. 따라서, 당업계에서는 글리코실화 부위를 정확하게 생성하고 이들 부위의 변형을 엄밀히 지시할 수 있는 방법이 요망된다.
발명의 요약
본 발명에 따라 효소 글리코콘쥬게이트 반응을 O-결합 글리코실화 부위 및 O-결합 글리코실화 부위에 부착되는 글리코실 잔기에 특이적으로 표적화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 표적화된 O-결합 글리코실화 부위는 야생형 펩티드의 고유 부위일 수 있거나, 또는 이들은 돌연변이에 의해 펩티드에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 O-결합 글리코실화에 적합한 돌연변이 부위를 포함하는 폴리펩티드 및 그의 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 제조방법 및 이들 폴리펩티드 및/또는 그의 약제학적 조성물을 치료적으로 처치하는데 사용하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 측면으로, 본 발명은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
일례로, 분리된 폴리펩티드는 G-CSF 폴리펩티드이다.
일례로, G-CSF 폴리펩티드는 식 M1XnTPLGP 또는 M1BoPZmXnTPLGP의 변이체 펩티드 서열을 포함한다. 이러한 구체예에서, 위첨자 1은 야생형 G-CSF 서열(SEQ ID NO: 3)에서 아미노산 서열의 첫번째 위치를 나타내며, 아래첨자 n 및 m은 0 내지 3중에서 선택된 정수이고, X 및 B의 적어도 하나는 트레오닌 또는 세린이며, 복수개의 X 및 B가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들 부분의 아이덴티티(identity)는 독립적으로 선택된다. 또한, 이 구체예에서, Z는 글루타메이트, 임의의 비하전 아미노산 또는 MQ, GQ 및 MV를 비롯한 디펩티드 조합중에서 선택된다. 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 MVTPLGP, MQTPLGP, MIATPLGP, MATPLGP, MPTQGAMPLGP, MVQTPLGP, MQSTPLGP, MGQTPLGP, MAPTSSSPLGP 및 MAPTPLGPA로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 식 M1TPXBOrP의 변이체 펩티드 서열을 포함한다. 이 구체예에서, 위첨자 1은 야생형 G-CSF 서열(SEQ ID NO: 3)에서 아미노산 서열의 첫번째 위치를 나타내며, 아래첨자 r은 0 내지 3중에서 선택된 정수이고, X, B 및 O의 적어도 하나는 트레오닌 또는 세린이며, 복수개의 X, B 및 O가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들 부분의 아이덴티티는 독립적으로 선택된다. 또한, 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 MTPTLGP, MTPTQLGP, MTPTSLGP, MTPTQGP, MTPTSSP, M1TPQTP, M1TPTGP, M1TPLTP, M1TPNTGP, MTPLGP, M1TPVTP, M1TPMVTP 및 MT1P2TQGL3G4P5A6S7로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 식 LGX53BoLGI의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열에서 아미노산 위치를 나타내고, X는 히스티딘, 세린, 아르기닌, 글루탐산 또는 티로신이며, B는 트레오닌 또는 세린이고, o는 0 내지 3의 정수이다. 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 LGHTLGI, LGSSLGI, LGYSLGI, LGESLGI 및 LGSTLGI로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 식 P129ZmJqOrXnPT의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열에서 아미노산 위치를 나타내고, Z, J, O 및 X는 트레오닌 및 세린중에서 독립적으로 선택되며, m, q, r 및 n은 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수이다. 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 P129ATQPT, P129TLGPT, P129TQGPT, P129TSSPT, P129TQGAPT, P129NTGPT, PALQPTQT, P129ALTPT, P129MVTPT, P129ASSTPT, P129TTQP, P129NTLP, P129TLQP, MAP129ATQPTQGAM 및 MP129ATTQPTQGAM으로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 식 PZmUsJqP61OrXnBoC의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열에서 아미노산 위치를 나타내고, Z, J, O 및 U의 적어도 하나는 트레오닌 및 세린중에서 선택되며, 복수개의 Z, J, O 및 U가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들은 각각 독립적으로 선택되고, X 및 B는 임의의 비하전 아미노산 또는 글루타메이트이며, m, s, q, r, n 및 o는 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수이다. 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 P61TSSC, P61TSSAC, LGIPTAP61LSSC, LGIPTQP61LSSC, LGIPTQGP61LSSC, LGIPQTP61LSSC, LGIPTSP61LSSC, LGIPTSP61LSSC, LGIPTQP61LSSC, LGTPWAP61LSSC, LGTPFAP61LSSC, P61FTP 및 SLGAP58TAP61LSS로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 식 ØaGpJqOrP175XnBoZmUsΨt의 변이체 펩 티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 SEQ ID NO: 3에서 아미노산 위치를 나타내고, Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X의 적어도 하나는 트레오닌 또는 세린이고, 복수개의 Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들은 독립적으로 선택된다. Ø는 임의로 R이고, G는 임의로 H이다. 기호 Ψ는 임의의 비하전 아미노산 잔기 또는 글루타메이트를 나타내고, a, p, q, r, n, o, m, s 및 t는 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수이다. 다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 RHLAQTP175, RHLAGQTP175, QP175TQGAMP, RHLAQTP175AM, QP175TSSAP, QP175TSSAP, QP175TQGAMP, QP175TQGAM, QP175TQGA, QP175TVM, QP175NTGP 및 QP175QTLP로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, G-CSF 폴리펩티드는 서열 P133TQTAMP139, P133TQGTMP, P133TQGTNP, P133TQGTLP 및 PALQP133TQTAMPA중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예로, 분리된 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드이다.
일례로, hGH 폴리펩티드는 식 P133JXBOZUK140QTYS의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산 위치를 나타내고, J는 트레오닌 및 아르기닌중에서 선택되며, X는 알라닌, 글루타민, 이소루이신 및 트레오닌중에서 선택되고; B는 글리신, 알라닌, 루이신, 발린, 아스파라긴, 글루타민 및 트레오닌중에서 선택되며; O는 티로신, 세린, 알라닌 및 트레오닌중에서 선택되 고; Z는 이소루이신 및 메티오닌중에서 선택되며; U는 페닐알라닌 및 프롤린중에서 선택된다. 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 PTTGQIFK, PTTAQIFK, PTTLQIFK, PTTLYVFK, PTTVQIFK, PTTVSIFK, PTTNQIFK, PTTQQIFK, PTATQIFK, PTQGQIFK, PTQGAIFK, PTQGAMFK, PTIGQIFK, PTINQIFK, PTINTIFK, PTILQIFK, PTIVQIFK, PTIQQIFK, PTIAQIFK, P133TTTQIFK140QTYS 및 P133TQGAMPK140QTYS로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 식 P133RTGQIPTQBYS의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산 위치를 나타내고, B는 알라닌 및 트레오닌중에서 선택된다. 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 PRTGQIPTQTYS 및 PRTGQIPTQAYS로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 식 L128XTBOP133UTG의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자는 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산 위치를 나타내고, X는 글루탐산, 발린 및 알라닌중에서 선택되며; B는 글루타민, 글루탐산 및 글리신중에서 선택되고; O는 세린 및 트레오닌중에서 선택되며; U는 아르기닌, 세린, 알라닌 및 루이신중에서 선택된다. 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 LETQSP133RTG LETQSP133STG LETQSP133ATG, LETQSP133LTG, LETETP133R, LETETP133A, LVTQSP133RTG, LVTETP133RTG, LVTETP133ATG 및 LATGSP133RTG로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 식 M1BPTXnZmOPLSRL의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 여기에서 위첨자 1은 (SEQ ID NO: 19)에서 아미노산 위치를 나타내고, B는 페닐알라닌, 발린, 알라닌 및 이들의 조합중에서 선택되며; X는 글루타메이트, 발린 및 프롤린중에서 선택되고; Z는 트레오닌이며; O는 루이신 및 이소루이신중에서 선택되고; X가 프롤린인 경우, Z는 트레오닌이며; n 및 m은 0 및 2중에서 선택된 정수이다. 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 M1FPTE IPLSRL, M1FPTV LPLSRL 및 M1APTPTIPLSRL로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 M1VTPTIPLSRL의 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, hGH 폴리펩티드는 M1APTSSPTIPL7SR9 및 DGSP133NTGQIFK140으로 구성된 서열중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 분리된 폴리펩티드는 IFN 알파 폴리펩티드이다.
일례로, INF 알파 폴리펩티드는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 서열을 가지며, 펩티드 서열은 SEQ NO: 22의 서열을 가지는 INF 알파 2 영역에 상응 하고, 변이체 아미노산 서열은 INF 알파 2의 T106에 상응하는 위치에 돌연변이를 함유한다. 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 IFN 알파, IFN 알파 4, IFN 알파 5, IFN 알파 6, IFN 알파 7, IFN 알파 8, IFN 알파 10, IFN 알파 14, IFN 알파 16, IFN 알파 17 및 IFN 알파 21로 구성된 그룹중에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVMQEERVTETPLMNADSIL118, 99CVMQEEGVTETPLMNADSIL118 및 99CVMQGVGVTETPLMNADSIL118중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMKEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 4 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CMMQEVGVTDTPLMNVDSIL118, 99CMMQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CMMQGVGVTDTPLMNVDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 5 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVMQEVWVTGTPLMNEDSIL118, 99CVMQEVGVTGTPLMNEDSIL118 및 99CVMQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 6 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGVTETPLMNEDFIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDFIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포 함하는 IFN 알파 7 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVMQEVGVTESPLMYEDSIL118 및 99CVMQGVGVTESPLMYEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 8 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 10 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 14 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVTQEVGVTEIPLMNEDSIL118, 99CVTQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVTQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 16 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGMTETPLMNEDSIL118, 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGMTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 17 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, IFN 알파 폴리펩티드는 99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNVDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 21 폴리펩티드이다.
제 2 측면에서, 본 발명은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O- 결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 일례로, 변이체 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 발현 카세트내에 포함된다. 다른 관련 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
제 3 측면에서, 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드는 다음중에서 선택되는 식을 가진다:
Figure 112006055848460-PCT00001
상기 식에서,
AA는 변이체 폴리펩티드 서열내에 존재하는 하이드록실 부분을 포함하는 아미노산 측쇄이고;
X는 변형 그룹 또는 사카릴 부분이다.
일례로, X는 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia 부분중에서 선택되는 그룹이고, 이들 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia중의 적어도 하나는 변형 그룹을 포함한다.
다른 구체예에서, X는 하기 부분을 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00002
상기 식에서,
D는 -OH 및 R1-L-HN-중에서 선택되는 멤버이고;
G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬중에서 선택되는 멤버이며;
R1은 직쇄 또는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분중에서 선택되는 멤버를 포함하는 부분이고;
L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬중에서 선택되는 멤버인 링커 (linker)이며, 여기에서, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이다.
다른 구체예에서, X는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00003
상기 식에서,
L은 치환되거나 비치환된 알킬 또는 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹이고;
n은 0 내지 약 500의 정수중에서 선택된다.
다른 구체예에서, X는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00004
상기 식에서,
s는 0 내지 20의 정수중에서 선택된다.
제 4 측면에서, 본 발명은
(a) 변이체 폴리펩티드를 재조합에 의해 제조하고;
(b) 변이체 폴리펩티드를 O-결합 글리코실화 부위에서 변형 당으로 효소적으로 글리코실화하는 단계를 포함하여, 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드의 글리코콘쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다.
제 5 측면에서, 본 발명은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드의 약제학적 조성물을 제공한다.
일례로, 약제학적 조성물은 변형 당으로 글리코콘쥬게이트된 유효량의 본 발명의 G-CSF 폴리펩티드를 포함한다. 관련 구체예에서, 변형 당은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된다.
다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 변형 당으로 글리코콘쥬게이트된 유효 량의 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 관련 구체예에서, 변형 당은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된다.
다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 변형 당으로 글리코콘쥬게이트된 유효량의 본 발명의 과립구 대식세포 집락 자극인자를 포함한다. 관련 구체예에서, 변형 당은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된다.
다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 변형 당으로 글리코콘쥬게이트된 유효량의 본 발명의 IFN 알파 폴리펩티드를 포함한다. 관련 구체예에서, 변형 당은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된다.
제 6 구체예로, 본 발명은 치료를 요하는 대상에 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하여, 상기 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 일례로, 제공된 치료는 G-CSF 요법이다. 다른 구체예에서, 제공된 치료는 과립구 대식세포 집락 자극인자 요법이다. 다른 구체예에서, 제공된 치료는 인터페론 알파 요법이다. 또 다른 구체예에서, 제공된 치료는 성장 호르몬 요법이다.
이하, 본 발명의 추가의 측면, 이점 및 목적을 상세한 설명으로 설명하도록 하겠다.
도 1은 NSF-60 세포 증식 어세이에서 비변형 G-CSF 및 글리코-PEG-일화 된(glyco-PEG-ylated) 유사체에 대한 GCSF 농도에 따른 흡광도를 나타낸다.
도 2는 방사선요오드화된 G-CSF 및 그의 글리콜-PEG-화 유도체를 사용한 래트의 약동학적 시험에서 시간에 따른 분당수(CPM)를 나타낸다.
도 3은 방사선요오드화된 G-CSF 및 그의 글리콜-PEG-화 유도체를 사용한 래트의 약동학적 시험에서 시간(h)에 따른 혈중 G-CSF(㎍/mL)를 나타낸다.
도 4는 비변형 G-CSF, 및 화학적- 및 글리코-PEG-일화된 G-CSF를 사용한 마우스의 백혈구 유도를 나타낸다.
도 5는 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약으로 방사선요오드화를 실시한 후 응집 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 글리코-PEG-일화된 G-CSF의 안정성 촉진 시험 결과를 나타낸다.
도 7은 도 6을 확대한 도면이다.
도 8은 볼튼-헌터 방사표지 방법을 이용한 래트 IV pK 시험 결과를 나타낸다(침전된 혈장 단백질).
도 9는 ELISA로 검출된 비표지된 G-CSF, 화학적- 및 글리코-PEG-일화된 G-CSF를 사용한 래트 IV pK 시험 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 대표적인 시알릴트랜스퍼라제를 나타낸다.
약어
PEG, 폴리(에틸렌 글리콜); m-PEG, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜); PPG, 폴리(프로필렌 글리콜); m-PPG, 메톡시-폴리(프로필렌 글리콜); Fuc, 푸코실; Gal, 갈락토실; GalNAc, N-아세틸갈락토사미닐; Glc, 글루코실; GlcNAc, N-아세틸글루코사미닐; Man, 만노실; ManAc, 만노사미닐 아세테이트; Sia, 시알산; 및 NeuAc, N-아세틸뉴라미닐.
정의
달리 정의되지 않으면, 본 원에 일반적으로 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하고 있는 업계의 숙련자들이 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 원에 사용된 명명 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기화학, 핵산 화학 및 하이브리드화의 실험실 방법은 당업계에 익히 알려졌으며 통상으로 사용되는 것이다. 핵산 및 펩티드 합성에 일반적인 기술이 사용되었다. 기술 및 방법은 본 명세서를 통해 제공되는 당업계의 통상적인 방법 및 각종 참고문헌에 따라 일반적으로 행해진다(포괄적 참조: 본 원에 참고로 인용되는 Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 본 원에 사용된 명명 및 이후 기술되는 분석 화학 및 유기 합성의 실험실 방법은 당업계에 익히 알려졌으며 통상으로 사용되는 것이다. 화학적 합성 및 화학적 분석에 표준 기술 또는 그의 변형 기술이 사용되었다.
본 원에 기술된 모든 올리고사카라이드는 비환원 사카라이드에 대한 명칭 또는 약어(즉, Gal), 글리코시드 결합 배열(α 또는 β), 환 결합(1 또는 2), 결합에 포함된 환원 사카라이드의 환 위치(2, 3, 4, 6 또는 8) 및 이어서 환원 사카라이드의 명칭 또는 약어(즉, GlcNAc)에 따라 기술된다. 각 사카라이드는 바람직하게는 피라노스이다. 일반적인 글리코 생물학 명명에 대해서는 Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999)를 참조하기 바란다.
올리고사카라이드는 환원 말단의 사카라이드가 실제로 환원 당인지 아닌지의 여부에 관계없이 환원 말단 및 비환원 말단을 가진다. 승인된 명명법에 따라, 올리고사카라이드는 본 원에서 좌측에 비환원 말단 및 우측에 환원 말단으로 표시된다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 형태의 중합체를 의미한다. 특별히 한정되지 않는 경우, 이 용어는 자연발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되며, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 특별히 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적 변형 변이체(예: 변성 코돈 치환), 대립 유전자, 오르톨로그(ortholog), SNP 및 상보 서열뿐 아니라 명시된 서열을 내포한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 전체) 코돈의 제 3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성하여 변성 코돈 치환을 이룰 수 있다(Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); 및 Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 코딩된 mRNA와 혼용하여 사용된다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬의 생성에 관여하는 DNA 세그먼트를 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 전 및 후 영역(리더(leader) 및 트레일러(trailer))와 각 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개입 서열(인트론)을 포함한다.
핵산 또는 단백질에 언급되는 용어 "분리"는 핵산 또는 단백질이 자연 상태로 회합된 다른 세포 성분들을 실질적으로 함유하고 있지 않음을 의미한다. 이것은 건조 또는 수용액일 수 있으나, 균질 상태인 것이 바람직하다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정된다. 제조시 존재하는 주종(predominant species) 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 분리된 유전자는 유전자에 인접하여 대상 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 ORF(open reading frame)로부터 분리된다. 용어 "정제"는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 하나의 밴드를 필수적으로 야기하는 것을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 것을 의미한다.
용어 "아미노산" 은 자연 발생 아미노산 및 합성 아미노산뿐 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 자연 발생 아미노산은 유전 암호(genetic code)에 의해 코딩되는 아미노산과 후-변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 기본 화학 구조가 동일한, 즉 수소, 카복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹에 결합된 α 탄소를 가지는 화합물 예컨대 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄이다. 이러한 유사체는 변형된 R 그룹(즉, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지나, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가진다. "아미노산 모방체" 는 아미노산의 일반 화학 구조가 상이하나 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 구조를 가지는 화학적 화합물을 의미한다.
폴리펩티드 사슬에 비자연 아미노산 유도체 또는 유사체를 부위-특이적 방식으로 도입할 수 있는 다양한 방법이 공지되었다(참조예: WO 02/086075).
본 원에서 아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 추천하는 단일 문자 기호로 표시될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 나타내어질 수 있다.
"보전적 변형 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보전적 변형 변이체"는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 본질적으로 동일한 서열로 아미노산 서열을 코딩하지 않는 핵산을 의미한다. 유전 암호의 변성(degeneracy)으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 주어진 임의의 단백질을 코딩하게 된다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 즉, 알라닌이 코돈으로 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드의 변경없이 기술된 상응하는 코돈중 임의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "잠재적인 변이(silent variation)"로서, 보존적 변형 변이의 1종이다. 본 원에 설명된 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 잠재적 변이를 나타낸다. 핵산에서 각 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 제공할 수 있다는 것을 당업자들은 인식하고 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 잠재적 변이가 기술된 각 서열에 내포되어 있다.
아미노산 서열에 있어서, 코딩 서열에서 낮은 비율의 아미노산 또는 단일 아미노산이 변경, 첨가 또는 결실된 단백질 서열, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산의 개별 치환, 결실 또는 부가가 "보존적 변형 변이체"이며, 이때 변경에 따라 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다는 것은 당업자들에게 주지의 사실이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 목록은 당업자들에게 익히 알려졌다. 이와같은 보존적 변형 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립 유전자를 포함하나, 이들로만 한정되지 않는다.
다음과 같은 8개 그룹이 각각 상호 보존적 치환을 나타내는 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(B);
3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(참조예: Creighton, Proteins(1984)).
아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 추천하는 단일 문자 기호로 표시될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 나타내어질 수 있다.
본 출원에서, 아미노산 잔기는 비변형 야생형 폴리펩티드 서열에서 1로 번호가 매겨진 가장 최 N-말단 잔기로부터 이들의 상대위치에 따라 넘버링된다.
"펩티드"는 모노머가 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 결합된 중합체를 의미한다. 본 발명의 펩티드는, 예를 들어 두개의 아미노산으로부터 수백 또는 수천개의 아미노산과 같이 크기가 다양할 수 있고, 폴리펩티드로도 지칭된다. 또한, 비자연 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌이 또한 포함된다. 유전자-코딩되지 않은 아미노산이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 중합체, 치료 부분, 생체분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 모든 아미노산은 D- 또는 L-이성체일 수 있다. L-이성체가 일반적으로 바람직하다. 또한, 다른 펩티드 모방체가 본 발명에 유용하다. 본 원에 사용된 "펩티드"는 글리코실화 및 비글리코실화 펩티드 둘다를 의미한다. 펩티드를 발현하는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화된 펩티드가 또한 포함된다. 포괄적 참조예: Spatola, A.F., in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDE AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983).
본 출원에서, 아미노산 잔기는 펩티드 서열에서 1로 번호가 매겨진 N-말단, 예컨대 최 좌측 잔기로부터 이들의 상대위치에 따라 넘버링된다.
용어 "변이체 폴리펩티드" 또는 "뮤테인(mutein)"은 그의 상응하는 야생형 형태 또는 자연적으로 존재하는 형태와 상이한 펩티드 형태를 의미한다. 변이체 펩티드는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환, 삽입, 결실 등을 포함하여 변이체 펩티드를 생성할 수 있다.
용어 "펩티드 콘쥬게이트"는 펩티드가 본 원에 기술된 바와 같이 변형 당으로 글리코콘쥬게이트된 본 발명의 종을 의미한다. 대표적인 예로, 펩티드는 야생형 펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 가지는 변이체 펩티드이다.
본 원에 사용된 "최인접 프롤린 잔기"(proximate a proline residue)는 프롤린 잔기로부터 제거되는 약 10개 미만의 아미노산, 바람직하게는 프롤린 잔기로부터 제거되는 약 9, 8, 7, 6 또는 5개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 프롤린 잔기로부터 제거되는 약 4, 3, 2 또는 1개 미만의 아미노산을 의미한다. 아미노산 "최인접 프롤린 잔기"는 프롤린 잔기의 C-또는 N-말단측에 존재할 수 있다.
용어 "시알산"은 9-탄소 카복실화 당의 패밀리 멤버를 의미한다. 시알산 패밀리의 가장 일반적인 멤버는 N-아세틸-뉴라민산(2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉴로피라노스-1-온산(종종 Neu5Ac, NeuAc 또는 NANA로 약칭된다)이다. 두번째 시알산 패밀리 멤버는 N-글리콜릴-뉴라민산(Neu5Gc 또는 NeuGc)이며, 여기에서 NeuAc의 N-아세틸 그룹은 하이드록실화된다. 세번째 시알산 패밀리 멤버는 2-케토-3-데옥시-노뉴로손산(KDN)(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990))이다. 9-치환된 시알산, 예컨대 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac 등의 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac가 또한 포함된다. 시알산 패밀리에 대해서는 문헌 [Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)]를 참조하기 바란다. 시알릴화 과정에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일 공개된 국제 출원 WO 92/16640호에 개시되었다.
본 원에 사용된 용어 "변형 당"은 본 발명의 방법에서 펩티드의 글리코실 잔기 또는 아미노산상에 효소적으로 첨가된 천연 또는 비천연 탄수화물을 의미한다. 변형 당은 당 뉴클레오티드(모노-, 디- 및 트리-포스페이트), 활성당(예: 글리코실 할라이드, 글리코실 메실레이트) 및 활성화되지 않았거나 뉴클레오티드가 아닌 당을 포함하나 이들에만 국한되지 않는 다수의 효소 기질로부터 선택된다. "변형 당"은 "변형 그룹"과 공유적으로 작용한다. 유용한 변형 그룹은 수용성 중합체, 치료 부분, 진단 부분, 생체분자 등을 포함하나 이들에만 한정되지 않는다. 변형 그룹은 바람직하게는 비자연 또는 비변형 탄수화물이 아니다. 변형 그룹과의 작용 부위는 펩티드에 효소적으로 첨가되는 "변형 당"을 방해하지 않도록 선택된다.
용어 "수용성"은 수중에서 검출가능한 정도의 용해도를 갖는 부분을 의미한다. 수 용해도를 검출/정량하는 방법은 당업계에 익히 공지되었다. 대표적인 수용성 중합체에는 펩티드, 사카라이드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카복실산)등이 포함된다. 펩티드는 단일 아미노산, 즉 폴리(리신)으로 구성된 혼합 서열을 가질 수 있다. 대표적인 폴리사카라이드에는 폴리(시알산)이 있다. 예시적인 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어 m-PEG이다. 폴리(에틸렌이민)이 예시적인 폴리아민이며, 폴리(아크릴)산은 대표적인 폴리(카복실산)이다.
수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG)일 수 있다. 그러나, 다른 관련 중합체도 또한 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합하며, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 이와 관련하여 포함하고자 하나 한정의 의미는 없다. 용어 PEG는 알콕시 PEG, 이작용성 PEG, 다중 팔을 갖는 PEG, 포크 형상(forked)의 PEG, 분지된(branched) PEG, 펜던트된(pendent) PEG(즉, 중합체 골격에 펜던트된 하나 이상의 작용기를 가지는 PEG 또는 관련 중합체) 또는 분해가능한 결합을 가진 PEG를 비롯한 임의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.
중합체 골격은 선형 또는 분지상(branched)일 수 있다. 분지상 중합체 골격은 당업계에 일반적으로 공지되었다. 전형적으로, 분지상 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 중심 분지 코어 부분에 결합된 다수의 선형 중합체 사슬을 가진다. PEG는 글리세롤, 펜타에리스리톨 및 소르비톨과 같은 다양한 폴리올에 에틸렌 옥사이드를 부가시켜 제조될 수 있는 분지 형태로 통상 사용된다. 중심 분지 부분은 또한 리신과 같은 수개의 아미노산으로부터 유도될 수 있다. 분지상 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)m(여기에서, R은 글리세롤 또는 펜타에리스리롤과 같은 코어 부분을 나타내며, m은 팔(arms)의 수를 나타낸다)로 나타내어질 수 있다. 예컨대, 본 원에 참고로 인용되는 US 특허 제 5,932,462로에 기재된 바와 같은 다중 팔 PEG 분자가 또한 중합체 골격으로 사용될 수 있다.
다수의 다른 중합체가 본 발명에 적합하다. 비펩티드이며 수용성이고 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 중합체 골격이 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예로는 다른 중합체(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 코폴리머, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴아미드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린)(본 원에 참고로 인용되는 US 특허 제 5,629,384호에 기재된 것) 및 이들의 코폴리머, 터폴리머 및 혼합물이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 중합체 골격의 각 사슬 분자량은 변할 수 있으나, 전형적으로 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da이다.
본 원에 사용되는 용어 "글리코콘쥬게이션(glycoconjugation)"은 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 변이체 인간 성장 호르몬의 글리코실 잔기 또는 아미노산에 변형된 당 종이 효소적으로 매개된 콘쥬게이션(conjugation)을 말한다. "글리코콘쥬게이트"의 아속(subgenus)은 "글리콜-PEG-일화" 이며, 여기에서 변형 당의 변형 그룹은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그의 알킬 유도체(예: m-PEG) 또는 반응성 유도체(예: H2N-PEG, HOOC-PEG)이다.
용어 "대규모" 및 "공업적 규모"는 상호 호환적으로 사용되며, 단일 반응 사이클이 완료될 때 글리코콘쥬게이트를 적어도 약 250 mg, 바람직하게는 적어도 약500 mg, 보다 바람직하게는 적어도 약 1 g을 생성하는 반응 사이클을 의미한다.
본 원에 사용되는 용어 "글리코실 연결 그룹"은 변형 그룹(예: PEG 부분, 치료 부분, 생체분자)이 공유 결합되는 글리코실 잔기를 의미한다; 글리코실 연결 그룹은 변형 그룹을 콘쥬게이트 잔부에 결합시킨다. 본 발명의 방법에서, "글리코실 연결 그룹"은 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 공유결합함으로써, 약제를 펩티드상의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 결합시키게 된다. "글리코실 연결 그룹"은 일반적으로 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 "변형 당"을 효소적으로 결합시켜 "변형 당"으로부터 유도된다. 글리코실 연결 그룹은 변형 그룹-변형 당 카세트를 형성하는 중에 분해되는 사카라이드-유도 구조일 수 있거나(즉, 산화 → 쉬프(Schiff) 염기 형성 → 환원), 글리코실 연결 그룹은 무손상 상태일 수 있다. "무손상 글리코실 연결 그룹"은 변형 그룹을 콘쥬게이트 잔부에 결합시키는 사카라이드 모노머가 예컨대 소듐 메타퍼아이오데이트에 의해 분해, 즉 산화되지 않은 글리코실 부위로부터 유도된 결합 그룹을 의미한다. 본 발명의 "무손상 글리코실 연결 그룹"은 모(parent) 사카라이드 구조로부터 하나 이상의 글리코실 단위를 제거 또는 글리코실 단위(들)를 부가하여 자연 발생 올리고사카라이드로부터 유도될 수 있다.
본 원에 사용되는 용어 "표적 부분"은 생체의 특정 조직 또는 영역에 선택적으로 위치할 종을 의미한다. 위치 설정은 분자 결정기의 특이적 인식, 표적제 또는 콘쥬게이트의 분자크기, 이온 상호작용, 소수성 상호작용 등에 의해 결정된다. 특정 조직 또는 영역에 약제를 표적화하는 다른 메카니즘은 당업자들에게 공지되었다. 예시적인 표적 부분으로는 항체, 항체 단편, 트랜스페린, HS-당단백질, 응집 인자, 혈청 단백질, β-당단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등이 포함된다.
본 원에 사용되는 "치료 부분"은 항생제, 소염제, 항종양제, 사이토톡신 및 방사성 약제를 포함하나, 이들로만 한정되지 않는 치료에 유용한 임의 약제를 의미한다. "치료 부분"은 생물학적 활성제의 프로드럭(prodrug), 복수개의 치료 부분이 담체에 결합되어 있는 구조물, 예컨대 다가 약제를 포함한다. 치료 부분은 또한 단백질 및 단백질을 포함하는 작제물을 포함한다. 예시적인 단백질에는 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 집락 자극인자(GCSF), 과립구 대식세포 집락 자극인자(GMCSF), 인터페론(예: 인터페론 -α, -β, -r), 인터류킨(즉, 인터류킨 Ⅱ), 혈청 단백질(즉, 팩터 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 Ⅹ), 사람 융모성 생식샘자극 호르몬(HCG), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH) 및 항체 융합 단백질(예: 종양 괴사 수용체((TNFG)/Fc 도메인 융합 단백질))이 포함되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다.
본 원에 사용되는 "항종양 약물"은 암을 퇴치하는데 유용한 임의 약제를 의미하며, 사이토톡신 및 항대사제, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생제, 항유사분열제, 프로카바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 인터페론 및 방사성 약제 등의 약제를 포함하나, 이들로만 한정되지 않는다. 또한, 예컨대 TNF-α와 같이 항종양 활성을 갖는 펩티드의 콘쥬게이트가 용어 "항종양 약물"의 범위에 포함된다. 콘쥬게이트에는 본 발명의 치료 단백질과 당단백질 사이에 형성된 콘쥬게이트들이 포함되나, 이로만 한정되는 것은 아니다. 대표적인 콘쥬게이트는 PSGL-1과 TNF-α 사이에서 형성된 것이다.
본 원에 사용되는 "사이토톡신 또는 세포독성제"는 세포에 해로운 임의 약제를 의미한다. 이들의 예에는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 다른 톡신으로는 예를 들어 리신, CC-1065 및 유사체, 듀오카마이신이 있다. 또 다른 톡신에는 디프테리아톡신 및 뱀독(즉, 코브라독)이 있다.
본 원에 사용되는 "방사성 약제"는 종양을 진단 또는 파괴하는데 효과적인 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. 인듐-111, 코발트-60이 예시되나, 이로만 한정되지 않는다. 또한, 전형적으로 방사성 동위원소의 혼합물을 나타내는 우라늄, 라듐 및 토륨과 같은 자연 발생 방사성 원소가 방사성 약제의 예로 적합하다. 금속 이온은 전형적으로 유기 킬레이트화 부분과 킬레이팅한다.
대부분의 유용한 킬레이화 그룹, 크라운 에테르, 크립탄드 등은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 화합물에 도입될 수 있다(즉, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA 등, 및 DTPP, EDTP, HDTP, NTP 등과 같은 이들의 포스포네이트 유사체)[참조예: Pitt et al., "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overoad" In, Inorganic Chemistry in Biology and Medicine; Martell, Ed.; American Chemistry Society, Washington, D.C., 1980; PP.279-312; Lindoy, The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes; Cambridige university Press, Cambridge; 1989, Dugas, Bioorganic Chcmistry; Springer-Verlag, New York, 1989 및 여기에 포함된 참고문헌).
또한, 당업자들은 다른 분자에 킬레이트화제, 크라운 에테르 및 사이클로덱스트린을 결합시키는 다양한 경로를 이용할 수 있다[참조예 Meares et al., "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides." In, MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney, et al., Eds., American Chemisrty Society, Washington, D.C., 1982, pp. 370-387; Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108-117(1998); Song et al., Bioconjugate Chem., 8:249-255(1997)].
본 원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 콘쥬게이트와 배합되는 경우 콘쥬게이트의 활성을 보유하면서 대상의 면역 시스템과 비반응성인 임의 물질을 포함한다. 이들의 예로는 포스페이트 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 타입의 습윤제 등의 임의의 일반적인 약제학적 담체를 포함하나 이로만 한정되지 않는다. 다른 담체로서 멸균 용액, 코팅 정제를 포함하는 정제 및 캡슐이 포함된다. 전형적으로, 이와같은 담체는 전분, 밀크, 당, 특정 타입의 클레이, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜과 같은 부형제, 또는 기타 공지된 부형제를 함유한다. 이들 담체는 또한 향미제 및 착색 첨가제 또는 기타 성분을 포함할 수 있다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 익히 공지된 통상의 방법으로 제제화된다.
본 원에 사용되는 용어 "투여"는 대상에 경구 투여, 좌약 투여, 국소 접촉 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 병변내 투여, 피하 투여, 흡입 투여, 서방성 장치, 즉 소형 삼투압 펌프 이식을 의미한다. 투여는 비경구 투여 및 점막 관통(transmucosal) 투여(예: 구강, 비강, 질내, 직장 또는 경피 투여), 특히 흡입 투여를 포함한 임의의 경로로 실시된다. 비경구 투여는 예를 들어 정맥내 투여, 근육내 투여, 세동맥내 투여, 피부내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 심실내 투여 및 두개내 투여를 포함한다. 또한, 주사가 종양 치료, 예컨대 아포프토시스(apoptosis) 유발을 위하여 사용되는 경우, 투여는 종양 및/또는 종양 주변 조직에 직접 행해질 수 있다. 다른 전달 형식에는 리포좀 제제, 정맥내 주입, 경피 패치제 등의 사용을 포함하나, 이들에만 한정되지 않는다.
용어 "개선" 또는 "개선하다"는 증상의 약화, 완화 또는 감소, 또는 환자의 물리적 또는 정신적 웰빙 향상과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 비롯하여 병리 또는 증상 치료시 성공적인 증후를 말한다. 증후 개선은 진찰 및/또는 정신의학적 평가 결과를 포함한 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다.
용어 "처치"는 질병에 걸리기 쉽지만 예전에 걸리지 않았거나 질병 증상을 나타내는 동물에서 일어난 질병 또는 증상을 예방(예방 치료)하고, 질병을 억제하고(진행 완화 또는 정지), 질병 증후 또는 부작용을 경감시키고(고식적 치료), 질병을 구제하는(질병 퇴행) 것을 비롯한 질병 또는 증상을 "치료하는" 것 또는 그의 "치료"를 말한다.
용어 "유효량" 또는 "유효한 양" 또는 "치료적으로 유효한 양" 또는 문법적으로 등가적인 임의 용어는 질병을 치료하기 위해 동물에 투여되는 경우 그 질병을 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "분리"는 물질을 제조하기 위해 사용되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 유리된 물질을 의미한다. 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서, 용어 "분리"는 펩티드 콘쥬게이트를 제조하는데 사용된 혼합물내 물질에 보통 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 유리된 물질을 의미한다. "분리" 및 "순수"는 혼용하여 사용된다. 전형적으로, 본 발명의 분리된 펩티드 콘쥬게이트는 바람직하게는 일정 범위로 나타내어지는 순도 수준을 가진다. 펩티드 콘쥬게이트의 순도 범위 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80% 이고, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
펩티드 콘쥬게이트의 순도가 약 90% 이상인 경우, 이들의 순도는 또한 바람직하게는 일정 범위로서 나타내어진다. 순도 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98% 이다. 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다.
순도는 종래 기술의 분석 방법(예: 은 염색 겔상의 밴드 강도, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 또는 유사 수단)에 의해 결정된다.
본 원에 사용되는 "집단(population)의 본질적인 각 멤버"는 펩티드에 부가된 선택된 비율의 변형 당이 펩티드상의 동일한 다중 수용체 부위에 부가되어 있는 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트 집단의 특성을 나타낸다. "집단의 본질적인 각 멤버"는 변형 당에 콘쥬게이트된 펩티드상 부위의 "균질성"으로 언급되며, 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 균질한 본 발명의 콘쥬게이트를 지칭한다.
"균질성"은 변형 당이 콘쥬게이트된 수용체 부분의 집단 전반에 걸친 구조적인 일치성을 의미한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서, 각 변형 당 성분은 모든 다른 변형 당이 콘쥬게이트된 수용체 부위와 동일한 구조를 가지고 있는 수용체 부위에 콘쥬게이트되어 있는 경우, 그 펩티드 콘쥬게이트는 거의 100% 균질하다고 말할 수 있다. 균질성은 전형적으로 범위로서 나타내어진다. 펩티드 콘쥬게이트에 대한 균질성 범위 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80% 이고, 균질성 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 90% 이상이다.
펩티드 콘쥬게이트가 약 90%의 균질성 또는 그 이상을 나타내는 경우, 이들의 균질성은 또한 바람직하게는 범위로 나타내어진다. 균질성 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 균질성 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다. 펩티드 콘쥬게이트의 순도는 전형적으로 당업자들에게 알려진 하나 이상의 방법, 예컨대 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS), 유체 속도 분광법의 매트릭스 보조 레이저 탈착질량 시간(MALDITOF), 모세관 전기영동 등에 의해 결정된다.
글리코펩티드 종을 언급할 때 "실질적으로 균일한 글리코폼(glycoform)" 또는 "실질적으로 균일한 글리코실화 패턴"은 대상 글리코실트랜스퍼라제(예: 푸코실트랜스퍼라제)에 의해 글리코실화된 수용체 부위의 퍼센트 비율을 의미한다. 예를 들어, α 1,2 푸코실트랜스퍼라제의 경우, 실질적으로 모든(이하 정의한 바와 같이) Galβ1,4-GlcNAc-R 및 그의 시알릴화 유사체가 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서 푸코실화하는 경우, 실질적으로 균일한 푸코실화 패턴이 존재한다. 출발 물질이 글리코실화된 수용체 부분(예: 푸코실화된 Galβ1,4-GlcNAc-R 부분)를 포함할 수 있다는 것은 당업자들에게 주지의 사실이다. 따라서, 계산된 %의 글리코실화는 본 발명의 방법에 의해 글리코실화된 수용체 부분뿐만 아니라 출발 물질에서 이미 글리코실화된 수용체 부분을 포함할 것이다.
"실질적으로 균일한"의 상기 정의에서 "실질적으로"라는 용어는 특정의 글리코실트랜스퍼라제에 대한 수용체 부분의 적어도 약 40%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%가 글리코실화됨을 의미한다.
치환체 그룹이 그의 통상적인 화학식에 의해 좌측으로부터 우측으로 표기되어 특정화되는 경우, 이들은 마찬가지로 우측으로부터 좌측으로 표기되어 나타내어진 화학적으로 동일한 치환체를 포괄하며, 예를 들어 -CH20-는 또한 -OCH2-를 상술한다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "알킬"은 자체로 또는 다른 치환체 의미의 일부로서 완전 포화, 모노- 또는 폴리불포화될 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 또는 사이클릭 탄화수소 래디칼, 또는 이들의 조합을 의미하며, 지정된 탄소수를 가지는 이- 및 다가 래디칼을 포함할 수 있다(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미한다). 포화 탄화수소 래디칼에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 이들의 유사체 및 이성체, 예를 들어, n-펜틸, n- 헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 그룹이 예시되나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 불포화 알킬 그룹은 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 것이다. 불포화 알킬 그룹의 예로서 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 고급 유사체 및 이성체가 포함되나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 용어 "알킬"은 달리 언급이 없으면, 이하 상세히 정의되는 알킬 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하고자 한다. 탄화수소 그룹으로만 한정된 알킬 그룹은 "호모알킬"로 지칭된다.
용어 "알킬렌"은 자체로 또는 다른 치환체 의미의 일부로서 알칸으로부터 유도된 이가 래디칼을 의미하며, -CH2CH2CH2CH2-가 예시되나, 이에만 한정되지 않고, "헤테로알킬렌"으로 후술되는 그룹을 추가로 포함한다. 전형적으로 알킬 (또는 알킬렌) 그룹은 1 내지 24개의 탄소원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소원자가 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소원자를 가지는 단쇄 알킬 또는 알킬렌 그룹이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 각각 산소 원자, 아미노 그룹 또는 황 원자를 통해 나머지 분자에 결합된 알킬 그룹을 의미한다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "헤테로알킬"은 자체로 또는 다른 용어와의 조합 형태로 지정된 수의 탄소 원자 및 O, N, Si 및 S중에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 구성되고, 질소 및 황 원자가 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 임의로 사급화될 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 또는 사이클릭 탄화수소 래디칼, 또는 이들의 조합을 의미한다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬 그룹의 임의 내부 위치 또는 알킬 그룹이 나머지 분자에 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 예로서 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-CH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3이 포함되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이, 최대 두개의 헤테로원자가 연속하여 존재할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "헤테로알킬렌"은 자체로 또는 다른 치환체 의미의 일부로서 헤테로알킬로부터 유도된 래디칼을 의미하며, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-가 예시되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 헤테로알킬렌 그룹에 있어서, 헤테로원자는 또한 사슬 말단중 어느 한 쪽 또는 양 쪽 모두를 차지할 수 있다(예: 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 그룹에 있어서, 결합 그룹의 배향은 결합 그룹의 식이 표기된 방향에 함축되지 않는다. 예를 들어 식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'-C(O)2 둘 다를 나타낸다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은 자체로 또는 다른 용어와의 조합 형태로 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 사이클릭 변형체를 나타낸다. 또한, 헤테로사이클로알킬에서, 헤테로 원자는 헤테로사이클이 나머지 분자에 결합되는 위치를 차지할 수 있다. 사이클로알킬의 예에는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로펩틸 등이 포함되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 헤테로사이클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 또한, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하고자 한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하나, 이들로만 한정되지 않는다.
달리 나타내지 않으면, 용어 "아릴"은 함께 융합되거나 공유 결합된 단일환 또는 다중환(바람직하게는 1 내지 3개의 환)일 수 있는 폴리불포화된 방향족 치환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S중에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴 그룹(또는 환)을 의미하며, 여기에서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화되고 질소 원자(들)는 임의로 사급화된다. 헤테로아릴 그룹은 헤테로원자를 통해 나머지 분자에 결합될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 그룹의 비한정적인 예로 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3- 티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소인돌릴, 5-이소인돌릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디하이드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 상기 각 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템에 대한 치환체는 후술하는 허용가능한 치환체 그룹중에서 선택된다.
간략하면, 용어 "아릴"은 다른 용어와 조합하여 사용되는 경우(예: 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬), 상기 정의된 아릴 및 헤테로아릴 환 둘 다를 포함한다. 즉, 용어 "아릴알킬"은 탄소 원자(예: 메틸렌 그룹)가 예를 들어 산소 원자로 대체된 알킬 그룹(예: 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)을 포함하여 아릴 그룹이 알킬 그룹에 결합된 래디칼(예: 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)을 포함하고자 한다.
상술된 각 용어(예: "알킬" "헤테로알킬" "아릴" 및 "헤테로아릴")는 언급된 래디칼의 치환 및 비치환 형태 둘 다를 포함하고자 한다. 이하, 각 래디칼 형태에 대해 바람직한 치환체가 제공된다.
알킬 및 헤테로알킬 래디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 헤테로사이클로알케닐로 언급되기도 하는 그룹 포함)에 대한 치환체는 "알킬 그룹 치환체"로 총칭되며, 이들은 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C (O)R', -C02R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRS02R', -CN 및 -N02중에서 0 내지 (2m'+1)(여기에서, m'는 래디칼내 탄소원자의 총 수이다) 범위의 수로 선택되나 이들로만 한정되지 않는 각종 그룹중 하나 이상일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 예컨대 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 그룹, 또는 아릴알킬 그룹을 의미한다. 본 발명의 화합물이 복수개의 R 그룹을 포함하는 경우, 예를 들어, 각 R 그룹은 복수개의 이들 그룹이 존재할 때 각 R', R", R"' 및 R"" 그룹중에서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 결합하는 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 5-, 6- 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하고자 하나, 이들로만 한정되는 것은 아니다. 상기 열거된 치환체로부터, 당업자들은 용어 "알킬"이 수소 그룹 이외의 그룹에 결합된 탄소 원자를 포함하는 그룹, 예컨대 할로알킬(예: -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예: -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH20CH3 등)을 포함할 것임을 이해할 것이다.
알킬 래디칼에 대해 기술된 치환체와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 그룹에 대한 치환체는 "아릴 그룹 치환체"로 총칭된다. 치환체는 예를 들어 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -C02R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRS02R', -CN, -N02, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬중에서 0 내지 방향족 환 시스템의 개방 원자가 범위의 수로 선택되며, R', R", R"' 및 R""는 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴 및 치환되거나 비치환된 헤테로아릴중에서 선택된다. 본 발명의 화합물이 복수개의 R 그룹을 포함하는 경우, 예를 들어, 각 R 그룹은 복수개의 이들 그룹이 존재할 때 각 R', R", R"' 및 R"" 그룹중에서 독립적으로 선택된다. 하기 반응식에서, 기호 X는 상술된 "R"을 나타낸다.
아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자상의 두 치환체는 임의로 식 -T-C(O)- (CRR')q-U-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기에서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 및 단일결합중에서 선택되고, q는 0 내지 3의 정수이다.
또한, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자상의 두 치환체는 임의로 식 -A-(CH2)r-B-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기에서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(0)2NR'- 및 단일결합중에서 선택되고, r은 1 내지 4의 정수이다. 형성된 새로운 환의 단일결합중 하나가 임의로 이중결합으로 대체될 수 있다. 또한, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접 원자상의 두 치환체는 임의로 식 -(CRR')s-X-(CR"R"')d-의 치환체로 대체될 수 있으며, 여기에서 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- 또는 -S(0)2NR'-이다. 치환체 R, R', R" 및 R"'는 바람직하게는 독립적으로 수소 또는 치환되거나 비치환된 (C1-C6)알킬중에서 선택된다.
본 원에 사용된 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)를 포함하고자 한다.
도입부
본 발명은 변형 당 부분이 펩티드상의 O-결합 글리코실화 부위에 직접 또는 간접적으로(예컨대 개입 글리코실 잔기를 통해) 부착된 글리코펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트 제조방법이 또한 제공된다.
O-결합 글리코실화 부위는 일반적으로 천연(예: 세린, 트레오닌) 또는 비천연(예: 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신) 아미노산의 하이드록시 측쇄이다. 예시적인 O-결합 사카릴 잔기는 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 만노스, GlcNAc, 글루코스, 프럭토스 또는 크실로스를 포함한다.
본 발명의 방법은 O-결합 글리코실화 부위를 가지는 임의의 펩티드상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 야생형 펩티드에 존재하는 O-결합 글리코실화 부위에 글리코실 부위가 부착된 O-결합 글리코콘쥬게이트를 제조하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명은 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 야생형 펩티드의 글리코콘쥬게이트를 제공한다. 이에 따른 예시적인 펩티드로 G-CSF, GM-CSF, IL-2 및 인터페론이 포함된다.
예시적인 구체예로, 본 발명은 또한 상응하는 야생형 펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위에 글리코실 부위를 포함하는 신규 변이체 펩티드를 제공한다. 일례로, 변이체 폴리펩티드는 G-CSF 폴리펩티드이다. 다른 예시적인 구체예로, 변이체 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드, IFN 알파 폴리펩티드 또는 GM-CSF 폴리펩티드이다. 또한, 변이체 펩티드의 O-결합 글리코실화 변이체 및 O-결합 글리코실화 변이체 펩티드의 제조방법이 제공된다. 추가의 방법은 O-결합 글리코실 잔기 및 O-결합이외 N-결합 글리코실 잔기의 합성, 백 트리밍(trimming back) 및/또는 변형을 포함한다.
예시적인 측면으로, 본 발명은 하기 식의 변이체 펩티드를 제공한다:
Figure 112006055848460-PCT00005
상기 식에서,
AA는 하이드록실 부분을 포함하는 측쇄 아미노산이다.
예시적인 하이드록시아미노산은 트레오닌 및 세린이다. GalNAc 부분이 하이드록실 부분의 산소 원자를 통해 AA에 결합된다. AA는 야생형 펩티드에 존재할 수 있거나, 야생형 펩티드 서열의 돌연변이에 의해 첨가되거나 재배치된다. X는 변형 그룹, 사카릴 부분, 예컨대 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia 그룹 또는 사카릴 부분 및 변형 그룹이다. 일례로, X가 사카릴 부분인 경우, 이는 본 원에 설명된 바와 같은 변형 그룹을 포함한다. 글리코실화 아미노산은 펩티드 서열내, 또는 N- 또는 C-펩티드 말단에 위치할 수 있다.
예시적인 구체예로, X는 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia 부분중에서 선택된 그룹을 포함하며, 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia중 적어도 하나는 변형 그룹을 포함한다. 또 다른 예시적인 구체예로, X는 하기 부분을 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00006
상기 식에서,
D는 -OH 및 R1-L-HN-중에서 선택된 멤버이고;
G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬중에서 선택된 멤버이며;
R1은 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분중에서 선택된 멤버를 포함한 멤버이고;
L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬중에서 선택된 링커이며, 이때 D가 OH이면 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬이면 D는 R1-L-HN-이다.
다른 예시적인 구체예로, X는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00007
상기 식에서,
L은 치환되거나 비치환된 알킬 또는 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹이고;
n은 0 내지 약 2500중에서 선택된 정수이다.
또 다른 예시적인 구체예로, X는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00008
상기 식에서,
s는 0 내지 약 20의 정수중에서 선택된다.
또 다른 예시적인 구체예로, AA는 변이체 펩티드의 프롤린이 풍부한 세그먼트내에 위치하고/하거나 프롤린 잔기에 인접해 있다. O-결합 글리코실화 부위를 형성하는데 적절한 서열은 하나 이상의 잠재적 O-결합 글리코실화 부위를 함유하는 단길이 펩티드의 효소적 O-결합 글리코실화를 지시하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 펩티드와 수용성 중합체, 치료 부분, 진단 부분, 표적 부분 등과 같은 다양한 종 간에 형성된다. 링커 팔, 즉 다작용성 콘쥬게이트와 함께 결합된 두개 이상의 펩티드를 포함하는 콘쥬게이트가 또한 제공되며; 여기에서 적어도 하나의 펩티드는 O-글리코실화되거나, 변이체 O-결합 글리코실화 부위를 포함한다. 본 발명의 다작용성 콘쥬게이트는 구조 및/또는 성질이 상이한 다양한 펩티드 조합물 또는 동일한 펩티드의 두개 이상의 복제물을 포함할 수 있다. 이러한 구체예에 따른 예시적인 콘쥬게이트에서, 두 펩티드간의 링커는 O-결합 글리코실 잔기, 예컨대 O-결합 글리코실 무손상 글리코실 링커 그룹을 통해 적어도 하나의 펩티드에 부착된다.
본 발명의 콘쥬게이트는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 변형 당을 효소적으로 부착시켜 형성한다. 변형 당은 O-결합 글리코실화 부위에 직 간접적으로(예를 들어 하나 이상의 글리코실 잔기를 통해) 부착된 글리코실 잔기 또는 O-결합 글리코실화 부위에 직접 부착된다. 본 발명은 또한 변형 당이 N-결합 글리코실화 부위에 직 간접적으로 부착된 글리코실 잔기 또는 N-결합 부분에 직접 부착된 O-결합 글리코실화 펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다.
펩티드(또는 글리코실 잔기)와 당의 변형 그룹 사이에 삽입된 변형 당은 본 원에서 "무손상 글리코실 연결 그룹"으로 지칭된다. 본 발명은 글리코실트랜스퍼라제와 같은 효소의 정교한 선택성을 이용하여 하나 이상의 특정 위치에 목적하는 그룹을 가지는 펩티드를 제공한다. 즉, 본 발명에 따라 변형 당은 펩티드 사슬의 선택된 위치에 직접 부착되거나, 또는 변형 당은 글리코펩티드의 탄수화물 부분에 첨가된다. 변형 당이 글리코펩티드 탄수화물 및 펩티드 골격의 아미노산 잔기에 직접 결합되어 있는 펩티드는 둘 다 본 발명의 범주내에 속한다.
공지된 화학 및 효소 펩티드 합성 전략과 달리, 본 발명의 방법에 따라 실질적으로 균질한 유도화 패턴을 가지는 펩티드 및 글리코펩티드를 어셈블하는 것이 가능하며; 본 발명에 사용된 효소는 일반적으로 펩티드의 특정 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기 조합에 대해 선택적이다. 본 발명의 방법은 또한 변형 펩티드 및 글리코펩티드의 대규모 생산에 유용하다. 따라서, 본 발명의 방법은 예정된 균일한 유도화 패턴을 가지는 글리코펩티드의 대규모 생산을 위한 실용 수단을 제공한다. 본 발명의 방법은 세포 배양 세포(예: 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포 또는 원핵생물 세포) 또는 형질전환 식물 또는 동물에서 제조중에 불완전하게 글리코실화된 글리코펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 치료 펩티드를 변형하는데 특히 적합하다.
본 발명의 방법은 또한 예를 들어, 면역 또는 세망내피 시스템(RES)에 의한 흡수율 감소 또는 제거율 감소에 따라 치료 반감기가 증가된 글리코실화 및 비글리코실화 펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 펩티드상의 항원 결정기를 마스킹하여 펩티드에 대한 숙주 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 수단을 제공한다. 적절한 변형 당을 사용하여 표적제를 펩티드에 선택적으로 결합시키는 것은 또한 펩티드를 특정 조직 또는 특정 표적제에 특이적인 세포 표면 수용체에 표적화시키는데 사용될 수 있다. 또한, 글리코실 연결 그룹을 통해 콘쥬게이트된 치료 부분으로 특이적으로 변형된 펩티드 부류가 제공된다.
O-글리코실화
본 발명은 O-결합 글리코실화 펩티드, 이들 종의 콘쥬게이트 및 선택된 아미노산 서열("O-결합 글리코실화 부위")을 포함하는 O-결합 글리코실화 펩티드의 형성방법을 제공한다. 상응하는 야생형 펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 변이체 펩티드가 특히 관심의 대상이다. O-결합 글리코실화 부위는 변형 그룹을 가지는 글리코실 잔기의 결합 지점이다.
단백질 글리코실화의 가장 많은 형태중 하나인 뮤신형 O-결합 글리코실화는 모든 진핵 세포의 분비 및 세포 표면 연합 당단백질상에서 발견된다. 골지 복합체(Golgi complex)에 존재하는 수백개의 글리코실트랜스퍼라제 효소의 촉매적 활성에 의해 만들어지는 것으로서, O-결합 글리코실화에 의해 형성되는 구조는 매우 다양하다(수백개의 잠재적인 구조), 단백질 골격에 O-글리칸의 결합 위치 및 글리칸 구조 수준은 다양하다. 고도의 다양성이 가능함에도 불구하고, O-결합 글리코실화는 다세포 유기체중에서 고도의 보존성을 나타내는 고도의 조절 방법이다.
뮤신형 O-결합 글리코실화의 제 1 단계는 대형 패밀리 UDP-GalNAc중 하나 이상의 멤버: 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(GalNAc-트랜스퍼라제)(EC 2.4.1.41)에 의해 촉매화되어 GalNAc를 세린 및 트레오닌 수용체 부위로 전달하는 것이다(Hassan et al., J. Biol. Chem. 275:38197-38205 (2000)). 지금까지 12 멤버의 포유동물 GalNAc-트랜스퍼라제 패밀리가 동정되어 특정화되었으며(Schwientek et al., J. Biol. Chem. 277:22623-22638 (2002)), 이 유전자 패밀리의 수개의 추가의 잠정 패밀리가 게놈 데이터베이스 분석으로부터 예측가능하다. GalNAc-트랜스퍼라제 이소폼(isoform)은 상이한 키네틱 성질을 가지며, 시공간적으로 차등적인 발현 패턴을 나타냄에 따라 별개의 생물학적 기능을 가진다고 제시되었다(Hassan et al., J. Biol. Chem. 275:38197-38205 (2000)). GalNAc-트랜스퍼라제의 서열 분석에 따라 이들 효소가 다음과 같은 두개의 상이한 서브유니트를 포함한다고 가정하게 되었다: 중앙 촉매 유니트 및 "렉틴 도메인"으로 지칭되는 식물 렉틴 리신과 서열이 동일한 C-말단 유니트(Hagen et al., J. Biol. Chem. 274: 6797-6803 (1999); Hazes, Protein Eng. 10:1353-1356 (1997); Breton et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 9:563-571 (1999)). 선택된 보존 잔기의 부위-특이적 돌연변이유발과 관련한 선행 실험은 촉매 도메인내 돌연변이가 촉매 활성을 제거함을 입증하였다. 이와 대조적으로, "렉틴 도메인"내 돌연변이는 GalNAc-트랜스퍼라제 이소폼, GalNAc-T1의 촉매 활성에 유의적인 영향을 주지 않았다(Tenno et al., J. Biol. Chem. 277 (49):47088-96 (2002)). 따라서, C-말단 "렉틴 도메인"은 기능적이지 않고 GalNAc-트랜스퍼라제의 효소 작용에 기여하지 않는 것으로 여겨진다(Hagen et al., J. Biol. Chem. 274:6797-6803 (1999)).
그러나, 최근 증거는 일부 GalNAc-트랜스퍼라제가 부분적으로 GalNAc-글리코실화된 글리코펩티드와 독특한 활성을 나타냄을 보여주었다. 적어도 세개의 GalNAc-트랜스퍼라제 이소폼인 GalNAc-T4, -T7 및 -T10의 촉매 작용은 뮤신 텐덤 반복 도메인에 상응하는 글리코펩티드에 선택적으로 작용하며, 이때 일부 가능한 군집 글리코실화 부위만이 다른 GalNAc-트랜스퍼라제에 의해 GalNAc 글리코실화된다(Bennett et al., FEBS Letters 460:226-230 (1999); Ten Hagen et al., J. Biol. Chem. 276: 17395-17404 (2001); Bennett et al., J. Biol. Chem. 273:30472-30481 (1998); Ten Hagen et al., J. Biol. Chem. 274:27867-27874 (1999)). GalNAc-T4 및 -T7은 상이한 GalNAc-글리코실화 펩티드를 인식하고, 앞서 이용한 것 이외에, GalNAc를 수용체 기질 부위로 전달하는 것을 촉매화한다. 이러한 GalNAc-트랜스퍼라제 활성의 한가지 기능은 고밀도의 O-결합 글리코실화를 이용하여 뮤신 및 뮤신형 당단백질에서 O-글리칸 점유 밀도 제어 단계 발현을 예측하는 것이다.
일례는 암관련 뮤신 MUC1의 글리코실화이다. MUC1은 다섯개의 가능한 O-결합 글리코실화 부위를 가지는 20개 잔기(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA)의 텐덤 반복 O-결합 글리코실화 영역을 함유한다. GalNAc-T1, -T2 및 -T3은 MUC1 텐덤 반복 글리코실화를 개시하고 세개 부위만을 통합시킨다(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA, 밑줄친 GalNAc 부착 부위). GalNAc-T4는 유방암 관련 뮤신 MUC1의 20개 아미노산 텐덤 반복 서열에서 모두 다섯개 수용체 부위에 O-결합 글리칸 부착을 완성할 수 있는 지금까지 동정된 유일한 GalNAc-트랜스퍼라제 이소폼이라는 점에서 유일하다. GalNAc-T4는 GalNAc를 GalNAc4TAP24 글리코펩티드(TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP, 유일한 GalNAc-T4 부착 부위는 볼드체이다)상의 다른 GalNAc-트랜스퍼라제 이소폼에 의해 사용되지 않는 적어도 두 부위에 전달한다(Bennett et al., J. Biol. Chem. 273:30472-30481 (1998). GalNAc-T4에 의해 나타난 것과 같은 활성이 모든 잠재 부위가 글리코실화되는 암세포에 의해 발현되는 MUC1의 글리코폼 생산에 필요한 것으로 나타났다(Muller et al., J. Biol. Chem. 274: 18165-18172 (1999)). 락테이트화 유선으로부터의 정상 MUC1은 하나의 반복에 대해 약 2.6 O-결합 글리칸을 갖고(Muller et al., J. Biol. Chem. 272: 24780-24793 (1997)), 암세포주 T47D로부터 유래된 MUC1은 하나의 반복에 대해 4.8 O-결합 글리칸을 갖는다(Muller et al., J. Biol. Chem. 274:18165-18172 (1999)). 따라서, 암 관련 형태의 MUC1은 고밀도의 O-결합 글리칸 점유율을 수반하며, 이는 GalNAc-T4의 것과 동일하거나 유사한 GalNAc-트랜스퍼라제 활성으로 얻어진다.
GalNAc-글리코펩티드 특이성을 명백하게 나타내지 않는 폴리펩티드 GalNAc-트랜스퍼라제가 또한 그의 잠정 렉틴 도메인에 의해 조절되는 것으로 나타났다(PCT WO01/85215 A2). 최근, GalNAc-T1 잠정 렉틴 도메인에서의 돌연변이가 GalNAc-T4에 대해 앞서 분석한 것과 유사하게(Hassan etal., J. Biol. Chem. 275:38197-38205 (2000)), GalNAc-T4와 유사한 방식으로 효소 활성을 변형시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 야생형 GalNAc-T1은 다중 수용체 부위를 가지는 펩티드 기질에 다중의 연속 GalNAc 잔기를 첨가할 수 있는 반면, 돌연변이된 GalNAc-T1은 동일한 기질에 복수개의 GalNAc 잔기를 첨가하는데 실패하였다(Tenno et al., J. Biol. Chem. 277 (49):47088-96 (2002)).
GalNAc 트랜스퍼라제의 돌연변이가 야생형 효소에 의해 생산된 것과 상이한 글리코실화 패턴을 제공하는데 이용될 수 있는 것으로 입증되었기 때문에, 본 발명의 O-결합 글리코실화 펩티드를 제조하는데 하나 이상의 변이체 GalNAc 트랜스퍼라제를 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 포함된다.
O-결합 글리코실화 부위를 가지는 변이체 펩티드
본 발명에 의해 제공되는 펩티드는 하나 이상의 야생형 또는 변이체 GalNac 트랜스퍼라제에 의해 GalNAc 수용체로 인식되는 아미노산 서열을 포함한다. 펩티드의 아미노산 서열은 O-결합 글리코실화 부위, 비자연 발생 O-결합 글리코실화 부위가 도입된 변이체 서열을 포함하는 펩티드의 경우 또는 자연 발생 및 비자연 발생 O-결합 글리코실화 부위를 둘 다 포함하는 폴리펩티드에 대해 야생형이다. 본 발명이 실시되는 예시적인 펩티드는 과립구 집락 자극인자(G-CSF), 예컨대 175 및 178 아미노산 야생형(N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않고), 인터페론(예: 인터페론 알파, 예컨대 인터페론 알파 2b, 또는 인터페론 알파 2a), 과립구 대식세포 집락 자극인자(GM-CSF), 인간 성장 호르몬 및 인터류킨(예: 인터류킨 2)을 포함한다. 이하, 보다 명확한 이해를 위해 G-CSF, GM-CSF 및 IFN-α 2β에 대해 설명하도록 하겠다. 아미노산의 임의 수의 위첨자는 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌에 대한 아미노산 위치를 나타낸다. 이들 수는 폴리펩티드의 N-말단이 메티오닌없이 개시되는 경우, N-말단 메티오닌의 부재를 반영하도록 적절히 조정될 수 있다. 예시적인 펩티드의 N-말단은 메티오닌과 함께 또는 없이 개시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 당업자들은 본 원에 개시된 야생형 및 변이체 펩티드의 O-결합 글리코콘쥬게이트된 유사체의 제조방법이 어떠한 펩티드에도 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
예시적인 구체예로, 펩티드는 H53, P61, P129, P133 및 P175에 인접하거나 이들을 포함하는 N-말단중에서 선택된 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 생물학적으로 활성인 G-CSF 변이체이다. 본 발명의 생물학적으로 활성인 G-CSF 변이체는 당업자들에게 공지된 임의의 적합한 기능 분석에 따라 측정된 바, 그의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 상실하지 않은 하나 이상의 돌연변이를 가지는 임의의 G-CSF 폴리펩티드 부분 또는 전체를 포함한다. 일례로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 G-CSF 변이체내 돌연변이는 야생형 G-CSF에 당연히 존재하지 않는 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위내에 위치한다. 다른 예로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 G-CSF 변이체내 돌연변이는 G-CSF 변이체의 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위의 내측 및 외측에 위치한다.
대표적인 야생형 및 변이체 G-CSF 폴리펩티드는 다음중에서 선택되는 서열을 갖는다:
SEQ. ID NO. 1 (178 아미노산 야생형)
Figure 112006055848460-PCT00009
SEQ. ID NO. 2 (N-말단 메티오닌을 갖지 않는 178 아미노산 야생형)
Figure 112006055848460-PCT00010
SEQ. ID NO. 3 (175 아미노산 야생형)
Figure 112006055848460-PCT00011
SEQ. ID NO. 4 (N-말단 메티오닌을 갖지 않는 175 아미노산 야생형)
Figure 112006055848460-PCT00012
SEQ. ID NO. 5
Figure 112006055848460-PCT00013
SEQ. ID NO. 6
Figure 112006055848460-PCT00014
SEQ. ID NO. 7
Figure 112006055848460-PCT00015
SEQ. ID NO. 8
Figure 112006055848460-PCT00016
SEQ. ID NO. 9
Figure 112006055848460-PCT00017
SEQ. ID NO. 10
Figure 112006055848460-PCT00018
SEQ. ID NO. 11
Figure 112006055848460-PCT00019
SEQ ID NO: 12
Figure 112006055848460-PCT00020
SEQ ID NO: 13
Figure 112006055848460-PCT00021
SEQ ID NO: 14
Figure 112006055848460-PCT00022
SEQ ID NO: 15
Figure 112006055848460-PCT00023
SEQ ID NO: 16
Figure 112006055848460-PCT00024
SEQ ID NO: 17
Figure 112006055848460-PCT00025
SEQ ID NO: 18
Figure 112006055848460-PCT00026
다른 예시적인 구체예로, 펩티드는 P133에 인접하거나 이들을 포함하는 N-말단중에서 선택된 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 생물학적으로 활성인 hGH 변이체이다. 본 발명의 생물학적으로 활성인 hGH 변이체는 당업자들에게 공지된 임의의 적합한 기능 분석에 따라 측정된 바, 그의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 상실하지 않은 하나 이상의 돌연변이를 가지는 임의의 hGH 폴리펩티드 부분 또는 전체를 포함한다. 일례로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 hGH 변이체내 돌연변이는 야생형 hGH에 당연히 존재하지 않는 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위내에 위치한다. 다른 예로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 hGH 변이체내 돌연변이는 hGH 변이체의 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위 내측 및 외측에 위치한다.
대표적인 야생형 및 변이체 hGH 폴리펩티드는 다음중에서 선택되는 서열을 갖는다:
SEQ ID NO: 19 (N-말단 메티오닌을 포함하는 192 아미노산 야생형 뇌하수체 유래 hGH)
Figure 112006055848460-PCT00027
SEQ ID NO: 20 (N-말단 메티오닌을 포함하지 않는 191 아미노산 야생형 뇌하수체 유래 hGH)
Figure 112006055848460-PCT00028
SEQ ID NO: 21 (야생형)
Figure 112006055848460-PCT00029
야생형 SEQ ID NO: 21에 밑줄쳐 진 영역에 상응하는 대표적인 변이체 펩티드 서열은 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00030
Figure 112006055848460-PCT00031
또 다른 예시적인 구체예로, 펩티드는, 예컨대 IFN 알파 야생형에 IFN 알파 2의 T106에 상응하거나 이와 동일하게 정렬된 아미노산 위치에 인접해 있거나 이를 포함하는 것과 같이, IFN 알파 2의 T106에 상응하는 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 생물학적으로 활성인 IFN 알파 변이체이다. 본 발명의 생물학적으로 활성인 IFN 알파 변이체는 당업자들에게 공지된 임의의 적합한 기능 분석에 따라 측정된 바, 그의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 상실하지 않은 하나 이상의 돌연변이를 가지는 임의의 IFN 알파 폴리펩티드 부분 또는 전체를 포함한다. 일례로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 IFN 알파 변이체내 돌연변이는 야생형 IFN 알파에 당연히 존재하지 않는 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위내에 위치한다. 다른 예로, 본 발명의 생물학적으로 활성인 IFN 알파 변이체내 돌연변이는 IFN 알파 변이체의 하나 이상의 O-결합 글리코실화 부위 내측 및 외측에 위치한다.
야생형 및 변이체 IFN 알파 폴리펩티드는 다음과 같이 나타내어진다:
SEQ ID NO: 22 (야생형 IFN 2b로부터)
Figure 112006055848460-PCT00032
G-CSF 및 G-CSF 이외 펩티드에 대한 다른 적절한 O-결합 글리코실화 서열은 잠재성 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 폴리펩티드를 제조하고, 폴리펩티드를 적합한 O-결합 글리코실화 조건에 제공하여 GalNac 트랜스퍼라제에 대한 수용체로서의 그의 제공 능력을 확인하여 결정할 수 있다. 또한, 당업자들에게 명백한 바와 같이, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 펩티드가 본 발명의 범주내에 포함된다. 돌연변이는 펩티드의 목적하는 성질, 예컨대 활성 및 펩티드상의 O- 및/또는 N-결합 글리코실화 부위 수 및 위치를 제공하도록 설계된다.
펩티드 코딩 서열 획득
일반적인 재조합 기술
본 발명은 재조합 유전자 기술 분야의 통상적인 기술에 기초한다. 본 발명에 사용될 수 있는 일반적인 방법을 기재한 기본 참조문헌은 Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3rd ed. 2001); Kriegier, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual(1990); 및 Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology(1994)를 포함한다.
핵산에 있어서, 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 주어진다. 이들 크기는 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 시퀀싱 핵산 또는 공표된 DNA 서열로부터 유도된 추정치이다. 단백질에 있어서, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기수로 주어진다. 단백질 크기는 겔 전기영동, 시퀀싱 단백질, 유도된 아미노산 서열 또는 공표된 단백질 서열로부터의 추정치이다.
입수가능하지 않은 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 참고문헌 [Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984)]에 기재되어 있는 바와 같이, 자동 합성기를 사용하여 문헌 [Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862(1981)]에 최초로 기술된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성할 수 있다. 전체 유전자가 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 기술, 예를 들어 문헌 [Peason & Reanier, J. Chrom, 255:137-149(1983)]에 기재된 이온-교환 HPLC 또는 비변성 아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 정제된다.
클로닝된 야생형 펩티드 유전자, 변이체 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 클로닝 사용후, 예를 들어 문헌 [Wallace et al., Gene 16:21-26(1981)]의 더블 스트랜드 템플레이트를 시퀀싱하는 연쇄 종료법을 사용하여 확인할 수 있다.
야생형 펩티드 코딩 서열의 클로닝 및 서브클로닝
야생형 펩티드, 예컨대 인간 성장 호르몬을 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열이 결정되었고, 유전자은행 취득번호 NM 000515, NM 002059, NM 022556, NM 022557, NM 022558, NM 022559, NM 022560, NM 022561 및 NM 022562로서 공급 업체로부터 입수할 수 있다.
인간 게놈 연구의 급속한 진보로 클로닝 접근이 가능하게 되어, 사전에 동정된 펩티드를 코딩하는 것과 같이, 공지된 뉴클레오티드 서열과 특정 %로 서열 상동성을 갖는 임의의 유전자 세그먼트에 대한 인간 DNA 서열 데이타베이스를 구축할 수 있게 되었다. 이어서, 화학적 합성 및/또는 PCR(중합효소 연쇄반응) 기술, 예컨대 중복 확장 방법(overlap extention method)에 의해 상기 동정된 DNA 서열을 수득할 수 있다. 단길이 서열에 대해서는 완전 데노보(de novo) 합성으로 충분한 반면; 대형 유전자를 수득하는데는 합성 프로브를 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리(genomic library)로부터 서열을 코딩하는 전장(full length) 분리가 필요할 수 있다.
또한, 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 일반적인 클로닝 기술을 이용하여 인간 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 분리할 수 있으며, 이때 상동성에 기초한 프라이머는 펩티드를 코딩하는 공지 핵산 서열로부터 유래될 수 있기도 하다. 이러한 목적으로 통상 사용되는 대부분의 기술은 일반적인 참조문헌(Sambrook and Russell, 상동)에 기재되어 있다.
야생형 펩티드 코딩 서열을 수득하기에 적합한 cDNA 라이브러리는 상업적으로 입수할 수 있거나, 작제될 수 있다. mRNA 분리, 역전사에 의한 cDNA 생성, 재조합 벡터에 cDNA의 결찰, 증식을 위한 재조합 숙주로의 형질감염, 스크리닝 및 클로닝의 일반적인 방법이 공지되었다(Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269(1983); Ausubel et al, 상동). PCR에 의해 뉴클레오티드 서열의 증폭 세그먼트를 얻는 경우, 세그먼트를 프로브로 추가로 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 야생형 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전장 서열을 분리할 수 있다. 적절한 처리과정에 대한 일반적인 설명은 Sambrook and Russell에 의한 상기 동일 문헌에 기재되어 있다.
유사한 절차에 따라 인간 게놈 라이브러리로부터 야생형 펩티드를 코딩하는 전장 서열, 예컨대 상기에 언급된 유전자 은행 취득번호중 어느 하나를 얻을 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 상업적으로 입수가능하거나, 당업계에 알려진 다양한 방법으로 작제될 수 있다. 일반적으로, 게놈 라이브러리를 작제하기 위하여, 먼저 펩티드가 확인될 가망성이 있는 조직으로부터 DNA를 추출한다. DNA를 기계적으로 전단하거나 효소 분해하여 길이 약 12 내지 20kb의 단편을 수득한다. 이어서, 원하지 않는 크기의 폴리뉴클레오티드 단편을 구배 원심분리하여 단편을 분리하여 박테리오파아지 λ 벡터에 삽입한다. 이들 벡터 및 파아지를 시험관내에서 패키징한다. 재조합 파아지를 문헌 [Benton and Davis, Science, 196:180~182(1977)]에 기술된 바와 같이 플라크 하이브리디제이션(plaque hybridization)으로 분석한다. 콜로니 하이브리디제이션(colony hybridization)을 문헌 [Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965(1975)]에 기술된 바와 같이 실시한다.
서열 상동성을 기준으로, 변성된 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 설계할 수 있고, PCR을 적합한 조건하에서 실시하여(White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin and Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994) cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 뉴클레오티드 서열의 세그먼트를 증폭시킬 수 있다. 프로브로서 증폭된 세그먼트를 사용하여 야생형 펩티드를 코딩하는 전장 핵산을 수득한다.
야생형 펩티드를 코딩하는 핵산서열을 얻을 때, 코딩 서열을 벡터, 예를 들어 발현 벡터내로 서브클로닝하여 생성된 작제물로부터 재조합 펩티드를 제조할 수 있다. 그후, 야생형 펩티드 코딩 서열로의 변형, 예컨대 뉴클레오티드 치환을 수행하여 분자의 특성을 변화시킬 수 있다.
펩티드 서열에 돌연변이의 도입
코딩한 폴리뉴클레오티드 서열로부터, 야생형 펩티드의 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 이어서, 아미노산 서열의 여러 위치에 추가의 글리코실화 부위(들)를 도입하여 아미노산 서열을 변형시켜 단백질의 글리코실화 패턴을 변경시킬 수 있다.
수개 타입의 단백질 글리코실화 부위가 당업계에 공지되었다. 예를 들어, 진핵 생물의 경우 공통서열 Asn-Xaa-Ser/Thr의 아스파라긴상에서 N-결합 글리코실화가 일어난다(여기에서, Xaa는 플로린을 제외한 임의의 아미노산이다)(Kornfield et al., Ann. Rev. Biochem. 54:631-664(1985); Kukuruzinska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2145-2149(1987); Herscovies et al., FASEB J7:540-550(1993): Orlean, Saccharomyces Vol. 3(1996)). O-결합 글리코실화가 세린 또는 트레오닌 잔기에서 일어난다(Tanner et al., Biochem. Biophys. Acta. 906:81-91(1987); Hounsell et al., Glycoconj. J. 13:19-26(1996)). 단백질의 카복실-말단 카복실기에 글리코실포스파티딜이노시톨을 결합시켜 다른 글리코실화 패턴을 형성시킨다(Takeda et al., Trends Biochem. Sci, 20:367-371(1996); Udenfriend et al., Ann. Rev. Biochem. 64:593-591(1995)). 이와 같은 정보에 기초하여, 적합한 돌연변이를 야생형 펩티드 서열에 도입하여 새로운 글리코실화 부위를 형성할 수 있다.
펩티드 폴리펩티드 서열내에 아미노산 잔기의 직접 변형이 새로운 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 부위를 도입하는데 적합하나, 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 돌연변이화하여 새로운 글리코실화 부위를 도입시키는 일이 빈번하다. 이는 공지된 돌연변이유발 방법중 임의의 방법을 이용하여 얻을 수 있으며, 그 방법중 일부를 이하 설명하기로 한다. G-CSF 펩티드로의 예시적인 변형은 SEQ ID NO: 5-18에 설명된 것을 포함한다.
여러가지 돌연변이발생 프로토콜이 당 기술분야에서 확립되어 기술되었다(Zhang et al., Proc Natl. Acod. Sci. USA, 94:4504-4509(1997); Stemmor, Nature, 370:389-391(1994)). 이 방법을 단독으로 또는 조합 사용하여 한 세트의 핵산 변이체 및 이에 따라 코딩된 폴리펩티드의 변이체를 생성할 수 있다. 돌연변이발생 키트, 라이브러리 작제물 및 다른 다양성(diversity)-발생 방법은 상업적으로 이용가능하다.
다양성을 발생시키는 돌연변이 방법은, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발[Botstein and Shortle, Science, 229:1193-1201(1985)], 우라실-함유 템플레이트를 사용하는 돌연변이유발[Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492(1985)], 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발[Zoller and Smith, Nacl. Acids Res. 10:6487-6500(1982)], 포소포로티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발[Taylor et al., Nacl. Acids Res., 13:8749-8764 및 8765-8787(1985)] 및 갭화(gapped) 이중나선 DNA를 사용한 돌연변이유발[Kramer et al., Nacl. Acids Res. 12:9441-9456(1984)]을 포함한다.
다른 돌연변이유발 방법에는 포인트 미스매치 복구(point mismatch repair)(Kramer et al., Cell, 38:879-887(1984)), 복구-결여 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발(Carter et al., Nucl. Acids Res., B: 4431.4443(1985)), 결실 돌연변이유발(Eghtedarzadeh and Henikoff, Nucl. Acids. Res., 14:5115(1986)), 제한-선택 및 제한-정제(Weils et al., Phil. Trans. R. Soc. Land. A, 317:415-423(1986), 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발(Nambiar et al., Science, 223:1299-1301(1984)), 더블 스트랜드 절단 복구(Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181(1986)), 폴리뉴클레오티드 연쇄 중지법에 의한 돌연변이유발(US 특허 제 5,965,408호)및 오류 허용 PCR(Leung et al., Biotechniques, 1:11-15(1989))을 포함한다.
숙주 유기체의 바람직한 코돈 사용을 위한 핵산 변형
변이체 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 변경하여 특정 숙주의 바람직한 코돈 사용에 부합시킬 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포중 한 균주의 바람직한 코돈을 사용하여 본 발명의 변이체 펩티드를 코딩하고 이러한 균주 지향 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 유도할 수 있다. 숙주 세포에 의해 나타나는 바람직한 코돈 사용의 빈도는 숙주 세포에 의해 발현된 다수의 유전자에서 바람직한 코돈사용의 빈도를 평균하여 계산할 수 있다(예컨대, 계산 방법은 Kazusa DNA Research Institute(Japan)의 웹사이트를 이용한다). 이 분석은 숙주 세포에 의해 고도로 발현된 유전자에 한정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, US 특허 제 5,824,864호에는 디코틸도노우스(dicotyledonous) 식물 및 모노코틸도노우스 식물에 의한 고도로 발현된 유전자에 의한 코돈 사용의 빈도에 대하여 기재되어 있다.
변이체 펩티드를 코딩하는 서열은 변형이 완료될 때 시퀀싱에 의해 검증되고, 이어서 서열은 야생형 펩티드와 동일한 방식으로 재조합 생성에 적절한 발현 벡터에 서브클로닝된다.
변이체 펩티드의 발현 및 정제
서열 검증에 이어, 재조합 유전학 분야의 통상적인 기술을 이용하여 본 원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 따라, 본 발명의 변이체 펩티드를 제조할 수 있다.
발현 시스템
본 발명의 변이체 펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 수준을 높이기 위하여, 전형적으로 변이체 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 직접 전사, 전사/해독 터미네이터 및 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부분에 대한 강력한 프로모터를 함유하는 발현 백터내로 서브클로닝한다. 적합한 박테리아 프로모터가 당업계에 익히 알려졌고, 문헌[Sambrook and Russell, 상기 동문헌 참조] 및 [Ausubel et al., 상기 동문헌 참조]에 기재되어 있다. 야생형 또는 변이체 펩티드를 발현하는 박테리아 발현 시스템은 E Coli, Bacllus sp. Salmonella 및 Caulobacter에서 얻을 수 있다. 이러한 발현 시스템의 키트는 상업적으로 입수할 수 있다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당업계에 익히 알려진 것으로, 역시 상업적으로 입수가능하다. 일례로, 진핵 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.
이종 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 특정 응용에 따라 좌우된다. 프로모터를 임의로, 자연 세팅된 전사개시 위치로부터와 이종 전사개시 위치에 대해 거의 동일한 거리에 선택적으로 위치시킨다. 그러나, 당업계에 공지된 바와 같이 이 거리에서의 일부 변이가 프로모터 기능의 손실없이 조절될 수 있다.
프로모터 이외에, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 변이체 펩티드의 발현에 필요한 모든 추가 요소를 포함하는 전사 유니트 또는 발현 카세트를 포함한다. 즉, 전형적인 발현 카세트는 변이체 펩티드를 코딩하는 핵산서열에 작동가능하게 결합된 프로모터와 전사, 리보솜 결합 부위 및 해독 종결의 유효한 폴리아데닐화에 필요한 시그널을 포함한다. 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 전형적으로 절단가능한 시그널 펩티드 서열에 결합하여 형질전환된 세포에 의한 펩티드 분비를 촉진한다. 이와같은 시그널 펩티드는 다른 시그널 펩티드 중에서도 조직 플라스미노겐 활성인자, 인슐린, 뉴론 성장인자 및 헬리오티스 비레스센스(Heliothis virescens)의 유충 호르몬 에스테라제로부터의 시그널 펩티드를 포함한다. 카세트의 추가 요소에는 인핸서(enhancer) 및, 게놈 DNA가 구조 유전자로 사용될 경우 기능성 스플라이스 도너(donor) 및 수용체 부위를 갖는 인트론을 포함한다.
프로모터 서열 이외에, 발현 카세트는 또한 유효한 종결을 제공하도록 구조 유전자의 하류에 전사종결 영역을 포함하여야 한다. 종결 영역은 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻을 수 있거나 다른 유전자로부터 얻을 수 있다.
세포에 유전 정보를 전달하는데 사용되는 특정 발현 벡터가 특별히 중요한 것은 아니다. 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 발현에 사용되는 통상의 벡터중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일반 박테리아 발현 벡터는 pBR322에 기초한 플라스미드, pSKF, pET23D와 같은 플라스미드 및 GST 및 LacZ와 같은 융합 발현 시스템을 포함한다. 편리한 분리 방법을 위해 예컨대 c-myc와 같은 에피토프 태그(epitope tag)가 또한 재조합 단백질에 첨가될 수 있다.
진핵 바이러스의 조절 요소를 포함하는 발현 벡터는 전형적으로 진핵 발현 벡터, 예컨대 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터 및 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)로부터 유래된 벡터에 사용된다. 다른 예시적인 진핵 벡터에는 pMSG, pAv009/A+, pMTO10/A+, pMAMeo-5, 바큘로바이러스(baculovirus) pDSVE; 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 마우스 유암 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 기타 프로모터 영향하에서 단백질을 발현시킬 수 있는 다른 벡터가 포함된다.
일부 예시적인 구체예에서, 발현 벡터는 본 원에 참고로 인용되는 2004년 4월 9일 출원된 공동 소유의 미국 특허 출원에 개시된 바와 같은 pCWin1, pCWin2, pCWin2/MBP, pCWin2-MBP-SBD(pMS39) 및 pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)중에서 선택된다.
일부 발현 시스템은 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 디하이드로폴레이트 환원효소와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커(marker)를 가진다. 또한, 폴리헤드린 프로모터 또는 기타 강력한 바큘로바이러스 프로모터 영향하에 변이체 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가지며 곤충 세포내 바클로바이러스 벡터와 같이 유전자 증폭에 관여하지 않는 고수율 발현 시스템이 적합하다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소는 또한 E. coli에서 작용하는 레플리콘(repicon), 재조합 플라스미드를 가지는 박테리아를 선택하도록 항생제 내성을 코딩하는 유전자 및 진핵 세포 서열을 삽입시키도록 하는 플라스미드의 비필수 영역내 유일한 제한 부위를 포함한다. 선택된 특정 항생제 내성 유전자는 중요하지 않으며, 당업계에 공지된 다수의 내성 유전자중 어느 것이라도 적합하다. 원핵 세포 서열은 필요할 경우, 진핵 세포에서 DNA의 복제에 간섭하지 않도록 임의로 선택된다.
재조합 단백질(예컨대 본 발명의 hGH 변이체)의 원형질막주위 발현이 필요할 경우, 발현 백터는 추가로 E.coli OppA(원형질막주위 올리고펩티드 결합 단백질) 분비 시그널 또는 그의 변이체와 같은 분비 시그널을 코딩하는 서열을 포함하며, 변이체는 발현될 단백질의 코딩 서열의 5'에 직접 연결된다. 이러한 시그널 서열은 세포막을 통해 세포질내에서 생성된 재조합 단백질을 원형질막주위 공간으로 유도한다. 발현 벡터는 재조합 단백질이 원형질막주위 공간으로 진입할 때 시그널 서열을 효소적으로 절단할 수 있는 시그널 펩티다제 1의 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 재조합 단백질의 원형질막주위 생성에 대한 보다 상세한 설명은 문헌(Gray et al., Gene 39:247-254(1985); US 특허 제 6,160,089호 및 6,436,674호)에 기재되어 있다.
상기 설명된 바와 같이, 당업계의 숙련자는 펩티드의 생물학적 활성을 유지하면서 야생형 또는 변이체 펩티드 또는 그의 코딩 서열에 대하여 다양한 보존적 치환을 실시할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드 코딩 서열을 변형시켜 수득한 아미노산 서열을 변형시킴이 없이 특정 발현 숙주에서 바람직한 코돈 사용을 도모할 수 있다.
트랜스펙션(transfection) 방법
표준 트랜스펙션(이입) 방법을 사용하여 다량의 변이체 펩티드를 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성한 후, 일반적인 방법에 따라 정제한다(참조예: Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622(1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182(Deutscher, ed. 1990)). 진핵 세포 및 원핵 세포의 형질전환은 일반적인 기술에 따라 실시한다(Morrison, J. Bact. 132:349-351(1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al., eds,(1983)).
외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에 도입하는 익히 공지된 방법중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이들의 방법에는 칼슘 포스페이트 형질감염, 폴리브렌(polybrene), 원형질체 융합, 전기천공(electroporation), 리포좀, 마이크로인젝션(microinjection), 플라즈마 벡터, 바이러스 벡터 사용 및, 숙주 세포에 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질을 도입하는 기타 공지 방법이 포함된다(Sambrook and Russel, 상기 동 문헌 참조). 사용한 특정 유전자 공학적 처리방법은 변이체 펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포에 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는 것만을 필요로 한다.
숙주 세포에서 변이체 펩티드의 발현 검출
발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입한 후에, 형질감염된 세포를 변이체 펩티드 발현에 바람직한 조건하에서 배양한다. 그 후, 세포를 재조합 폴리펩티드의 발현에 대해 스크리닝하고, 일반적인 기술에 따라 배양물로부터 회수한다(참조예: Scopes, Protein Purification: Principles and Practice(1982); US 특허 제 4,673,641호; Ausubel et al., 상기 동문헌; Sambrook and Russell, 상기 동 문헌).
유전자 발현을 스크리닝는 다수의 일반적인 방법이 당업자들에 익히 공지되었다. 첫째로, 유전자 발현을 핵산 수준으로 검출할 수 있다. 핵산 하이브리드화 기술을 사용하여 특정 DNA 및 RNA를 측정하는 각종 방법이 통상 사용된다(예: Sambrook and Russell, 상기 동 문헌). 일부 방법은 전기영동 분리(예: DNA 검출을 위한 서던 블롯 및 RNA 검출을 위한 노던 블롯)를 포함하나, DNA 또는 RNA의 검출은 전기영동 없이도 실시할 수 있다(예: 도트 블롯). 형질감염 세포에서 변이체 펩티드를 코딩하는 핵산의 존재는 또한 서열-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 또는 RT-PCR에 의해 검출할 수 있다.
둘째로, 유전자 발현을 폴리펩티드 수준으로 검출할 수 있다. 특히, SEQ ID NO:1-7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 같은 본 발명의 변이체 펩티드와 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 유전자 산물의 수준을 측정하기 위해 다양한 면역 어세이가 당업자들에 의해 통상적으로 행해진다(예: Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor, 1998; Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-497(1975)). 이러한 기술은 변이체 펩티드에 대해 고도의 특이성을 가지는 항체 또는 그의 항원 부분을 선택하여 항체를 제조하는데 필요하다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 증가시키는 방법은 이미 확립되어 있으며, 문헌 (Harlow and Lane, 상기 동 문헌; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519(1976))에서 확인할 수 있다. 이하, 다음 섹션에 본 발명의 변이체 펩티드에 대한 항체의 제조방법 및 변이체 펩티드를 검출하는 면역 어세이 수행방법을 보다 상세히 기술하도록 하겠다.
재조합에 의해 생성된 변이체 펩티드의 정제
형질감염된 숙주 세포에서 재조합 변이체 펩티드의 발현이 일단 확인되면, 이어서 숙주 세포를 재조합 폴리펩티드를 정제할 목적에 적절한 규모로 배양한다.
1. 박테리아로부터 재조합에 의해 생성된 변이체 펩티드의 정제
본 발명의 변이체 펩티드가 전형적으로 프로모터 유도후, 다량으로 형질전환된 박테리아에 의해 재조합 생성되는 경우, 발현이 구성될 수 있지만, 단백질은 불용성 응집물을 형성할 수 있다. 단백질 포함체의 정제에 적합한 다수의 프로토콜이 있다. 예를 들어, 응집 단백질(이후 포함체로 지칭)의 정제는 전형적으로 박테리아 세포 파괴, 예컨대 1 ㎖ 당 리소자임 약 100 내지 150 ㎍ 및 비이온성 세정제 0.1% Nonidet P40의 완충액에서의 인큐베이션에 의해 포함체를 추출, 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다. 폴리트론 그라인더(Polytron grinder)(Brolkman Instruments, Westbury, NY)를 사용하여 세포 현탁액을 분쇄할 수 있다. 또한, 세포를 얼음상에서 음파 처리할 수 있다. 박테리아를 용해시키는 다른 방법이 Ausabel 등과 Sambrook and Russell에 의한 상기 동 문헌에 기재되어 있으며, 당업자들에게는 주지의 사실이다.
세포 현탁액을 일반적으로 원심분리하고, 포함체를 함유하는 펠릿을 완충액, 예컨대 20 mM Tris-HCl(pH 7.2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 및 2% Triton-X100(비이온성 세정제)에 현탁시켜 포함체를 용해시키지 않고 세척한다. 가능한 많은 세포 단편을 제거하기 위하여 세척 단계를 반복하는 것이 필요할 수 있다. 포함체의 잔류 펠릿을 적절한 완충액(예: 20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 150 mM NaCl)에 재현탁시킬 수 있다. 다른 적절한 완충액은 당업자들이 알 수 있을 것이다.
세척 단계후, 강한 수소 수용체 및 강한 수소 도너(또는 각각 이들 성질중 하나를 가지는 용매 배합물)인 용매를 첨가하여 포함체를 용해시킨다. 그후, 포함체를 형성시킨 단백질을 혼화성 완충액으로 희석 또는 투석시켜 복원시킬 수 있다. 적합한 용매는 우레아(약 4M 내지 약 8M), 포름아미드(적어도 약 8%, vol/vol 기준) 및 구아니딘 하이드로클로라이드(약 4M 내지 약 8M)를 포함하나, 이들에만 한정되지 않는다. SDS(소듐 도데실 설페이트)및 70% 포름산과 같은 응집물-형성 단백질을 가용화시킬 수 있는 일부 용매는 면역원성 및/또는 활성의 결여에 따라 단백질의 비가역 변성 가능성을 수반함으써 상기 공정에 사용하는 것이 적합치 않을 수 있다. 구아니딘 하이드로클로라이드 및 유사 약제는 변성제이나, 이 변성은 비가역성이 아니며 변성제를 제거(예컨대 투석에 의해) 또는 희석함에 따라 복원이 발생하여 대상으로 하는 면역원 및/또는 생물학적 활성 단백질을 재형성시킬 수 있도록 한다. 가용화후, 단백질을 일반적인 분리 기술에 의해 다른 박테리아 단백질로부터 분리할 수 있다. 박테리아 포함체로부터 재조합 펩티드를 정제하는 보다 구체적 설명은 다음 문헌을 참조할 수 있다(Patra et al., Protein Expression and Purification 18:182~190(2000)).
또한, 박테리아 원형질막 공간으로부터 재조합 폴리펩티드, 예컨대 변이체 펩티드를 정제하는 것이 가능하다. 재조합 단백질을 박테리아의 원형질막 공간에 도입하는 경우, 박테리아의 원형질막 공간 부분은 한냉 삼투압 쇼크 및 당업자들에게 공지된 다른 방법으로 분리할 수 있다(참조예: Ausubel et al., 상기 동 문헌). 원형질막 공간으로부터 재조합 단백질을 분리하기 위하여, 박테리아 세포를 원심분리하여 펠릿을 형성한다. 펠릿을 20% 수크로스를 함유하는 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 용해시키기 위하여, 박테리아를 원심분리하고, 펠릿을 빙냉 5 mM MgSO4에 재현탁시킨 후, 빙조에서 약 10 분간 유지한다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 경사분리(decanting)하여 저장한다. 상등액에 존재하는 재조합 단백질을 당업자들에 공지된 일반적인 분리기술에 따라 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.
2. 정제에 대한 일반적인 단백질 분리 기술
재조합 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 변이체 펩티드가 가용 형태로 숙주 세포에서 발현되는 경우, 후술하는 일반적인 단백질 정제 방법에 따라 정제를 실시할 수 있다.
i. 용해도 분획화
초기 단계에 빈번히, 그리고 단백질 혼합물이 복합체인 경우, 초기 염 분획화에 따라 해당 재조합 단백질, 예컨대 본 발명의 변이체 펩티드로부터 원치않는 숙주 세포 단백질(또는 세포배양 배지로부터 유래된 단백질) 대부분을 분리할 수 있다. 바람직한 염은 황산암모늄이다. 황산암모늄은 단백질 혼합물중의 물의 양을 효과적으로 감소시켜 단백질을 침전시킨다. 단백질은 이들의 용해도에 따라 침전한다. 단백질이 보다 소수성일수록 더 낮은 황산암모늄 농도에서 보다 용이하게 침전할 것이다. 전형적인 프로토콜은 생성된 황산암모늄 농도가 20 내지 30%가 되도록 단백질 용액에 포화 황산암모늄을 첨가하는 것이다. 이는 대부분의 소수성 단백질을 침전시킬 것이다. 침전물을 버리고(대상 단백질이 소수성이 아닌 경우), 황산암모늄을 해당 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도로 상등액에 첨가한다. 그후, 침전을 완충액에 용해시키고, 필요에 따라 투석 또는 정용여과(diafiltration)에 의해 과량의 염을 제거한다. 냉 에탄올 침전과 같은 단백질의 용해도에 따른 다른 방법은 당업자들에 익히 공지되었으며, 복합 단백질 혼합물을 분획하는데 사용할 수 있다.
ii. 사이즈 차 여과
계산한 분자량을 기초로 하여, 기공 크기가 다른 막[예로서 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Milipore)막]을 통한 한외여과를 이용하여 단백질을 크기가 더 크고 작은 것으로 분리할 수 있다. 제 1 단계로, 단백질 혼합물을 대상 단백질, 예를 들어 변이체 펩티드의 분자량보다 작은 분자량을 컷-오프(cut-off)시키는 기공 크기를 가진 막을 통해 한외여과한다. 이어서, 한외여과 잔류물을 대상 단백질의 분자량 보다 큰 분자 컷오프를 가진 막에 한외여과한다. 재조합 단백질을 막에 통과시켜 여액을 수득한다. 그후, 여액을 후술하는 바에 따라 크로마토그래피할 수 있다
iii. 컬럼 크로마토그래피
대상 단백질(예컨대 본 발명의 변이체 펩티드)을 또한 이들의 크기, 순 표면 전하, 소수성 또는 리간드 친화성에 기초해 다른 단백질로부터 분리할 수 있다. 또한, 펩티드 항체를 컬럼 매트릭스에 콘쥬게이트시키고, 펩티드를 면역정제할 수 있다. 이들 모든 방법은 당업계에 공지되었다.
당업자들에게 크로마토그래피 기술이 여러 다른 제조사들로부터 입수가능한 장비를 사용하여 임의 규모로 수행될 수 있음은 주지의 사실이다.
변이체 펩티드 발현 검출에 대한 면역어세이
재조합 변이체 펩티드의 생성을 확인하기 위하여, 면역어세이 방법이 샘플에서 폴리펩티드 발현을 검출하는데 유용할 수 있다. 면역 어세이는 또한 재조합 호르몬의 발현 수준을 정량화하는데도 유용하다. 변이체 펩티드에 대한 항체가 이들의 면역 어세이를 실시하는데 필요하다.
변이체 펩티드에 대한 항체 생성
해당 면역원과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 생성방법이 당업자들에게 공지되었다(참조예: Coligan, Current Protocols in Immunology Willey/Greene, NY, 1991; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites et al.(eds.) Basic and Clinical Immunology(4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 여기에 인용된 참조문헌; Goding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed.) Academic Press, New York, NY, 1986; 및 Kohler and Milstein, Nature 256:495-497,1975). 이와 같은 기술에는 파아지 또는 유사 벡터의 재조합 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하여 항체를 제조하는 것을 포함한다(Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Ward et al., Nature 340:544-546, 1989).
목적하는 특이성을 가지는 항체를 포함하는 항혈청을 생성하기 위하여, 대상 폴리펩티드(예컨대, 본 발명의 변이체 펩티드) 또는 그의 항원 단편을 사용하여 적합한 동물, 예컨대 마우스, 토끼 또는 영장류를 면역화할 수 있다. 프로인트 어주번트(Freund adjuvant)와 같은 일반적인 어주번트를 일반적인 면역화 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 또한, 특정 폴리펩티드로부터 유래된 합성 항원 펩티드를 캐리어 단백질에 콘쥬게이트시킨 후 면역원으로 사용할 수 있다.
시험 혈액을 채혈하고 대상 항원에 대한 반응성 역가를 결정하여 면역원 제조에 대한 동물의 면역 반응을 모니터링할 수 있다. 항원에 대한 적절한 고역가 항체를 수득하면, 동물로부터 혈액을 채혈하여 항혈청을 만든다. 항원에 대해 특이적으로 반응하는, 항체가 풍부한 항혈청을 추가로 분획화한 후, 항체를 정제할 수 있다(Harlow and Lane, 상기 동문헌 및 단백질 정제에 대한 상기 제공된 일반적인 설명).
당업자들에게 의해 알려진 다양한 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 수득한다. 전형적으로, 목적 항원으로 면역화된 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 통상적으로 면역화시킨다(참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976). 다른 면역화 방법에는 엡스테인 바 바이러스, 온고 유전자(oncogene) 또는 레트로바이러스에 의한 형질전환, 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 포함한다. 단일 불멸화 세포로부터의 콜로니를 스크리닝하여 항원에 대한 바람직한 특이성 및 친화성을 가진 항체를 생성시킬 수 있으며, 척추동물 숙주의 복강내에 주입하는 것을 비롯한 다양한 기술에 따라 이러한 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 수율을 높일 수 있다.
또한, 문헌 (Huse et al., 상기 동 문헌)에 개략적으로 설명된 일반 프로토콜에 따라 인간 B 세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 항체의 결합 단편 또는 바람직한 특이성을 가지는 항체를 코딩하는 핵산 서열을 동정하여 모노클로날 항체를 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 상술된 재조합 폴리펩티드의 생성에 대한 일반적인 원칙 및 방법을 재조합 방법에 의한 항체 생성에 적용시킬 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 변이체 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 야생형 펩티드에 대한 항체의 교차 반응성에 대하여 시험할 수 있고, 그에 따라 야생형 단백질에 대한 항체를 구별할 수 있다. 예를 들어, 변이체 펩티드로 면역화된 동물로부터 얻은 항혈청을 야생형 펩티드가 고정화된 컬럼에 통과시킬 수 있다. 컬럼을 통과하는 항혈청 부분은 변이체 펩티드만을 인식하고 야생형 인간 펩티드는 인식하지 않는다. 마찬가지로, 변이체 펩티드에 대한 모노클로날 항체를 또한 변이체 펩티드만을 인식하고 야생형 펩티드를 인식하지 않는 배타성에 대하여 스크리닝할 수 있다.
야생형 펩티드를 인식하지 않고 본 발명의 돌여변이체 펩티드만을 특이적으로 인식하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는, 예컨대 샘플을 고체 지지체 상에 고정된 변이체 펩티드-특이성 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와 인큐베이션함으로써, 야생형 단백질로부터 변이체 단백질을 분리하는데 유용하다.
변이체 펩티드 발현을 검출하기 위한 면역어세이
본 발명의 변이체 펩티드에 대해 특이적인 항체가 이용가능하다면, 당업자들에 공지된 정량 및 정성 결과를 제공하는 각종 면역어세이로 샘플, 예를 들어 세포 용해물중의 폴리펩티드 양을 측정할 수 있다. 일반적으로 면역학적 및 면역 어세이 처리절차에 대해 다음 문헌을 참조할 수 있다; Stites, 상기 동 문헌; US 특허 제 4,366,352호; 4,376,110호; 4,517,288호; 및 4,837,168호.
면역어세이에서의 표지화
항체 및 표적 단백질에 의해 형성된 결합 복합체를 특이적으로 결합시키고 표지화하는데 면역어세이는 종종 표지제를 사용한다. 표지제는 자체가 항체/표적 단백질 복합체를 포함하는 부분중 하나일 수 있거나, 또는 항체/표적 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 다른 항체와 같은 제 3 부분일 수 있다. 표지는 분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광 또는 화학 수단으로 검출할 수 있다. 예로서 자기 비드(magnetic bead)(예: DynabeadsTM), 형광 염료(예: 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성 표지(즉, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 ELISA에서 통상 사용되는 효소) 및 콜로이드 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 발색 표지를 포함하나, 이들에만 한정되는 것은 아니다.
일부의 경우, 표지제는 검출가능한 표지를 가지는 제 2 항체이다. 또한, 제 2 항체는 표지되어 있지 않을 수 있지만, 제 2 항체가 유도되는 종의 항체에 특이적인 표지된 제 3 항체에 의해 결합될 수 있다. 제 2 항체는 효소-표지된 스트렙타비딘과 같은 제 3 표지 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴 등의 검출가능한 성분으로 변형될 수 있다.
단백질 A 또는 단백질 G와 같은 면역글로불린의 일정 영역을 특이적으로 결합시킬 수 있는 다른 단백질이 또한 표지제로 사용될 수 있다. 이들 단백질은 연쇄상구균 박테리아 세포벽의 정상 성분이다. 이들은 여러가지 종으로부터의 면역글로불린 일정 영역과 강력한 비면역원성 반응성을 나타낸다(참조: Kronual et al., J. Immunol., 111:1401-1406(1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 136:2589-2542(1985).
면역어세이 포맷
샘플로부터 대상 표적 단백질(예컨대 변이체 인간 성장 호르몬)을 검출하기 위한 면역어세이는 경쟁 또는 비경쟁적인 것일 수 있다. 비경쟁 면역어세이는 표적 단백질의 포획량을 직접 측정하는 어세이이다. 바람직한 한 "샌드위치식" 어세이에서는, 예를 들어 표적 단백질에 특이적인 항체를 고상 기질에 직접 결합시킬 수 있으며, 여기서 항체는 고정화되어 있다. 이는 후에 시험 샘플내의 표적 단백질을 포획한다. 그후, 고정된 항체/표적 단백질 복합체를 상기 설명된 바와 같이 표지를 갖는 제 2 또는 제 3 항체 등의 표지제로 결합시킨다.
경쟁 어세이에서는, 샘플에 존재하는 표적 단백질에 의해 표적 단백질에 특이적인 항체로부터 변위된(또는 경쟁에서 밀린) 첨가(외인성) 표적 단백질의 양을 측정하여 샘플내 표적 단백질의 양을 간접 측정한다. 이와같은 어세이의 전형적인 예에서, 항체를 고정화시키고, 외인성 표적 단백질을 표지화한다. 항체에 결합된 외인성 표적 단백질의 양은 샘플에 존재하는 표적 단백질의 농도에 반비례하기 때문에, 샘플내 표적 단백질 수준은 항체에 결합되어 고정된 외인성 표적 단백질의 양에 기초해 결정될 수 있다.
일부의 경우, 샘플중 변이체 펩티드의 존재를 검출하고 정량화하는데 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석을 이용한다. 이 기술은 일반적으로 분자량에 기초해 겔 전기영동에 의해 샘플 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 적합한 고상 지지체(예컨대 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터 또는 유도화된 나일론 필터)로 이입한 후, 샘플을 표적 단백질을 특이적으로 결합시키는 항체와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 이들 항체를 직접 표지화할 수 있거나, 또는 변이체 펩티드에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체(예: 표지된 양 항-마우스 항체)를 사용하여 검출할 수 있다.
다른 어세이 포맷에는 특이 분자(예: 항체)를 결합시키고 캡슐화 시약 또는 마커를 방출하도록 설계된 리포좀을 사용하는 리포좀 면역어세이(LIA)를 포함한다. 이어서, 방출된 화학물질을 표준 기술에 따라 검출한다(Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev., 5:34-41(1986).
콘쥬게이트
대표적인 측면으로, 본 발명은 펩티드와 선택된 변형 그룹간의 글리코콘쥬게이트를 제공하며, 여기에서 변형 그룹은 글리코실 연결 그룹, 예컨대 무손상 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드에 콘쥬게이트된다. 글리코실 연결 그룹은 펩티드상의 O-결합 글리코실화 부위에 직접 결합하거나, 하나 이상의 추가의 글리코실 잔기를 통해 0-결합 글리코실화 부위에 결합한다. 콘쥬게이트 제조방법이 본 원 및 U.S. 특허 제 5,876,980호; 6,030,815호; 5,728,554호; 5,922,577호; WO 98/31826; US2003180835; 및 WO 03/031464에 기술되었다.
예시적인 펩티드는 GalNAc 트랜스퍼라제 작용에 의해 O-결합 글리코실화 부위에 결합되어 있는 O-결합 GalNAc 잔기를 포함한다. GalNAc 자체가 무손상 글리코실 연결 그룹일 수 있다. GalNAc는 또한 예를 들어, 무손상 글리코실 연결 그룹으로 작용할 수 있는 Gal 또는 Sia 잔기에 의해 추가로 합성될 수 있다. 대표적인 구체예로, O-결합 사카릴 잔기는 GalNAc-X, GalNAc-Gal-Sia-X 또는 GalNAc-Gal-Gal-Sia-X이며, 여기에서 X는 변형 그룹이다.
예시적인 구체예로, 펩티드는 야생형 펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 변이체 펩티드이다. 펩티드는 바람직하게는 GalNAc 잔기를 가지는 돌연변이 부위에서 O-글리코실화된다. 사카릴 부분 구조에 대한 전술한 설명이 또한 적용된다.
펩티드와 선택된 부분 사이의 결합은 펩티드와 변형 부분 사이에 삽입된 뮤손상 글리코실 연결 그룹을 포함한다. 본 원에 설명된 바와 같이, 선택된 부분은 본질적으로 사카라이드 단위에 결합하여 적절한 트랜스퍼라제 효소에 의해 인식되는 "변형 당"을 제공함으로써 펩티드상에 변형 당을 부가할 수 있는 임의의 종일 수 있다. 변형 당의 사카라이드 성분은 펩티드와 선택된 부분 사이에 삽입된 경우 "무손상 글리코실 연결 그룹"으로 된다. 글리코실 연결 그룹은 선택된 부분으로 변형후 적절한 트랜스퍼라제 기질로 되는 모노- 또는 올리고-사카라이드로부터 형성된다.
본 발명의 콘쥬게이트는 전형적으로 다음 구조에 상응할 것이다:
Figure 112006055848460-PCT00033
상기 구조에서,
기호 a, b, c, d 및 s는 영(0)이 아닌 양의 정수이고,
t는 0 또는 양의 정수이다.
"약제(agent)"는 치료제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 수용성 부분 등이다. "약제"는 펩티드, 예컨대 효소, 항체, 항원 등일 수 있다. 링커(linker)는 하기에 열거되는 광범위 연결 그룹중 임의의 것일 수 있다. 또한, 링커는 단일 결합 또는 "0차 링커"일 수 있다. 펩티드 아이덴티티는 제한이 없다.
예시적인 구체예로, 선택된 부분은 수용성 중합체, 예를 들어 PEG, m-PEG, PPG 및 m-PPG 등이다. 수용성 중합체는 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드에 공유결합한다. 글리코실 연결 그룹은 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기에 공유결합한다. 또한, 글리코실 연결 그룹은 글리코펩티드의 하나 이상의 글리코실 단위에 결합된다. 본 발명은 또한 글리코실 연결 그룹(예: GalNAc)이 아미노산 잔기(예: Thr 또는 Ser)에 부착된 콘쥬게이트를 제공한다.
예시적인 구체예로, 단백질은 인터페론이다. 인터페론은 인간에서 바이러스 또는 더블 스트랜드 RNA 유도후 인간 제 1 섬유모세포에 의해 분비되는 항바이러스 당단백질이다. 인터페론은 치료제, 예컨대 항바이러스제(예: B형 및 C형 간염), 항종양(예: 간세포암) 및 다발성 경화증 치료제로 관심의 대상이다. 인터페론-α에 대한 관련 참조문헌은 다음과 같다: Asano, et al., Eur. J. Cancer, 27 (Suppl 4):S21-S25 (1991); Nagy, et al., Anticancer Research, 8(3):467-470 (1988); Dron, et al, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 3(1):13-19 (1989); Habib, et al., Am. Surg., 67(3): 257-260 (3/2001); 및 Sugyiama et al., Eur. J. Biochem., 217:921-927 (1993). 인터페론-β에 대한 관련 참조문헌은 다음과 같다: Yu et al., J. Neuroimmunol., 64(1):91-100 (1996); Schmidt, J., J. Neurosci. Res., 65(1):59-67 (2001); Wender et al., Folia Neuropathol., 39(2): 91-93 (2001)24 (1996); Martin, et al., Springer Semin Immunopathol., 18(1): 1024 (1996); Takane, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 294(2):746-752 (2000); Sburlati, et al., Biotechnol. Prog., 14:189-192 (1998); Dodd, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 787:183-187(1984); Edelbaum, et al., J. Interferon Res., 12:449-453 (1992); Conradt, et al., J. Biol. Chem., 262(30):14600-14605 (1987); Civas, et al., Eur. J. Biochem., 173:311-316 (1988); Demolder, et al., J. Biotechnol., 32:179-189 (1994); Sedmak, et al., J. Interferon Res., 9 (Suppl 1):S61-S65 (1989); Kagawa, et al., J. Biol. Chem., 263(33):17508-17515 (1988); Hershenson, et al., U.S. 특허 제 4,894,330호; Jayaram, et al., J. Interferon Res., 3(2):177-180 (1983); Menge, et al., Develop. Biol. Standard., 66:391-401 (1987); Vonk, et al., J. Interferon Res., 3(2):169-175 (1983); 및 Adolf, et al., J. Interferon Res., 10: 255-267 (1990).
예시적인 인터페론 콘쥬게이트에서, 인터페론 알파, 예컨대 인터페론 알파 2b 및 2a는 무손상 글리코실 링커를 통해 수용성 중합체에 콘쥬게이트된다.
다른 예시적인 구체예로, 본 발명은 인간 과립구 집락 자극인자(G-CSF)의 콘쥬게이트를 제공한다. G-CSF는 뉴트로포이에틱(neutropoietic) 선조 세포를 기능적 성숙 중성구가 되도록 증식, 분화 및 활성화를 촉진하는 당단백질이다. 주입된 G-CSF는 체내로부터 신속히 제거된다. 참조예: Nohynek, et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 39:259-266 (1997); Lord, et al., Clinical Cancer Research, 7 (7):2085-2090 (07/2001); Rotondaro, et al., Molecular Biotechnology, 11(2):117-128 (1999); 및 Boenig, et al., Bone Marrow Transplantation, 28:259-264 (2001).
본 발명은 GM-CSF의 변형방법을 제공한다. GM-CSF는 활성화 T-세포, 대식세포, 내피세포 및 간질 섬유모세포에 의해 생성된 사이토킨으로서 당업계에 익히 알려졌다. GM-CSF는 주로 골수에 작용하여 염증 백혈구를 증가시키며, 엔도크린 호르몬으로 추가로 작용하여 염증 작용동안 소모된 중성구의 새로운 보충을 개시한다. 추가의 GM-CSF는 대식세포-활성화 인자이며, 랑게르한스 세포가 가지 세포로 분화하는 것을 촉진한다. G-CSF와 마찬가지로, GM-CSF가 또한 화학요법후 골수재생에 임상적용되고 있다.
효소 부가된 무손상 글리코실 연결 그룹을 통해 형성된 콘쥬게이트를 제공하는 것 이외에, 본 발명은 그의 치환 패턴이 매우 균일한 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하여, 본 발명의 콘쥬게이트 집단의 실질적으로 모든 변형 당 부분이 구조적으로 동일한 아미노산 또는 글리코실 잔기에 부착된 펩티드 콘쥬게이트를 형성하는 것이 가능하다. 즉, 제 2 측면으로, 본 발명은 무손상 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드에 공유결합된 수용성 중합체 부분 집단을 가지는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 다른 콘쥬게이트로, 본질적으로 집단의 각 멤버는 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드의 글리코실 잔기에 결합되고, 글리코실 연결 그룹이 결합된 펩티드의 각 글리코실 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
또한, 글리코실 연결 그룹을 통해 공유결합된 수용성 중합체 부분 집단을 가지는 펩티드 콘쥬게이트가 제공된다. 다른 구체예에서, 본질적으로 수용성 중합체 부분 집단의 모든 멤버는 무손상 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드의 아미노산 잔기에 결합되고, 무손상 글리코실 연결 그룹을 가지는 각 아미노산 잔기는 동일한 구조를 갖는다.
본 발명은 또한 펩티드가 글리코실 연결 그룹을 통해 치료 부분, 진단 부분, 표적 부분, 톡신 부분 등에 콘쥬게이트된 상술된 콘쥬게이트의 유사체를 제공한다. 상기 언급된 각 부분은 소형 분자, 중성 중합체(예: 폴리펩티드) 또는 합성 중합체일 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 발명은 콘쥬게이트 성분으로서 표적제의 존재로 인해 특정 조직에 선택적으로 위치한 콘쥬게이트를 제공한다. 예시적인 구체예로, 표적제는 단백질이다. 예시적인 단백질에는 트랜스페린[뇌, 혈액 풀(blood pool)], HS-당단백질(뼈, 뇌, 혈액 풀), 항체(뇌, 항체-특이적 항원을 가진 조직, 혈액 풀), 응집 인자 V-XII(손상 조직, 클롯, 암, 혈액 풀), 혈청 단백질, 예컨대 α-산 당단백질, 페투인, α-태아 단백질(뇌, 혈액 풀), β2-당단백질(간, 죽상동맥경화증 플라크, 뇌, 혈액 풀), G-CSF, GM-CSF, M-CSF 및 EPO(면역자극, 암, 혈액 풀, 적혈구세포 과잉생산, 신경보호), 알부민(반감기 증가), IL-2 및 IFN-a가 포함된다.
예시적인 표적 콘쥬게이트에서, 인터페론 알파 2β(IFN-α2β)는 PEG 부분의 각 말단에 무손상 글리코실 연결 그룹을 포함하는 이작용성 링커를 통해 트랜스페린에 콘쥬게이트된다(도 1). 예를 들어, PEG 링커의 한 말단은 트랜스페린에 부착된 무손상 시알산 링커로 기능화되고, 다른 것은 IFN-α2β에 부착된 무손상 O-결합 GalNAc 링커로 기능화된다.
본 발명의 콘쥬게이트는 일가 또는 다가(예: 안테나 구조)의 글리코실 연결 그룹을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 콘쥬게이트는 선택된 부분이 일가 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드에 부착된 두 종을 모두 포함한다. 선택된 복수개의 부분이 다가 연결 그룹을 통해 펩티드에 부착된 콘쥬게이트가 또한 본 발명내에 포함된다.
방법
상술된 콘쥬게이트 이외에, 본 발명은 이들 콘쥬게이트 및 기타 콘쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 질병이 진행될 위험이 있거나 질병을 가지는 대상에 본 발명의 콘쥬게이트를 투여하여 질병 상태를 예방, 치유 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 콘쥬게이트를 신체의 특정 조직 또는 영역에 표적화하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 치료 부분과 펩티드간의 공유 콘쥬게이트를 형성하는 방법을 제공한다. 예시적인 구체예로, 콘쥬게이트는 수용성 중합체, 치료 부분, 표적 부분 또는 생체분자 및 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드 사이에 형성된다. 중합체, 치료 부분 또는 생체분자는 펩티드와 변형 그룹(예: 수용성 중합체) 사이에 삽입되어 이 둘다에 공유적으로 결합된 글리코실 연결 그룹을 통해 펩티드에 콘쥬게이트된다. 본 발명의 방법은 펩티드를 변형 당 및 변형 당을 기질로 하는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 반응은 변형 당과 펩티드 사이에 공유결합을 형성하기에 적절한 조건하에서 수행된다. 변형 당의 당 부분은 바람직하게는 뉴클레오티드 당, 활성 당 및 뉴클레오티드도 아니고 활성화되지도 않은 당중에서 선택된다.
수용체 펩티드(O-글리코실화 또는 비글리코실화)는 전형적으로 데노보 합성되거나, 또는 원핵 세포(예 E.coli와 같은 박테리아 세포) 또는 진핵 세포(예: 포유동물, 효모, 곤충, 진균 또는 식물 세포 등)에서 재조합 발현된다. 펩티드는 전장 단백질 또는 단편일 수 있다. 또한, 펩티드는 야생형 또는 돌연변이 펩티드이다. 예시적인 구체예에서, 펩티드는 펩티드 서열에 하나 이상의 N- 또는 O-결합 글리코실화 부위가 첨가된 돌연변이를 포함한다.
예시적인 구체예로, 펩티드는 하기 방법으로 O-글리코실화되고 수용성 중합체로 기능화된다. 펩티드는 이용가능한 아미노산 글리코실화 부위로 제조되거나, 글리코실화된 경우, 글리코실화 부위의 트리밍으로(trimmed off) 아미노산을 노출시키게 된다. 예를 들어, GalNAc를 세린 또는 트레오닌에 첨가하고, 갈락토실화 펩티드를 ST6Gal-1을 사용하여 시알산-변형 그룹 카세트로 시알릴화한다. 또한, 갈락토실화 펩티드를 Core-1-GalT-1을 사용하여 갈락토실화하고, 생성물을 ST3GalT1을 사용하여 시알산-변형 그룹으로 시알릴화한다. 본 발명에 따른 예시적인 콘쥬게이트는 결합: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia*를 갖고, 여기에서 Sia*는 시알산-변형 그룹 카세트이다.
예컨대 상술된 바와 같은 본 발명의 방법에서, 다중 효소 및 사카릴 도너를 사용하여, 개별 글리코실화 단계를 별도로 또는 "단일 포트" 반응으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 상술된 세 효소 반응에서, GalNAc 트랜스퍼라제, GalT 및 SiaT 및 그의 도너를 단일 용기에서 배합할 수 있다. 또한, GalNAc 반응을 단독으로 수행할 수 있고, GalT 및 SiaT 및 적절한 사카릴 도너는 단일 단계로 첨가된다. 다른 반응 수행 방법은 각 효소 및 적절한 도너를 연속 첨가하고, 반응을 "단일 포트" 모티브로 수행하는 것을 포함한다. 상술된 각 방법의 조합이 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 콘쥬게이트에서, Sia-변형 그룹 카세트는 α-2,6 또는 α-2,3 결합으로 Gal에 결합할 수 있다.
예를 들어, 일례로, G-CSF를 포유동물 시스템에서 발현시키고, 시알리다제로 처리하여 말단 시알산 잔기를 백 트리밍한 후, PEG-시알산의 도너 및 ST3Gal3을 사용하여 PEG일화한다.
본 발명의 방법은 또한 재조합적으로 제조된 불완전 글리코실화된 펩티드의 변형방법을 제공한다. 다수의 재조합적으로 제조된 당단백질은 불완전하게 글리코실화되어 RES에 의해 인식되는 바람직하지 않은 성질, 예컨대 면역원성을 가질 수 있는 탄수화물 잔기를 노출한다. 본 발명의 방법에 변형 당을 사용함으로써, 펩티드는 동시에 추가로 글리코실화되고 예컨대 수용성 중합체, 치료제 등으로 유도화될 수 있다. 변형 당의 당 부분은 완전 글리코실화된 펩티드내 수용체에 적절히 콘쥬게이트될 수 있는 잔기 또는 바림직한 성질을 가지는 다른 당 부분일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 변형된 펩티드는 합성 또는 야생형 펩티드일 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 방법, 이를테면 부위-지향 돌연변이유발에 의해 제조된 돌연변이화 펩티드일 수 있다. 펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 0-결합이다. 예시적인 N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 변형 당의 결합이다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 효소 부착 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드내 이들 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합 글리코실화란 하이드록시아미노산, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌의 하이드록시 측쇄에 하나의 당(예: N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 만노스, GlcNAc, 글루코스, 프럭토스 또는 크실로스)이 부착하는 것을 말하며, 이때 특별하거나 비자연 아미노산, 예컨대 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리산이 또한 사용될 수 있다.
또한, 펩티드 이외에, 본 발명의 방법을 다른 생물학적 구조(예: O-결합 글리코실화 부위를 가지는 글리코리피드, 리피드, 스핑고이드, 세라마이드, 전 세포 등)에 대해 수행할 수 있다.
펩티드 또는 다른 구조에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 편의상 아미노산 서열이 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 아미노산 서열을 변경시켜 수행된다. 부가는 또한 펩티드 서열내에서, -OH 그룹을 나타내는 하나 이상의 종, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함시켜 실시할 수 있다(O-결합 글리코실화 부위의 경우). 부가는 펩티드의 완전 화학 합성 또는 돌연변이에 의해 제공될 수 있다. 펩티드 아미노산 서열은 바람직하게는 DNA 수준에서 변화시켜, 특히 바람직한 아미노산으로 해독될 코돈을 발생시키도록 사전 선택된 염기에서 펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변경된다. DNA 돌연변이(들)는 바람직하게는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 실시된다.
예시적인 구체예에서, 글리코실화 부위는 폴리뉴클레오티드를 셔플링(shuffling)하여 부가된다. 후보 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 셔플링 프로토콜로 조정될 수 있다. DNA 셔플링은 관련 유전자 풀(pool)의 랜덤 단편화후, 중합효소 연쇄반응 등의 방법에 의한 단편 어셈블리로 수행되는 반복적인 재조합 및 돌연변이 과정이다. 참조예: Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:10747-10751(1994); Stemmer, Nature 370:389-391(1994); US 특허 제 5,605,793호; 5,837,458호; 5,830,721호; 5,811,238호.
본 발명은 또한 펩티드에 하나 이상의 선택된 글리코실 잔기를 부가(또는 제거)한 후, 변형 당을 펩티드의 선택된 글리코실 잔기중 적어도 하나에 콘쥬게이트시키기 위한 수단을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어, 펩티드에 존재하지 않거나 또는 바람직한 양으로 존재하지 않는 선택된 글리코실 잔기에 변형 당을 콘쥬게이트시키는 것을 목적으로 하는 경우 유용하다. 즉, 변형 당을 펩티드에 결합시키기 전에, 선택된 글리코실 잔기를 효소 또는 화학적 결합에 의해 펩티드에 콘쥬게이트시킨다. 또 다른 구체예에서, 글리코펩티드로부터 탄수화물 잔기를 제거하여 변형 당을 콘쥬게이트시키기 전에 글리코펩티드의 글리코실화 패턴이 변경된다. 참조예: WO 98/31826.
글리코펩티드상에 존재하는 임의 탄수화물 부분의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 실시된다. 화학적 탈글리코실화는 바람직하게는 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 동등 화합물에 폴리펩티드 변이체를 노출시켜 실시된다. 이러한 처리로 결합 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당이 절단되나, 펩티드는 무손상 상태로 남아있게 된다. 화학적 탈글리코실화가 문헌 [Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52(1987); Edge et al., Anal. Biochem. 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 변이체상에서 탄수화물 부분의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350(1987)]에 기재된 바와 같이, 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 제공할 수 있다.
글리코실 부분의 화학적 부가는 당업계에 알려진 임의 방법으로 수행된다. 당 부분의 효소적 부가는 바람직하게는 본 발명에 사용된 변형 당 대신 고유 글리코실 단위를 사용하여 본 원에 기술된 방법을 변형시켜 수행한다. 당 부분을 부가하는 다른 방법이 US 특허 제 5,876,980호; 6,030,815호; 5,728,554호; 및 5,922,577호에 기재되어 있다.
선택된 글리코실 잔기의 예시적인 결합 지점은
(a) N-결합 글리코실화 공통 부위 및 O-결합 글리코실화 부위;
(b) 글리코실트랜스퍼라제 수용체인 말단 글리코실 부분;
(c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘;
(d) 유리 카복실 그룹;
(e) 시스테인의 것과 같은 유리 설피드릴 그룹;
(f) 세린, 트레오닌 또는 하니드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실 그룹;
(g) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기; 또는
(h) 글루타민의 아미드 그룹을 포함하나, 이들에만 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적인 사용방법이 WO 87/05330(1987.09.11. 공개); 및 Aplin and Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM., PP259-306(1981)에 기재되어 있다.
일례로, 본 발명은 연결 그룹을 통해 2 이상의 펩티드를 결합시키는 방법을 제공한다. 연결 그룹은 임의의 유용한 구조의 것이며, 직쇄 및 분지쇄 구조중에서 선택될 수 있다. 바람직하게, 펩티드에 결합된 링커의 각 말단은 변형 당(즉, 초기 무손상 글리코실 연결 그룹)을 포함한다.
본 발명의 예시적인 방법에서, 두 펩티드는 PEG 링커를 포함하는 링커 부분을 통해 함께 결합된다. 작제물은 상술된 일반 구조와 일치한다. 본 원에 설명된 바와 같이, 본 발명의 작제물은 두개의 무손상 글리코실 연결 그룹(즉, s+t=1)을 포함한다. 두 글리코실 그룹을 포함하는 PEG 링커는 명확히 설명하는데 목적이 있으며, 본 발명의 구체예에서 사용하는 링커 팔의 아이덴티티를 한정하려는 것으로 해석하여서는 안된다.
즉, PEG 부분은 제 1 글리코실 단위를 가진 제 1 말단 및 제 2 글리코실 단위를 가진 제 2 말단에서 기능작용을 한다. 제 1 및 제 2 글리코실 단위는 바람직하게는 상이한 트랜스퍼라제의 기질이며, 각각 제 1 및 제 2 글리코실 단위에 제 1 및 제 2 펩티드가 직교결합되도록 한다. 실제로, (글리코실)1PEG-(글리코실)2 링커를 제 1 글리코실 단위가 기질인 제 1 트랜스퍼라제 및 제 1 펩티드와 접촉시켜 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2를 형성한다. 그후, 트랜스퍼라제 및/또는 미반응 펩티드를 반응 혼합물로부터 임의로 제거한다. 제 2 펩티드와, 제 2 글리코실 단위가 기질인 제 2 트랜스퍼라제를 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2 콘쥬게이트에 부가하여 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2-(펩티드)2를 형성하며; 적어도 하나의 글리코실 잔기는 직접 또는 간접적으로 O-결합된다. 당업자들은 상술된 방법이 또한 예컨대 분지상 PEG, 덴드리머(dendrimer), 폴리(아미노산), 폴리사카라이드 등을 사용하여 두개 이상의 펩티드 사이에 콘쥬게이트를 형성하는데 적용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
예시적인 구체예로, 인터페론 알파 2β(IFN-α 2β)는 PEG 부분의 각 말단에서 무손상 글리코실 연결 그룹을 포함하는 이작용성 링커에 의해 트랜스페린에 콘쥬게이트된다(반응식 1). IFN 콘쥬게이트는 콘쥬게이트의 분자 크기보다 크기 때문에 IFN 단독의 것보다 증가된 생체내 반감기를 가진다. 또한, 트랜스페린에 IFN의 콘쥬게이트가 뇌에 콘쥬게이트를 선택적으로 표적화시키기 위해 제공된다. 예를 들어, PEG 링커의 한 말단이 CMP 시알산으로 가능화되며, 다른 말단은 UDPGalNAc로 가능화된다. 링커를 GalNAc 트랜스퍼라제의 존재하에서 IFN과 결합시키고, 그에 따라 IFN 상의 세린 및/또는 트레오닌 잔기에 링커팔의 GalNAc가 결합된다.
Figure 112006055848460-PCT00034
상기 설명된 과정은 필요에 따라 가급적 많은 사이클을 통하여 실시될 수 있으며, 단일 링커로 두 펩티드 사이에 콘쥬게이트를 형성하는 것이 예시되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 당업자들은 펩티드로 PEG 링커(또는 다른 링커)의 말단에서 무손상 글리코실 연결 그룹을 기능화시키는 반응이 동일 반응 용기내에서 동시에 일어날 수 있거나, 또는 이들 반응이 단계식 방법으로 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 반응이 단계식 방법으로 수행되는 경우, 각 단계에서 생성된 콘쥬게이트는 임의로 하나 이상의 반응 성분(즉, 효소, 펩티드)으로부터 정제된다.
또 다른 예시적인 구체예가 반응식 2에서 나타내어졌다. 반응식 2는 선택된 단백질, 예를 들어 GM-CSF를 뼈에 표적화시켜 선택된 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 콘쥬게이트의 제조방법을 나타낸다.
Figure 112006055848460-PCT00035
상기 반응식에서, G는 콘쥬게이트에서 무손상 글리코실 링커 그룹으로 전환되는 활성당 부분(예: 당 뉴클레오티드) 상의 글리코실 잔기이다. s가 O 보다 큰 경우, L은 GalNAc 또는 GalNAc-Gal과 같은 사카릴 연결 그룹이다.
하나 이상의 펩티드 부분을 링커에 결합시키기 위해 PEG(또는 다른 링커)의 반응성 유도체를 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명은 반응성 PEG 유사체의 아이덴티티로만 한정되지 않는다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 활성화된 유도체 대부분은 상업적으로 입수가능하거나, 문헌에 기술되었다. 본 발명에 유용한 기질을 제조하기에 적합한 활성화 PEG 유도체를 선택하고 필요에 따라 합성하는 것은 당업자들의 능력내에서 가능하다. 참조: Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186(1984); Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252:3582-3586(1977); Jackson et al., Anal. Biochem., 165:114-127(1987); Koide et al., Biochem Biophys. Res. Commun., 111:659-667(1983)), 트레실레이트(Nilsson et al., Methods Enzymol., 104:56-69(1984); Delgado et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 12:119-128(1990)); N-하이드록시숙신이미드 유도된 활성 에스테르(Buckmann et al., Makromol. Chem., 182:1379-1384(1981); Joppich et al., Makromol. Chem., 180:1381-1384(1979); Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186(1984); Katreet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:1487-1491(1987); Kitamura et al., Cancer Res., 51:4310-4315 (1991); Boccu et al., Z. Naturforsch., 38C: 94-99 (1983), 카보네이트(Zalipsky et al., POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris, Ed., Plenum Press, New York, 1992, pp.347-370; Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 15:100-114(1992); Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141-152(1985)), 이미다졸릴 포르메이트(Beauchamp et al., Anal. Biochem., 131:25-33(1983); Berger et al., Blood, 71:1641-1647(1988)), 4-디티오피리딘(Woghiren et al., Bioconjugate Chem., 4:314-318 (1993); 이소시아네이트(Byun et al., ASAIO Journal, M649-M-653(1992)) 및 에폭사이드(U.S. 특허 제4,806,595호(Noishiki et al.,(1989)). 다른 연결 그룹은 아미노 그룹과 활성화 PEG 사이의 우레탄 연결 그룹을 포함한다(참조예: Veronese et al., Appl. Biochem. Biotechnical, 11:141-152(1985)).
반응성 PEG 유도체가 사용되는 또 다른 구체예에서, 본 발명은 사구체(glomerules)에 의한 단백질(즉, 알부민) 여과를 지연하는데 충분한 크기의 합성 또는 천연 중합체에 펩티드를 콘쥬게이트시킴으로써, 본질적으로 펩티드를 혈액 풀에 표적화하여 선택된 펩티드의 혈액 순환 반감기를 연장하는 방법을 제공한다(반응식 3 참조). 본 발명의 이러한 구체예를 하기 반응식 3에 나타내었으며, 여기에서는 G-CSF가 화학적 및 효소적 변형의 조합으로 PEG 링커를 통해 알부민에 콘쥬게이트된다.
Figure 112006055848460-PCT00036
즉, 상기 반응식 3에 도시된 바와 같이, 알부민 잔기(예: 아미노산 측쇄)는 X-PEG-(CMP-시알산)과 같은 반응성 PEG 유도체로 변형된다(여기에서, X는 활성 그룹(예: 활성 에스테르, 이소티오시아네이트 등)이다. PEG 유도체와 G-CSF를 배합하고, CMP-시알산이 기질인 트랜스퍼라제와 접촉시킨다. 또 다른 구체예에서, 리신의 ε-아민을 PEG-링커의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 반응시켜 알부민 콘쥬게이트를 형성한다. 링커의 CMP-시알산을 G-CSF 상의 적절한 잔기(예: Gal 또는 GalNAc)에 효소적으로 콘쥬게이트시켜 콘쥬게이트체를 형성한다. 당업자들은 상술된 방법이 서술된 반응 파트너에만 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, 상기 방법을 실시하여 예를 들어 두개 이상의 말단을 갖는 분지된 링커를 이용하여 두개 이상의 단백질 부분을 포함하는 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
변형 당
변형 글리코실 도너종("변형 당")은 바람직하게는 변형 당 뉴클레오티드, 활성화 변형 당 및 뉴클레오티드도 아니고 활성화되지도 않은 단순 사카라이드인 변형 당중에서 선택된다. 본 발명의 방법을 사용하여 임의의 바람직한 탄수화물 구조를 펩티드에 부가할 수 있다. 전형적으로, 구조는 모노사카라이드일 것이나, 본 발명은 변형 모노사카라이드 당의 사용에만 한정되지 않고, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드도 마찬가지로 유용하다.
변형 그룹을 효소 수단, 화학적 수단 또는 이들의 조합 수단에 의해 당 부분에 결합시켜 변형 당을 형성한다. 당은 펩티드에 변형 당을 결합시키는데 사용되는 효소 기질로 당을 작용시킬 수 있으면서 변형 부분을 결합시킬 수 있는 임의 위 치에서 치환된다. 다른 구체예로, 시알산이 당인 경우, 시알산은 피루빌 측쇄상의 9-위치 또는 시알산에서 일반적으로 아세틸화되는 아민 부분상의 5-위치에서 변형 그룹에 의해 치환된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 변형 당 뉴클레오티드를 사용하여 변형 당을 펩티드에 부가한다. 본 발명에서 변형된 형태로 사용되는 예시적인 당 뉴클레오티드에는 뉴클레오티드 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 이들의 유사체가 포함된다. 다른 구체예로, 변형 당 뉴클레오티드는 UDP-글리코시드, CMP-글리코시드 및 GDP-글리코시드중에서 선택된다. 보다 바람직하게, 변형 당 뉴클레오티드는 UDP-갈락토스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코스, UDP-글루코사민, GDP-만노스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 및 CMP-NeuAc중에서 선택된다. 당 뉴클레오티드의 N-아세틸아민 유도체가 또한 본 발명의 방법에 유용하다.
본 발명은 또한 변형 당, 예를 들어 변형-갈락토오스, -푸코오스, -GalNAc 및 -시알산을 사용하여 변형 펩티드를 합성하는 방법을 제공한다. 변형 시알산이 사용되는 경우, 시알릴트랜스퍼라제 또는 트랜스-시알리다제(α2,3-결합 시알산의 경우에만)가 이들 방법에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 변형 당은 활성당이다. 본 발명에 유용한 활성화 변형 당은 전형적으로 활성화 이탈기를 포함하도록 합성적으로 변경된 글리코시드이다. 본 원에 사용된 용어 "활성화 이탈기"는 효소에 의해 조절되는 친핵성 치환 반응에서 용이하게 치환되는 부분을 말한다. 다수의 활성당이 당업계에 공지되었다. 참조예: Vocadlo et al., In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, Vol, 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34:6419(1993); Lougheed, et al., J. Biol. Chem. 274:37717(1999)).
활성화 그룹(이탈기)의 예에는 플루오로, 클로로, 브로모, 토실레이트 에스테르, 메실레이트 에스테르, 트리플레이트 에스테르 등이 포함된다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 활성화 이탈기는 수용체에 글리코시드의 효소적 전이를 입체적으로 상당히 방해하지 않는 이탈기이다. 따라서, 활성화 글리코시드 유도체의 바람직한 예에는 글리코실 플루오라이드 및 글리코실 메실레이트가 포함되며, 글리코실 플루오라이드가 특히 바람직하다. 글리코실 플루오라이드 중에서, α-갈락토실 플루오라이드, α-만노실 플루오라이드, α-글루코실 플루오라이드, α-푸코실 플루오라이드, α-크실로실 플루오라이드, α-시알릴 플루오라이드, α-N-아세틸글루코사미닐 플루오라이드, α-N-아세틸갈락토사미닐 플루오라이드, β-갈락토실 플루오라이드, β-만노실 플루오라이드, β-글루코실 플루오라이드, β-푸코실 플루오라이드, β-크실로실 플루오라이드, β-시알릴 플루오라이드, β-N-아세틸글루코사미닐 플루오라이드 및 β-N-아세틸갈락토사미닐 플루오라이드가 가장 바람직하다.
구체적으로, 당을 먼저 아세틸화한 다음, HF/피리딘으로 처리하여 유리 당으로부터 글리코실 플루오라이드를 제조할 수 있다. 이는 보호된 (아세틸화) 글리코실 플루오라이드(즉, α-글리코실 플루오라이드)의 열역학적으로 가장 안정한 아노머(anomer)를 생성한다. 덜 안정한 아노머(즉, β-글리코실 플루오라이드)를 필요로 하는 경우, 이는 퍼아세틸화 당을 HBr/HOAc 또는 HCl로 전환시켜 아노머 브로 마이드 또는 클로라이드를 생성하여 제조할 수 있다. 이 중간체를 불화은과 같은 플루오라이드 염과 반응시켜 글리코실 플루오라이드를 생성한다. 아세틸화 글리코실 플루오라이드를 메탄올(예: NaOMe/MeOH)중에서 온화한 (촉매) 염기와 반응시켜 탈보호시킬 수 있다. 또한 다수의 글리코실 플루오라이드는 상업적으로 입수가능하다.
다른 활성화 글리코실 유도체는 당업자들에게 공지된 통상의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 당의 완전 벤질화된 헤미아세탈 형태를 메실 클로라이드로 처리한 다음, 촉매적 수소화하여 벤질 그룹을 제거하여 글리코실 메실레이트를 제조할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형 당은 안테나 구조를 가지는 올리고사카라이드이다. 다른 구체예에서, 안테나 모양의 하나 이상의 말단은 변형 당 부분을 갖는다. 복수개의 변형 당 부분이 안테나 구조를 갖는 올리고사카라이드에 결합되는 경우, 올리고사카라이드는 변형 부분을 "증폭"시키는데 유용하며, 펩티드에 콘쥬게이트된 각 올리고사카라이드는 변형 그룹의 다중 복제물을 펩티드에 결합시킨다. 본 발명의 전형적인 콘쥬게이트의 일반 구조는 상기 도시된 바와 같이, 안테나 구조를 이용하여 본 발명의 콘쥬게이트를 제조함에 따라 발생되는 다가의 종을 포함한다. 많은 안테나 형상의 사카라이드 구조가 공지되었으며, 본 발명의 방법에서는 제한 없이 이들의 구조를 사용하여 실시할 수 있다.
이하, 예시적인 변형 그룹을 설명하기로 한다. 변형 그룹은 펩티드에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예시적인 특성에는 약물동태 촉진, 약력학 촉진, 생체분포 향상, 다가 종 제공, 수용해도 향상, 친유성 촉진 또는 감소 및 조직 표적화가 포함되나, 이들로만 한정되지 않는다.
수용성 중합체
많은 수용성 중합체가 당업자들에 공지되었으며, 본 발명을 실시하는데 유용하다. 용어 수용성 중합체는 사카라이드(예: 덱스트란, 아밀로스, 히알우론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예컨대 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 중합체(예: 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 이를테면 폴리(에틸렌 글리콜)); 펩티드, 단백질 등의 종을 포함한다. 본 발명은 임의의 수용성 중합체를 사용하여 실시할 수 있으나, 단 수용성 중합체는 나머지 복합체에 결합될 수 있는 지점을 포함하여야 한다.
중합체 활성화 방법은 또한 WO 94/17039; US 특허 제 5,324,844호; WO 94/18247; WO 94/04193; US 특허 제 5,219,564호; US 특허 제 5,122,614호; WO 90/13540; US 특허 제 5,281,698호; WO 93/15189에 예시되어 있으며, 활성화 중합체와 펩티드, 예컨대 응집인자 VIII 사이의 콘쥬게이트는 WO 94/15625에, 헤모글로빈은 WO 94/09027에, 산소 보유 분자는 US 특허 제 4,412,989호에, 리보뉴클레아제 및 수퍼옥사이드 디스무타아제는 Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11:141-45(1985)에 예시되어 있다.
바람직한 수용성 중합체는 중합체 샘플내 상당한 비율의 중합체 분자가 거의 동일한 분자량을 가지는 중합체이며; 이러한 중합체는 "균일분산성(homodisperse)" 을 가진다.
본 발명을 폴리(에틸렌 글리콜) 콘쥬게이트에 대하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. PEG의 기능화 및 콘쥬게이트에 대해 문헌 및 논문을 이용할 수 있다. 참조예: Harris, Macronol. Chem. Phys. C25:325-373(1985); Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65(1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Carrier Systems 9:249-304(1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6:150-165(1995); 및 Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29(2002). 반응성 PEG 분자의 제조방법 및 이 반응성 분자를 사용하여 콘쥬게이트를 형성하는 방법이 당업계에 공지되었다. 예를 들어, U.S. 특허 제 5,672,662호는 선형 또는 분지상 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알콜) 및 폴리(아크릴로모르폴린)중에서 선택된 중합체산 활성화 에스테르의 분리가능한 수용성 콘쥬게이트를 기술하고 있다.
U.S. 특허 제 6,376,604호는 중합체의 말단 하이드록실을 유기 용매중에서 디(1-벤조트리아졸릴)카보네이트와 반응시켜 비-펩티드 수용성 중합체의 수용성 1-벤조트리아졸릴카보네이트 에스테르를 제조하는 방법을 개시하였다. 활성화 에스테르는 단백질 또는 펩티드와 같은 생물학적 활성제와 콘쥬게이트를 형성하는데 사용된다.
WO 99/45964에 안정한 결합에 의해 중합체 골격에 결합된 적어도 하나의 말단을 가지는 중합체 골격을 포함하는 활성화 수용성 중합체와 생물학적 활성제를 포함하는 콘쥬게이트가 기재되어 있으며, 여기에서 적어도 하나의 말단은 분지 부 분에 연결된 인접한 반응성 그룹을 가지는 분지 부분을 포함하며, 생물학적 활성제는 적어도 하나의 인접한 반응성 그룹에 연결된다. 다른 분지상 폴리(에틸렌 글리콜)이 WO 96/21469에 기술되어 있으며, U.S. 특허 제 5,932,462호에는 반응성 작용기를 포함하는 분지된 말단을 가지는 분지된 PEG 분자와 함께 형성된 콘쥬게이트가 기술되어 있다. 자유 반응성 그룹을 생물학적 활성종, 예컨대 단백질 또는 펩티드와 반응시켜 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적 활성종 사이에 콘쥬게이트를 형성하는 것이 가능하다. U.S. 특허 제 5,446,090호에 이작용성 PEG 링커 및 각 PEG 링커 말단에 펩티드를 가지는 콘쥬게이트를 형성하기 위한 그의 용도가 기술되었다.
분해가능한 PEG 결합을 포함하는 콘쥬게이트가 WO 99/34833, WO 99/14259 및 U.S. 특허 제 6,348,558호에 기술되었다. 이러한 분해가능한 결합은 본 발명에 이용가능하다.
당업계에 알려진 상술된 중합체 활성화 방법은 상술된 분지된 중합체를 형성하고 이들 분지된 중합체를 다른 종, 예컨대 당, 당 뉴클레오티드 등에 콘쥬게이트시키기 위해 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 하기 식의 것을 포함하나, 이에만 한정되지 않는다:
Figure 112006055848460-PCT00037
상기 식에서,
R8은 H, OH, NH2, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 예컨대 아세탈, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q 또는 -(CH2)Cq(Y)Z1이다. 지수 "e"는 1 내지 2500의 정수를 나타낸다. 지수 b, d 및 q는 독립적으로 0 내지 20의 정수를 나타낸다. 기호 Z 및 Z1은 독립적으로 OH, NH2, 이탈기, 예컨대 이미다졸, p-니트로페닐, HOBT, 테트라졸, 할라이드, S-R9, 활성화 에스테르의 알콜 부분; -(CH2)pC(Y1)V 또는 -(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v를 나타낸다. 기호 Y는 H(2), =O, =S, =N-R10을 나타낸다. 기호 X, Y, Y1, A1 및 U는 독립적으로 부분 O, S, N-R11을 나타낸다. 기호 V는 OH, NH2, 할로겐, S-R12, 활성화 에스테르의 알콜 성분, 활성화 아미드의 아민 성분, 당-뉴클레오티드 및 단백질을 나타낸다. 지수 p, q, s 및 v는 0 내지 20의 정수중에서 독립적으로 선택된 멤버이다. 기호 R9, R10, R11 및 R12는 독립적으로 H, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로아릴을 나타낸다.
다른 예시적인 구체예로, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 하기 그룹중에서 선택 된다:
Figure 112006055848460-PCT00038
본 발명의 콘쥬게이트를 형성하는데 유용한 폴리(에틸렌 글리콜)은 선형 또는 분지 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 분지상 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 하기 구조로 나타내어지는 것을 포함하지만, 이로만 한정되는 것은 아니다:
Figure 112006055848460-PCT00039
상기 식에서,
R8 및 R8'는 상기 R8에 대해 정의된 그룹중에서 독립적으로 선택되는 멤버이다. A1 및 A2는 상기 A1에 대해 정의된 그룹중에서 독립적으로 선택되는 멤버이다. 지수 e, f, o 및 q는 상술된 바와 같다. Z 및 Y는 상술된 바와 같다. X1 및 X1'는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH, NHC(O)O 및 OC(O)NH중에서 독립적으로 선택되는 멤버이다.
다른 예시적인 구체예로, 분지된 PEG는 시스테인, 세린 또는 디-리신 코어를 기본으로 한다. 따라서, 예시적인 분지된 PEG는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00040
또 다른 구체예로, 분지된 PEG 부분은 트리-리신 펩티드를 기본으로 한다. 트리-리신은 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-PEG-일화일 수 있다. 이러한 구체예에 따른 예시적인 종은 다음 구조를 포함한다:
Figure 112006055848460-PCT00041
상기 식에서,
e, f 및 f'는 독립적으로 1 내지 2500의 정수중에서 선택되고;
q, q' 및 q"는 독립적으로 1 내지 20의 정수중에서 선택된다.
본 발명의 예시적인 구체예에서, PEG는 m-PEG(5 kD, 10 kD 또는 20kD)이다. 예시적인 분지된 PEG 종은 세린- 또는 시스테인-(m-PEG)2이며, 여기에서 m-PEG는 20 kD m-PEG이다.
당업자들에 자명한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 분지상 중합체는 상술된 것들의 변형체를 포함한다. 예를 들어, 상술된 디-리신-PEG 콘쥬게이트는 세개의 중합체 서브유니트를 포함할 수 있으며, 여기에서 세번째 것은 상술된 구조식에서 비변형된 것으로 표시된 α-아민에 결합된다. 유사하게, 세개 또는 네개의 중합체 서브유니트로 작용화된 트리-리신의 사용이 본 발명의 범주내에 포함된다.
본 발명에 따른 특정 구체예로 하기 식 및
Figure 112006055848460-PCT00042
이들 종의 활성화 에스테르 및 탄수화물, 예컨대 다음 그룹들이 포함된다:
Figure 112006055848460-PCT00043
본 원에 상술된 화합물을 제조하는데 사용되는 선형 PEG를 활성화시키는데 적절한 다른 활성화 또는 이탈기는 다음과 같은 종들을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다:
Figure 112006055848460-PCT00044
상기 및 다른 종으로 활성화된 PEG 분자, 및 활성화 PEG의 제조방법이 WO 04/083259에 개시되었다.
당업자들은 분지상 중합체의 하나 이상의 m-PEG 팔이 상이한 말단, 예컨대 OH, COOH, NH2, C2-C10-알킬 등을 가지는 PEG 부분으로 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 상기 구조는 α-탄소 원자와 측쇄의 작용기 사이에 알킬 링커를 삽입(또는 탄소 원자를 제거)하여 용이하게 변형시킬 수 있다. 따라서, "호모" 유도체 및 고급 유사체 뿐만 아니라 저급 유사체가 본 발명에 사용되는 분지된 PEG 코어 범주내에 포함된다.
본 원에 기술된 분지된 PEG 종은 다음과 같은 반응식의 방법으로 용이하게 제조된다:
Figure 112006055848460-PCT00045
상기 식에서,
Xa는 O 또는 S이고,
r은 1 내지 5의 정수이다.
지수 e 및 f는 독립적으로1 내지 2500중에서 선택되는 정수이다.
즉, 상기 반응식에 따라, 천연 또는 비천연 아미노산을 활성화 m-PEG 유도체와 접촉시켜, 토실레이트의 경우 측쇄 헤테로원자 Xa를 알킬화하여 1을 형성시킨다. 일작용성 m-PEG 아미노산을 반응성 m-PEG 유도체와 N-아실화 조건에 적용하여 분지된 m-PEG 2를 어셈블링한다. 당업자들이 인식할 수 있는 바와 같이, 토실레이트 이탈기는 임의의 적절한 이탈기, 예컨대 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 치환될 수 있다. 아민을 아실레이트화하기 위해 사용되는 반응성 카보네이트도 마찬가지로 활성화 에스테르, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드 등으로 치환될 수 있거나, 디사이클로헥실카보다이미드, 카보닐디이미다졸 등과 같은 탈수화제를 사용하여 산을 동일계에서 활성화시킬 수 있다.
예시적인 구체예로, 변형 그룹은 PEG 부분이지만, 임의의 변형 그룹, 이를테 면 수용성 중합체, 수불용성 중합체, 치료 부분 등이 적절한 결합을 통해 글리코실 부위에 도입될 수 있다. 효소 수단, 화학 수단 또는 이들의 조합으로 변형 당을 제조하여 변형 당을 형성한다. 예시적인 구체예에서, 당은 변형 부분 부착이 가능하고 변형 당을 G-CSF 펩티드에 커플링시킬 수 있는 효소 기질로 당이 작용하도록 할 수 있는 임의 부분에서 활성화 아민으로 치환된다. 예시적인 구체예로, 갈락토사민이 변형 당인 경우, 아민 부분은 6-위치에서 탄소 원자에 부착된다.
수용성 중합체에 의한 변형 종
당 부분이 수용성 중합체로 변형된 수용성 중합체로 변형된 뉴클레오티드 당 종이 본 발명에 유용한다. 예시적인 변형 당 뉴클레오티드는 당에서 아민 부분을 통해 변형된 당 그룹을 가진다. 변형 당 뉴클레오티드, 예컨대 당 뉴클레오티드의 사카릴-아민 유도체가 또한 본 발명의 방법에 사용된다. 예를 들어, 사카릴 아민(변형 그룹을 가지지 않는)은 펩티드(또는 다른 종)에 효소적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이어서 유리된 사카릴 아민 부분이 목적하는 변형 그룹에 콘쥬게이트될 수 있다. 또한, 변형 당 뉴클레오티드가 변형 당을 예컨대 펩티드, 글리코펩티드, 리피드, 아글리콘, 글리코리피드 등과 같은 기질상의 사카릴 수용체로 전달하는 효소 기질로 작용할 수 있다.
사카라이드 코어가 갈락토스 또는 글루코인 일례에서, R5는 NHC(O)Y이다.
예시적인 구체예로, 변형 당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 부분을 기본으로 한다. N-아세틸갈락토사민에 대해 후술하는 바와 같이, 6-아미노-당 부분은 일반적인 방법으로 용이하게 제조된다:
Figure 112006055848460-PCT00046
상기 반응식에서, 지수 n은 1 내지 2500, 바람직하게는 10 내지 1500 및, 보다 바람직하게는 10 내지 1200의 정수를 나타낸다. 기호 "A"는 활성화 그룹, 예를 들어 할로, 활성화 에스테르 성분(예: N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 카보네이트 성분(예: p-니트로페닐 카보네이트) 등을 나타낸다. 당업자들은 다른 PEG-아미드 뉴클레오티드 당이 상기 및 이와 유사한 방법으로 용이하게 제조될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
다른 예시적인 구체예에서, 아미드 부분은 우레탄 또는 우레아와 같은 그룹으로 대체된다.
다른 예시적인 구체예에서, R1은 분지된 PEG, 예를 들어, 상술된 종중의 하나이다. 이러한 구체예에 따른 화합물로 다음과 같은 화합물들이 포함된다:
Figure 112006055848460-PCT00047
상기 식에서,
X4는 결합 또는 O이고,
J는 S 또는 O이다.
또한, 상술한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 분지상 수용성 중합체로 변형된 뉴클레오티드 당을 사용하여 형성된 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 예를 들어, 하기 화학식의 화합물들이 본 발명의 범주내에 포함된다:
Figure 112006055848460-PCT00048
상기 식에서,
X4는 결합 또는 O이고,
J는 S 또는 O이다.
유사하게, 본 발명은 6-위치의 탄소가 변형된 변형 당 종의 뉴클레오티드 당을 사용하여 형성된 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006055848460-PCT00049
상기 식에서,
X4는 결합 또는 O이고,
J는 S 또는 O이며,
y는 0 또는 1이다.
본 발명의 조성물에 포함되는 펩티드 및 글리코펩티드, 리피드 및 글리코리피드의 콘쥬게이트가 또한 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 하기 화학식의 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006055848460-PCT00050
상기 식에서
J는 S 또는 O이다.
수불용성 중합체
또 다른 구체예에서, 상기 논의된 것과 유사하게, 변형된 당은 수용성 중합체보다는 수불용성 중합체를 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트는 또한 하나 이상의 수불용성 중합체를 포함할 수 있다. 본 구체예에서 콘쥬게이트는 비히클로 사용되어 치료활성 펩티드를 서방성으로 전달하게 된다. 중합체성 약물 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다 (참조: Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991). 당업자는 실질적으로 어떤 공지의 약물 전달 시스템이라도 본 발명의 콘쥬게이트에 적용할 수 있다는 사실을 이해할 것이다.
대표적인 수불용성 중합체는 폴리포스파진, 폴리(비닐알콜), 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실 메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉 및 폴리비닐페놀 및 그의 공중합체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 콘쥬게이트에 사용되는, 합성에 의해 변형된 천연 중합체는 알킬 셀룰로즈, 하이드록시알킬 셀룰로즈, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 에스테르 및 니트로셀룰로즈를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 합성에 의해 변형된 천연 중합체의 광범위한 범주에 속하는 멤버로서 특히 바람직한 것은 메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로즈, 하이드록 시부틸 메틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 셀룰로즈 프로피오네이트, 셀룰로즈 아세테이트 부티레이트, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 카복시메틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 트리아세테이트, 셀룰로즈 설페이트 소듐염 및 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르 및 알긴산의 중합체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 언급된 이들 및 다른 중합체들은 예를 들어 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO.), Polysciences(Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, WI.), Fluka(Ronkonkoma, NY), 및 BioRad(Richmond, CA)와 같은 회사로 부터 상업적으로 용이하게 구입할 수도 있고, 이들 공급업체로부터 구입한 단량체를 사용하여 표준 방법에 따라 합성할 수도 있다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트에 사용되는 대표적인 생분해성 중합체는 폴리락티드, 폴리글리콜리드 및 그의 공중합체, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 혼합물 및 그의 공중합체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어 콜라겐, 플루로닉 등을 포함하는 조성물과 같이 겔을 형성하는 조성물이 특별히 사용된다.
본 발명에서 사용되는 중합체는 적어도 구조의 일부에 생흡수성(bioresorbable) 분자를 갖는 수불용성 물질을 포함하는 '하이브리드'중합체를 포함한다. 이러한 중합체의 예는 생흡수성 영역, 친수성 영역 및 중합체 체인당 다수의 가교성 작용기를 갖는 수불용성 공중합체를 포함하는 것이다.
본 발명의 목적에 비추어, "수불용성 물질"은 물 또는 물-함유 환경에 실질 적으로 불용성인 물질이다. 따라서, 공중합체의 일정 영역 또는 세그먼트가 친수성이거나 수용성일 수는 있지만, 중합체 분자 전체적으로는 실질적으로 물에 용해되지 않는다.
본 발명의 목적에 비추어, 용어 "생흡수성 분자"는 체내에서 정상적인 배설 경로를 통해 대사되거나 분해되고 재흡수되고/되거나 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 이러한 대사물질 또는 분해 산물은 바람직하게는 실질적으로 무독성이다.
공중합체 조성물이 전체적으로 수용성으로 되지 않는 한, 생흡수성 영역은 소수성이거나 친수성일 수 있다. 따라서 생흡수성 영역은 우선적으로 중합체가 전체적으로 수불용성인 상태로 유지되는지의 관점에서 선택된다. 따라서, 상대적인 성질, 즉, 포함된 작용기의 종류, 및 생흡수성 영역의 상대적인 비율, 및 친수성 영역은 유용한 생흡수성 조성물이 수불용성인 상태를 유지하도록 선택된다.
흡수성 중합체는 예를 들어 합성된 폴리(α-하이드록시-카복실산)/폴리(옥시알킬렌) (참조: Cohn et al., U. S. Patent No. 4,826,945)의 흡수성 블록 공중합체를 포함한다. 이들 공중합체는 가교되어 있지 않으며 수용성이어서 분해된 블록 공중합체 조성물로 배설될 수 있다(참조: Younes et al., J Biomed . Mater. Res . 21: 1301-1316(1987); and Cohn et al., J Biomed . Mater . Res . 22: 993-1009(1988)).
바람직한 생흡수성 중합체는 폴리(에스테르), 폴리(하이드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드리드), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카라이드 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 좀더 바람직하게, 생흡수성 중합체는 폴리(하이드록시산) 성분을 포함한다. 폴리(하이드록시산)중에서도 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산 및 공중합체 및 이들의 혼합물이 바람직하다.
생체내 흡수되는("생흡수된") 단편의 형성과 함께, 본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 중합체성 코팅은 또한 배설가능하고/하거나 대사가능한 단편을 형성할 수 있다.
고 차수 공중합체도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Casey et al., U. S. Patent No. 4,438,253, 등록일자 1984. 3. 20)에는 폴리(글리콜산) 및 하이드록실 말단의 폴리(알킬렌 글리콜)의 트랜스에스테르화에 의해 생성된 트리-블록 공중합체가 개시되어 있다. 이러한 조성물은 흡수성 모노필라멘트 봉합사에 사용되는 것으로 개시되어 있다. 이러한 조성물의 유연성은 테트라-p-톨릴 오르토카보네이트와 같은 방향족 오르토카보네이트를 공중합체 구조내에 혼입시킴에 의해 조절된다.
다른 락트산 및/또는 글리콜산계 중합체도 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Spinu, U. S. Patent No. 5,202, 413, 등록일자 1993. 4. 13)에는 락티드 및/또는 글리콜리드를 올리고머 디올 또는 디아민 잔기 상에서 개환 중합반응시킨 후 이작용기 화합물, 예를 들어 디이소시아네이트, 디아실클로라이드 또는 디클로로실란을 사용하여 체인을 연장시켜 생성된, 연속적인 순서로 배열된 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜리드 블록을 갖는 생분해성 다중-블록 공중합체가 개시되어 있다.
본 발명에서 유용한 생흡수성 코팅 영역은 가수분해적으로 및/또는 효소적으로 분해가능하도록 고안될 수 있다. 본 발명의 목적상, "가수분해적으로 분해가능한"은 공중합체, 특히 생흡수성 영역이 물 또는 물-함유 환경에서 가수분해되기 쉬운 것을 의미한다. 유사하게, "효소적으로 분해가능한"은 공중합체, 특히 생흡수성 영역이 내인성 또는 외인성 효소에 의해 분해되기 쉬운 것을 의미한다.
체내에 놓였을 때, 친수성 영역은 배설가능하고/하거나 대사가능한 단편으로 가공될 수 있다. 따라서 친수성 영역은 예를 들어 폴리에테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐 피롤리딘), 폴리(비닐 알콜), 폴리(알킬 옥사졸린), 폴리사카라이드, 탄수화물, 펩티드, 단백질 및 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 친수성 영역은 예를 들어 폴리(알킬렌)옥사이드일 수도 있다. 이러한 폴리(알킬렌)옥사이드의 예로는 폴리(에틸렌)옥사이드, 폴리(프로필렌)옥사이드 및 이들의 혼합물 및 공중합체를 들 수 있다.
하이드로겔의 성분인 중합체도 본 발명에서 유용하게 사용된다. 하이드로겔은 상대적으로 많은 양의 물을 흡수할 수 있는 중합체성 물질을 의미한다. 하이드로겔을 형성하는 화합물의 예로는 폴리아크릴산, 소듐 카복시메틸셀룰로즈, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리딘, 젤라틴, 카라기난 및 다른 폴리사카라이드, 하이드록시에틸렌메타크릴산(HEMA), 및 이들의 유도체 등을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 안정하고 생분해성이며 생흡수성인 하이드로겔이 얻어질 수 있다. 또한, 하이드로겔 조성물은 이들 성질의 하나 이상을 나타내는 서브유닛을 포함할 수 있다.
구조가 가교를 통해 조절될 수 있는 생적합성 하이드로겔 조성물이 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다. 예를 들어, 문헌(Hubbell et al., U. S. Patent Nos. 5,410,016, 등록일자 1995. 4. 25. 및 5,529,914, 등록일자 1996. 6. 25)에는 수용성 시스템이 개시되어 있는데, 이는 2개의 가수분해되기 쉬운 익스텐션 사이에 샌드위치된 수용성 센트럴 블록 세그먼트를 갖는 가교된 블록 공중합체이다. 이러한 공중합체의 말단에는 또한 광중합될 수 있는 아크릴레이트 작용기가 결합할 수 있다. 가교되었을 때, 이들 시스템은 하이드로겔이 된다. 이러한 공중합체의 수용성 센트럴 블록은 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있는 반면, 가수분해되기 쉬운 익스텐션은 폴리글리콜산 또는 폴리락트산과 같은 폴리(α-하이드록시산)일 수 있다(참조: Sawlney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993)).
또 다른 구체예에서, 겔은 열가역성 겔이다. 열가역성 겔을 포함하는 성분, 예를 들어, 플루로닉, 콜라겐, 젤라틴, 히알우론산, 폴리사카라이드, 폴리우레탄 하이드로겔, 폴리우레탄-우레아 하이드로겔 및 이들의 배합물이 바람직하다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 리포솜 성분을 포함한다. 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌(Eppstein et al., U. S. Patent No. 4,522,811, 등록일자 1985. 6. 11)에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 제제는 적당한 리피드(들) (예를 들어, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 무기 용매에 녹이고, 증발시켜, 용기 표면상에 건조된 리피드의 얇 은 필름을 형성함에 의해 제조될 수 있다. 그 후, 활성 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 수용액을 용기에 가한다. 용기를 손으로 소용돌이 모양으로 돌려서 용기 면으로부터 리피드 물질이 떨어져나오게 하여 리피드 응집물이 분산되도록 함으로써 리포솜 현탁액을 형성한다.
상기 언급된 마이크로입자 및 마이크로입자의 제조방법은 예시일 뿐이며, 본 발명에서 사용되는 마이크로입자의 범위를 제한하고자 한 것이 아니다. 당업자에게는 상이한 방법으로 제조된 많은 마이크로입자를 본 발명에서 사용할 수 있다는 것이 명백할 것이다.
수용성 중합체와 관련하여 상기 논의된 구조적 포맷, 즉, 직쇄 및 측쇄는 둘다 수불용성 중합체와 관련해서도 일반적으로 적용가능하다. 따라서, 예를 들어, 시스테인, 세린, 디리신, 및 트리리신 측쇄 코어는 2개의 수불용성 중합체 그룹으로 작용기화될 수 있다. 이들을 제조하는데 사용되는 방법은 수용성 중합체를 제조하는데 사용된 것과 일반적으로 매우 유사하다.
치료활성 글리코펩티드의 생체내 반감기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 PEG 그룹에 의해 증가될 수도 있다. 예를 들어, PEG를 사용하여 단백질을 화학적으로 변형시키면(PEG화; PEGylation) 분자 크기가 증가하고 표면- 및 작용그룹-접근성이 감소하는데, 이들 둘다 단백질에 부착된 PEG의 크기에 좌우된다. 그 결과, 플라스마 반감기 및 단백질 분해 안정성이 개선되고, 면역원성 및 간흡수를 감소시킨다(참조: Chaffee et al. J Clin . Invest . 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al. Res. Commun . Chem . Pathol Pharmacol . 29: 113-127 (1980)). 인터루킨-2의 PEG화 는 그의 생체내 항종양 능력을 증가시키는 것으로 보고되어 있으며(참조: Katre et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 84:1487-1491 (1987)), 모노클로날 항체 A7 유래의 F(ab')2의 PEG화가 그의 종양 국소화를 개선시켰다(참조: Kitamura et al . Biochem . Biophys . Res . Commun. 28: 1387-1394 (1990)). 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 PEG 그룹으로 유도체화된 펩티드의 생체내 반감기는 유도체화되지 않은 펩티드의 생체내 반감기에 비해 증가된다.
펩티드 생체내 반감기 증가는 퍼센트 증가 범위로서 가장 잘 표현된다. 퍼센트 증가 범위의 하한은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150%, 또는 약 200%이다. 범위의 상한은 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150%이거나, 약 250%보다 크다.
생체분자
또 다른 구체예에서, 변형된 당은 생체분자를 포함한다. 추가의 구체예에서, 생체분자는 기능성 단백질, 효소, 항원, 항체, 펩티드, 핵산(예를 들어, 단분자 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 단일- 및 고-가닥 핵산), 렉틴, 수용체 또는 이들의 배합물이다.
바람직한 생체분자는 본질적으로 비형광이거나 최소량의 형광을 방출하므로 에세이에서 형광 마커로 사용하기에 부적합하다. 또한, 일반적으로 당이 아닌 생체분자를 사용하는 것이 바람직하다. 예외적으로, 다른 것(예를 들어, PEG, 생체분자, 치료활성 물질, 진단 물질 등)이 공유적으로 결합되어 변형된 천연 발생 당을 사용하는 것은 바람직하다. 예시적인 구체예에서, 생체분자인 당 부분은 링커의 팔에 콘쥬게이트되고, 당-링커 팔 카세트는 본 발명의 방법에 따라 펩티드와 콘쥬게이트된다.
본 발명에서 사용하기에 유용한 생체분자는 어떤 공급원 유래의 것이라도 사용할 수 있다. 생체분자는 천연 공급원으로부터 분리할 수도 있고 합성방법으로 생산할 수도 있다. 펩티드는 천연 펩티드이거나 변이된 펩티드일 수 있다. 화학적 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이 또는 당업자에게 공지된, 돌연변이를 유도하는 다른 수단에 의해 돌연변이를 일으킬 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 펩티드는 예를 들어 효소, 항원, 항체 및 수용체이다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있고; 전체 또는 단편일 수 있다. 펩티드는 지시된 진화 프로그램의 임의적인 산물이다.
천연 유래의 펩티드, 합성 펩티드 및 핵산을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다. 이들 분자는 이용가능한 모든 반응성 그룹에 의해 당 잔기 성분이나 가교제에 결합할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 반응성 아민, 카복실, 설프하이드릴, 또는 하이드록실 그룹을 통해 결합할 수 있다. 반응성 그룹은 펩티드 말단 또는 펩티드 체인의 내부 부위에 존재할 수 있다. 핵산은 반응성 그룹을 통해 염기(예를 들어, 엑소사이클릭 아민) 또는 이용가능한 하이드록실 그룹을 통해 당 분자(예를 들어, 3'- 또는 5'-하이드록실)에 결합할 수 있다. 펩티드 및 핵산 체인은 하나 이상의 부위에서 추가로 유도체화되어 체인 상에 적합한 반응성 그룹이 결합하게 할 수 있다(참조: Chrisey et al . Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996)).
추가의 구체예에서, 생체분자는 본 발명의 방법에 의해 변형된 펩티드를 특정 조직으로 유도함으로써 비유도체화된 펩티드가 조직으로 전달되는 양에 비해 조직으로의 펩티드 전달을 증가시킬 수 있도록 선택된다. 또 다른 구체예에서, 선택된 시간 범위 내에 특정 조직으로 전달된 유도체화된 펩티드의 양은 유도체화에 의해 적어도 약 20%, 좀더 바람직하게는 적어도 약 40%, 좀더 바람직하게는 적어도 약 100% 증가된다. 표적화된 적용을 위한 바람직한 생체분자는 세포-표면 수용체에 대한 항체, 호르몬 및 리간드를 포함한다.
추가의 예시적인 구체예에서, 바이오틴과의 콘쥬게이트가 제공된다. 따라서, 예를 들어, 하나 이상의 변형 그룹을 포함하는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 결합시킴으로써 선택적으로 바이오틴화된 펩티드를 만들 수 있다.
치료 부분(Therapeutic moieties)
다른 구체예에서, 변형된 당은 치료 부분을 포함한다. 당업자는 치료 부분과 생체분자 사이에 중첩되는 것이 있음을 이해할 것이다. 많은 생체분자는 치료 활성 또는 잠재적 활성을 가지고 있다.
치료 부분은 임상적으로 이미 사용되고 있는 제제일 수 있고, 그 용도가 실험 단계에 있는 약물일 수도 있으며, 그 활성 또는 작용 메카니즘이 연구 단계에 있는 것일 수도 있다. 치료 부분은 특정 질환에 대해 입증된 작용을 가지고 있을 수도 있고 바람직한 작용을 보이리라고 추정되는 것에 불과할 수도 있다. 다른 구체예에서, 치료 부분은 특정 조직과 상호작용하는 능력에 따라 선별된 화합물이다. 본 발명을 실시하는데 유용한 치료 부분은 다양한 약리적 활성을 갖는 광범위한 약물 클래스로부터의 약물을 포함한다. 바람직한 치료 부분은 본질적으로 비형광이거나 최소량의 형광을 방출하여 에세이에서 형광 마커로 사용하기에 부적합한 것이다. 또한, 일반적으로, 당이 아닌 치료 부분을 사용하는 것이 바람직하다. 예외적으로, PEG, 생체분자, 치료 부분, 진단 부분 등과 같은 또 다른 부분이 공유적으로 결합하여 변형된 당을 사용하는 것이 바람직하다. 다른 예시적인 구체예에서, 치료적 당 부분은 링커의 팔에 콘쥬게이트되고, 당-링커 팔 카세트는 본 발명의 방법에 따라 펩티드와 콘쥬게이트된다.
다양한 종류의 물질에 치료제 및 진단제를 콘쥬게이트시키는 방법이 당업계에 주지되어 있다(참조: Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991).
예시적 구체예에서, 치료 부분은 선택된 조건하에 분해되는 링커를 통하여 변형된 당과 결합한다. 예시적 조건으로는 선택된 pH(즉, 위, 장, 세포내이입 액포), 활성 효소의 존재(즉, 에스테라제, 리덕타제, 옥시다제), 빛, 열 등을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 많은 분해성 그룹이 당업계에 공지되어 있다(참조: Jung et al ., Biochem . Biophys . Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol . Chem ., 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al ., J. Immunol ., 124: 913-920 (1980); Bouizar et al ., Eur . J. Biochem., 155: 141- 147 (1986); Park et al ., J. Biol . Chem ., 261: 205-210 (1986); Browning et al ., J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989)).
유용한 치료 부분의 클래스는 예를 들어 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)를 포함한다. NSAIDS는 예를 들어 하기 카테고리로부터 선택될 수 있다: (예를 들어, 프로피온산 유도체, 아세트산 유도체, 페남산 유도체, 비페닐카복실산 유도체 및 옥시캄); 하이드로코티손 등을 포함하는 스테로이드성 항염증제; 항히스타민제(예를 들어, 클로르페니르아민, 트리프롤리딘); 진해제(예를 들어, 덱스트로메토르판, 코데인, 카라미펜 및 카르베타펜탄); 항소양제(예를 들어, 메트딜라진 및 트리메프라진); 항콜린작용제(예를 들어, 스코폴라민, 아트로핀, 호마트로핀, 레보도파); 진토제 및 항구토제(예를 들어, 사이클리진, 메클리진, 클로르프로마진, 부클리진); 식욕억제제(예를 들어, 벤즈페타민, 펜테르민, 클로르펜테르민, 펜플루라민); 중추자극제(예를 들어, 암페타민, 메탐페타민, 덱스트로암페타민 및 메틸페니데이트); 항부정맥제(예를 들어, 프로파놀놀, 프로카인아미드, 디소피라미드, 퀴니딘, 엔카이니드); β-아드레날린 차단제(예를 들어, 메토프롤롤, 아세부톨롤, 베탁솔롤, 라베탈롤 및 티몰롤); 강심제(예를 들어, 밀리논, 암리논 및 도부타민); 혈압강하제(에를 들어, 에날라프릴, 클로니딘, 하이드랄라진, 미녹시딜, 구아나드렐, 구아네티딘), 이뇨제(예를 들어, 아밀로리드 및 하이드로클로로티아지드); 혈관확장제(에를 들어, 딜티아젬, 아미오다론, 이속수프린, 닐리드린, 톨라졸린 및 베라파밀); 혈관수축제(에를 들어, 디하이드로에르고타민, 에르고타민 및 메틸세르지드); 항궤양제(예를 들어, 라니티딘 및 시메티딘); 마취제(예를 들어, 리도카인, 부피바카인, 클로로프로카인, 디부카인); 항우울제(예를 들어, 이미프라민, 데시프라민, 아미트립틸린, 노르트립틸린); 신경안정제 및 진정제(예를 들어, 클로로디아제폭시드, 베나사이티진, 벤즈퀴나미드, 플루라제팜, 하이드록시진, 록사핀 및 프로마진); 항정신병제(예를 들어, 클로르프로틱센, 플루페나진, 할로페리돌, 몰린돈, 티오리다진 및 트리플루오페라진); 항미생물제(항박테리아제, 항진균제, 항원생동물제 및 항바이러스제).
본 발명의 조성물에 혼입시키기에 바람직한 항미생물제는, 예를 들어, β-락탐제, 퀴놀론제, 시프로플록사신, 노르플록사신, 테트라사이클린, 에리스로마이신, 아미카신, 트리클로산, 독시사이클린, 카프레오마이신, 클로르헥시딘, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 클린다마이신, 에탐부톨, 헥사미딘 이소티오네이트, 메트로니다졸, 펜타미딘, 젠타마이신, 카나마이신, 리네오마이신, 메타사이클린, 메텐아민, 미노사이클린, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 미코나졸 및 아만타딘의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명을 실시하는데 사용되는 다른 약물로는 항신생물제(예를 들어, 항안드로겐(예를 들어, 루이프로리드 또는 플루타미드), 세포파괴제(예를 들어, 아드리아마이신, 독소루비신, 탁솔, 사이클로포스파미드, 부설판, 시스플라틴, β-2-인터페론), 항에스트로겐제(예를 들어, 타목시펜), 항대사제(예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 티오구아닌)를 들 수 있다. 이 클래스에 포함되는 것으로는 또한 진단 및 치료를 위한 방사능동위원소계 약제, 콘쥬게이트된 톡신, 예를 들어 리신, 겔다나마이신, 미탄신, CC-1065, 두오카르마이신, 클리케아마 이신 및 관련 구조물질 및 그의 유사체를 들 수 있다.
치료 부분은 또한 호르몬(예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라디올, 루이프롤리드, 메게스트롤, 옥트레오티드 또는 소마토스타틴); 근육 이완제(예를 들어, 신나메드린, 사이클로벤자프린, 플라복세이트, 오르페나드린, 파파베린, 메베베린, 이다베린, 리토드린, 디페녹실레이트, 단트롤렌 및 아주몰렌); 진경제; 골활성화제(예를 들어, 디포스포네이트 및 포스포노알킬포스피네이트 약물 화합물); 내분비 조절제(예를 들어, 콘트라셉티브(예를 들어, 에티노디올, 에티닐 에스트라디올, 노르에틴드론, 메스트라놀, 데소게스트렐, 메드록시프로게스테론), 당뇨조절제(예를 들어, 글리부리드 또는 클로르프로파미드), 동화제, 예를 들어 테스토락톤 또는 스타노졸롤, 안드로겐(예를 들어, 메틸테스토스테론, 테스토스테론 또는 플루옥시메스테론), 항이뇨제(예를 들어, 데스모프레신) 및 칼시토닌)일 수 있다.
본 발명에서는 또한 에스트로겐(에를 들어, 디에틸스틸베스테롤), 글루코코르티코이드(예를 들어, 트리암시놀론, 베타메타손 등) 및 프로게스토겐, 예를 들어 노르에틴드론, 에티노디올, 노르에틴드론, 레보노르게스트렐; 갑상선제(에를 들어, 리오티로닌 또는 레보티록신) 또는 항갑상선제(예를 들어, 메티마졸); 항과프로락틴제(antihyperprolactinemic drugs)(예를 들어, 카베르골린); 호르몬 억제제(예를 들어, 다나졸 또는 고세렐린), 자궁수축제(예를 들어, 메틸에르고노빈 또는 옥시토신) 및 프로스타글란딘, 예를 들어 미오프로스톨, 알프로스타딜 또는 디노프로스톤을 사용할 수 있다.
유용한 변형화 그룹으로는 면역조절제(예를 들어, 항히스타민, 비만세 포(mast cell) 안정화제, 예를 들어 로독사미드 및/또는 크로몰린, 스테로이드(예를 들어, 트리암시놀론, 베클로메타존, 코르티손, 덱사메타손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 베클로메타손 또는 클로베타솔), 히스타민 H2 길항제(예를 들어, 파모티딘, 시메티딘, 라니티딘), 면역억제제(예를 들어, 아자티오프린, 사이클로스포린) 등을 들 수 있다. 항염증 활성을 지닌 그룹, 예를 들어 술린닥, 에토돌락, 케토프로펜 및 케토롤락이 또한 사용된다. 본 발명과 관련하여 사용되는 다른 약물은 당업자에게 자명할 것이다.
변형된 당의 제조
일반적으로, 당 부분 및 변형화 그룹은 반응성 그룹을 사용하여 함께 연결되며, 이는 통상 연결 프로세스에 의해 새로운 유기 작용 그룹 또는 비반응성 물질로 변환된다. 당 반응성 작용 그룹(들)은 당 부분상의 어떤 위치에라도 존재한다. 본 발명을 실시하기에 유용한 반응성 그룹 및 반응 클래스는 일반적으로 바이오콘쥬게이트 화학 기술분야에 주지된 것이다. 반응성 당 부분에 이용하기에 바람직한 반응 클래스는 상대적으로 온화한 조건하에서 진행되는 것이다. 이들 반응의 예로는 친핵성 치환(예를 들어, 아민 및 알콜의 아실 할라이드, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에의 부가반응(예를 들어, 마이클 반응, 디엘스-알더 부가반응)을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 및 기타 유용한 반응이, 예를 들어, 문헌(참조: March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D. C., 1982)에 언급되어 있다.
당 핵 또는 변형화 그룹에 매달리는 유용한 반응성 작용 그룹으로는 다음의 것을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다:
(a) N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 카복실 그룹 및 그의 다양한 유도체;
(b) 예를 들어 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환될 수 있는 하이드록실 그룹;
(c) 할라이드가 추후 친핵성 그룹, 예를 들어, 아민, 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카바니온 또는 알콕시드 이온으로 바뀌어짐으로써 할로겐 원자의 작용 그룹에 새로운 그룹이 공유적으로 결합될 수 있는 할로알킬 그룹;
(d) 말레이미도 그룹과 같이 디엘스-알더(Diels-Alder) 반응에 참여할 수 있는 디에노필 그룹;
(e) 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심과 같은 카보닐 유도체의 형성을 통해, 또는 그리나드 부가 또는 알킬리튬 부가와 같은 메카니즘을 통해 후속의 유도체화가 가능한 알데히드 또는 케톤 그룹;
(f) 추후에 아민과 반응함으로써, 예를 들어, 설폰아미드를 형성하는 설포닐 할라이드 그룹;
(g) 예를 들어, 디설파이드로 전환되거나 아실 할라이드와 반응할 수 있는 티올 그룹;
(h) 예를 들어, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴 그룹;
(i) 예를 들어, 폐환부가, 아실화, 마이클 부가 등을 진행할 수 있는 알켄; 및
(j) 예를 들어, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드.
반응성 작용 그룹으로는 반응성 당 핵 또는 변형화 그룹을 조립하기에 필요한 반응에 참여하지 않거나 간섭하지 않는 것을 선택한다. 또는, 반응성 작용 그룹에 보호기를 도입시켜 반응에 참여하지 못하도록 할 수도 있다. 당업자는 특정 작용 그룹을 어떻게 보호하여 특정 반응 조건에서 간섭을 일으키지 않도록 할 것인가를 알고 있다. 유용한 보호기의 예는 문헌(Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991)을 참조할 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시하는데 유용한 변형된 당의 특정 예를 다수 개시할 것이다. 예시적인 구체예에서, 시알산 유도체가 변형화 그룹이 결합되는 당 핵으로서 이용된다. 시알산 유도체를 중심으로 설명하는 것은 설명의 명확성을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 그렇게 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 시알산을 예로 들어 설명한 것과 유사한 방법으로 다양한 다른 당 부분이 활성화되고 유도체화될 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 몇 가지 당 기질들을 예를 들어 거론하면, 갈락토즈, 글루코즈, N-아세틸갈락토사민 및 푸코즈 등을 변형시키는데 수많은 방법이 사용될 수 있으며, 이들은 당업계에 공지된 방법에 의해 쉽게 변형된다(참조: Elhalabi et al ., Curr . Med . Chem . 6: 93 (1999); and Schafer et al ., J. Org . Chem . 65: 24 (2000)).
예시적 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 변형된 펩티드는 원핵세포(예를 들어 대장균), 효모 및 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포)를 포함하는 진핵세포, 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 글리코펩티드이며, 따라서 불완전하게 시알화된 N- 및/또는 O-결합된 올리코사카라이드쇄를 포함한다. 시알산을 포함하지 않고 말단 갈락토즈 잔기를 포함하는 글리코펩티드의 올리고사카라이드쇄는 글리코-PEG-화되거나, 글리코-PPG-화되거나, 기타 변형된 시알산에 의해 변형될 수 있다.
반응식 4에서, 아미노 글리코시드 1을 보호된 아미노산(예를 들어, 글리신) 유도체의 활성 에스테르로 처리하여 당 아민 잔기를 상응하는 보호된 아미노산 아미드 어덕트로 전환시킨다. 어덕트를 알돌라제로 처리하여 α-하이드록시카복실레이트 2를 형성한다. 화합물 2를 CMP-SA 합성효소의 작용에 의해 상응하는 CMP 유도체로 전환시킨 후 CMP 유도체의 촉매적 수소화에 의해 화합물 3을 제조한다. 글리신 어덕트의 형성을 통해 도입된 아민을 PEG 또는 PPG 결합 부위로서 사용하여 화합물 3을 활성화된 (m-) PEG 또는 (m-) PPG 유도체(예를 들어, PEG-C(O)NHS, PPG-C(O)NHS)와 반응시킴으로써 각각 화합물 4 또는 5를 제조한다.
Figure 112006055848460-PCT00051
표 2는 PEG 또는 PPG 부분을 사용하여 유도체화된 당 모노포스페이트의 대표적인 예를 나타낸다. 표 2의 일부 화합물은 반응식 4의 방법에 의해 제조된 것이다. 다른 유도체들은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조되었다(참조: Keppler et al ., Glycobiology 11:11R (2001); and Charter et al ., Glycobiology 10: 1049 (2000)). 기타 아민 반응성 PEG 및 PPG 유사체들은 상업적으로 구입가능하거나 당업자가 쉽게 접근할 수 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112006055848460-PCT00052
본 발명을 실시하는데 사용되는 변형된 당 포스페이트는 상기 언급된 것 뿐 아니라 다른 위치에서도 치환될 수 있다. 시알산의 바람직한 치환은 일반식 I에 설명되어 있다:
Figure 112006055848460-PCT00053
상기식에서 X 는 링커 그룹으로서 바람직하게는 -O-, -N(H)-, -S, CH2-, 및 -N(R)2 로부터 선택되며, 여기에서 각각의 R은 R1-R5로부터 독립적으로 선택된 멤버이다. 기호 Y, Z, A 및 B는 각각 상기 X에 대해 설명된 그룹으로부터 선택된 그룹을 나타낸다. X, Y, Z, A 및 B는 각각 독립적으로 선택되며, 따라서 동일하거나 상이할 수 있다. 기호 R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 수용성 중합체, 치료 부분, 생체분자 또는 기타 부분을 나타낸다. 또는, 이들 기호는 수용성 중합체, 치료 부분, 생체분자 또는 기타 부분에 결합된 링커를 나타낸다.
본 명세서에 개시된 콘쥬게이트에 결합된 예시적인 부분은 PEG 유도체(예를 들어, 알킬-PEG, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG 카바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG 유도체(예를 들어, 알킬-PPG, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG 카바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료 부분, 진단 부분, 만노즈-6-포스페이트, 헤파린, 헤파란, SLex, 만노즈, 만노즈-6-포스페이트, 시알릴 루이스 X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 더마탄, 알부민, 인테그린, 촉각의(antennary) 올리고사카라이드, 펩티드 등을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 사카라이드 부분에 다양한 변형 그룹을 콘쥬게이트시키는 방법은 당업자가 쉽게 입수할 수 있다(참조: POLY ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY :BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY (ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991).
가교 그룹
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 변형된 당의 제조는 당 잔기에 변형 그룹을 결합시키고 글리코실트랜스퍼라제의 기질인 안정한 어덕트를 형성함으로써 이루어진다. 당 및 변형 그룹은 0차수 또는 좀더 높은 차수의 가교제를 사용하여 커플링될 수 있다. 변형 그룹을 탄수화물 부분에 결합시키기 위해 사용할 수 있는 이작용성 화합물의 예로는 이작용성 폴리(에틸렌글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에스테르 등을 언급할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 탄수화물을 다른 분자에 결합시키기 위한 일반적인 방법은 문헌에 공지되어 있다(참조: Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et al ., Anal . Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al ., J. Am . Chem . Soc. 112: 8886 (1990) and Bednarski et al., WO 92/18135). 하기 논의에서, 반응성 그룹은 미완성의(nascent) 변형 당의 당 부분에 대해 비공격적(benign)인 것으로 간주한다. 논의의 초점은 설명의 명확성에 맞추어진다. 당업자는 이 논의가 변형 그룹상의 반응성 그룹에 대해서도 타당한 것임을 이해할 것이다.
예시적인 전략은 헤테로이작용성 가교제 SPDP (n-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용하여 당(suger) 상에 보호된 설프하이드릴을 도입한 다음 설프하이드릴을 탈보호기화하여 변형 그룹상의 다른 설프하이드릴과 디설파이드 결합을 형성하게 하는 것이다.
만약 SPDP가 변형된 당이 글리코실트랜스퍼라제 기질로 작용하는 능력에 유해한 영향을 미친다면, 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)와 같은 다른 가교제 중의 하나를 사용하여 디설파이드 결합을 형성한다. 2-이미노티올란은 일차 아민과 반응하여, 보호되지 않은 설프하이드릴을 아민-함유 분자 상에 순간적으로 도입시킨다. SATA도 또한 일차 아민과 반응하지만 보호된 설프하이드릴을 도입시키므로 추후 하이드록실아민을 사용하여 탈아세틸화하여 유리된 설프하이드릴을 제조한다. 각 경우에, 도입된 설프하이드릴은 자유로운 상태에서 다른 설프하이드릴 또는 SPDP와 같은 보호된 설프하이드릴과 반응하여 요구되는 디설파이드 결합을 형성한다.
상기 기술된 전략은 예시적인 것이며 본 발명에서 사용되는 링커를 제한하지 않는다. 변형 그룹을 펩티드에 가교시키기 위한 다른 전략에서 사용될 수 있는 다른 가교제들도 사용가능하다. 예를 들어, TPCH(S-(2-티오피리딜)-L-시스테인 하이드라지드 및 TPMPH((S-(2-티오피리딜)머캅토-프로피오노하이드라지드)는 온화한 과요오드산염 처리에 의해 미리 산화된 탄수화물 부분과 반응하여 가교제의 하이드라지드 부위와 과요오드산염에 의해 생성된 알데히드 사이에 하이드라존 결합을 형성한다. TPCH 및 TPMPH는 당(suger) 상에 2-피리딜티온 보호된 설프하이드릴 그룹을 도입시키며, 이는 DTT에 의해 탈보호화되어 성분들 사이에 디설파이드 결합을 형성하는 것과 같은 콘쥬게이션에 사용될 수 있다.
만약 안정한 변형된 당의 제조에 디설파이드 결합이 적합하지 않은 것으로 판단된다면, 성분들 사이에 좀더 안정한 결합을 도입시키는 다른 가교제가 사용될 수 있다. 헤테로이작용성 가교제 GMBS(N-감마-말리미도부티릴옥시)숙신이미드) 및 SMCC(숙신이미딜 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산)는 일차 아민과 반응하여 성분 상에 말레이미드 그룹을 도입시킨다. 말레이미드 그룹은 앞에서 언급한 가교제에 의해 도입될 수 있는 다른 성분 상의 설프하이드릴과 반응하여 성분들 사이에 안정한 티오에테르 결합을 형성할 수 있다. 만약 성분들 사이의 입체 장애(steric hindrance)가 성분의 활성 또는 변형된 당이 글리코실트랜스퍼라제 기질로 작용하는 능력을 방해하게 된다면, 성분들 사이에 긴 간격 팔(long spacer arm)을 제공하며, 앞에서 언급한 가교제들(즉, SPDP)의 일부의 유도체를 포함하는 가교제를 사용할 수 있다. 따라서, 다수의 적합한 가교제를 이용할 수 있으며, 이들 각각은 최적의 펩티드 콘쥬게이트 및 변형된 당을 제조하는데 대해 이들이 갖는 효과에 따라 선택된다.
변형된 당의 성분을 분자내 화학적 가교를 사용하여 변형하기 위하여 다양한 시약들이 사용된다(가교제 및 가교방법에 대해서는 다음을 참조할 수 있다: Wold, F., Meth . Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp.395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth . Enzymol. 91: 580-609,1983; Mattson et al ., Mol. Biol . Rep. 17: 167-183,1993, 이들 모두 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다). 바람직한 가교제는 다양한 제로-길이(zero-length), 호모-이작용성 및 헤테로-이작용성 가교제로부터 유래된 것이다. 제로-길이 가교제는 외부로부터의 물질의 도입 없이 2개의 내재적인 화학 그룹의 직접적인 콘쥬게이션을 포함한다. 디설파이드 결합의 형성을 촉매하는 물질이 이 범주에 속한다. 또 다른 예는 카복실 및 일차 아미노 그룹을 축합시켜 아미드 결합을 형성하는, 카보디이미드, 에틸클로로포르메이트, 우드워즈 시약 K(Woodward's reagent K; 2-에틸-5-페닐이속사졸리움-3'-설포네이트), 및 카보닐 디이미다졸과 같은 시약이다. 이러한 화학물질과 함께, 효소 트랜스글루타미나제(글루타밀-펩티드 γ-글루타밀트랜스퍼라제; EC 2.3.2.13)가 제로-길이 가교제로 사용될 수 있다. 이 효소는 보통 기질로서 일차 아미노 그룹을 사용하여 단백질-결합된 글루타미닐 잔기의 카복사미드 그룹에서 아실 전이 반응을 촉매한다. 바람직한 호모- 및 헤테로-이작용성 시약은 각각 2개의 동일한, 또는 2개의 상이한 부위를 포함하며, 이는 아미노, 설프하이드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이적 그룹에 대해 반응성일 수 있다.
i. 가교제에서 바람직한 특이적 부위
1. 아미노-반응성 그룹
한 구체예에서, 가교제 상의 부위는 아미노-반응성 그룹이다. 유용하며 제한되지 않는 아미노-반응성 그룹의 예는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 아실할라이드, 아릴아지드, p-니트로페닐 에스테르, 알데히드 및 설포닐 클로라이드를 포함한다.
NHS 에스테르는 변형된 당 성분의 일차(방향족 포함) 아미노 그룹과 우선적으로 반응한다. 히스티딘의 이미다졸 그룹이 일차 아민과 반응에서 경합하는 것으로 알려져 있지만, 반응 생성물은 불안정하며 쉽게 가수분해된다. 아민이 NHS 에스테르의 산카복실에 친핵성 공격을 하여 아미드를 형성하면서 N-하이드록시숙신이미드를 방출시킴으로써 반응이 이루어진다. 따라서 원래 아미노 그룹의 양성 전하가 소실된다.
이미도에스테르는 변형된 당 성분의 아민 그룹과 반응함에 있어 가장 특이적인 아실화제이다. 7 내지 10의 pH에서 이미도에스테르는 일차 아민하고만 반응한다. 일차 아민은 친핵적으로 이미데이트를 공격하여 중간체를 형성하고, 이 중간체는 높은 pH에서 아미딘으로 분해되거나 낮은 pH에서 새로운 이미데이트로 분해된다. 새로운 이미데이트는 또 다른 일차 아민과 반응하여 2개의 아미노 그룹을 가교시킬 수 있으며, 이는 이작용적으로 반응하나 추정적으로 일작용성인 이미데이트의 한 경우이다. 일차 아민과의 반응의 주된 생성물은 원래의 아민보다 더 강한 염기인 아미딘이다. 따라서 원래 아미노 그룹의 양성 전하는 보존된다.
이소시아네이트(및 이소티오시아네이트)는 변형된 당 성분의 일차 아민과 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 이들의 설프하이드릴, 이미다졸 및 타이로실 그룹과의 반응은 상대적으로 불안정한 생성물을 만들어낸다.
아실아지드 역시 아미노-특이적 시약으로 사용되며, 여기에서 친화성 성분의 친핵성 아민은 약한 알칼리 조건, 예를 들어 pH 8.5에서 산성 카복실 그룹을 공격한다.
1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 아릴할라이드는 변형된 당 성분의 아미노 그룹 및 타이로신 페놀릭 그룹과 우선적으로 반응하지만, 또한 설프하이드릴 및 이미다졸 그룹과도 반응한다.
모노- 및 디카복실산의 p-니트로페닐 에스테르도 유용한 아미노-반응성 그룹이다. 비록 시약 특이성은 매우 높지 않지만, α- 및 ε-아미노 그룹은 가장 신속하게 반응하는 것으로 보인다.
글루타르알데히드와 같은 알데히드는 변형된 당의 일차 아민과 반응한다. 비록 아미노 그룹이 알데히드의 알데히드와 반응하면 불안정한 쉬프(Schiff) 염기가 형성되지만, 글루타르알데히드는 안정한 가교를 사용하여 변형된 당을 변형할 수 있다. 통상의 가교 조건인 pH 6-8에서 사이클릭 중합체는 탈수되어 α-β 불포화된 알데히드 중합체를 형성한다. 그러나, 쉬프 염기는 다른 이중 결합과 콘쥬게이트되는 경우 안정하다. 2개의 이중 결합의 공명 상호작용은 쉬프 결합의 가수분해를 막는다. 또한, 높은 국소 농도에서의 아민은 에틸렌성 이중 결합을 공격하여 안정한 마이클 부가 생성물을 형성한다.
방향족 설포닐 클로라이드는 변형된 당 성분의 다양한 부위와 반응하지만 아미노 그룹과의 반응이 가장 중요하며 그 결과 안정한 설폰아미드 결합이 생긴다.
2. 설프하이드릴-반응성 그룹
또 다른 구체예에서, 가교제 상의 부위는 설프하이드릴-반응성 그룹이다. 유용하며 제한되지 않는 설프하이드릴-반응성 그룹의 예는 말레이미드, 알킬 할라이드, 피리딜 디설파이드 및 티오프탈리미드를 포함한다.
말레이미드는 변형된 당 성분의 설프하이드릴 그룹과 우선적으로 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성한다. 이들은 또한 훨씬 낮은 속도로 일차 아미노 그룹 및 히스티딘의 이미다졸 그룹과 반응한다. 그러나, pH 7에서 말레이미드 그룹은 설프하이드릴-특이적 그룹으로 생각될 수 있는데, 그 이유는 이 pH에서 단순 티올의 반응속도가 상응하는 아민의 반응속도에 비해 1000배나 크기 때문이다.
알킬 할라이드는 설프하이드릴 그룹, 설파이드, 이미다졸 및 아미노 그룹과 반응한다. 그러나, 중성 내지 약한 알칼리 pH에서 알킬 할라이드는 먼저 설프하이드릴 그룹과 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성한다. 더 높은 pH에서는 아미노 그룹과의 반응이 선호된다.
피리딜 디설파이드는 디설파이드 교환을 통하여 보호되지 않은 설프하이드릴과 반응하여 혼합된 디설파이드를 형성한다. 따라서, 피리딜 디설파이드는 가장 특이적인 설프하이드릴-반응성 그룹이다.
티오프탈이미드는 보호되지 않은 설프하이드릴 그룹과 반응하여 디설파이드를 형성한다.
3. 카복실-반응성 잔기
또 다른 구체예에서, 물 및 유기 용매에 가용성인 카보디이미드가 카복실-반응성 시약으로서 사용된다. 이들 화합물은 보호되지 않은 카복실 그룹과 반응하여 슈도우레아를 형성하며, 이는 다시 이용가능한 아민과 커플링되어 아미드 결합을 만들어낸다. 카보디이미드를 사용하여 카복실 그룹을 변형하는 방법은 문헌을 참조할 수 있다(Yamada et al ., Biochemistry 20: 4836-4842, 1981).
ii. 가교제의 바람직한 비특이적 부위
부위-특이적 반응성 부분을 사용하는 것과 함께, 본 발명에서는 당을 변형화 그룹에 결합시킴에 있어 비특이적 반응성 그룹의 사용을 또한 고려할 수 있다.
비특이적 가교제의 예로는 어둠 속에서는 완전히 불활성이지만 적당한 에너지의 광자를 흡수함에 의해 반응성 그룹으로 전환되는 광활성화 그룹을 들 수 있다. 한 구체예에서, 광활성화 그룹은 아지드의 가열 또는 광분해에 의해 생성된 니트렌의 전구체들로부터 선택된다. 전자가 불충분한 니트렌은 매우 반응성이 크며, N-H, O-H, C-H 및 C=C를 포함한 다양한 화학 결합과 반응할 수 있다. 아지드의 3가지 타입(아릴, 알킬 및 아실 유도체)이 사용될 수 있지만 아릴아지드가 사용된다. 광분해된 후 아릴아지드는 C-H 결합에 비해 N-H 및 O-H 결합과의 반응성이 더 크다. 전자가 불충분한 아릴니트렌은 신속하게 환을 팽창시켜 데하이드로아제핀을 형성하며, 이는 C-H 삽입 생성물을 형성하기 보다는 친핵체와 반응하려고 한다. 아릴아지드의 반응성은 환 내의 니트로 또는 하이드록실 그룹과 같은 전자-흡인 치환체의 존재에 의해 증가될 수 있다. 이러한 치환체는 아릴아지드의 최대 흡수를 더 긴 파장으로 이동시킨다. 비치환된 아릴아지드는 260-280nm 범위에서 최대 흡수를 나타내는 반면, 하이드록시 및 니트로아릴아지드는 305nm 이상에서 상당한 빛을 흡수한다. 따라서, 하이드록시 및 니트로아릴아지드는 비치환된 아릴아지드와 비교하여 친화성 성분에 대해 덜 해로운 광분해 조건을 사용할 수 있도록 하기 때문에 가장 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 광활성화 그룹은 불소화된 아릴아지드로부터 선택된다. 불소화된 아릴아지드의 광분해 생성물은 아릴니트렌이며, 이들 모두는 C-H 결합 삽입을 포함하는 이 그룹의 특징적인 반응을 매우 효율적으로 수행한다(참조: Keana et al ., J. Org . Chem . 55: 3640-3647, 1990).
또 다른 구체예에서, 광활성화 그룹은 벤조페논 잔기로부터 선택된다. 벤조페논 시약은 일반적으로 아릴아지드 시약에 비해 더 높은 가교 수율을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 광활성화 그룹은 광분해에 의해 전자가 불충분한 카벤을 형성하는 디아조 화합물로부터 선택된다. 이들 카벤은 C-H 결합으로의 삽입, 이중 결합에의 부가(방향족 시스템 포함), 수소 유인 및 카본 이온을 형성하는 친핵성 센터에의 배위를 포함한 다양한 반응을 수행한다.
또 다른 구체예에서, 광활성화 그룹은 디아조피루베이트로부터 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 디아조피루베이트의 p-니트로페닐 에스테르는 지방족 아민과 반응하여 디아조피루브산 아미드를 형성하고, 이는 자외선 광분해에 의해 알데히드를 형성한다. 광분해된 디아조피루베이트-변형된 친화성 성분은 포름알데히드 또는 글루타르알데히드 형성 가교제와 유사하게 반응할 것이다.
iii. 호모이작용성 시약
1. 일차 아민과 반응성인 호모이작용성 가교제
아민-반응성 가교제의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 상업적으로 기술되어 있다(가교 과정 및 시약에 대해서는 상기 참조). 많은 시약을 이용할 수 있다(예를 들어, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
호모이작용성 NHS 에스테르의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르타레이트(DST), 디설포숙신이미딜 타르타레이트(설포-DST), 비스-2-(숙신이미도옥시카보닐옥시)에틸설폰(BSOCOES), 비스-2-(설포숙신이미도옥시-카보닐옥시)에틸설폰(설포-BSOCOES), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌 글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디티오비스(숙신이미딜-프로피오네이트)(DSP), 및 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(설포-DSP)를 들 수 있다. 호모이작용성 이미도에스테르의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 디메틸 말론이미데이트(DMM), 디메틸 숙신이미데이트(DMSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베리미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-옥시디프로피온이미데이트(DODP), 디메틸-3,3'-(메틸렌디옥시)디프로피온이미데이트(DMDP), 디메틸-,3'-(디메틸렌디옥시)디프로피온이미데이트(DDDP), 디메틸-3,3'-(테트라메틸렌디옥시)-디프로피온이미데이트(DTDP), 및 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)를 들 수 있다. .
호모이작용성 이소티오시아네이트의 바람직하며 제한되지 않는 예는 다음을 포함한다: p-페닐렌디이소티오시아네이트(DITC) 및 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-디설폰산 스틸벤(DIDS).
호모이작용성 이소시아네이트의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 크실렌 디이소시아네이트, 톨루엔-2,4-디이소시아네이트, 톨루엔-2-이소시아네이트-4-이소티오시아네이트, 3-메톡시디페닐메탄-4,4'-디이소시아네이트, 2,2'-디카복시-4,4'-아조페닐디이소시아네이트 및 헥사메틸렌디이소시아네이트를 들 수 있다.
호모이작용성 아릴할라이드의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(DFDNB) 및 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐-설폰을 들 수 있다.
호모이작용성 지방족 알데히드 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 글리옥살, 말론디알데히드 및 글루타르알데히드를 들 수 있다.
호모이작용성 아실화제 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 디카복실산의 니트로페닐 에스테르를 들 수 있다.
호모이작용성 방향족 설포닐 클로라이드의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 페놀-2,4-디설포닐 클로라이드 및 α-나프톨-2,4-디설포닐 클로라이드를 들 수 있다.
추가적인 아미노-반응성 호모이작용성 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 아민과 반응하여 비스카바메이트를 형성하는 에리스리톨비스카보네이트를 들 수 있다.
2. 보호되지 않은 설프하이드릴 그룹과 반응성인 호모이작용성 가교제
이러한 시약의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 기재되어 있다(가교 과정 및 시약에 대해서는 상기 참조). 많은 시약을 상업적으로 구입할 수 있다(예를 들어, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
호모이작용성 말레이미드의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 비스말레이미도헥산(BMH), N,N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드, N,N'-(1,2-페닐렌)비스말레이미드, 아조페닐디말레이미드 및 비스(N-말레이미도메틸)에테르를 들 수 있다.
호모이작용성 피리딜 디설파이드의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도부탄(DPDPB)을 들 수 있다.
호모이작용성 알킬 할라이드의 바람직하며 제한되지 않는 예로는2,2'-디카복시-4,4'-디요오도아세트아미도아조벤젠, α,α'-디요오도-p-크실렌설폰산, α,α'-디브로모-p-크실렌설폰산, N,N'-비스(b-브로모에틸)벤질아민, N,N'-디(브로모아세틸)페닐티드라진 및 1,2-디(브로모아세틸)아미노-3-페닐프로판을 들 수 있다.
3. 호모이작용성 광활성화 가교제
이러한 시약의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 기재되어 있다(가교 과정 및 시약에 대해서는 상기 참조). 일부 시약을 상업적으로 구입할 수 있다(예를 들어, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
호모이작용성 광활성화 가교제의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 비스-β-(4-아지도살리실아미도)에틸디설파이드(BASED), 디-N-(2-니트로-4-아지도페닐)-시스타민-S,S-디옥사이드(DNCO) 및 4,4'-디티오비스페닐아지드를 들 수 있다.
iv. 헤테로이작용성 시약
1. 피리딜 디설파이드 부분을 가진 아미노-반응성 헤테로이작용성 시약
이러한 시약의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 기재되어 있다(가교 과정 및 시약에 대해서는 상기 참조). 많은 시약을 상업적으로 구입할 수 있다(예를 들어, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. ; Sigma Chemical Company, St. Louis,Mo. ; Molecular Probes, Inc. , Eugene, OR).
피리딜 디설파이드 부분 및 아미노-반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로-이작용성 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6-3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도헥사노에이트(LC-SPDP), 설포숙신이미딜 6-3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도헥사노에이트(설포-LCSPDP), 4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(SMPT) 및 설포숙신이미딜 6-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도헥사노에이트(설포-LC-SMPT)를 들 수 있다.
2. 말레이미드 부분을 가진 아미노-반응성 헤테로이작용성 시약
이러한 시약의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 기재되어 있다. 말레이미드 부분 및 아미노-반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로-이작용성 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 숙신이미딜 말레이미딜아세테이트(AMAS), 숙신이미딜 3-말레이미딜프로피오네이트(BMPS), N-γ-말레이미도부티릴옥시숙신이미드 에스테르(GMBS)N-γ-말레이미도부티릴옥시설포 숙신이미드 에스테르(설포-GMBS) 숙신이미딜 6-말레이미딜헥사노에이트(EMCS), 숙신이미딜 3-말레이미딜벤조에이트(SMB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(sulfo-MBS), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB) 및 설포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-SMPB)를 들 수 있다.
3. 알킬 할라이드 부분을 가진 아미노-반응성 헤테로이작용성 시약
이러한 시약의 합성, 성질 및 적용은 문헌에 기재되어 있다. 알킬 할라이드 부분 및 아미노-반응성 NHS 에스테르를 가진 헤테로-이작용성 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예로는 N-숙신이미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 설포숙신이미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포- SIAB), 숙신이미딜-6-(요오도아세틸)아미노헥사노에이트(SIAX), 숙신이미딜-6-(6-((요오도아세틸)-아미노)헥사노일아미노)헥사노에이트(SIAXX), 숙신이미딜-6-(((4-(요오도아세틸)-아미노)-메틸)-사이클로헥산-l-카보닐)아미노헥사노에이트(SIACX) 및 숙신이미딜-4((요오도아세틸)-아미노)메틸사이클로헥산-1-카복실레이트(SIAC)를 들 수 있다.
아미노-반응성 NHS 에스테르 및 알킬 디할라이드 부분을 가지는 헤테로-이작용성 시약의 예는 N-하이드록시숙신이미딜 2,3-디브로모프로피오네이트(SDBP)이다. SDBP는 친화성 성분의 아미노 그룹과 콘쥬게이트되어 분자내 가교결합을 도입한다. 일차 아민 그룹에 대한 디브로모프로피오닐 부분의 반응성은 반응 온도에 의해 조절된다(참조: McKenzie et al ., Protein Chem. 7: 581-592 (1988)).
알킬 할라이드 부분 및 아미노-반응성 p-니트로페닐 에스테르 부분을 가지는 헤테로-이작용성 시약의 바람직하며 제한되지 않는 예는 p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA)이다.
다른 가교제도 당업자에게 공지되어 있다(참조: Pomato et al., U. S. Patent No. 5,965,106). 당업자는 특정 적용을 위해 적합한 가교제를 선택할 수 있다.
v. 분해가능한 링커 그룹
추가의 구체예에서, 링커 그룹은 분해되어 당 잔기로부터 변형화 그룹을 방출시킬 수 있는 그룹으로서 제공된다. 많은 분해가능한 그룹이 당업계에 공지되어 있다(참조: Jung et al ., Biochem . Biophys . Acta 761: 152-162 (1983); Joshi et al ., J. Biol . Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al ., J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar et al ., Eur . R Biochem. 155: 141-147 (1986); Park et al ., J. Biol . Chem. 261: 205-210 (1986); Browning et al ., J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989)). 또한, 분해가능하고 이작용성인(호모- 및 헤테로-이작용성 둘다) 광범위한 링커 그룹을 Pierce와 같은 제조업체로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
예시적인 분해가능한 부분은 빛, 열 또는 티올, 하이드록실아민, 염기, 퍼요오데이트 등과 같은 시약을 사용하여 분해될 수 있다. 또한, 어떤 바람직한 그룹은 엔도사이토시스되는 것에 반응하여 생체내에서 분해된다(예를 들어, 시스-아코니틸; 참조, Shen et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun. 102: 1048 (1991)). 바람직한 분해가능한 그룹은 디설파이드, 에스테르, 이미드, 카보네이트, 니트로벤질, 펜아실 및 벤조인 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된 멤버인 분해가능한 부분을 포함한다.
변형된 당과 펩티드의 콘쥬게이션
변형된 당은 콘쥬게이션을 매개하는 적합한 효소를 사용하여 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 펩티드와 콘쥬게이트된다. 바람직하게는, 변형된 공여체 당(들), 효소(들) 및 수용체 펩티드(들)의 농도를 수용체가 소모될 때까지 글리코실화를 진행하도록 선택한다. 시알릴트랜스퍼라제와 관련하여 하기 설명된 것은 일반적으로 다른 글리코실트랜스퍼라제 반응에 대해서도 적용할 수 있다.
목적하는 올리고사카라이드 구조를 합성하기 위해 글리코실트랜스퍼라제를 사용하는 다수의 방법이 공지되어 있으며, 일반적으로 본 발명에 적용할 수 있다. 예를 들어 문헌(WO 96/32491, Ito et al ., Pure Appl . Chem . 65: 753 (1993), and U. S. Pat. Nos. 5,352,670, 5,374,541, and 5,545,553)에 예시적인 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 단일의 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코실트랜스퍼라제 배합물을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라제와 갈락토실트랜스퍼라제의 배합물을 사용할 수 있다. 하나 이상의 효소를 사용하는 구체예에서, 효소와 기질은 바람직하게는 초기 반응 혼합물에서 배합되거나, 첫 번째 효소 반응이 완결되거나 거의 완결되었을 때 반응액에 두 번째 효소 반응을 위한 효소 및 시약을 첨가한다. 단일 용기에서 연속적으로 2개의 효소 반응을 수행함으로써 중간체 물질이 분리되는 방법에 비해 전체적인 수율이 개선된다. 또한, 여분의 용매 및 부산물의 제거 및 처리(disposal)가 감소한다.
또 다른 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 효소는 각각 글리코실트랜스퍼라제이다. 또 다른 구체예에서, 한 효소는 엔도글리코시다제이다. 추가의 구체예에서, 2개 이상의 효소가 본 발명에 따른 변형된 당단백질을 조립하기 위해 사용된다. 변형된 당을 펩티드에 첨가하기 전 또는 후의 어느 시점에도 펩티드 상의 사카라이드 구조를 변경하는데 효소가 사용된다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트의 O-결합된 글리코실 부분은 일반적으로 펩티드에 결합된 GalNAc 부분으로부터 유래한다. GalNAc 트랜스퍼라제 패밀리의 어떤 멤버도 GalNAc 부분을 펩티드에 결합시키기 위해 사용될 수 있다(참조: Hassan H, Bennett EP, Mandel U, Hollingsworth MA, and Clausen H (2000). Control of Mucin-Type O-Glycosylation: O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities of Polypeptide GalNAc-Transferases. (Eds. Ernst, Hart, and Sinay). Wiley-VCH chapter "Carbohydrates in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook", 273-292). GalNAc 부분 자체는 온전한 글리코실 링커일 수 있다. 또는, 추가의 효소 및 하나 이상의 그 효소에 적합한 글리코실 기질을 사용하여 사카릴 잔기가 형성되고, 이렇게 형성된 글리코실 부분에 변형된 당이 첨가된다.
또 다른 구체예에서, 하나 이상의 엑소- 또는 엔도글리코시다제를 사용한다. 글리코시다제는 통상 글리코실 결합을 분해하기 보다는 형성하는데 이용하기 위해 유도된 돌연변이이다. 변이체 글리카나제는 통상 활성 부위 산성 아미노산 잔기 대신에 아미노산 잔기를 치환시킨다. 예를 들어, 엔도글리카나제가 엔도-H 일 때, 치환된 활성 부위 잔기는 통상 130 위치의 Asp, 132 위치의 Glu, 또는 이들의 배합일 것이다. 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 글루타민에 의해 대체된다.
변이체 효소는 보통 엔도글리카나제 가수분해 단계의 역반응과 유사한 합성 단계에 의해 반응을 촉매한다. 이러한 구체예에서, 글리코실 공여체 분자(예를 들어, 목적하는 올리고- 또는 모노-사카라이드 구조)는 이탈기를 포함하며, 반응은 단백질 상의 GlcNAc 잔기에 공여체 분자를 첨가함으로써 진행된다. 예를 들어, 이탈기는 플루오라이드와 같은 할로겐일 수 있다. 다른 구체예에서, 이탈기는 Asn 또는 Asn-펩티드 부분이다. 추가의 구체예에서 글리코실 공여체 분자 상의 GlcNAc 잔기가 변형된다. 예를 들어, GlcNAc 잔기는 1,2-옥사졸린 부분을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 콘쥬게이트를 제조하는데 사용되는 각각의 효소는 촉매량으로 존재한다. 특정 효소의 촉매량은 효소 기질의 농도에 따라, 그리고 온도, 시간 및 pH 값과 같은 반응 조건에 따라 변화한다. 미리 선택된 기질 농도 및 반응 조건하에서 특정 효소의 촉매량을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 방법이 수행되는 온도는 얼기 직전에서부터 가장 민감한 효소가 변성되는 온도 범위이다. 바람직한 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 55℃, 좀더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 본 발명에 따른 방법의 하나 이상의 컴포넌트(component)는 호열성(thermophilic) 효소를 사용하여 상승된 온도에서 수행된다.
수용체가 글리코실화되기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 유지함으로써 목적하는 콘쥬게이트를 형성한다. 일부의 콘쥬게이트는 종종 몇시간 지나지 않아서 24시간 이하의 시간 내에 보통 얻어지는 회수가능한 양으로 검출될 수 있다. 당업자는 반응 속도가 다수의 가변적인 요인들(예를 들어, 효소 농도, 공여체 농도, 수용체 농도, 온도, 용매 부피)에 의존적이며, 이들은 선택된 시스템에 대해 최적화됨을 이해한다.
본 발명은 또한 변형된 펩티드를 공업적 규모로 생산하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 공업적 규모는 완성되어(finished) 정제된 콘쥬게이트를 일반적으로 적어도 약 250mg, 바람직하게는 적어도 약 500mg, 좀더 바람직하게는 적어도 약 1g의 양으로 바람직하게는 단일 반응 사이클 후에, 즉, 콘쥬게이트가 동일하고, 연속적으로 반복되는 합성 사이클로부터의 반응 생성물의 배합물이 아닌 상태로 생산하는 것을 의미한다.
하기에서, 본 발명은 예를 들어 변형된 시알산 부분을 글리코실화된 펩티드에 콘쥬게이션함으로써 설명된다. 대표적인 변형된 시알산은 (m-) PEG에 의해 표지된 것이다. PEG-변형된 시알산 및 글리코실화된 펩티드를 사용하는 하기 기술내용은 설명의 편의를 위한 것일 뿐 본 발명을 이 2가지 파트너의 콘쥬게이션에 한정시키고자 함이 아니다. 당업자는 시알산 이외의 변형된 글리코실 부분을 첨가하는데 하기 논의가 일반적으로 적용될 수 있음을 이해한다. 또한, PEG 이외에 수용성 중합체, 치료 부분 및 생체분자를 포함하는 다른 제제를 사용하여 글리코실 단위를 변형하는데 하기 논의가 동일하게 적용될 수 있다.
펩티드 또는 글리코펩티드 상에 (m-) PEG-화되거나 (m-) PPG-화된 탄수화물을 선택적으로 도입하는데 효소적 접근법이 사용될 수 있다. 이 방법은 PEG, PPG 또는 차폐된(masked) 반응성 작용기를 포함하는 변형된 당을 사용하며, 적당한 글리코실트랜스퍼라제 또는 글리코신타제와 배합된다. 목적하는 탄수화물 결합을 만드는 글리코실트랜스퍼라제를 선택하고 변형된 당을 공여체 기질로 사용함으로써 PEG 또는 PPG 가 펩티드 골격(backbone) 상에, 글리코펩티드의 기존 당 잔기 상에 또는 펩티드에 첨가된 당 잔기 상에 직접적으로 도입될 수 있다.
시알릴트랜스퍼라제에 대한 수용체는 본 발명의 방법에 의해 변형하고자 하는 펩티드 상에 천연적으로 생긴 구조로서, 또는 재조합적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 그곳에 위치하게 된 구조로서 존재한다. 적당한 수용체는 예를 들어 GalNAc, Galβ1,4G1cNAc, Galβ1,4Ga1NAc, Galβ1,3Ga1NAc, 락토-N-테트라오즈, Galβl,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβl,6GlcNAc, Galβ1,4Glc(락토즈)과 같은 갈라코실 수용체 및 당업계에 공지된 다른 수용체들을 포함한다(참조: Paulson et al., J. Biol . Chem. 253: 5617-5624 (1978)).
한 구체예에서, 시알릴트랜스퍼라제에 대한 수용체가 글리코펩티드의 생체내 합성을 통해 변형되고자 하는 글리코펩티드 상에 존재한다. 그러한 글리코펩티드는 글리코펩티드의 글리코실화 패턴을 미리 변형시키지 않고 청구된 방법을 사용하여 시알화될 수 있다. 또는, 본 발명의 방법은 적합한 수용체를 포함하지 않는 펩티드를 시알화하는데 사용될 수 있는데, 이때는 먼저 펩티드를 당업자에게 공지된 방법을 통해 수용체를 포함하도록 변형시킨다. 예시적인 구체예에서, GalNAc 잔기를 GalNAc 트랜스퍼라제를 사용하여 O-결합된 글리코실화 부위에 첨가한다 (참조: Hassan H, Bennett EP, Mandel U, Hollingsworth MA, and Clausen H (2000). Control of Mucin-Type O-Glycosylation: O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities of Polypeptide GalNAc-Transferases.(Eds. Ernst, Hart, and Sinay). Wiley-VCH chapter "Carbohydrates in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook", 273-292).
예시적인 구체예에서, 갈락토실 수용체는 예를 들어 GalNAc와 같은 펩티드에 결합된 적당한 수용체에 갈락토즈 잔기를 결합시킴으로써 조립된다. 이 방법에서는 변형하고자 하는 펩티드를 적당량의 갈락토실트랜스퍼라제(예를 들어, Galβl,3 또는 Galβl,4) 및 적당한 갈락토실 공여체(예를 들어, UDP-갈락토즈)를 포함하는 반응 혼합물과 인큐베이션시킨다. 반응이 실질적으로 완결될 때까지 반응시킬 수도 있고, 예정된 양의 갈락토즈 잔기가 첨가되었을 때 반응을 종결시킬 수도 있다. 선택된 사카라이드 수용체를 조립하는 다른 방법들은 당업자에게 자명할 것이다.
또 다른 구체예에서, 글리코펩티드-결합된 올리고사카라이드는 먼저 전체적으로 또는 부분적으로 "절삭되어(trimmed)" 시알릴트랜스퍼라제에 대한 수용체 또는 하나 이상의 적당한 잔기가 첨가되어 적당한 수용체가 얻어질 수 있는 부분이 노출된다. 글리코실트랜스퍼라제 및 엔도글리코시다제와 같은 효소(참조, 예를 들어 U. S. Patent No. 5,716,812)가 결합 및 절삭(trimming) 반응에 유용하다.
하기 논의에서, 본 발명에 따른 방법을 결합된 수용성 중합체를 갖는 변형된 당을 사용하여 설명한다. 이는 설명상의 명확성을 기하기 위한 것이다. 당업자는 변형된 당이 치료 부분, 생체분자 등을 포함하는 구체예에도 이러한 논의가 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
예시적인 구체예에서, O-결합된 탄수화물 잔기가 변형된 당의 첨가 전에 "절삭"된다. 예를 들어, GalNAc-Gal 잔기가 절삭되어 GalNAc로 되돌아간다. 수용성 중합체를 가지는 변형된 당은 "절삭"에 의해 노출된 하나 이상의 당 잔기에 콘쥬게이트된다. 한 실시예에서, 수용성 중합체가 사카릴 부분, 예를 들어, 수용성 중합체에 콘쥬게이트된 Sia, Gal 또는 GalNAc 부분을 통해 글리코펩티드가 "절삭"되어 생성된 O-곁사슬(side chain) 아미노산 또는 글리코펩티드 글리칸에 첨가된다. 변형된 사카릴 부분은 "절삭"된 글리코펩티드의 수용체 부위에 결합한다. 또는, 변형되지 않은 사카릴 부분, 예를 들어, Gal이 O-결합된 글리칸의 말단에 첨가될 수 있다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 수용성 중합체가 갈락토즈 잔기를 가지는 변형된 당을 통해 GalNAc 잔기에 첨가된다. 또는, 변형되지 않은 Gal이 말단 GalNAc 잔기에 첨가될 수 있다.
추가의 실시예에서, 수용성 중합체가 변형된 시알산을 사용하여 Gal 잔기에 첨가된다.
또 다른 예시적인 구체예에서, O-결합된 글리코실 잔기가 절삭되어 아미노산에 결합된 GalNac로 되돌아간다. 한 실시예에서 수용성 중합체가 중합체에 의해 변형된 Gal을 통해 첨가된다. 또는, 변형되지 않은 Gal이 GalNAc에 첨가된 후 결합된 수용성 중합체를 가진 Gal이 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 변형되지 않은 Gal 잔기가 GalNAc에 첨가된 후 수용성 중합체에 의해 변형된 시알산 부분이 첨가된다.
상기 예시적인 구체예들은 본 명세서에 설명된 방법의 적용성을 설명하기 위해 제공된 것이다. 본 발명의 방법을 사용하여 실질적으로 모든 목적하는 구조의 탄수화물 잔기를 "절삭하여 되돌리고(trim back)" 형성하는 것이 가능하다. 상기 설명한 바와 같이 변형된 당은 탄수화물 부분의 말단에 첨가될 수도 있고, 펩티드 코어와 탄수화물 말단 사이의 중간 부분이 될 수도 있다.
예시적인 구체예에서, 수용성 중합체는 중합체 변형된 시알산을 사용하여 말단 Gal 잔기에 첨가된다. 적당한 시알릴트랜스퍼라제가 변형된 시알산을 첨가하는데 사용된다. 이 방법이 반응식 5에 요약되어 있다.
Figure 112006055848460-PCT00054
추가의 연구에서, 반응식 6에 요약된 바와 같이, 차폐된 반응성 작용성이 시 알산에 존재한다. 차폐된 반응성 그룹은 바람직하게는 변형된 시알산을 펩티드에 결합시키는데 사용된 조건에 의해 영향을 받지 않는다. 변형된 시알산이 펩티드에 공유결합된 후, 마스크가 제거되고 펩티드는 PEG, PPG, 치료 부분, 생체분자 또는 다른 제제와 같은 제제와 콘쥬게이트된다. 이 제제는 변형된 당 잔기의 차폐되지 않은 반응성 그룹과의 반응에 의해 특이적인 방식으로 펩티드에 콘쥬게이트된다.
Figure 112006055848460-PCT00055
글리코펩티드의 올리고사카라이드 측쇄(side chain)의 말단 당이 무엇이냐에 따라 어떤 변형된 당이라도 적당한 글리코실트랜스퍼라제와 함께 사용될 수 있다(표 3). 앞에서 논의된 바와 같이, PEG-화되거나 PPG-화된 구조를 도입하는데 요구되는 글리코펩티드의 말단 당이 발현 중에 자연적으로 도입될 수도 있고, 발현 후 적당한 글리코시다제(들), 글리코실트랜스퍼라제(들) 또는 글리코시다제(들) 및 글리코실트랜스퍼라제(들)의 혼합물을 사용하여 생성될 수 있다.
Figure 112006055848460-PCT00056
대안적인 구체예에서, 펩티드 골격 상의 O-결합된 글리코실화 부위에 당 잔기를 이동시키는 것으로 알려진 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 펩티드 골격에 직접적으로 변형된 당을 첨가한다. 이 예시적 구체예는 반응식 7에 설명되어 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 예시적인 글리코실트랜스퍼라제로는 GalNAc 트랜스퍼라제(GalNAc T1-20), GlcNAc 트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, 크실로실트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법을 사용함으로써, 어떤 탄수화물도 가지고 있지 않은 펩티드, 또는 기존의 글리코펩티드 상에 변형된 당을 직접 첨가할 수 있다. 양쪽 경우에, 글리코실트랜스퍼라제의 기질 특이성에 의해 정해진 대로 펩티드 골격의 특정 위치에서 변형된 당의 첨가가 이루어지며, 화학적 방법으로 단백질의 펩티드 골격을 변형할 때와 같은 무작위한 방식의 첨가는 이루어지지 않는다. 적당한 아미노산 서열을 폴리펩티드쇄에 도입(engineering)함으로써 글리코실트랜스퍼라제 기질 펩티드 서열을 가지고 있지 않은 단백질 또는 글리코펩티드로 일련의 제제를 도입할 수 있다.
Figure 112006055848460-PCT00057
상기 설명된 각각의 예시적인 구체예에서, 변형된 당을 펩티드에 콘쥬게이션시킨 후에 하나 이상의 추가의 화학적 또는 효소적 변형화 단계를 이용할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 펩티드에 결합된 말단 변형된 당에 글리코실 단위(예를 들어, 푸코즈)를 연결하기 위해 효소(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제)가 사용된다. 또 다른 실시예에서, 변형된 당이 콘쥬게이트하는데 실패한 부위를 "캡(cap)"하기(예를 들어, 시알릴화)위해서 효소적 반응이 사용된다. 또는, 콘쥬게이트되고 변형된 당의 구조를 변경시키기 위하여 화학적 방법이 이용된다. 예를 들어, 변형된 당이 결합된 펩티드 성분과의 결합을 안정화시키거나 불안정화시키는 제제를 콘쥬게이트되고 변형된 당과 반응시킨다. 또 다른 실시예에서, 변형된 당이 펩티드에 콘쥬게이션된 후 변형된 당의 성분을 탈보호화한다. 당업자는 변형된 당이 펩티드에 콘쥬게이션된 후의 어느 단계에서 일련의 효소적 및 화학적 방법이 본 발명에서 유용하게 이용된다는 것을 이해할 것이다. 변형된 당-펩티드 콘쥬게이트의 추가적인 변경(elaboration)은 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 글리코펩티드는 표적 제제, 예를 들어 트랜스페린(펩티드를 혈액-뇌 관문을 통해, 그리고 엔도좀에 전달), 카니틴(펩티드를 근육 세포에 전달; 참조, 예를 들어 LeBorgne et al ., Biochem . Pharmacol . 59: 1357-63 (2000)), 및 포스포네이트, 예를 들어 비스포스포네이트(펩티드를 뼈 및 다른 탄산칼슘 함유 조직에 표적화(target); 참조, 예를 들어, Modern Drug Discovery, August 2002, page 10)와 콘쥬게이트된다. 표적화하기에 유용한 다른 제제는 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 글루코즈, 글루타민 및 IGF가 또한 근육 표적화에 유용하다.
표적 부분 및 치료 펩티드는 본 명세서에서 논의된 어떤 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 콘쥬게이트된다. 당업자는 상기 언급된 것 이외의 펩티드도 또한 본 명세서에서 설명한 바와 같이 유도체화할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 펩티드가 2001. 10. 10 자 출원되고 특허청에 계속중인 본 출원인의 US 가특허출원 제60/328,523호에 첨부된 부록에 기재되어 있다.
예시적인 구체예에서, 표적 제제 및 치료 펩티드는 링커 부분을 통하여 커플 링된다. 이 구체예에서, 적어도 하나의 치료 펩티드 또는 표적 제제가 본 발명의 방법에 따라 온전한 글리코실 링커 그룹을 통해 링커 부분에 커플링된다. 예시적인 구체예에서, 링커 부분은 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 폴리(에테르)를 포함한다. 또 다른 예시적인 구체예에서, 링커 부분은 콘쥬게이트가 신체의 표적 조직 또는 영역에 전달된 후 생체내에서 분해되어 표적 제제로부터 치료 펩티드를 분비하는 적어도 하나의 결합을 포함한다.
또 다른 예시적인 구체예에서, 치료 펩티드를 표적 부분에 콘쥬게이트시키지 않고 치료 부분 상의 글리코형태(glycoform)를 변경시킴에 의해 치료 부분의 생체내 분배(distribution)을 변경시킨다. 예를 들어, 글리코실 그룹의 말단 갈락토즈 부분을 시알산(또는 그의 유도체)으로 캐핑(capping)함으로써 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의해 치료 펩티드가 흡수되지 않도록 할 수 있다.
i. 효소들
1. 글리코실트랜스퍼라제
글리코실트랜스퍼라제는 활성화 당(공여체 NDP-당)를 단계적인 방식으로 단백질, 글리코펩티드, 리피드 또는 글리코리피드 또는 성장중인 올리고사카라이드의 비환원성 말단에 첨가하는 것을 촉매한다. N-결합된 글리코펩티드는 엔 블록(en block) 전이에서 트랜스퍼라제 및 리피드-결합된 올리고사카라이드 공여체 Dol-PP-NAG2Glc3Man9 를 통해 합성된 후 코어가 절삭된다. 이 경우에 "코어" 사카라이드의 성질은 후속의 결합물과 약간 상이하다. 다수의 글리코실트랜스퍼라제가 당업계에 공지되어 있다.
변형된 당을 당 공여체로 이용할 수 있는 한 어떤 글리코실트랜스퍼라제라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 그러한 효소의 예로는 Leloir 경로 글리코실트랜스퍼라제, 예를 들어 갈락토실트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 크실로실트랜스퍼라제, 글루쿠로노닐트랜스퍼라제 등을 들 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제 반응을 포함하는 효소적 사카라이드 합성을 위해, 글리코실트랜스퍼라제를 어떤 공급원으로부터 클로닝하거나 분리할 수 있다. 클로닝된 많은 글리코실트랜스퍼라제가 그들의 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 공지되어 있다(참조: 예를 들어, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases," (http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)). 또한, 글리코실트랜스퍼라제 아미노산 서열 및 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서 이로부터 아미노산 서열의 추론이 가능한 서열을 다양하며 일반인이 입수가능한 데이터베이스, 예를 들어 GenBank, Swiss-Prot, EMBL 등으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산트랜스퍼라제, 갈락투론산트랜스퍼라제 및 올리고사카릴트랜스퍼라제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적당한 글리코실트랜스퍼라제는 원핵세포 뿐아니라 진핵세포로부터 얻어진 것을 포함한다.
글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA는 화학적 합성에 의해, 적당한 세포 또는 세포주 배양물로부터의 mRNA 역전사물을 스크리닝함에 의해, 적당한 세포로부터의 게노믹 라이브러리를 스크리닝함에 의해, 또는 이들 방법의 조합에 의해 얻을 수 있다. mRNA 또는 게노믹 DNA의 스크리닝은 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열로부터 생성된 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 수행될 수 있다. 탐침은 공지의 방법에 따라 형광 그룹, 방사성 원자 또는 화학발광 그룹과 같은 검출가능한 그룹으로 표지되어 통상의 혼성화 에세이에서 사용될 수 있다. 또는, 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열로부터 생성된 PCR(polymerase chain reaction) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 방법을 사용하여 글리코실트랜스퍼라제 유전자 서열을 얻을 수 있다(참조: Mullis et al의 U. S. Pat. No. 4,683,195 및 Mullis의 U. S. Pat. No. 4,683,202).
글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 글리코실트랜스퍼라제를 합성할 수 있다. 벡터는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 DNA를 증폭시키고/시키거나 글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 DNA를 발현시키기 위해 사용된다. 발현 벡터는 복제가능한 DNA 구조물로서 여기서 글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 DNA 서열은 적당한 숙주에서 글리코실트랜스퍼라제 효소의 발현을 제어할 수 있는 적당한 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 그러한 조절 서열의 필요성은 선택된 숙주 및 형질전환방법에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 조절 서열은 전사 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적당한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 증폭 벡터는 발현 조절 도메인을 필요로 하지 않는다. 단지 필요한 것은 통상 복제의 기원에 의해 부여된, 숙주에서 복제할 수 있는 능력과 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자이다.
예시적인 구체예에서, 본 발명은 원핵세포 효소를 사용한다. 그러한 글리코실트랜스퍼라제는 리포올리고사카라이드(LOS)의 합성에 관여하며 많은 그램 음성 박테리아에 의해 생산되는 효소를 포함한다(참조: Preston et al ., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)). 그러한 효소는 이.콜라이(E.coli) 및 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)과 같은 종의 rfa 오페론 단백질로서 β1,6 갈락토실트랜스퍼라제 및 β1,3 갈락토실트랜스퍼라제(참조, 예를 들어 EMBL Accession Nos. M80599 및 M86935 (E. coli); EMBL Accession No. S56361(S. typhimurium)), 글루코실트랜스퍼라제(Swiss-Prot Accession No. P25740 (E. coli), an β1,2-글루코실트랜스퍼라제(rfaJ)(Swiss-Prot Accession No. P27129(E. coli) 및 Swiss-Prot Accession No. P19817 (S. typhimurium)), 및 β1,2-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(rfaK)(EMBL Accession No. U00039(E. coli))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 서열이 공지된 다른 글리코실트랜스퍼라제로는 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 이.콜라이, 살로넬라 티피무륨, 살모넬라 엔테리카, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 미코박테리움 레프로숨(Mycobacterium leprosum)과 같은 유기체 에서 특성화된 rfaB와 같은 오페론 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 rh1 오페론에 의해 암호화된 것을 들 수 있다.
점막 병원균 나이세리아 곤노로에아에(Neisseria gonnorhoeae) 및 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis)의 LOS에서 확인된 락토-N-네오테트라오즈, D-갈락토실-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사미닐-β-1,3-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코즈 및 Pk 혈액 그룹 트리사카라이드 서열, D-갈락토실-α-1,4-D-갈락토실-β-1,4-D-글루코즈를 함유하는 구조를 생성하는데 관여된 글리코실트랜스퍼라제를 본 발명에서 사용하는 것도 또한 적당하다(참조: Scholten et al ., J. Med . Microbiol . 41: 236-243(1994)). 이러한 구조의 생합성에 관여된 글리코실트랜스퍼라제가 암호화하는 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis) 및 엔. 고노로에아에(N. gonorrhoeae) 유래의 유전자를 엔. 메닝기티디스 면역타입 L3 및 L1(참조: Jennings et al ., Mol . Microbiol. 18: 729-740(1995)) 및 엔. 고노로에아에 변이체 F62(참조: Gotshlich, J. Exp . Med . 180: 2181-2190(1994))로부터 확인되었다. 엔. 메닝기티디스에서는 3개의 유전자 lgtA, lgtB 및 lg E로 구성된 부분이 락토-N-네오테트라오즈쇄에서 마지막 3개의 당을 첨가하는데 요구되는 글리코실트랜스퍼라제 효소를 암호화한다(참조: Wakarchuk et al ., J. Biol . Chem. 271: 19166-73(1996)). 최근에 lgtB 및 lgtA 유전자 생성물의 효소적 활성이 입증되었는데, 이는 그들에 대해 예견되었던 글리코실트랜스퍼라제 기능에 대한 최초의 직접적인 증거를 제공한다(참조: Wakarchuk et al ., J. Biol . Chem. 271(45): 28271-276(1996)). 엔. 고노로에아에 에는 락토-N-네오테트라오즈 구조의 말단 갈락토즈의 3 위치에 β-D-GalNAc을 첨가하는 lgtD와 절단된(truncated) LOS의 락토즈 부분에 말단 α-D-Gal을 첨가하여 PK 혈액 그룹 항원 구조를 생성하는 lgtC 2개의 추가 유전자가 있다(참조: Gotshlich (1994), supra.). 엔. 메닝기티디스에서는 분리된 면역 타입 L1이 PK 혈액 그룹 항원을 발현하며, lgtC 유전자를 운반하는 것으로 나타났다(참조: Jennings et al.,(1995), supra.). 나이제리아(Neisseria) 글리코실트랜스퍼라제 및 관련 유전자들이 또한 USPN 5,545,553(Gotschlich)에 기재되어 있다. 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)로부터 α1,2-푸코실트랜스퍼라제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라제의 유전자가 특성조사되었다(참조: Martin et al ., J. Biol . Chem. 272: 21349-21356(1997)). 본 발명에서는 또한, 캄파일로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 글리코실트랜스퍼라제가 사용된다(참조, 예를 들어, http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html).
a) 푸코실트랜스퍼라제
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라제이다. 푸코실트랜스퍼라제는 당업자에게 공지되어 있다. 예시적인 푸코실트랜스퍼라제로는 GDP-푸코즈로부터 수용체 당의 하이드록시 위치로 L-푸코즈를 전이시키는 효소들을 들 수 있다. 수용체에 비-뉴클레오티드 당을 전이시키는 푸코실트랜스퍼라제가 또한 본 발명에서 사용된다.
일부 구체예에서, 수용체 당은 예를 들어 올리고사카라이드 글리코시드의 Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-그룹의 GlcNAc이다. 이 반응에 적당한 푸코실트랜스퍼라제는 사람 모유로부터 최초로 특성조사된 Galβ(1→3,4)GlcNAcβl-α(1→3,4)푸코실트랜스퍼라제(FTIII E.C. No. 2.4.1.65)(참조: Palcic, et al ., Carbohydrate Res. 190: 1-11(1989); Prieels, et al ., J. Biol . Chem. 256: 10456-10463(1981); 및 Nunez, et al ., Can . J. Chem. 59: 2086-2095(1981)) 및 사람 혈청으로부터 발견된 Galβ(1→4)GlcNAcβ-α푸코실트랜스퍼라제(FTIV, FTV, FTVI)이다. 시알릴α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ 푸코실트랜스퍼라제인 FTVII(E. C. No. 2.4.1.65)도 또한 특성조사되었다. Galβ(l→3,4)GlcNAcβ-α(l→3,4)푸코실트랜스퍼라제의 재조합 형태도 특성조사되었다(참조: Dumas, et al ., Bioorg . Med. Letters 1: 425-428(1991) 및 Kukowska-Latallo, et al ., Genes and Development 4: 1288-1303(1990)). 다른 예시적인 푸코실트랜스퍼라제로는 예를 들어 αl,2 푸코실트랜스퍼라제(E.C. No. 2.4.1.69)를 들 수 있다. 효소적 푸코실화는 문헌(참조: Mollicone, et al ., Eur . J. Biochem. 191: 169-176(1990) 또는 U. S. Patent No. 5,374,655)에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다. 푸코실트랜스퍼라제를 생산하는데 사용되는 세포는 또한, GDP-푸코즈를 합성하기 위한 효소적 시스템을 포함할 것이다.
b) 갈락토실트랜스퍼라제
또 다른 그룹의 구체예에서, 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제이다. 예시적인 갈락토실트랜스퍼라제로는 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라제(E.C. No. 2.4.1.151, 참조, 예를 들어, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25: 2921(1993) 및 Yamamoto et al. Nature 345: 229-233(1990), 소(GenBank j04989, Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297(1989)), 쥐(GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231(1989)), 돼지(GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105(1995))를 들 수 있다. 또 다른 적당한 α1,3 갈락토실트랜스퍼라제는 혈액 그룹 B 항원의 합성에 관여된 것이다(EC 2.4.1.37, Yamamoto et al ., J. Biol . Chem. 265: 1146-1151 (1990)(human)). 추가의 예시적인 갈락토실트랜스퍼라제는 코어 Gal-Tl이다.
본 발명의 방법에 사용하기에 또한 적당한 것은 β(1,4)갈락토실트랜스퍼라제이며, 여기에는 예를 들어 EC 2.4.1.90(LacNAc 신테타제) 및 EC 2.4.1.22 (락토즈 신테타제)(소(D'Agostaro et al ., Eur . J. Biochem. 183: 211-217(1989)), 사람(Masri et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun. 157: 657-663(1988)), 쥐(Nakazawa et al ., J. Biochem. 104: 165-168(1988)), 그리고 E.C. 2.4.1.38 및 세라마이드 갈락토실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.45, Stahl et al ., J. Neurosci . Res. 38: 234-242(1994))가 포함된다. 다른 적당한 갈락토실트랜스퍼라제는 예를 들어 α1,2갈락토실트랜스퍼라제(예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe )로 부터 유래, Chapell et al ., Mol . Biol . Cell 5: 519-528(1994))를 포함한다.
본 발명의 실시에 적당한 것은 또한 문헌(참조: Cho, S. K. and Cummings, R. D. (1997) J. Biol . Chem ., 272, 13622-13628)에 보고된 것과 같은 α1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 r 가용성 형태이다.
c) 시알릴트랜스퍼라제
시알릴트랜스퍼라제는 본 발명의 재조합 세포 및 반응 혼합물에서 유용한 글리코실트랜스퍼라제의 또 다른 타입이다. 재조합 시알릴트랜스퍼라제를 생산하는 세포는 또한 시알릴트랜스퍼라제에 대한 시알산 공여체인 CMP-시알산을 생산할 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 시알릴트랜스퍼라제로는 ST3Gal III (예를 들어, 랫트 또는 사람 ST3Gal III), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II 및 ST6GalNAc III(본 명세서에서 사용된 시알릴트랜스퍼라제 명명은 Tsuji et al ., Glycobiology 6: v-xiv(1996)에 기술되어 있다)를 들 수 있다. α(2,3)시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.6)로 인용되는 예시적인 α(2,3)시알릴트랜스퍼라제는 Galβl→3Glc 디사카라이드 또는 글리코시드의 비환원성 말단 Gal에 시알산을 전이시킨다(참조: Van den Eijnden et al ., J. Biol. Chem. 256: 3159(1981), Weinstein et al ., J. Biol . Chem. 257: 13845 (1982) and Wen et al ., J. Biol . Chem. 267: 21011(1992)). 또 다른 예시적인 α2,3-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.4)는 디사카라이드 또는 글리코시드의 비환원성 말단 Gal에 시알산을 전이시킨다(참조: Rearick et al ., J. Biol . Chem. 254: 4444 (1979) and Gillespie et al ., J. Biol . Chem. 267: 21004 (1992)). 추가의 예시적인 효소는 Gal-β-1,4-GlcNAc α-2,6 시알릴트랜스퍼라제를 포함한다(참조: Kurosawa et al ., Eur . J. Biochem . 219: 375-381(1994)).
바람직하게는, 글리코펩티드의 탄수화물의 글리코실화에 있어서, 시알릴트랜스퍼라제는 완전히 시알화된 탄수화물 구조 상의 말단 시알산의 기초를 이루는 가 장 일반적인 끝에서 두번째(penultimate) 서열 Galβ1,4GlcNAc- 에 시알산을 전이시킬 수 있을 것이다(표 5 참조).
Figure 112006055848460-PCT00058
수용체 기질로서 Galβl,4GlcNAc 서열을 사용하는 시알릴트랜스퍼라제
1) Goochee et al ., Bio / Technology 9: 1347-1355 (1991)
2) Yamamoto et al ., J. Biochem. 120: 104-110 (1996)
3) Gilbert et al ., J. Biol . Chem. 271: 28271-28276 (1996)
청구된 방법에서 유용하게 사용되는 시알릴트랜스퍼라제의 예는 α(2,3)시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.6)로도 인용되는 ST3Gal III이다. 이 효소는 Galβ1,3GlcNAc 또는 Galβ1,4GlcNAc 글리코시드의 Gal에 시알산의 전이를 촉매하고(참조: 예를 들어, Wen et al ., J. Biol . Chem. 267: 21011(1992); Van den Eijnden et al ., J. Biol . Chem. 256: 3159(1991)), 글리코펩티드에서 아스파라긴-결합된 올리고사카라이드의 시알화를 담당한다. 시알산은 Gal에 결합되어 2개의 사카라이드 사이에 α-연결을 형성한다. 사카라이드 사이의 결합(연결)은 NeuAc의 2-위치와 Gal의 3-위치 사이에 있다. 이 특별한 효소는 랫트의 간(Weinstein et al ., J. Biol . Chem. 257: 13845(1982))으로부터 분리될 수 있으며; 사람 cDNA 서열(Sasaki et al. (1993) J. Biol . Chem . 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol . Chem. 269: 1394-1401) 및 게노믹(Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938) DNA 서열이 공지되어 재조합 발현에 의해 이 효소를 생산하는 것을 촉진하고 있다. 또 다른 구체예에서, 청구된 시알화 방법은 랫트 ST3Gal III을 사용한다.
본 발명에서 사용되는 다른 예시적인 시알릴트랜스퍼라제로는 α(2,3)을 포함하여 캄파일로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 분리된 것을 들 수 있다(예를 들어, WO99/49051).
표 5에 열거된 것 이외의 시알릴트랜스퍼라제도 상업적으로 중요한 글리코펩티드의 시알화를 위한 경제적이고 효율적인 대량 스케일 공정에서 유용하게 사용된다. 이들 효소의 유용성을 확인하기 위한 간단한 테스트로서 다양한 양의 각 효소(1-100 mU/mg 단백질)를 아시알로-α1 AGP(1-10 mg/ml)와 반응시켜 관심있는 시알릴트랜스퍼라제가 소의 ST6Gal I 또는 ST3Gal III 또는 양쪽 모두의 시알릴트랜스퍼라제와 비교하여 글리코펩티드를 시알화시키는 능력을 비교한다. 또는, 다른 글리코펩티드 또는 글리코펩티드, 또는 펩티드 골격으로부터 효소적으로 분리된 N-결합된 올리고사카라이드가 이러한 평가에서 아시알로-α1 AGP 대신에 사용될 수 있다. ST6Gal I 보다 효율적으로 글리코펩티드의 N-결합된 올리고사카라이드를 시알화시키는 능력을 가진 시알릴트랜스퍼라제는 펩티드 시알화를 위한 실제적인 대량 스케일 공정에서 유용하게 사용된다(본 명세서에서 ST3Gal III에 대해 설명된 바와 같다). 다른 예시적인 시알릴트랜스퍼라제가 도 10에 나타나 있다.
d) GalNAc 트랜스퍼라제
N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제는 본 발명을 실시하는데, 특히 펩티드의 O-결합된 글리코실화 부위의 아미노산에 GalNAc 부분을 결합시키는데 사용된다. 적당한 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제로는 α(1,3) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제, β(1,4) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(참조: Nagata et al ., J. Biol . Chem. 267: 12082-12089 (1992) 및 Smith et al ., J. Biol . Chem. 269: 15162 (1994)) 및 폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(참조: Homa et al., J. Biol . Chem. 268: 12609 (1993))를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
유전공학적 방법에 의해 클로닝된 유전자로부터 효소 GalNAc TI - XX 와 같은 단백질을 생산하는 방법이 주지되어 있다(예를 들어, U.S. Pat. No. 4,761,371). 어떤 방법에서는 충분한 샘플을 수집한 다음 효소의 아미노산 서열을 N-말단 서열분석에 의해 결정한다. 이 정보는 곤충 세포주 Sf9 에서 발현된 전체 길이(막 결합된) 트랜스퍼라제를 암호화하는 cDNA 클론을 분리하는데 사용되며, 그 결과 완전히 활성인 효소를 합성할 수 있다. 그 후 16개의 상이한 단백질에서 공지의 글리코실화 부위를 둘러싸는 아미노산 서열의 반정량적인 분석 및 합성 펩티드의 시험관내 글리코실화 연구를 통해 효소의 수용체 특이성을 결정한다. 이러한 작업의 결과 어떤 아미노산 잔기가 글리코실화된 펩티드 세그먼트에서 과도하게 존재하며, 글리코실화된 세린 및 트레오닌 잔기를 둘러싸는 특정 위치의 잔기가 다른 아미노산 부분에 비해 수용체 효율성에 있어서 좀더 뚜렷한 영향력을 행사함이 밝혀졌다.
2. 설포트랜스퍼라제
본 발명은 또한 설페이트화된 분자, 예를 들어 설페이트화된 폴리사카라이드, 예를 들어 헤파린, 헤파란 설페이트, 카라기넨 및 관련 화합물을 포함하는 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 적당한 설포트랜스퍼라제는, 예를 들어, 콘드로이틴-6-설포트랜스퍼라제(Fukuta et al ., J. Biol . Chem . 270: 18575-18580 (1995)에 의해 기술된 병아리 cDNA; GenBank Accession No. D49915), 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라제/N-설포트랜스퍼라제 1(Dixon et al ., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918) 및 글리코사미노글리칸 N-아세틸글루코사민 N-데아세틸라제/N-설포트랜스퍼라제 2(Orellana et al ., J. Biol . Chem. 269: 2270-2276 (1994) 및 Eriksson et al ., J. Biol . Chem. 269: 10438-10443 (1994)에 의해 기술된 쥐의 cDNA; GenBank Accession No. U2304에 기술된 사람 cDNA)를 포함한다.
3. 세포-결합된 글리코실트랜스퍼라제
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서 이용되는 효소는 세포-결합된 글리코실트랜스퍼라제이다. 많은 가용성 글리코실트랜스퍼라제가 공지되어 있기는 하지만(예를 들어, U. S. Pat. No. 5,032,519), 글리코실트랜스퍼라제는 세포와 결합되는 경우 일반적으로 막-결합된 형태이다. 지금까지 연구된 많은 막-결합된 효소가 내재된(intrinsic) 단백질인 것으로 생각된다; 즉, 그들은 초음파 처리에 의해 막으로부터 방출되지 않으며 가용화되기 위해서는 세제가 필요하다. 표면 글리코실트랜스퍼라제가 척추 및 무척추 세포의 표면에서 확인되었으며, 이들 표면 트랜스퍼라제들은 생리적 조건하에서 촉매 활성을 유지하는 것으로 인식되었다. 그러나, 세포 표면 글리코실트랜스퍼라제에 대해 좀더 인식된 기능은 세포간 인식에 대한 것이다(참조: Roth, MOLECULAR APPROACHES to SUPRACELLULAR PHENOMENA, 1990).
세포에 의해 발현된 글리코실트랜스퍼라제를 변경하기 위한 방법들이 개발되었다. 예를 들어, 문헌(Larsen et al ., Proc . Natl . Acad Sci. USA 86: 8227-8231(1989))에서는 세포 표면 올리고사카라이드 구조의 발현을 결정하는 크로닝된 cDNA 서열을 분리하기 위한 유전자적 접근법 및 그들의 동종(cognate) 글리코실트랜스퍼라제를 보고하고 있다. UDP-갈락토즈 : β-D-갈락토실-1,4-N-아세틸-D-글루코사미니드 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 발현시키는 것으로 알려진 쥐의 세포주로부터 분리된 mRNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리가 COS-1 세포로 형질감염되었다. 형질감염된 세포를 배양하고 α 1-3 갈락토실트랜스퍼라제 활성을 에세이하였다.
문헌(Francisco et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89: 2713-2717 (1992))에서는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)의 외부 표면에 β-락타마제를 고정시키는 방법을 개시하고 있다. (i) 외부 막 단백질의 시그널 서열, (ii) 외부 막 단백질의 막 경유 섹션 및 (iii) 온전한 성숙 β-락타마제 서열로 구성된 3자 융합이 이루어져 활성 표면 결합된 β-락타마제 분자를 생성한다. 그러나, 프란시스코의 방법은 원핵 세포 시스템에만 한정되어 있고, 저자에 의해 인식된 바와 같이 적절한 기능을 위해서는 완전한 3자 융합을 필요로 한다.
4. 융합 단백질
다른 예시적인 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 목적하는 글리코펩티드 콘쥬게이트를 합성하는데 필요한 효소적 활성을 한가지 초과하여 가진 융합단백질을 이용한다. 융합 폴리펩티드는 예를 들어 글리코실트랜스퍼라제의 촉매적 활성 도메인이 부속(accessory) 효소의 효소적 활성 도메인에 결합되어 구성된다. 부속 효소 촉매적 도메인은 예를 들어 글리코실트랜스퍼라제에 대한 공여체인 뉴클레오티드 당을 형성하는 단계를 촉매할 수도 있고, 글리코실트랜스퍼라제 사이클에 포함된 반응을 촉매할 수도 있다. 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프레임 내에서 뉴클레오티드 당 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 생성된 융합 단백질은 뉴클레오티드 당의 합성 뿐아니라 당 부분이 수용체 분자로 전이되는 것까지 촉매할 수 있다. 융합 단백질은 하나의 발현가능한 뉴클레오티드 서열과 연결된 2개 이상의 사이클 효소일 수 있다. 다른 구체예에서 융합 단백질은 2개 이상의 글리코실트랜스퍼라제의 촉매적 활성 도메인을 포함한다(예를 들어 5,641,668 참조). 본 발명의 변형된 글리코펩티드는 다양하고 적당한 융합 단백질들을 사용하여 쉽게 디자인되고 제조된다(예를 들어, 1999. 6. 24자 WO 99/31224호로 공개된 PCT Patent Application PCT/CA98/01180 참조).
5. 고정화된 효소
세포-결합된 효소에 추가하여, 본 발명은 또한 고체 및/또는 가용성 지지체 상에 고정된 효소의 사용을 제공한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 온전한 글리코실 링커를 통해 PEG에 콘쥬게이트된 글리코실트랜스퍼라제가 제공된다. PEG-링커-효소 콘쥬게이트는 임의로 고체 지지체에 결합한다. 본 발명의 방법에서 고체 지지된 효소를 사용하면 반응 혼합물의 후처리, 반응 생성물의 정제가 단순해지고 효소의 간편한 회수가 가능해진다. 글리코실트랜스퍼라제 콘쥬게이트가 본 발명의 방법에 사용된다. 효소 및 지지체의 다른 배합물들도 당업자에게는 자명할 것이다.
펩티드 콘쥬게이트의 정제
상기 방법에 의해 얻어진 생성물들은 정제없이 사용될 수 있다. 그러나 보통은 생성물을 회수하는 것이 바람직하다. 기본적으로, 얇은 또는 두꺼운 막 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 막 여과와 같이 글리코실화된 사카라이드의 회수에 대해 주지된 기술이 사용될 수 있다. 막 여과를 사용하는 것이 바람직하고, 역삼투 막 또는 하기 및 본 명세서에서 인용하고 있는 문헌에서 논의된 회수용 칼럼 크로마토그래피 기술의 하나 이상을 사용하는 것이 좀더 바람직하다. 예를 들어, 약 3000 내지 약 10,000의 분자량 컷오프를 가지는 막 여과를 사용하여 글리코실 트랜스퍼라제와 같은 단백질을 제거할 수 있다. 그 후, 나노여과 또는 역삼투를 사용하여 염을 제거하고/하거나 생성물인 사카라이드를 정제할 수 있다(예를 들어, WO 98/15581 참조). 나노필터 막은 사용된 막에 따라 일가 염은 통과시키지만 다가 염 및 약 100 내지 약 2,000 달톤보다 크고 전하를 갖지 않는 용질을 통과시키지 않는 역삼투막의 부류에 속한다. 따라서, 통상의 적용에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 사카라이드는 막을 통과하지 못하고 불순물 염은 통과할 것이다.
첫 번째 단계로서, 변형된 당단백질이 세포내에서 생산되면 미립자 파편, 숙주세포 또는 용해된 단편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거되며, 임의로 단백질은 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터를 사용하여 농축된 다음 면역친화성 크로마토그래피, 이온-교환 칼럼 분획화(예를 들어, 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 카복시메틸 또는 설포프로필 그룹을 함유하는 매트릭스 상), 블루-세파로즈, CM 블루-세파로즈, MONO-Q, MONO-S, 렌틸 렉틴-세파로즈, WGA-세파로즈, Con A-세파로즈, 에테르 토요펄, 부틸 토요펄, 페닐 토요펄, SP-세파로즈, 또는 단백질 A 세파로즈, SDS-PAGE 크로마토그래피, 실리카 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 역상 HPLC(예를 들어, 지방족 그룹이 결합된 실리카겔), 예를 들어 세파덱스 분자체 또는 분자량-배제(size-exclusion) 크로마토그래피를 이용하는 겔 여과, 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 칼럼의 크로마토그래피 및 에탄올 또는 암모늄 설페이트 침전 중에서 선택된 하나 이상의 단계에 의해 다른 불순물로부터 폴리펩티드 변이체를 분리한다.
배양액에서 생산된 변형된 글리코펩티드는 보통 세포, 효소 등으로부터 일차 추출된 다음, 농축, 염석(salting-out), 수성 이온-교환 또는 분자량-배제 크로마토그래피 단계, 예를 들어 SP 세파로즈의 하나 이상에 의해 분리된다. 또한, 변형된 당단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. HPLC가 하나 이상의 정제 단계에서 사용될 수도 있다.
프로테아제 억제제, 예를 들어 메틸설포닐플루오라이드(PMSF)가 단백질 분해(proteolysis)를 억제하는 상기 단계들 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 우발적 오염원의 성장을 차단하기 위해 항생제를 사용할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 변형된 글리코펩티드를 생산하는 시스템으로부터의 상등액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. 농축 단계 후에 농축물을 적당한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 예를 들어, 적당한 친화성 매트릭스는 적당한 지지체에 결합된 펩티드에 대한 리간드, 렉틴 또는 항체 분자를 포함한다. 또는, 예를 들어 펜던트 DEAE 그룹을 가진 매트릭스 또는 기질을 음이온-교환 수지로 사용할 수 있다. 적당한 매트릭스로는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 단백질 정제에서 통상 사용되는 다른 타입들을 들 수 있다. 또는 양이온-교환 단계를 사용할 수 있다. 적당한 양이온 교환제로는 설포프로필 또는 카복시메틸 그룹을 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 들 수 있다. 설포프로필 그룹이 특히 바람직하다.
마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 그룹을 가진 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계를 폴리펩티드 변이체 조성물을 추가로 정제하기 위해 사용할 수 있다. 상기 정제 단계들의 일부 또는 전부를 다양하게 조합하여, 균질한 변형 당단백질을 제공하는데 사용할 수 있다.
대량-스케일 발효를 통해 얻어진 본 발명의 변형 글리코펩티드는 문헌(참조: Urdal et al ., J. Chromatog. 296: 171 (1984))에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 정제될 수 있다. 이 문헌은 재조합 사람 IL-2를 분취용(preparative) HPLC 칼럼 상에서 정제하는 2개의 연속적인 RP-HPLC 단계를 기술한다. 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 기술을 변형 당단백질을 정제하는데 사용할 수 있다.
의약 조성물
본 발명의 방법에 따라 다양한 O-결합된 글리코실화 부위에서 변형된 폴리펩티드는 광범위하게 약제학적으로 적용된다. 예를 들어, 변형된 에리스로포이에틴(EPO)는 일반적 빈혈, 재생불량성 빈혈, 케모-유도된 손상(예를 들어 골수에 대한 손상), 만성 신부전, 신장염, 및 지중해 빈혈을 치료하는데 사용될 수 있다. 변형된 EPO는 또한 신경학적 질환, 예를 들어 뇌/척추 손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
두 번째 예는 AIDS 및 B형 또는 C형 간염, 다양한 바이러스, 예를 들어, 사람 파필로마바이러스(HBV), 코로나바이러스, 사람 면역결핍바이러스(HIV), 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 바리셀라-조스터 바이러스(VZV)에 의해 유발된 바이러스 감염, 암, 예를 들어, 모상세포백혈병, AIDS-관련 카포시 육종, 악성 흑색종, 여포성 비-호지킨 림프종, 필라델피아 염색체(Ph)-양성, 만성기 골수성 백혈병(CML), 신장암, 골수종, 만성 골수성 백혈병, 머리 및 목의 암, 골암(bone cancer), 및 자궁경부 이형화 및 다발성 경화증과 같은 중추신경계(CML) 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 인터페론-α(IFN-α)이다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 변형된 IFN-α는 쇼그렌증후군(자가면역 질환), 베체트병(자가면역 염증성 질환), 섬유조직염(근골격 통증/피로 질환), 아프타성 구내염(canker sores), 만성 피로 증후군, 및 폐섬유증과 같은 다른 유형별 질환 및 증상의 치료에 유용하다.
또 다른 예는 CNS 질환, 예를 들어 다발성 경화증(재발성/이장성 또는 만성 진행성), AIDS 및 B형 또는 C형 간염, 사람 파필로마바이러스(HBV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 바리셀라-조스터 바이러스(VZV)와 같은 다양한 바이러스에 의해 유발된 바이러스 감염, 이과학적 감염, 근골격 감염, 및 암, 예를 들어 유방암, 뇌암, 직장암, 비소세포 폐암, 두부 및 목의 암, 기저 세포암, 자궁경부 이형화, 흑색종, 피부암 및 간암을 치료하는데 유용한 인터페론-β이다. 본 발명의 방법에 따라 변형된 IFN-β는 또한 이식 거부(예를 들어, 골수 이식), 헌팅톤 무도병, 대장염, 뇌 염증, 폐섬유증, 황반변성, 간경변 및 각결막염과 같은 다른 질환 및 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)는 또 다른 예이다. 본 발명의 방법에 따라 변형된 G-CSF는 암을 치료하기 위한 화학요법에서 어떤 의료 절차와 관련된 증상 또는 합병증, 예를 들어, 화학요법-유도된 골수 손상; 류코페니아(일반); 화학요법-유도된 발열성 뉴트로페니아; 골수 이식과 관련된 뉴트로페니아; 및 심각한 만성 뉴트로페니아를 예방하거나 경감시키기 위한 보조제로 사용될 수 있다. 변형된 G-CSF는 또한 이식; 말초 혈구 세포 유동화(mobilization); 수절단성(myeloablative) 또는 수억제성(myelosuppressive) 화학요법을 받는 환자에서의 회수용 말초 혈액 선조 세포의 유동화; 및 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 유도/통합 치료후 뉴트로페니아, 발열, 항생제 사용, 입원 기간의 감소에 사용될 수 있다. 천식 및 알러지성 비염을 포함한 다른 증상 또는 질환의 치료에 변형된 G-CSF를 사용할 수 있다.
추가의 실시예로서, 본 발명의 방법에 따라 변형된 사람 성장 호르몬(hGH)이 성장-관련 증상, 예를 들어, 소인증, 아이와 어른의 작은 신장, 악액질/근육 소모, 일반적인 근위축 및 성염색체 이상(예를 들어, 터너 증후군)을 치료하는데 사용될 수 있다. 변형된 hGH를 사용하여 치료할 수 있는 다른 증상으로는 작은-창자 증후군, 지방이영양증, 골다공증, 유리마이어(uraemaia), 화상, 여성 불임증, 골재생, 일반 당뇨, 타입 II 당뇨, 골관절염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 및 불면증(insomia)을 들 수 있다. 또한, 변형된 hGH는 또한, 예를 들어 일반적인 조직 재생, 골재생 및 상처 치유와 같은 다양한 과정을 촉진하기 위해 사용되거나 백신 보조제로서 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제 및 비천연적으로 발생하는 수용성 중합체, 치료 부분 또는 생체분자와 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 펩티드 사이의 공유결합 콘쥬게이트를 포함한다. 중합체, 치료 부분 또는 생체분자는 펩티드와 중합체, 치료 부분 또는 생체분자 양쪽에 공유적으로 결합되고 이들 사이에 걸쳐있는 온전한 글리코실 링커 그룹을 통해 펩티드에 콘쥬게이트된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적당하다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 제형은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985))을 참조할 수 있다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 리뷰는 문헌(Langer, Science 249: 1527-1533 (1990))을 참조한다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 국소 투여, 경구 투여, 비강 투여, 정맥 투여, 두개내 투여, 복강내 투여, 피하 투여 또는 근육내 투여를 포함하는 투여 방식에 따라 적당하게 제형화될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 피하 주사에서 담체는 바람직하게는 물, 식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여에서, 상기 담체중의 어느 하나 또는 고체 담체, 예를 들어, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈쿰, 셀룰로즈, 글루코즈, 수크로즈 및 마그네슘 카보네이트를 사용할 수 있다. 미소 구체(microsphere; 예를 들어 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)와 같은 생분해가능한 매트릭스를 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로 사용할 수 있다. 적당한 생분해가능한 미소 구체가 예를 들어 문헌(U. S. Patent Nos. 4,897,268 및 5,075,109)에 개시되어 있다.
통상, 약제학적 조성물은 피하적으로 또는 비경구적으로, 예를 들어 정맥주사에 의해 투여된다. 따라서 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수용성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된 화합물을 함유하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 조성물은 또한 트윈 20 및 트윈 80과 같은 세제; 만니톨, 솔비톨, 수크로즈 및 트레할로즈와 같은 안정화제; 및 EDTA 및 m-크레졸과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하기에 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제 및 완충제, 강장조절제, 습윤제, 세제 등을 포함할 수 있다.
이들 조성물은 통상의 멸균 기술에 의해 멸균화되거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그 상태로 사용되기 위해 포장될 수도 있고, 동결 건조되어 동결 건조된 제제가 투여 전에 멸균 수용성 담체와 혼합될 수 있다. 제제의 pH는 보통 3 내지 11이고, 좀더 바람직하게는 5 내지 9이며, 가장 바람직하게는 7 내지 8이다.
일부 구체예에서 본 발명의 글리코펩티드는 표준 비히클-형성 리피드로부터 형성된 리포솜으로 혼입될 수 있다. 리포솜을 제조하는데 문헌(예를 들어, Szoka et al ., Ann . Rev . Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980), U. S. Pat. Nos. 4,235,871, 4, 501,728 및 4,837,028)에 기재된 다양한 방법들을 이용할 수 있다. 다양한 표적화 제제(예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토시드)를 사용하여 리포솜을 표적화하는 방법이 당업계에 주지되어 있다(참조: 예를 들어 U. S. Patent Nos. 4,957,773 및 4,603,044).
표적화 제제를 리포솜에 커플링시키는 표준 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 포스파티딜에탄올아민과 같은 리피드 성분의 리포솜 내의 혼입을 포함하며, 이는 표적화 제제 또는 리피드-유도체화된 본 발명의 글리코펩티드와 같이 유도체화된 친유성 화합물의 결합에 대해 활성화될 수 있다.
표적화 메카니즘은 일반적으로 표적화 제제가 리포솜의 표면에 위치하여 표적화 부분이 표적, 예를 들어, 세포 표면 수용체와 상호작용할 수 있기를 요구한다. 본 발명의 탄수화물은 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, 장쇄 알킬 할라이드 또는 지방산을 각각 사용하여 탄수화물에 존재하는 하이드록실 그룹의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 리포솜이 형성되기 전에 리피드 분자에 결합할 수 있다. 또는, 연결 부분이 먼저 막 형성 시점에 막에 혼입되는 것과 같은 방식으로 리포솜이 형성될 수도 있다. 연결 부분은 막에 단단하게 파묻혀 부착되는 친유성 부분을 포함하여야 한다. 이는 또한 리포솜의 수용성 표면에서 화학적으로 이용할 수 있는 반응성 부분을 포함하여야 한다. 반응성 부분은 나중에 첨가되는 표적화 제제 또는 탄수화물과 안정한 화학 결합을 형성하기에 화학적으로 적당한 것으로 선택된다. 어떤 경우에는 표적화 제제를 연결 분자에 직접적으로 결합시키는 것이 가능하지만, 대부분의 경우 화학적 가교로서 작용하여 막에 있는 연결 분자를 3차원적으로 소포(vesicle) 표면 밖으로 연장된 표적화 제제 또는 탄수화물과 결합시키는 제3의 분자를 이용하는 것이 좀더 적당하다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 화합물은 또한 진단 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 화합물을 사용하여 염증을 가진 것으로 의심되는 환자에서 염증 또는 종양 전이의 영역을 표시할 수 있다. 이러한 목적으로 화합물을 125I, 14C, 또는 트리튬으로 표지할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 콘쥬게이트 및 방법을 설명하기 위해 제공된 것일 뿐, 청구된 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
1.1a 인터페론 알파-2β- GalNAc (pH 6.2)의 제조
인터페론 알파-2β 4 mg에 물 200 μL를 첨가하여 IFN 알파-2β를 재구성하였다. 고체가 용해되었을 때 반응 완충액(20 mM MES, pH 6.2, 150 mM NaCl, 5 mM MgC12, 5 mM MnCl2, 0.05% 폴리솔베이트 및 0.05% NaN3) 1.92 mL를 가하였다. 그 후, UDP-GalNAc(4.16 mg; 3 mM) 및 GalNAc T2(80 mU; 80 μL)를 가하고 반응 혼합물을 천천히 회전 운동시키면서 32℃에서 배양하였다. MALDI 분석을 이용하여 반응을 모니터하였으며 72 h 후에 실질적으로 완결되었다. 완결 후, 반응 혼합물을 펩티드 매핑(mapping)과 부위 점유의 분석에 사용하였다.
1.1b 인터페론 알파-2β- GalNAc ( pH 7.4)의 제조
제조업자에 의해 기술된 방법으로 인터페론 알파 2β를 재구성하였다. 물 50 μL를 IFN 알파-2β 50 ㎍에 가하였다. 고체가 용해되었을 때, 반응 완충액(20 mM MES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 0.05% 폴리솔베이트 및 0.05% NaN3) 50 μL를 가하였다. 그 후, UDP-GalNAc(100㎍; 3 mM) 및 GalNAc T2(8 mU; 8 μL)를 가하고, 반응 혼합물을 천천히 회전 운동시키면서 32℃에서 배양하였다. MALDI 분석을 이용하여 반응을 모니터하였으며 약 48 내지 72 h 내에 완결된 것으로 관찰되었다.
1.2 CMP - SA - PEG 및 ST6GalNAcI 를 사용한 인터페론-알파-2β- GalNAc - SA - PEG -20킬 로달톤의 제조
상기 1.1에서 얻은 IFN-알파-2β-GalNAc(1.0 mL, ~2 mg, 0.1 μmole)을 5 킬로달톤 MWCO 필터 센트리콘 카트리지를 사용하여 완충액 교환(2x)하고 두번째 완충액(20 mM MES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 0.05% 폴리솔베이트 및 0.05% NaN3)으로 교환하였다. 두번째 완충액 1.0 mL를 사용하여 스핀 카트리지로부터 IFN-알파-2β-GalNAc을 재구성하고, CMP-SA-PEG-20킬로달톤(10 mg, 0.5 마이크로몰) 및 ST6GalNAcl(200 μL)를 둘다 반응 혼합물에 가하였다. 천천히 회전 운동시키면서 96 h 동안 32℃에서 반응액을 배양하였다. 생성물인 IFN-알파-2β-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤을 SP 세파로즈 및 SEC (수퍼덱스 75) 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 시알산-PEG의 첨가를 MALDI 분석법으로 확인하였다.
1.3. CMP - SA - PEG , 코어-1-β1,3- 갈락토실 - 트랜스퍼라제 및 ST3Gal2 를 사용한 인터페론-알파-2β- GalNAc - Gal - SA - PEG - 20킬로달톤의 제조
상기 기재된 GalNAc(pH 6.2)의 첨가로부터 얻어진 IFN-알파-2β-GalNAc(1.0 mL, ~2 mg, 0.1 μmole)을 5 킬로달톤 MWCO 필터 센트리콘 카트리지 및 두 번째 완충액(20 mM MES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 0.05% 폴리솔베이트 및 0.05% NaN3)를 사용하여 완충액 교환하였다(x2). 1.0 mL의 두 번째 완충액을 사용하여 CMP-SA-PEG-20킬로달톤(10 mg, 0.5 마이크로몰), UDP-갈락토즈(1.8 mg, 3 mM), 코어-1-β1,3-갈락토실-트랜스퍼라제(수지 상 200 mU) 및 ST3Gal2(200 mU, α 2,3-(O)-시알릴트랜스퍼라제)를 포함하는 IFN-알파-2β-GalNAc를 스핀 카트리지로부터 재구성하였다. 천천히 회전 운동시키면서 96 h 동안 32℃에서 반응 혼합물을 배양하였다. 생성물인 IFN-알파-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20킬로달톤을 SP 세파로즈 및 SEC (수퍼덱스 75) 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 시알산-PEG의 첨가를 MALDI 분석법으로 확인하였다.
1.9 단백질 농도 에세이
1 cm 투과 길이의 셀을 사용하여 280 nm의 고정된 흡광도에서 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 물 및 완충액을 대조군으로 하여 시험 샘플에 대해 3회씩 측정하였다. 0.799 mL/mg 단백질의 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
1.10 최종 생성물의 제제
제제 완충액은 발열물질(pyrogen)이 없는 PBS, pH 6.5, 2.5% 만니톨 및 0.05% 폴리솔베이트 80을 함유하며 진공으로 탈기시키고 멸균 여과하였다(0.2 ㎛).
5배 칼럼 부피의 제제 완충액(PBS, pH 6.5, 2.5% 만니톨 및 0.05% 폴리솔베이트 80)으로 평형화된 Detoxi-GelTM 을 사용하여 내독소(endotoxin)를 제거하였다. 중력에 의해 유속을 ~0.3 mL/분으로 조절하였다. 생성물 샘플을 겔에 적용하고 제제 완충액을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 추가의 제제 완충액으로 회수된 생성물의 부피를 조절하여 약 100 ㎍/mL의 단백질 농도를 제공하였다.
펩티드 제제를 멸균 여과(0.2 μ)하고, 발열물질이 없는 2.0 mL 바이알 당 1 mL 분획 씩 분배하였다. 또한, 내독소 및 단백질 분석을 위해 분획을 취하였다. 모든 생성물을 4℃에서 보관하였다.
1.13 약물동력학 연구
방사성요오드화된 단백질을 사용하여 약물동력학 분석을 수행하였다. 표지된 인터페론을 랫트에 IV 꼬리 정맥 주사에 의해 투여한 후, 72 h 동안 정해진 간격으로 혈액 내 방사능의 감소로서 정화율(clearance rate)을 측정하였다. 각 시간 포인트별로 적어도 5마리의 랫트를 측정하였다.
1.14 결과
GalNAc-T2의 반응 속도를 2개의 pH, 중성 pH(7.4) 및 약산성 pH(6.2)에서 측정하였다. GalNAc 에 의한 글리코실화는 pH 6.2 및 pH 7.4에서 모두 성공적으로 진행되었다. 반응 진행에 대한 MALDI 분석에서 알 수 있듯이, 반응 속도는 pH 6.2에서보다 pH 7.4에서 더 빨랐다.
pH 6.2 또는 pH 7.4에서 GalNAc-T2 및 GalNAc를 인터페론 알파-2β에 정량적으로 가하였다. 반응 후 MALDI를 수행하였다. 효소적 반응 중에 새로운 인터페론 알파 질량(mass) 이온이 형성되었다(IFN-알파-2b 19,281 Da 및 IFN-알파-2β-GalNAc, 19,485 Da).
pH 6.2에서의 반응 생성물인 IFN-알파-2b-GalNAc을 분석하여 단백질 상의 GalNAc 치환 위치를 결정하였다. 이러한 목적으로 펩티드 매핑 및 부위 점유 매핑을 사용하였다. LC-MS/MS의 TIC 및 IFN-알파-2b의 GluC 분해물을 사용한 펩티드 매핑의 결과 질량 1018.69의 펩티드 단편이 생성되었다. GalNAc를 포함하는 1018.69의 펩티드 매스 이온을 MS/MS 펩티드 아미노산 서열분석한 결과 당이 T106에 결합된 것으로 나타났다.
ST6GalNAc-1 및 CMP-SA-PEG-20킬로달톤을 사용하여 IFN-알파-2b-GalNAc의 시알릴-PEG화를 조사하였다. IFN-알파-2b-GalNAc의 반응 결과 SDS PAGE에 의해 관찰되는 PEG-화된 단백질이 생성되었다. 일반적으로, 반응은 96 h 동안 32℃에서 진행되었다. 반응을 SDS PAGE로 모니터하였다. SDS PAGE에 의해 약 70%의 IFN-알파-2b-GalNAc이 IFN-알파-2b-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤으로 전환되었음을 알 수 있었다. 새로운 밴드를 MALDI 분석한 결과 IFN-알파-2b-GalNAc-SA-PEG-20 킬로달톤의 질량인 41,500 달톤의 매스 이온임이 확인되었다.
GalNAc-Gal-SA-PEG 구조를 포함하는, PEG-화된 인터페론 알파-2b의 글리코형태도 생성되었다. 반응은 상기 기술된 조건을 사용하여 수행되었다. SDS PAGE에 의해 목적하는 생성물을 검출하였다. IFN-알파-2β-GalNAc과 함께 코어-1-β3-갈락토실트랜스퍼라제-1,ST3Gal2, UDP-갈락토즈 및 CMP-SA-PEG-20킬로달톤을 출발물질로 하는 원 팟(one pot), 2단계 반응에 의해 목적하는 생성물을 얻었다. 반응은 96 h 동안 32℃에서 배양하여 이루어졌다. 반응을 SDS PAGE로 모니터하였다. 24 h 후, 약 70%의 반응이 완결되었다. 생성물의 MALDI 결과, 목적하는 IFN-알파-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20킬로달톤 생성물로부터 유래된 41,900 Da의 매스 이온이 확인되었다.
PEG-화된 인터페론 알파-2b 생성물의 양쪽 글리코형태를 2 단계 공정으로 정 제하였다. 첫 번째 단계에서는 SP 세파로즈를 사용하여 이온-교환 크로마토그래피를 수행하였다. 이 단계에 의해 미반응 PEG 물질이 제거되고 다른 단백질이 일부 분리되었다. 이온 교환 단계 후에 SEC 상에서의 분리가 수행되었다. 글리코실트랜스퍼라제 및 PEG-화되지 않은 인터페론 알파를 포함하여, 잔류하는 더 작은 단백질들을 제거하기 위해 수퍼덱스 75 칼럼을 사용하였다. 인터페론 알파의 PEG-화된 양쪽 글리코형태는 SDS PAGE에 의해 알 수 있는 바와 같이 90% 이상으로 정제되었다.
항바이러스 데이터에 의해 PEG-화된 글리코형태 A 및 B가 둘다 그들의 항바이러스 효과를 보유함을 알 수 있었다.
방사성요오드화되고 PEG-화된 단백질을 꼬리 정맥을 통하여 랫트에 주입한 결과, 양쪽 단백질에 대한 AUC가 PEG-화되지 않은 인터페론 알파-2β에 비해 5-7배 증가하였다.
글리코형태 A(IFN-알파-2β-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤) 및 B(IFN-알파-2β-GalNAc-Gal-SA-PEG-20킬로달톤)는 둘다 생활성을 보유하였다.
실시예 2
2.1 G- CSF - GalNAc ( pH 6.2)의 제조
완충액 3.2 mL 중의 G-CSF 960 ㎍을 UF 필터(5킬로달톤)를 사용하여 한외여과로 농축시키고 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3) 1 mL로 재구성하였다. 그 후, UDP-GalNAc(6 mg, 9.24 mM), GalNAc-T2(40 ㎕, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2(40 ㎕, 4 mM)를 가하고 생성된 용액을 실온에서 48 시간동안 배양하였다. 48 시간 후, MALDI 결과 반응이 완결되었음을 알 수 있었다(매스 이온이 18800에서 19023 매스 유닛으로 이동). 반응 혼합물을 SEC(수퍼덱스 75 및 수퍼덱스 200)을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 포스페이트 완충된 식염수(pH 4.9, 0.005% 트윈 80)를 사용하여 칼럼을 용출시켰다. G-CSF-GalNAc에 상응하는 피크를 회수하여 센트리콘 5킬로달톤 필터를 사용하여 약 150 ㎕까지 농축시키고 PBS(포스페이트 완충된 식염수, pH 4.9, 0.005% 트윈 80)를 사용하여 1 mL로 부피를 조절하였다; 단백질 농도는 1 mg/mL A280 이었다.
2.2 G- CSF - GalNAc - Gal ( pH 6.0)의 제조
G-CSF-GalNAc(100 ㎍)을 25 mM MES 완충액, pH 6.0, 1.5 mM UDP-GalNAc, 10 mM MgCl2 및 80 mU GalNAc-T2를 포함하는 용액 100 ㎕에 가하였다. 그 후, CMP-SA-PEG-20킬로달톤(0.5 mg, 0.025 μmole), UDP-갈락토즈 75 ㎍(0.125 μmole), 코어-1-Gal-T 20 ㎕(10 mU)을 가하고, 용액을 32 ℃에서 24 시간동안 천천히 진탕시켰다. G-CSF-GalNAc이 G-CCSF-GalNAc-Gal로 완전히 전환되었음을 MALDI로 확인하였다.
2.3 G- CSF - GalNAc - SA - PEG - 20킬로달톤 (C)의 제조
2.3a 연속 공정(pH 6.2)
단백질 1 mg을 포함하는 G-CSF-GalNAc 용액을 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3)으로 완충액 교환한 다음, 5 mg(0.25 μmole)의 CMP-SA-PEG (20킬로달톤)을 첨가하였다. 마지막으로, 100 ㎕의 100 mM MnCl2 용액 및 ST6GalNAc-I (100 ㎕)를 가하고, 반응 혼합물을 32 ℃에서 천천히 진탕시켰다. 일정한 시간 지점(24, 48 및 72 h)에 분획을 취하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 24 h 후, 추가의 반응이 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 스핀 여과(5킬로달톤)에 의해 농축하고, 25 mM NaOAc(pH 4.9)에 대하여 완충액 교환하고 1 mL로 농축하였다. 이온 교환(SP-세파로즈, 25 mM NaOAc, pH 4.9) 및 SEC(수퍼덱스 75;PBS-pH 7.2, 0.005% 트윈 80, 1 ml/분)를 사용하여 생성물을 정제하였다. 목적하는 분획을 모아서 0.5 mL로 농축하고 4 ℃에서 보관하였다.
2.3b ST6GalNAc-I(pH 6.0)을 이용한 원 팟 공정
3.2 mL의 생성물 제제 완충액에 용해된 960 ㎍의 G-CSF 단백질을 스핀 여과(5킬로달톤)로 0.5 mL까지 농축하고, 약 1 mL의 총 부피 또는 1 mg/mL의 단백질 농도를 갖도록 25 mM MES 완충액(pH 6.0, 0.005% NaN3)에서 재구성하였다. 재구성 후, UDP-GalNAc(6 mg, 9.21 μmol), GalNAc-T2(80 ㎕, 80 mU), CMP-SA-PEG-20킬로달톤(6 mg, 0,3 μmol) 및 마우스 효소 ST6GalNAc-I(120 ㎕)를 가하였다. 용액을 48 시간동안 32 ℃에서 진탕하였다. 반응 후, 상기 기재된 SP-세파로즈 및 SEC 상의 표준 크로마토그래피 조건을 사용하여 생성물을 정제하였다. 약 50%의 총 수율에 해당하는 총 0.5 mg의 단백질(A280)이 얻어졌다. 생성물 구조를 MALDI 및 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다.
2.4 G- CSF - GalNAc - Gal - SA - PEG - 20킬로달톤 (D)의 제조
2.4a G-CSF-GalNAc으로부터의 출발
UDP-갈락토즈(4 mg, 6.5 μmole), 코어-1-Gal-T1(320 ㎕, 160 mU), CMP-SA-PEG-20킬로달톤(8 mg, 0.4 μmole), ST3Gal2(80 ㎕, 0.07 mU) 및 80 ㎕의 100 mM MnCl2를 실시예 2.1(상기)에서 얻어진 25 mM MES 완충액(pH 6.0) 중의 G-CSF-GalNAc(1.5 mg)의 조 반응 혼합물 1.5 mL에 직접 가하였다. 반응 혼합물을 32 ℃에서 60 시간 동안 배양하였으나, 반응은 24 h 후에 완결되었다. 반응 혼합물을 원심분리하고 용액을 한외여과(5킬로달톤)로 0.2 mL까지 농축한 다음 25 mM NaOAc (pH 4.5)에 다시 녹여 최종 부피 1 mL가 되도록 하였다. SP-세파로즈를 사용하여 생성물을 정제하고, 피크 분획을 스핀 필터(5킬로달톤)로 농축하고 잔류물을 SEC(수퍼덱스 75)를 사용하여 추가 정제하였다. 스핀 필터(5킬로달톤)를 사용하여 농축한 다음, PBS, 2.5% 만니톨, 0.005% 폴리솔베이트, pH 6.5로 구성된 제제 완충액을 사용하여 단백질을 1 mL로 희석하고, 단백질 농도를 mL 당 850 ㎍ 단백질(A280)로 조절하였다. 전체 수율은 55%이었다. MALDI 분석 결과를 도 28에 나타내었다.
2.4b G-CSF로부터의 출발
960 ㎍의 G-CSF(3.2 mL)를 스핀 필터(5킬로달톤)로 농축하고 25 mM MES 완충액(pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 재구성하였다. G-CSF 용액의 총 부피를 약 1 mg/mL로 조정한 다음, UDP-GalNAc(6 mg), GalNAc-T2(80 ㎕), UDP-갈락토즈(6 mg), 코어-l- Gal-Tl(160 ㎕, 80 μU), CMP-SA-PEG(20킬로달톤)(6 mg), ST3Gal-2(160 ㎕, 120 μU) 및 MnCl2(100 mM 용액 40 ㎕)를 가하였다. 생성된 혼합물을 48 h 동안 32 ℃에서 배양하였다.
2.5 SP 세파로즈 HPLC 크로마토그래피
실시예 1.4에 기술된 방법으로 SP 세파로즈를 수행하였다
2.6 분자량 배제(Size Exclusion) 크로마토그래피
실시예 1.5에 기술된 방법으로 SEC를 수행하였다. 정제된 샘플은 4℃에서 보관하였다.
2.6a 소수성 상호작용 크로마토그래피( HIC )
첫 번째 단계의 크로마토그래피를 수행한 후, HIC를 PEG-화되지 않은 G-CSF 이외의 불순물을 제거하기 위한 두 번째 정제 단계로 사용할 수 있다. 따라서, 겔 투과 칼럼 상의 초기 정제를 통해 얻어진 글리코PEG화된 G-CSF의 정제를 위해 이용될 수 있는 방법이다.
2.7 SDS PAGE 분석
실시예 1.6에 기술된 방법으로 SDS PAGE를 수행하였다.
2.8 MALDI 분석
실시예 1.7에 기술된 방법으로 MALDI 분석을 수행하였다.
2.9 펩티드 매핑 분석
실시예 1.8에 기술된 방법으로 단백질 매핑 분석을 수행하였다.
2.10 단백질 농도 에세이
실시예 1.9에 기술된 바에 따라 단백질 농도를 결정하였다.
2.11 생성물 제형화
실시예 1.10에 기술된 바에 따라 생성물을 제형화하였다.
2.12 내독소 결정
실시예 1.11에 기술된 바에 따라 내독소를 결정하였다.
2.13 세포 증식 에세이
표준 방법에 따라 NFS-60 세포주 및 Tf-1 세포주를 사용하여 G-CSF 증식 에세이를 수행하였다. 상이한 농도의 G-CSF(51 nM, 25.5 nM, 12.75 nM, 3.2 nM, 1.6 nM, 0.8 nM, 0 nM), 화학적으로 PEG-화된 G-CSF 유사체 및 실시예 2.3(상기)에서 얻어진 PEG화된 G-CSF C 및 실시예 2.4(상기)에서 얻어진 PEG화된 G-CSF D 의 존재하에 세포를 96 웰 플레이트에 25000 세포/ml로 평판배양하였다. 세포를 48 시간동안 37 ℃에서 배양하였다. 비색(colorimetric) MTT 에세이를 수행하여 세포 생존력을 결정하였다.
2.14 생체내 활성: 랫트에서의 백혈구( WBC ) 생산
마우스를 사용하여 C, G-CSF 및 화학적으로 PEG-화된 G-CSF 각각에 대해 두가지 투여량의 약물(50 ㎍/kg, 250 ㎍/kg)을 조사하였다. 2 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간 및 96 시간의 각 시점에 혈액을 취하여 WBC 및 호중구를 계수하였다(도 4).
2.15 가속 안정화 연구
실시예 2.3에서 얻어진 PEG화된 G-CSF, C 및 실시예 2.4에서 얻어진 PEG화된 G-CSF, D의 가속 안정화 연구를 40 ℃로 가열된 pH 8.0의 완충액을 사용하여 수행하였다. 제제 완충액(PBS, 2.5% 만니톨, 0.005% 폴리솔베이트 80)을 사용하여 72 ㎍의 PEG화된 G-CSF C를 8 mL로 희석하였다. 제제 완충액 16 mL를 사용하여 1 mg의 PEG화된 G-CSF D를 희석하였다. 두 용액의 pH를 NaOH를 사용하여 8.0으로 조정하고, 생성된 용액을 발열물질이 없는 튜브안으로 멸균 여과하였다. 샘플을 40 ℃에서 천천히 회전시키고, 분획(0.8 mL)을 0 시간, 72 시간 및 168 시간의 시점에 취하였다. 상기 기술한 바에 따라 SEC(수퍼덱스 200)를 사용하여 분석하였다(도 6 및 도 7).
2.16 단백질의 방사성표지
볼톤 헌터 시약(Bolton Hunter reagent)을 사용하여 G-CSF를 방사성표지하였다. 이 반응을 pH 7.4에서 15분간 수행한 다음 SEC(수퍼덱스 200) 정제하였다. 정제 후, 제제 완충액 pH를 5.0으로 조정하고 단백질 농도를 A280으로 결정하였다.
2.17 ELISA 에세이
엘라이자 에세이를 사용하여 랫트 플라스마에서의 G-CSF 유도체를 정량하였다. 약물동력학적 결과를 도 9에 나타내었다.
2.18 약물동력학 연구
두가지 약물동력학 연구를 수행하였다. 첫 번째 약물동력학 연구를 위해 단백질을 방사성표지하고 랫트에 IV 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 48 시간 동안 일 정 간격으로 채취한 혈액 내의 방사능의 감소로서 정화율을 측정하였다. 각 시간 포인트별로 적어도 5마리의 랫트를 측정하였다.
구체적으로, 동물당 10 ㎍의 G-CSF 유도체(~1 ㎍의 표지된 단백질 및 9 ㎍의 표지되지 않은 단백질)를 주입하였다. 상기 기술한 바와 같이 혈액을 취하여 계수하는 것에 추가하여, 플라스마를 회수하고 단백질 산을 침전시켰다. 단백질 펠렛에 대해서도 방사능을 계수하였다. 이러한 연구결과 얻어진 데이터를 도 2, 도 3 및 도 8에 나타내었다.
두 번째 약물동력학 연구에서는 표지되지 않은 G-CSF 유도체(동물당 30 ㎍)를 랫트에 IV 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 언급된 시점에 혈액 샘플을 취하고 샘플을 G-CSF ELISA 에세이로 분석하였다. 데이터를 도 9에 나타내었다.
2.19 결과
사람 GalNAc T2는 UDP-GalNAc를 공여체로 사용하여 대장균에서 발현된 G-CSF로 GalNAc을 전이시켰다. 반응 완충액의 pH에 따라 하나 또는 두개의 GalNAc 부분이 G-CSF에 첨가된 것을 MALDI로 결정하였다. 두 번째 GalNAc의 첨가는 총 생성물의 약 10-15%에 이를 때까지 천천히 진행되었다. 반응 용액의 pH를 6.0-6.2로 조정함으로써 90% 이상의 전환율로 하나의 GalNAc을 선택적으로 G-CSF에 첨가할 수 있다. 반응이 약 7.2 내지 7.4의 pH에서 수행될 때 두 번째 GalNAc의 첨가가 일어났다. Co+2 및 Mn+2 는 둘다 반응에 유용한 이가 금속 이온이다. 반응 생성물의 펩티드 매핑 결과 반응의 주된 생성물은 포유동물 시스템에서 O-결합된 글리코실화 의 천연적인 부위인 트레오닌-133에 GalNAc이 첨가된 것으로 나타났다. 두 번째 GalNAc은 G-CSF의 아미노 말단 펩티드 단편에서 관찰되었으며, 트레오닌-2에서 발생한 것으로 생각된다.
G-CSF-GalNAc과 ST6GalNAc-1(병아리 또는 마우스) 및 CMP-SA-PEG-20킬로달톤의 반응 결과 MALDI로 확인한 바와 같이 생성물 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤이 얻어졌고, SDS-PAGE로 확인한 바와 같이 약 50%의 전환율로 얻어졌다. G-CSF-GalNAc은 코어-1-Gal-T 및 UDP-갈락토즈를 사용하여 좀더 연장되어 G-CSF-GalNAc-Gal로의 완전한 전환을 제공할 수 있다. 이 중간체를 ST3Gal2 및 CMP-SA-PEG-20킬로달톤으로 글리코-PEG-화하면 약 50%의 전체 수율로 생성물 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG-20킬로달톤이 얻어졌다. 이 반응들은 원 팟에서 연속적으로 수행될 수도 있고, G-CSF 또는 그의 글리코실화 중간체로부터 원 팟에서 동시에 수행될 수도 있다. 이러한 연구에서, 어떤 방법을 사용하든 전체 수율에는 차이가 전혀 없거나 거의 없는 것으로 관찰되었다.
글리코실화 또는 글리코-PEG-화 반응의 생성물을 이온 교환 및 SEC를 조합하여 정제하였다. 이온 교환 단계는 미반응 G-CSF 또는 그의 글리코실화 중간체(GalNAc 또는 GalNAc-Gal) 뿐아니라 어떤 미반응 CMP-SA-PEG-20킬로달톤이라도 제거한다. SEC 단계는 잔류하는 미반응 G-CSF 및 방법 수행중 사용된 글리코실트랜스퍼라제 유래의 기타 단백질 불순물을 제거하였다. G-CSF가 GalNAc-SA-PEG-20 킬로달톤을 포함하든, GalNAc-Gal-SA-PEG-20킬로달톤을 포함하든 이들 정제 방법에서는 동일한 성질 및 체류시간을 나타내었다. 최종 생성물은 나타낸 바와 같은 전 형적인 프로파일을 보였다.
정제된 후, PEG-화된 단백질을 2.5% 만니톨 및 0.005% 트윈 80을 함유하는 PBS 완충액에서 제제화하였다. 처음에는 제제화에서 pH 6.5를 사용하였지만, 글리코-PEG-화된 단백질의 응집이 관찰되어(하기 참조) 제제화 완충액 pH를 5.0으로 낮추었다. 문헌에 보고된 바에 따르면 G-CSF 응집은 용액의 pH를 4-5로 유지함으로써 막을 수 있다. 멸균 기술을 사용하는 내독소 제거 카트리지를 사용하여 내독소를 제거하였다. 단백질 농도는 통상 생물학적 연구에 요구되는 100 ㎍/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 조정하였다. 이 방법에 의하면 내독소는 통상 3 EU/ml 미만으로 계산되었다. 제제화된 생성물은 4 ℃에서 보관하였다.
생성물은 G-CSF에 민감성인 NSF-60 세포를 사용하여 시험관내 세포 증식 에세이에서 시험하였다. 세포 증식을 유발시키는데 GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤 및 GalNAc-Gal-SA-20킬로달톤 둘다 효과적인 것으로 관찰되었다(도 1).
화학적으로 PEG-화된 G-CSF 및 C(G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤)에서 가속 안정화 연구를 수행하였다. 제제 완충액의 pH를 8.0으로 조정하고 온도를 40 ℃로 높였다. 각 단백질의 샘플을 0, 72 및 168 h 시점에 취하였다(도 6 및 도 7). 화학적으로 PEG-화된 G-CSF는 이러한 조건하에서 168 h 내에 완전히 응집하는 것으로 관찰되었다. 수퍼덱스 200 크로마토그래피를 사용하는 SEC를 사용하여 응집물을 분리하였다. 글리코콘쥬게이트 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤 역시 SEC를 사용하여 분리할 수 있는 응집물을 형성하였지만, 응집은 훨씬 느린 속도로 일어났다.
글리코-PEG-화된 G-CSF를 볼톤 헌터 시약을 사용하여 방사성요오드화하였다. 실제로 방사성표지하기 전에 콜드(cold) 표지화 연구를 수행하여 응집의 정도를 결정하고 형성된 어떤 응집물이라도 제거하기 위한 방법을 수립하였다. 볼톤 헌터 시약(cold)를 사용함으로써 도 5에 나타낸 일부 응집물을 제공하였다. 수퍼덱스 200을 사용하는 SEC는 응집물을 제거하고 단량체성 표지된 물질을 제공하였다. l25I 표지된 시약을 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 제제의 사용에 의해 보관 중의 응집을 최소화하였다. A280에서의 흡광도를 측정하여 단백질 함량을 측정하였다.
볼톤 헌터 시약으로 표지된 G-CSF, 화학적으로 PEG-화된 G-CSF 및 PEG-G-CSF 콘쥬게이트를 사용하여 랫트 pK 연구를 수행함으로써 도 3에 나타낸 결과를 얻었다. 이 연구에서, 랫트당 10 ㎍의 G-CSF 콘쥬게이트를 IV 투여한 후에 혈액 및 플라스마로부터 침전된 단백질의 방사능을 계수하였다. 혈액 및 플라스마 단백질 양쪽의 결과는 PEG 콘쥬게이트 및 화학적으로 PEG-화된 G-CSF가 동일한 정화율을 가짐을 나타내고 있다(도 3 및 도 8).
마우스 모델에서 G-CSF 유도체가 WBC 생산을 유발시키는 능력을 조사하였다. 각 시험 화합물을 단일 환약(bolus)으로 IV 주입하고 WBC 및 호중구의 유도를 시간별로 모니터하였다. 화학적으로 PEG-화된 G-CSF가 250 ㎍/kg으로 투여되는 경우 시험된 것중 가장 강력한 단백질이었다. PEG 콘쥬게이트(G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20킬로달톤)는 250 ㎍/kg에서 화학적으로 PEG-화된 G-CSF와 거의 동일한 정도로, 유사한 농도에서 G-CSF에 비해서는 훨씬 더 큰 정도로 WBC 생산을 유도하였다.
실시예 3
본 실시예는 G-CSF의 175개 아미노산 야생형 서열 또는 그의 변이체의 바람직하게는 프롤린-함유 부위에 O-결합된 글리코실화 부위, 즉, 세린 또는 트레오닌 잔기를 도입하여 변화시킨 아미노산 서열 변이체를 개시한다. 참고적으로, 175개 아미노산 야생형 G-CSF 서열을 하기 나타내었다:
Figure 112006055848460-PCT00059
3.1 N-말단 돌연변이
N-말단 돌연변이에서, 야생형 G-CSF의 N-말단인 M1TPLGPA(SEQ ID NO:)가 M1XnTPLGPA 또는 M1BoPZmXnTPLGPA로 대체된다. 여기에서 n, o 및 m은 0 내지 3에서 선택된 정수이고, 적어도 하나의 X, B 및 O가 Thr 또는 Ser 이다. 하나를 초과하는 X, B 및 O가 Thr 또는 Ser인 경우, 이들 부분의 동일성(identity)는 독립적으로 선택된다. 윗 첨자는 야생형 개시 서열에서의 아미노산 위치를 나타낸다.
바람직한 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00060
3.2 내부 돌연변이 부위 1
이들 돌연변이에서, 야생형 GCSF의 N-말단인 M 1 TPLGP (SEQ ID NO: 8)가 M 1 TPXnBoOr P로 대체된다. 여기에서 n, o 및 r은 0 내지 3에서 선택된 정수이며, 적어도 하나의 X, B 및 O는 Thr 또는 Ser 이다. X, B 및 O 중의 하나 초과가 Thr 또는 Ser 인 경우, 이들 부분의 동일성이 독립적으로 선택된다. 윗 첨자는 야생형 개시 서열에서의 아미노산 위치를 나타낸다.
바람직한 돌연변이는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00061
3.3 내부 돌연변이 부위 2
이 돌연변이는 G-CSF 활성을 유지하기 위한 목적으로 이루어졌다. 이들 돌연변이에서, H53을 포함하는 아미노산 서열인 LGH 53 SLGI (SEQ ID NO:)는 LGH53Bo LGI로 돌연변이되었으며, 여기에서 Θ는 H, S, R, E 또는 Y이고, B 는 Thr 또는 Ser 이다.
바람직한 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00062
3.4 내부 돌연변이 부위 3
이 타입의 돌연변이에서, P129를 포함하는 아미노산 서열인 P 129 ALQPT ( SEQ ID NO:)은 P 129ZmJqOrXn PT로 돌연변이되었으며, 여기에서 Z, J, O 및 X는 독립적으로 Thr 또는 Ser으로부터 선택되며, m, q, r 및 n은 0 내지 3으로부터 선택된 정수이다.
바람직한 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00063
3.5 내부 돌연변이 부위 4
이 타입의 돌연변이에서, P61을 둘러싼 아미노산 서열인 LGIPWAP61LSSC (SEQ ID NO:)는 PZmUsJqP6lOrXnBoC로 대체되며, 여기에서 m, s, q, r, n 및 o는 0 내지 3으로부터 선택된 정수이고, 적어도 하나의 Z, J, O, X, B 및 U는 Thr 또는 Ser로서 선택된다. Z, J, O, X, B 및 U의 하나 초과가 Thr 또는 Ser인 경우 각각은 독립적으로 선택된다.
바람직한 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00064
3.6 C-말단 돌연변이
이 타입의 돌연변이에서, 야생형 G-CSF의 C-말단 아미노산 서열인 RHLAQP175 (SEQ ID NO:)는 ØaGpJqOrP175XnBoZmUsΨt로 대체되며, 여기에서 a, p, q, r, n, o, m, s 및 t 는 0 내지 3에서 선택된 정수이고, Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X의 적어도 하나는 Thr 또는 Ser이며, Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X의 하나 초과가 Thr 또는 Ser인 경우 이들은 독립적으로 선택된다. Ø는 임의로 R이며, G는 임의로 H이다. 기호 Ψ는 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기 중의 하나 또는 E(글루타메이트)를 나타낸다.
바람직한 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00065
3.7 P 133 를 둘러싼 내부 돌연변이
추가의 G-CSF 변이체는 아미노산 P133 을 둘러싼 내부 변이체를 포함한다. 실시예는 다음과 같다:
Figure 112006055848460-PCT00066
실시예 4
과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)의 아미노산 서열에서의 변이체는 O-결합된 글리코실화를 위한 추가의 부위를 도입시켜, 본 발명의 방법을 사용하여 이들 부위에서 단백질을 변형시킬 수 있다. 본 실시예는 본 발명의 선택된 대표적인 돌연변이를 설명한다.
4.1 G-CSF (야생형 178 aa 변이체)
Figure 112006055848460-PCT00067
4.2 G-CSF (야생형 175 aa 변이체)
Figure 112006055848460-PCT00068
4.9 G-CSF 돌연변이 1 (아미노 말단 변이체)
Figure 112006055848460-PCT00069
4.1O G-CSF 돌연변이 2 (아미노 말단 변이체)
Figure 112006055848460-PCT00070
4.11 G-CSF 돌연변이 3 (아미노 말단 변이체)
Figure 112006055848460-PCT00071
4.12 G-CSF 변이체 4 (부위 1)
Figure 112006055848460-PCT00072
4.13 G-CSF 변이체 5 (부위 3)
Figure 112006055848460-PCT00073
4.14 G-CSF 변이체 6 (부위 4)
Figure 112006055848460-PCT00074
실시예 5
CHO 세포에서 생산된 G- CSF 의 글리코PEG 화
5a. 아시알로 -과립구- 콜로니 자극 인자(G- CSF )의 제조
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 2.5 mg/mL 농도로 50 mM 트리스 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2에 녹이고, 센트리콘 플러스 20 원심 필터에서 500 ㎕로 농축시켰다. 용액을 32 ℃에서 16 시간동안 300 mU/mL 뉴라미니다제 II(Vibrio cholerae)와 함께 배양하였다. 반응을 모니터하기 위해 반응액 소분획을 적당한 완충액으로 희석하고 IEF 겔을 수행하였다. 그 후, 반응 혼합물을 미리 세척된 N-(p-아미노페닐)옥삼산-아가로즈 콘쥬게이트(800 ㎕/mL 반응 부피)에 가하 고 세척된 비드를 4 ℃에서 24 시간동안 약하게 회전시켰다. 혼합물을 10,000 rpm에서 원심분리하고 상등액을 회수하였다. 비드를 트리스-EDTA 완충액으로 3회, 0.4 mL 트리스-EDTA 완충액으로 1회 및 0.2 mL 트리스-EDTA 완충액으로 1회 세척하고, 모든 상등액을 합하였다. 상등액을 4 ℃에서 50 mM 트리스-HC1 pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해 투석한 다음, 50 mM 트리스-HC1 pH 7.4, 1 M NaCl, 0.05% NaN3에 대해 2회 더 투석하였다. 투석된 용액을 센트리콘 플러스 20 원심 필터로 농축하고, -20 ℃에서 보관하였다. 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 제공된 방법 및 시약에 따라 IEF 겔에 대한 조건을 충족시켰다 천연 및 탈시알화된 G-CSF 샘플을 물에 대해 투석하고 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
5b. G- CSF -( 알파2 ,3)- 시알릴 - PEG 의 제조
탈시알화된 G-CSF 50 mM 트리스-HCI, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2에 2.5 mg/mL로 용해시켰다. 용액을 32 ℃에서 2일간 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL의 ST3Gal1과 함께 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니터하기 위해 반응액 소분획에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고; PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분석용 칼럼에서의 겔 여과를 통해 펩티드에 혼입된 표지를 혼입되지 않은 표지와 분리하였다. 펩티드 내로 형광 표지가 혼입된 양을 인라인(in-line) 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후, 반응 혼합물을 PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분취용 칼럼을 사용하여 정제하고 UV 흡광에 의거하여 분획을 수거하였다. 인비트로겐에 의해 공급된 방법 및 시약에 따라 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 이용하여 반응 생성물을 분석하였다. 천연 및 PEG화된 G-CSF 샘플을 물에 대해 투석하고 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
5c. G- CSF -( 알파2 ,8)- 시알릴 - PEG 의 제조
CHO 세포에서 생산된 G-CSF로서 알파 2,3-시알화된 O-결합된 글리칸을 함유하는 것을 2.5 mg/mL로 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2에 용해시켰다. 용액을 32 ℃에서 2일간 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL CST-II와 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니터하기 위해 반응액 소분획에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고; PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분석용 칼럼에서의 겔 여과를 통해 펩티드에 혼입된 표지를 혼입되지 않은 표지와 분리하였다. 펩티드 내로 형광 표지가 혼입된 양을 인라인(in-line) 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후, 반응 혼합물을 PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분취용 칼럼을 사용하여 정제하고 UV 흡광에 의거하여 분획을 수거하였다. 인비트로겐에 의해 공급된 방법 및 시약에 따라 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 이용하여 반응 생성물을 분석하였다. 천연 및 PEG화된 G-CSF 샘플을 물에 대해 투석하고 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
5d. G- CSF -( 알파2 ,6)- 시알릴 - PEG 의 제조
O-결합된 GalNAc만을 포함하는 G-CSF를 2.5 mg/mL로 50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3, pH 7.2에 용해시켰다. 용액을 32 ℃에서 2일간 1 mM CMP-시알산-PEG 및 0.1 U/mL ST6GalNAcI 또는 II와 배양하였다. 시알산-PEG의 혼입을 모니 터하기 위해 반응액 소분획에 CMP-SA-PEG-형광 리간드를 첨가하고; PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분석용 칼럼에서의 겔 여과를 통해 펩티드에 혼입된 표지를 혼입되지 않은 표지와 분리하였다. 펩티드 내로 형광 표지가 혼입된 양을 인라인(in-line) 형광 검출기를 사용하여 정량하였다. 2일 후, 반응 혼합물을 PBS 완충액(pH 7.1)을 사용하는 Toso Haas G3000SW 분취용 칼럼을 사용하여 정제하고 UV 흡광에 의거하여 분획을 수거하였다. 인비트로겐에 의해 공급된 방법 및 시약에 따라 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 이용하여 반응 생성물을 분석하였다. 천연 및 PEG화된 G-CSF 샘플을 물에 대해 투석하고 MALDI-TOF MS로 분석하였다.
CHO 세포에서 생산된 G-CSF를 알트로박터 시알리다제(Arthrobacter sialidase)로 처리한 다음 수퍼덱스 75 상에서 분자량 배제(size exclusion)에 의해 정제하고, ST3Gal1 또는 ST3 Gal2 및 계속하여 CMP-SA-PEG 20Kda으로 처리하였다. 생성된 분자를 이온 교환 및 겔 여과로 정제하고 SDS PAGE로 분석한 결과 PEG화가 완결되었음을 확인하였다. 이것이 O-결합된 글리칸의 글리코PEG화가 입증된 첫 번째 경우이다.
실시예 6
재조합 GCSF - 발현, 리폴딩 ( refolding ) 및 정제
- 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 상등액을 버린다. 다양한 배지에서의 성장 결과를 도 9에 나타내었다.
- 세포 펠렛을 lO mM 트리스 pH 7.4, 75 mM NaCl, 5 mM EDTA(용해 완충액)에 lO ml/g로 재현탁시킨다.
- 세포를 마이크로루이다이즈(microlluidize)한다(프렌치 프레스를 사용할 수도 있다).
- 4 ℃, 5,000RPM에서 30분간 원심분리하고, 상등액을 버린다.
- 용해 완충액에 펠렛을 재현탁시키고 상기와 같이 원심분리한다.
- IB's를 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 1% TX-100, 1% NaDOC, 5 mM EDTA에서 세척한다. 피펫 및 볼텍싱(vortexing)으로 펠렛을 재현탁시킨다. 4 ℃, 5,000RPM에서 15분간 원심분리한다. 이 단계를 1회 반복한다(총 2회의 세척).
- 펠렛을 25 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA에서 2회 세척하여 세제를 제거하고, 상기와 같이 원심분리한다.
- 펠렛을 dH20에 재현탁시켜 분획화하고 상기와 같이 원심분리한다. 펠렛을 -20 ℃에서 얼린다.
- 피펫을 사용하여 IB's를 20 mg/ml의 6M 구아니딘HCl, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 100 mM 트리스 pH 8, 1O mM DTT에 재현탁시킨 다음, 실온에서 24 h 동안 회전시킨다.
- 용해된 IB's를 실온, 14,OOO RPM에서 1분간 원심분리한다. 상등액을 취한다.
- 리폴드 완충액 50 mM MES pH 6, 240 mM NaCl, 10 mM KC1, 0.3 mM 라우릴 말토시드, 0.055% PEG3350, 1 mM GSH, O.1M GSSG, 0.5M 아르기닌으로 상등액을 희 석하고, 4 ℃에서 밤새 회전기상에서 리폴드시켰다.
- 리폴드를 피얼스 스네이크스킨(snakeskin) 7kDa MWCO로 옮겨 투석 완충액 20 mM NaOAc pH 4, 50 mM NaCl, 0.005% 트윈-80, 0.l mM EDTA에 대해 투석한다. 4 ℃에서 적어도 200 배 과량에 대해 총 3회 투석한다.
- 투석 후, 0.45 μM 필터를 통과시킨다.
- SP-세파로즈 칼럼을 투석 완충액으로 평형화하고 샘플을 적용한다. 칼럼을 투석 완충액으로 세척하고 1 M NaCl까지 염(salt) 구배를 갖는 투석 완충액을 사용하여 용출시킨다. 단백질은 통상 300-400 mM NaCl에서 용출된다.
- 수득된 물질을 SDS-PAGE로 확인한다(참조, 예를 들어, 도 10).
실시예 7
2개의 팟(pot)에서의 2가지 효소 방법
하기 실시예는 각각의 중간체 생성물이 다음 단계에서 사용되기 전에 정제되는 2개의 연속 단계를 통한 G-CSF-GalNAc-SA-PEG 제조를 설명한다.
7a. GalNAc - T2 를 사용한 G- CSF 및 UDP - GalNAc 으로부터의 G- CSF - GalNAc (pH 6.2)의 제조
패키지 완충액 3.2 mL중의 G-CSF(960 ㎍)을 UF 필터(MWCO 5K)를 사용하여 한외여과로 농축한 다음 1 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3)로 재구성하였다. UDP-GalNAc(6 mg, 9.24 mM), GalNAc-T2(40 ㎕, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2(40 ㎕, 4 mM)를 가하고, 생성된 용액을 실온에서 배양하였다.
24 시간 후, MALDI에 의해 반응 완결을 확인하였다. 반응 생성물을 SEC(수퍼덱스 75 및 수퍼덱스 200)와 PBS(포스페이트 완충된 식염수, pH 4.9 및 0.005% 트윈 80) 함유 용출 완충액을 사용하는 HPLC로 직접 정제하였다. G-CSF-GalNAc에 대해 회수된 피크를 센트리콘 5 KDa MWCO 필터를 사용하여 약 150 ㎕로 농축하고 PBS(포스페이트 완충된 식염수, pH 4.9 및 0.005% 트윈 80)를 사용하여 부피를 1 ml로 조정하였다. 최종 단백질 농도는 1 mg/mL(A280)이고, 수율은 100%였다. 샘플은 4 ℃에서 보관하였다.
7b. 정제된 G- CSF - GalNAc , CMP - SA - PEG (20 KDa ) 및 마우스 ST6GalNAc - TI ( pH 6.2)를 사용한 G- CSF - GalNAc - SA - PEG 의 제조
단백질 1 mg을 함유하는 G-CSF-GalNAc 용액을 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3)로 완충액 교환하고, CMP-SA-PEG(20KDa)(5 mg, 0.25 μmol)을 가하였다. 용해시킨 후, MnCl2(100 mcL, 100 mM 용액) 및 ST6GalNAc-I(100 mcL, 마우스 효소)를 가하고, 반응 혼합물을 32 ℃에서 3일간 천천히 진탕하였다. 반응 혼합물을 한외여과(MWCO 5K)로 농축하고 25 mM NaOAc(pH 4.9)로 1회 완충액 교환한 다음 총 부피 1 mL로 농축하였다. 체류 시간 13-18분에서의 SP-세파로즈(A: 25 mM NaOAc+0.005% 트윈-80 pH 4.5; B: 25 mM NaOAc+0.005% 트윈-80 pH 4.5+2M NaCl) 및 체류 시간 8.6분에서의 SEC(수퍼덱스 75; PBS-pH 7.2, 0.005% 트윈 80)(수퍼덱스 75, 유속 1 ml/분)를 사용하여 생성물을 정제하였다. 목적하는 분획을 회수하여 0.5 mL로 농축하고 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 8
효소를 동시 첨가하여 G- CSF - GalNAc - SA - PEG 를 제조하는 원 팟 방법
하기 실시예는 효소를 동시 첨가하여 원 팟에서 G-CSF-GalNAc-SA-PEG를 제조하는 것을 설명한다.
8a. 마우스 ST6GalNAc -I(pH 6.0)을 사용한 원 팟 공정
G-CSF(생성물 제제 완충액 3.2 mL에 용해된 단백질 960 ㎍)를 한외여과(MWCO 5K)로 0.5 ml까지 농축하고 25 mM MES 완충액(pH 6.0, 0.005% NaN3)로 재구성하여 약 1 mL의 총 부피 또는 1 mg/mL의 단백질 농도가 되도록 하였다. UDP-GalNAc(6 mg, 9.21 μmol), GalNAc-T2(80 ㎕, 80 mU), CMP-SA-PEG(20KDa)(6 mg, 0.3 μmol) 및 마우스 효소 ST6GalNAc-I(120 ㎕) 및 100 mM MnCl2(50 ㎕)를 첨가하였다. 용액을 32 ℃에서 48 시간동안 진탕하고 SP-세파로즈 상의 표준 크로마토그래피 조건을 사용하여 정제하였다. 총 0.5 mg의 단백질(A280) 또는 약 50%의 전체 수율을 얻었다. MALDI 및 SDS-PAGE로 분석하여 생성물 구조를 확인하였다.
8b. 병아리 ST6GalNAc -I( pH 6.0)을 사용한 원 팟 공정
14.4 mg의 G-CSF를 3 mL의 최종 부피로 농축하고, 25 mM MES 완충액(pH 6.0, 0.05% NaN3, 0.004% 트윈 80)으로 완충액 교환하고, 부피를 13 mL로 조정하였다. UDP-GalNAc(90 mg, 150 μmole), GalNAc-T2(0.59 U), CMP-SA-PEG- 20KDa(90 mg), 병아리 ST6GalNAc-I(0.44 U) 및 100 mM MnCl2(600 mcL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 60 시간동안 두었다. 그 후, 반응 혼합물을 UF(MWCO 5K) 및 원심분리를 사용하여 농축하였다. 잔류물(약 2 mL)을 25 mM NaOAc 완충액(pH 4.5)에 녹이고 5 mL의 최종 부피로 다시 농축하였다. 약 10-23 분동안 SP-세파로즈를 사용하여 이 샘플을 정제하고, SEC(수퍼덱스 75, 17 분, 유속 0.5 ml/분) 및 추가의 SEC(수퍼덱스 200, 23 분, 유속 0.5 ml/분)를 수행하여 3.6 mg(25% 전체 수율)의 G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20 KDa(A280 및 BCA 방법)를 얻었다.
실시예 9
효소의 연속적인 첨가에 의해 G- CSF - GalNAc - Gal - SA - PEG 를 제조하는 원 팟 방법
하기 실시예는 효소의 연속적인 첨가에 의해 원 팟에서 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG를 제조하는 방법을 설명한다.
9.1 GalNAc -G- CSF 로부터의 출발
a. GalNAc - T2 를 사용한 G- CSF 및 UDP - GalNAc 으로부터의 G- CSF - GalNAc ( pH 6.2)의 제조
3.2 mL의 패키지 완충액 중의 G-CSF(960 mcg)를 UF 필터(MWCO 5K)를 사용한 한외여과로 농축한 다음 1 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6.2, 0.005% NaN3)를 사용하여 재구성하였다. UDP-GalNAc(6 mg, 9.24 mM), GalNAc-T2(40 ㎕, 0.04 U) 및 100 mM MnCl2(40 ㎕, 4 mM)를 가하고, 생성된 용액을 실온에서 배양하였다.
b. G- CSF - GalNAc ; UDP - 갈락토즈 , SA - PEG -20 Kdalton 및 적당한 효소로부터 G-CSF-GalNAc-Gal-SA-PEG의 제조
상기 단계 a에서 얻어진, 1.5 ml의 25 mM MES 완충액(pH 6.0) 중의 G-CSF-GalNAc(1.5 mg)의 조 반응 혼합물에 UDP-갈락토즈(4 mg, 6.5 μmoles), 코어-1-Gal-T(320 ㎕, 160 mU), CMP-SA-PEG-20KDa(8 mg, 0.4 μmole), ST3Gal2(80 ㎕, 0.07 mU) 및 100 mM MnCl2(80 ㎕)를 직접 가하였다. 생성된 혼합물을 32 ℃에서 60 시간동안 배양하였다. 반응 혼합물을 원심분리하고 한외여과(MWCO 5K)를 사용하여 용액을 0.2 mL로 농축한 다음, 25 mM NaOAc(pH 4.5)로 재용해시켜 최종 부피 1 mL가 되도록 하였다. 생성물을 SP-세파로즈(10-15분 사이의 체류 시간)를 사용하여 정제하고, 피크 분획을 스핀 필터(MWCO 5K)를 사용하여 농축하고, 잔류물을 SEC(수퍼덱스 75, 체류 시간 10.2 분)를 사용하여 추가로 정제하였다. 스핀 필터(MWCO 5K)를 사용하여 농축한 후, PBS, 2.5% 만니톨, 0.005% 폴리솔베이트, pH 6.5의 제제 완충액을 사용하여 단백질을 1 mL로 희석하고, 단백질 농도가 mL 당 850 mcg 단백질(A280)이 되도록 제제화하였다. 전체 수율은 55%였다.
실시예 10
효소의 동시 첨가에 의해 G- CSF - GalNAc -Gal-SA-PEG를 제조하는 원 팟 방법
a. G- CSF 로부터의 출발
G-CSF(960 mcg, 3.2 ml)를 한외여과(MWCO 5K)로 농축하고, 25 mM Mes 완충액(pH 6.0, 0.005% NaN3)으로 재구성하였다. G-CSF 용액의 총 부피는 약 1 mg/ml였다. UDP-GalNAc(6 mg), GalNAc-T2(80 ㎕, ~80 μU), UDP-Gal(6 mg), 코어1 GalT(160 ㎕, 80 μU), CMP-SA-PEG(20K)(6 mg) 및 2,3-(O)-시알릴트랜스퍼라제(160 ㎕, 120 μU), 100 mM MnCl2(40 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 32 ℃에서 48 h 동안 배양하였다. IEX 및 SEC를 사용하여 후술하는 바와 같이 정제하였다. 생성물 함유 분획을 한외여과(MWCO 5K)를 사용하여 농축하고 완충액으로 부피를 약 1 mL로 조정하였다. A280에 의거하여 결정된 단백질 농도는 0.392 mg/ml였고, G-CSF로부터의 전체 수율은 40%였다.
실시예 11
하기 실시예는 다량의 글리코PEG화된 G-CSF를 얻기 위한 다른 효소적 방법을 설명한다.
과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 단백질을 대장균에서 발현시키고 실시예 X(상기)에 개시된 바와 같이 내포체(inclusion body)로부터 리폴드하였다.
11a. GalNAc 의 첨가에 의한 반응의 프라이밍 ( priming ):
리폴드된 GalNAcT2를 사용하여 UDP-GalNAc의 존재하에 1 mM MnCl2 를 함유하는 50 mM 비스-트리스 pH 6.5 완충액에서 33 ℃에서 G-CSF의 GalNAc-화를 수행하였다. 이 단계는 추후의 단계에서 GalNAc 트랜스퍼라제와 시알릴트랜스퍼라제가 함 께 작용하도록 반응을 프라임하여 매우 효율적으로 최대량의 GCSF-PEG를 짧은 시간내에 생산하도록 한다.
11b. PEG 화 공정:
PEG화는 프라이밍 반응에 CMP-SA-PEG(20K) 및 ST6GalNAcI(병아리 또는 사람)을 직접 첨가함으로써 GalNAc-화 후 2(+/-1) 시간에 시작하였다. 이 단계는 시알릴트랜스퍼라제에 대한 기질(GCSF-O-GalNAc)을 생산하여, GCSF-O-GalNAc이 UDP-GalNAc 및 다른 반응 성분들로부터 먼저 정제되는 2 단계 반응(예를 들어, 상기 실시예 X 참조)에서 달성될 수 있는 것보다 더 짧은 시간 내에 더 빠르게 반응을 진행시킨다. 또한, 프라임된 원 팟 반응은 모든 성분들이 동시에 첨가되는 원 팟 반응에 비해 고수율로 생성물을 생산한다.
실제로, 여러 종류의 원 팟 반응들을 비교한 결과 모든 성분들이 동시에 첨가되고 23 시간동안 배양되는 경우 GCSF-PEG가 77%로 생산되는 것으로 나타났다. 반면에, 상기 기술된 2 시간의 GalNAc-화 단계가 PEG화 반응에 필요한 모든 효소들의 첨가 전에 이루어지는 경우, 생성물 수율은 85%였다. 따라서, 반응 성분들의 연속적인 첨가는 모든 반응 성분들을 동시에 첨가하는 경우 얻어지는 것에 비해 10% 더 높은 수율을 나타내었다.
실시예 12
본 실시예는 6개의 돌연변이 G-CSF 단백질들의 O-결합된 GalNAc-화 결과를 기술한다.
12.1. 돌연변이 G- CSF 단백질의 GalNAc 화:
돌연변이 G-CSF 단백질들의 모든 서열이 하기 열거되어 있다. 이들 단백질에 대해 O-결합된 글리코실화를 조사하였다. 천연 G-CSF의 글리코실화에 대한 것과 동일한 조건하에 GalNAc-T2(BV)를 25 mM MES 완충액(pH 6.0)에서의 UDP-GalNAc과 함께 시험관내에서 사용하였다. 반응을 모니터하는데 MALDI를 사용하였다. 단백질의 분자량 증가를 측정하면 GalNAc 첨가 수를 알 수 있다. GalNAc 1개의 첨가에 대한 분자량 증가는 203 Da이다. MALDI 결과에 의거할 때, 돌연변이 G-CSF-2,-3,-4는 1개의 GalNAc을 수용하였고; 돌연변이 G-CSF-5에는 몇 개의 첨가가 관찰되며, 돌연변이 G-CSF-1은 2개의 GalNAc을 수용하여 MAPT-G- CSF(GalNAc)2 (18965에서 19369달톤으로의 분자량 증가)를 형성한 것을 알 수 있었다.
Figure 112006055848460-PCT00075
돌연변이 G-CSF의 GalNAc 첨가(MALDI에 의해 측정된 분자량)
MAPT-G-CSF-(GalNAc)2의 글리코실화 부위를 결정하기 위해 펩티드 매핑과 N-말단 분석을 사용하였다. Glu C-분해된 펩티드 매핑에서 G-1+GalNAc 피크가 관찰되었는데, 이는 1개의 GalNAc이 G-1 서열에 첨가되었음을 나타낸다. N-말단 에드만(Edman) 분해 분석의 결과 정상적인(normal) T가 유실된 것으로 나타났고, 이는 T 잔기 상에 GalNAc이 첨가되었음을 나타낸다.
12.2 돌연변이 G- CSF 서열의 글리코PEG 화
a. 돌연변이 G- CSF 서열의 글리코PEG 화 및 MAPT -G- CSF 의 글리코PEG 화에 대한 완충액의 영향
5개 변이체에 대한 글리코PEG화(20K)를 조사하였다. 25 mM MES 완충액(pH 6.0)에서 3가지 효소/3가지 뉴클레오티드 시스템(UDP-GalNAc/GalNAc-T2/UDP-Gal/코어 GalT/CMP-SA-PEG/O-시알릴트랜스퍼라제)을 사용하여 글리코PEG화를 수행하였다. 모든 변이체들은 모노글리코PEG화되었다. 이 조건에서는 쿠마시 블루 염색에 의한 SDS-PAGE 겔에서 디PEG화가 검출되지 않았다.
MAPT-G-CSF가 2개의 GalNAc을 수용하였으므로, 이 변이체는 이론적으로 2개의 PEG를 받아야만 한다. 따라서, 본 발명자들은 출발물질로서 MAPT-G-CSF의 PEG화에 대한 완충액의 영향을 조사하였다. 이 반응에 대해 4가지 상이한 완충액(1.1M MES 완충액; 2.25 mM MES 완충액(pH 6.0); 3.50 mM 비스-트리스 완충액(pH 6.0); 4.1M HEPS 완충액(pH 7.4))을 조사하였다. MAPT-G-CSF는 시험된 완충액 시스템 모두에서 PEG화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 모노PEG화 생성물이 여전히 다수였다. 1M MES 및 1 M HEPS 완충액이 사용된 경우, 일부의 디PEG화 생성물이 형성되었는데, 이는 고농도의 완충액이 글리코PEG화를 개선시킴을 나타낸다.
b. MAPT -G- CSF ( GalNAc - SA - PEG ) 2 및 MAPT -G- CSF ( GalNAc - Gal - SA - PEG ) 2 를 형성함에 의한 글리코PEG 화 효율의 비교
상이한 효소들에 의해 촉매된 돌연변이 G-CSF-1의 글리코PEG화 효율을 알아보기 위해, 2개의 효소(St6GalNAcI 및 O-시알릴트랜스퍼라제)의 시알릴PEG화를 조사하였다. 따라서, MAPT-G-CSF를 시알릴PEG화를 위한 MAPT-G-CSF(GalNAc)2 및 MAPT-G-CSF(GalNAc-Gal)2 로 전환시켰다. 전자를 CMP-SA-lys-PEG(20K)/St6GalNAc I으로 처리하고, 후자를 CMP-SA-PEG(20K)/O-시알릴트랜스퍼라제로 처리하였다. 양 반응을 25 mM MES 완충액(pH 6.0) 및 l mg/ml 단백질 농도에서 수행하였다. PEG화 효율은 SDS-Page 겔에서 알 수 있다. 2개의 효소는 시험된 조건하에서 CMP-SA-Lys- PEG(20KDa)을 사용하는 이 단백질의 글리코PEG화에 있어 매우 유사한 것으로 보였다.
c. 주된 생성물로서 MAPT -G-CSF(( GalNAc - SA - PEG (20 KDa )) 2 의 형성에 이르게 하는 고 단백질 농도
글리코PEG화에 대한 효소 및 완충액의 영향을 조사한 후, 상기 기술된 바와 같이, 글리코PEG화 효소로서 ST6GalNAcI을 사용하는 고 완충액 농도의 요소와 조합하여 PEG화에 대한 단백질 농도의 영향을 조사하였다. 따라서, 본 발명자들은 1 M MES 완충액(pH 6.0)에서의 반응을 위한 8~10 mg/ml의 단백질 농도를 사용하여 MAPT-G-CSF의 글리코PEG화에 대해 UDP-GalNAc/GalNAc-T2 및 CMP-SA-PEG (20KDa)/St6GalNAcI을 적용하였다. 그 결과는 이러한 조건하에서 목적하는 디PEG화 생성물이 주된 생성물임을 제시하고 있다. 더 많은 CMP-SA-PEG(20K) 및 효소를 적용함으로써 90% 이상의 전환이 달성되었다. PEG화된 G-CSF 생성물인 MAPT-G-CSF((GalNAc-SA-PEG(20KDa))2를 SP-세파로즈 및 수퍼덱스 200에서의 SEC 정제를 조합하여 정제하였다.
12.3. MAPT -G- CSF -( GalNAc - SA - PEG ) 2 의 세포 증식 활성
NFS-60 세포주 및 Tf-1 세포주를 사용하여 MAPT-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG)2 의 세포 증식 에세이를 수행하였다. 0 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 단백질 농도를 사용하여 에세이를 수행하였다. 이 에세이에서 MAPT-G-CSF(GalNAc-SA-PEG (20K))2 는 활성을 나타냈다.
12.4 실험적 세부 항목들
12.4a 돌연변이 G-CSF의 GalNAc화의 일반적 방법
돌연변이 G-CSF 용액(100 ㎍ 단백질)의 일정 부피를 MES 완충액(25 mM + 0.005% NaN3, pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 최종 부피를 100 ㎍/100 ㎕로 조정하였다. 이 용액에 5 ㎕의 100 mM MnCl2 및 GalNAc-T2(1 mU)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 MALDI 또는 QTOF 분석에 필요한 시간동안 진탕하였다.
12.4b MAPTP -G- CSF -( GalNAc ) 2 의 제조
MAPTP-G-CSF 5.4 mg(KJ-675-159, 0.18 mg/ml, 0.053 μmol)을 MES 완충액(25 mM + 0.005% NaN3, pH 6.0)으로 교환하였다. 최종 부피를 5.4 ml로 조정하였다. 이 용액에 UDP-GalNAc(5 mg, 0.15 μmol), 100 mM MnCl2 0.25 ml 및 GalNAc-T2(1.O U/ml, 50 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 32 ℃에서 24 h 동안 진탕하였다. M+ (MALDI): 19364(MAPT-G-CSF-(GalNAc)2 verse 18951(MVPTP-G-CSF).
12.4c 원-팟 반응에 의한 돌연변이 G-CSF 서열의 글리코PEG화의 일반적 방법
돌연변이 G-CSF 100 ㎍(돌연변이 G-CSF-1,2,3,4,5)를 100 ㎕의 25 mM MES 완충액(pH 6.0+0.005% NaN3)에서 UDP-GalNAc(0.6 mg, 0.923 μmol), GalNAc-T2(20 ㎕, 8 mU), UDP-Gal(0.6 mg, 0.923 μmol), 코어 1 Gal T(20 ㎕, 10 mU), CMP-SA-PEG(20K)(1 mg, 0.05 μmol), St3GalII(20 ㎕, 28 mU) 및 100 mM MnC12 3 ㎕와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 24 h 동안 진탕하였다. 글리코PEG화 후에 SDS-PAGE를 수행하였다.
12.4d 다양한 완충액 시스템에서의 돌연변이 G-CSF-1 글리코PEG화(20KDa)의 비교
GalNAc2-MATP-G-CSF(54 ㎍)을 하기 4가지 완충액 시스템(l.1 M MES 완충액(pH 6.0); 2.25 mM MES 완충액(pH 6.0); 3.50 mM 비스-트리스 완충액(pH 6.5); 4.1M HEPS 완충액(pH 7.4))으로 완충액 교환하였다. 그 후, CMP-SA-PEG (20K)(216 ㎍), ST6GalNAcI(BV, l U/mL, 2.5 ㎕) 및 100 mM MnCl2(2.5 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 24 h 동안 진탕하였다. 반응 후에 SDS-PAGE 겔을 수행하였다.
12.4e ST6GalNAcI 및 O-시알릴트랜스퍼라제(Wang787-29 및 787-40)을 사용한 MAPT-G-CSF의 글리코PEG화의 비교
12.4e1 St6GalNAc I의 사용
첫 번째 단계: 30 ml의 KJ-675-159 용액(0.18 mg/ml, 총 5.4 mg 단백질)을 3500 g에서 한외여과(MWCO 5K)로 농축한 다음 25 mM MES 완충액(pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 최종 부피를 플라스틱 튜브에서 5.4 ml로 조정하였다. GalNAc-T2(1.O U/ml, 50 ㎕)를 가한 다음, 0.25 mL의 MnCl2를 가하였다. 혼합물을 32 ℃에서 24 h 동안 진탕하였다. 반응이 완결되었음을 MALDI로 확인하였다. 반응 혼합물을 UF(MWCO 5K)로 농축하고 25 mM MES 완충액으로 5 ml까지 희석한 다음, CMP-SA-PEG(20K)(2x25mg), ST6GalNAcI(BV, l U/ml), 100 mM의 MnCl2 0.25 ml를 가하였다. 혼합물을 32 ℃에서 밤새 진탕하였다. 반응에 SDS-PAGE를 사용하였다.
12.4e2 O-시알릴트랜스퍼라제(St3GalII)의 사용
200 ㎕의 25 mM MES 완충액(pH 6.0)중의 200 ㎍ GalNAc2-MATP-G-CSF를 UDP-Gal 0.6 mg 및 코어 GalT(0.2 U/ml, 10 ㎕) 및 10 ㎕의 100 mM MnCl2와 혼합하였다. 혼합물을 32 ℃에서 24 h 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 UF(MWCO 5K)로 농축하고, 25 mM MES 완충액으로 200 ㎕까지 희석하였다. CMP-SA-PEG(800 ㎍), St3GalII(l.O U/ml, 10 ㎕), 10 ㎕의 100 mM MnCl2 를 가하였다. 혼합물을 실온에서 24 h 동안 진탕하였다. 혼합물을 32 ℃에서 밤새 진탕하였다. 반응 후에 SDS-PAGE 겔을 사용하였다.
12.4f MAPT-G-CSF-(GalNAc)2의 글리코PEG화로부터의 MAPTP-G-CSF-(GalNAc-SA-PEG(20K)2 (Wang 787-42)
MAPTP-G-CSF 용액(540 ㎍)을 농축하고, 1M MES 완충액(pH 6.0)으로 교환하고, 50 ㎕로 조정하였다. 그 후, UDP-GalNAc(100 ㎍, 0.15 μmol, 5 eq), GalNAcT2(5.0 U/ml, 5 ㎕) 및 100 mM MnCl2(5 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 그 후, CMP-SA-PEG(20K)(2.16 mg, 0.108 μmol) 및 St6GalNAcI (1.0 U/ml, 50 ㎕)를 가하였다. 용액을 실온에서 60 h 동안 진탕하였다. 추가로 CMP-SA-PEG(20K)(2.16 mg, 0.108 μmol) 및 St6GalNAcI(l.O U/ml, 50 ㎕)를 가한 다음, 실온에서 24 h 동안 천천히 회전시켰다. 반응 혼합물을 완충액 A(25 mM NaOAc, 0.005% 폴리솔베이트 80, pH 4.5)로 교환한 다음, 아머샴 SP-FF(5 mL) 칼럼으로 3 mL/분의 유속에서 10분간 100% A의 단일(isocratic) 용출 후 20분에 걸쳐 100% A에서 20% B로 선형 구배 용출시켜 정제하였다(여기에서 B = 25 mM NaOAc, 2 M NaCl 0.005% 폴리솔베이트 80, pH 4.5). 체류 시간 17분에서의 피크를 모아서 0.5 ml로 농축하고, 이를 아머샴 HiLoad 수퍼덱스 200(16 x 600 mm, 34 μm)으로 0.4 mL/분의 유속에서 포스페이트 완충된 식염수(pH 5.0, 0.005% 트윈 80)를 사용하여 추가 정제하였다. 160 분의 체류 시간에서의 생성물 분획을 모아서 농축하여 30 ㎍의 MAPT-G-CSF(GalNAc-SA-PEG(20K))2(BCA)를 얻었다. 수율은 최적화되지 않았다.
12.4g G-CSF 돌연변이 서열
돌연변이 G- CSF -1:
Figure 112006055848460-PCT00076
돌연변이 G- CSF -2:
Figure 112006055848460-PCT00077
돌연변이 G- CSF -3:
Figure 112006055848460-PCT00078
돌연변이 G- CSF -4 (C-말단 tag ):
Figure 112006055848460-PCT00079
돌연변이 G- CSF -5 (N-말단 MIATP ):
Figure 112006055848460-PCT00080
돌연변이 G- CSF -6 (177 Mer ):
Figure 112006055848460-PCT00081
대장균에서 발현된 사람 재조합 G- CSF :
Figure 112006055848460-PCT00082
실시예 13
하기 실시예는 글리코PEG화된 hGH 단백질의 제조를 설명한다. 야생형 hGH는 천연 글리코실화 부위를 가지고 있지 않으므로 데 노보(de novo) O-글리코실화 부위를 돌연변이 hGH 단백질에 도입한 다음 돌연변이 부위에 GalNAc 트랜스퍼라제로 글리코실화하고 시알릴PEG화하였다. 단백질 분자의 아미노 말단 또는 루프(loop) 영역에 O-글리코실화 부위가 도입되도록 5가지 돌연변이 hGH 단백질을 디자인하였다. 5가지 돌연변이 단백질을 생산하고, Nb2-11 세포 증식 에세이에서 각각의 hGH 활성을 시험하였다.
13.1 돌연변이 hGH 아미노산 서열:
192 아미노산 와일드-타입 뇌하수체 유래의, N-말단 메티오닌이 함유된 hGH
Figure 112006055848460-PCT00083
191 아미노산 와일드-타입 뇌하수체 유래의, N-말단 메티오닌이 결여된 hGH
Figure 112006055848460-PCT00084
MVTP 변이체:
Figure 112006055848460-PCT00085
PTOGAMP 변이체:
Figure 112006055848460-PCT00086
TTT 변이체:
Figure 112006055848460-PCT00087
MAPT 변이체:
Figure 112006055848460-PCT00088
NTG 변이체:
Figure 112006055848460-PCT00089
4가지 hGH 돌연변이가 글리코실트랜스퍼라제 GalNAcT2의 기질로 작용할 수 있는지 시험하였다. MALDI-MS 분석 결과, 4가지 hGH 돌연변이 중 2가지는 GalNAcT2에 의해 글리코실화되는 것으로 밝혀졌다.
13.2 hGH -( TTT )- GalNAc - SA - PEG -30 KDa 의 제조
TTT 변이체에 GalNAc을 첨가하면 글리코실화되지 않은 종, 1-GalNAc 및 2-GalNAc 종들의 복잡한 혼합물이 형성된다. 펩티드 매핑 실험(트립신 분해) 결과 TTT 변이체를 포함하는 T12 펩티드(L129-K141)에 2개의 GalNAc이 첨가된 것으로 나타났다. MALDI-MS 결과, (M)VTP 변이체에는 오직 소량의 GalNAc이 첨가된 것으로 나타났다.
hGH-TTT-변이체(4.0 mL, 6.0 mg, 0.27 마이크로몰)을 세척 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3, pH 7.4) 15 mL로 2회, 반응 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2, 5 mM MgC12, 0.02% NaN3, pH 7.4)으로 1회 완충액 교환한 다음 센트리콘 원심 필터(5 KDa MWCO)를 사용하여 2.0 mL로 농축하였다.
hGH-TTT 변이체를 UDP-GalNAc(1.38 마이크로몰, 0.90 mg) 및 GalNAc-T2(0.12 mL, 120 mU)와 결합시켰다. 반응액을 32 ℃에서 약하게 진탕하면서 19시간 동안 배양하였다. MALDI-MS로 분석한 결과 GalNAc이 hGH-TTT 변이체에 부분적으로 첨가되었음을 관찰하였다(대략 40%). CMP-SA-PEG-30K(16 mg, 0.533 마이크로몰) 및 ST6GalNAcl(0.375 mL, 375 mU)를 반응 혼합물에 첨가하여 총 부피를 2.85 mL가 되게 하였다. 반응액을 32 ℃에서 약하게 진탕하면서 22시간 동안 배양하였다. 0 h 및 22 h에 SDS PAGE로 반응을 모니터하였다. 반응 정도를 SDS-PAGE 겔로 결정하였다. 생성물인 hGH-(TTT)-GalNAc-SA-PEG-30 KDa을 SP 세파로즈로 정제하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 매우 낮은 수율의 목적하는 hGH-(TTT)-GalNAc-SA-PEG-30 KDa이 관찰되었다.
13.3 hGH -( PTQGAMP )- GalNAc - SA - PEG -30 KDa 의 제조
PTQGAMP 변이체는 10 mg 스케일에서 UDP-GalNAc 및 GalNAc T2에 의해 쉽게 글리코실화된 다음, CMP-SA-PEG-30KDa 및 ST6GalNAcl에 의해 글리코PEG화되어 1.45 mg의 정제된 hGH-(PTQGAMP)-GalNAc-SA-PEG-30KDa을 제공하였다. 펩티드 매핑 실험(트립신 분해) 결과, PTQGAMP 돌연변이를 포함하는 트립신 T12 펩티드(L129-K141)에 GalNAc이 위치함을 알 수 있었다.
hGH-PTQGAMP-변이체(4.55 mL, 10.0 mg, 0.45 마이크로몰)를 15 mL의 세척 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3, pH 7.4)으로 2회, 반응 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2, 5 mM MgCl2, 0.02% NaN3, pH 7.4)으로 1회 완충액 교환한 다음, 센트리콘 원심 필터(5 KDa MWCO)를 사용하여 3 mL로 농축하였다.
hGH-PTQGAMP 변이체를 UDP-GalNAc(2.26 마이크로몰, 1.47 mg) 및 GalNAc-T2(0.1 mL, 100 mU)와 결합시켰다. 반응액을 32 ℃에서 약하게 진탕하면서 22시간 동안 배양하였다. MALDI-MS로 분석한 결과 GalNAc이 hGH-PTQGAMP 변이체에 완전히 첨가되었음을 관찰하였다. CMP-SA-PEG-30K(27 mg, 0.9 마이크로몰) 및 ST6GalNAcl(0.350 mL, 350 mU)를 반응 혼합물에 첨가하여 총 부피를 3.4 mL가 되게 하였다. 반응액을 32 ℃에서 약하게 진탕하면서 24시간 동안 배양하였다. 0 h 및 16.5 h에 SDS PAGE로 반응을 모니터하였다. 반응 정도를 SDS-PAGE 겔로 결정하였다. 생성물인 hGH-(PTQGAMP)-GalNAc-SA-PEG-30 KDa을 SP 세파로즈 및 SEC(수퍼덱스 200) 크로마토그래피로 정제한 다음 제제화하였다. 최종 생성물을 MALDI, 펩티드 맵 및 SDS-PAGE(은 염색)로 분석하였다. 단백질을 BCA 대 BSA 표준에 의해 결정하였다. 전체 분리 수율(1.45 mg)은 단백질 기준 12.5%였다.
실시예 14
본 실시예는 본 발명에 따른 GM-CSF PEG 글리코콘쥬게이트의 제조를 설명한다.
14.1 (PEG(20K)-SA-Gal-GalNAc)2-GM-CSF 및 PEG(20k)-SA-Gal-GalNAc-GM-CSF의 제조
GM-CSF(1 mg)를 25 mM MES 완충액(1 mL)(pH 6.0, 0.005% NaN3)에 용해시킨 다음, UDP-GalNAc(1 mg), GalNAc-T2(200 ㎕, 0.38 U/mL, 0.076 U), 100 mM MnCl2(80 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 72 h 동안 배양하였다. MALDI 결과 GalNAc2-GM-CSF가 형성되었음을 알 수 있었다.
UDP-Gal(6 mg, 9.8 mmol), 코어-l-Gal-T1(0.5 U/mL, 80 ㎕), CMP-SA-PEG(20킬로달톤)(6 mg, 0.3 μmol), α-(O)-시알릴트랜스퍼라제(1 U/mL, 120 ㎕), 100 mM MnCl2(50 ㎕)를 가하였다. 혼합물을 32 ℃에서 48 h 동안 천천히 회전시켰다. 반응 혼합물을 2 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 단백질 용액을 취하였다. 잔류 수지를 1 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6.0)과 혼합하고 30 초간 흔들었다. 현탁액을 다시 원심분리하고; 단백질 용액들을 합하여 200 mcL로 농축하였다. HPLC 정제에 의해 글리코-PEG-화된 GM-CSF를 얻었다.
실시예 15
인터페론 알파-2의 것과 유사한 O-결합된 글리코실화 부위를 동일한 상대적 위치에서 임의의 인터페론 알파 단백질에 혼입시킬 수 있다. 이는 관심있는 단백질의 아미노산 서열을 IFN-알파-2b 서열(10-20 아미노산 길이)과 정렬시키고 아미노산 서열을 변형시켜 글리코실화 부위를 혼입시킴으로써 수행된다. 어떤 아미노산에 의한 돌연변이, 결실 또는 삽입은 부위를 창출하는데 사용될 수 있다. 예시적인 변이체는 106 위치의 T에 대해 중점을 둔 채, 이 영역의 IFN-알파-2 서열과 가능한 한 높은 상동성을 유지한다(하기에서 굵은 글씨로 표시). 이 과정이 어떻게 진행되는지에 대한 실시예를 하기 나타내었다.
NCBI 단백질 데이터베이스에서 인터페론 알파의 정렬
Figure 112006055848460-PCT00090
글리코실화/글리코-PEG-화는 Tl06(IFN-알파-2)에서 일어난다. 단백질 번호매김은 천연으로 발현된 프레-프로 형태(pre-pro form)의 단백질 리더 서열의 제거 후 첫 번째 아미노산으로부터 시작된다.
O-결합된 글리코실화 부위를 가지고 있지 않은 인터페론-알파에 이 부위를 도입하기 위한 IFN-알파 변이체
Figure 112006055848460-PCT00091
Figure 112006055848460-PCT00092
첫 번째 번호 124449를 제외한 상기 표의 GI 숫자는 변형되지 않은 와일드-타입 단백질의 것을 나타낸다.
상기 설명한 바와 같이, 적당한 아미노산 부위에 T 또는 S를 위치시킴으로써 어떤 인터페론 알파 이소형태(isoform)에서도 O-결합된 글리코실화 부위를 형성할 수 있다. 상기 표에 나타낸 바와 같이 치환은 T이다. 다양한 인터페론 알파 형태들 사이의 아미노산 서열은 유사하다. 상기 나타낸 정렬 서열에서 Pl09(IFN-알파-2)에 대해 글리코실화/글리코-PEG-화하기에 적당한 위치에 T 또는 S가 존재하는 한 이 영역에 어떠한 아미노산 돌연변이, 삽입, 결실이라도 이루어질 수 있다.
본 발명이 특정 구체예에 관하여 개시되기는 했지만, 본 발명의 범주 내에서 당업자에 의해 다른 구체예 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 자명하다.
본 출원에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 다른 간행물은 전체적으로 참고문헌으로서 포함되어 있다.

Claims (62)

  1. 분리된 폴리펩티드에 상응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 코딩하는 변이체 펩티드 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 G-CSF 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 M1XnTPLGP 또는 M1BoPZmXnTPLGP의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)에서 아미노산의 위치를 나타내며, 아래첨자 n 및 m은 0 내지 3중에서 선택된 정수이고, X 및 B의 적어도 하나는 Thr 또는 Ser이며, 복수개의 X 및 B가 The 또는 Ser인 경우, 이들 부분의 아이덴티티는 독립적으로 선택되고, Z는 글루타메이트, 또는 임의의 비하전 아미노산 중에서 선택되는 폴리펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 MVTPLGP, MQTPLGP, MIATPLGP, MATPLGP, MPTQGAMPLGP, MVQTPLGP, MQSTPLGP, MGQTPLGP, MAPTSSSPLGP 및 MAPTPLGPA로 구성된 서열중에서 선택되는 변이체 G-CSF 폴리펩티드.
  5. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 M1TPXnBoOrP의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 SEQ ID NO: 3에서 아미노산 서열의 위치를 나타내며, 아래첨자 r은 0 내지 3중에서 선택된 정수이고, X, B 및 O의 적어도 하나는 The 또는 Ser이며, 복수개의 X, B 및 O가 Thr 또는 Ser인 경우, 이들 부분의 아이덴티티는 독립적으로 선택되는 폴리펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 MTPTLGP, MTPTQLGP, MTPTSLGP, MTPTQGP, MTPTSSP, M1TPQTP, M1TPTGP, M1TPLTP, M1TPNTGP, MTPLGP (G-CSF mut #4), M1TPVTP, M1TPMVTP 및 MT1P2TQGL3G4P5A6S7로 구성된 서열중에서 선택되는 폴리펩티드.
  7. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 LGX53BoLGI의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)에서 아미노산 위치를 나타내고, X는 히스티딘, 세린, 아르기닌, 글루탐산 또는 티로신이며, B는 트레오닌 또는 세린이고, o는 0 내지 3의 정수인 폴리펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 LGHTLGI, LGSSLGI, LGYSLGI, LGESLGI 및 LGSTLGI로 구성된 서열중에서 선택된 폴리펩티드.
  9. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 P129ZmJqOrXnPT의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)에서 아미노산의 위치를 나타내고, Z, J, O 및 X는 Thr 및 Ser중에서 독립적으로 선택되며, m, q, r 및 n은 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수인 폴리펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 P129ATQPT, P129TLGPT, P129TQGPT, P129TSSPT, P129TQGAPT, P129NTGPT, PALQPTQT, P129ALTPT, P129MVTPT, P129ASSTPT, P129TTQP, P129NTLP, P129TLQP, MAP129ATQPTQGAM 및 MP129ATTQPTQGAM으로 구성된 서열중에서 선택되는 폴리펩티드.
  11. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 PZmUsJqP61OrXnBoC의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)에서 아미노산의 위치를 나타내고, Z, J, O 및 U의 적어도 하나는 트레오닌 및 세린중에서 선택되며, 복수개의 Z, J, O 및 U가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들은 각각 독립적으로 선택되고, m, s, q, r, n 및 o는 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수인 폴리펩티드.
  12. 제 11 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 P61TSSC, P61TSSAC, LGIPTAP61LSSC, LGIPTQP61LSSC, LGIPTQGP61LSSC, LGIPQTP61LSSC, LGIPTSP61LSSC, LGIPTSP61LSSC, LGIPTQP61LSSC, LGTPWAP61LSSC, LGTPFAP61LSSC, P61FTP 및 SLGAP58TAP61LSS로 구성된 서열중에서 선택되는 폴리펩티드.
  13. 제 2 항에 있어서, G-CSF 폴리펩티드가 식 ØaGpJqOrP175XnBoZmUsΨt의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 G-CSF 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)에서 아미노산의 위치를 나타내고, Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X의 적어도 하나는 트레오닌 또는 세린이고, 복수개의 Z, U, O, J, G, Ø, B 및 X가 트레오닌 또는 세린인 경우, 이들은 독립적으로 선택되며; Ø는 임의로 R이고, G는 임의로 H이며; 기호 Ψ는 임의의 비하전 아미노산 잔기 또는 글루타메이트를 나타내고, a, p, q, r, n, o, m, s 및 t는 0 내지 3중에서 독립적으로 선택되는 정수인 폴리펩티드.
  14. 제 13 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 RHLAQTP175, RHLAGQTP175, QP175TQGAMP, RHLAQTP175AM, QP175TSSAP, QP175TSSAP, QP175TQGAMP, QP175TQGAM, QP175TQGA, QP175TVM, QP175NTGP 및 QP175QTLP로 구성된 서열중에서 선택되는 폴리펩티드.
  15. 제 2 항에 있어서, 서열 P133TQTAMP139, P133TQGTMP, P133TQGTNP, P133TQGTLP 및 PALQP133TQTAMPA 중에서 선택된 변이체 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 hGH 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  17. 제 16 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 M1APTSSPTIPL7SR9 및 DGSP133NTGQIFK140 중에서 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  18. 제 15 항에 있어서, hGH 폴리펩티드가 식 P133JXBOZUK140QTYS의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 hGH 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산의 위치를 나타내고, J는 트레오닌 및 아르기닌중에서 선택되며, X는 알라닌, 글루타민, 이소루이신 및 트레오닌중에서 선택되고; B는 글리신, 알라닌, 루이신, 발린, 아스파라긴, 글루타민 및 트레오닌중에서 선택되며; O는 티로신, 세린, 알라닌 및 트레오닌중에서 선택되고; Z는 이소루이신 및 메티오닌중에서 선택되며; U는 페닐알라닌 및 프롤린중에서 선택되는 폴리펩티드.
  19. 제 18 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 PTTGQIFK, PTTAQIFK, PTTLQIFK, PTTLYVFK, PTTVQIFK, PTTVSIFK, PTTNQIFK, PTTQQIFK, PTATQIFK, PTQGQIFK, PTQGAIFK, PTQGAMFK, PTIGQIFK, PTINQIFK, PTINTIFK, PTILQIFK, PTIVQIFK, PTIQQIFK, PTIAQIFK, P133TTTQIFK140QTYS 및 P133TQGAMPK140QTYS로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리펩티드.
  20. 제 15 항에 있어서, hGH 폴리펩티드가 식 P133RTGQIPTQBYS의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 hGH 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산의 위치를 나타내고, B는 알라닌 및 트레오닌중에서 선택되는 폴리펩티드.
  21. 제 20 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 PRTGQIPTQTYS 및 PRTGQIPTQAYS로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리펩티드.
  22. 제 16 항에 있어서, hGH 폴리펩티드가 식 L128XTBOP133UTG의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 hGH 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 20)에서 아미노산의 위치를 나타내고, X는 글루탐산, 발린 및 알라닌중에서 선택되며; B는 글루타민, 글루탐산 및 글리신중에서 선택되고; O는 세린 및 트레오닌중에서 선택되며; U는 아르기닌, 세린, 알라닌 및 루이신중에서 선택되는 폴리펩티드.
  23. 제 22 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 LETQSP133RTG LETQSP133STG LETQSP133ATG, LETQSP133LTG, LETETP133R, LETETP133A, LVTQSP133RTG, LVTETP133RTG, LVTETP133ATG 및 LATGSP133RTG로 구성된 그룹중에서 선택되는 변이체 hGH 폴리펩티드.
  24. 제 16 항에 있어서, hGH 폴리펩티드가 식 M1BPTXnZmOPLSRL의 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 위 식에서 위첨자는 야생형 hGH 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 19)에서 아미노산의 위치를 나타내고, B는 페닐알라닌, 발린, 알라닌 및 이들의 조합중에서 선택되며; X는 글루타메이트, 발린 및 프롤린중에서 선택되고; Z는 트레오닌이며; O는 루이신 및 이소루이신중에서 선택되고; X가 프롤린인 경우, Z는 트레오닌이며; n 및 m은 0 및 2중에서 선택된 정수인 폴리펩티드.
  25. 제 24 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 M1FPTE IPLSRL, M1FPTV LPLSRL 및 M1APTPTIPLSRL로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리펩티드.
  26. 제 24 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 M1VTPTIPLSRL이며, 여기에서 위첨자 1은 야생형 hGH 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 19)에서 아미노산의 위치를 나타내는 폴리펩티드.
  27. 제 15 항에 있어서, 변이체 펩티드 서열이 LEDGSPTTGQIFKQTYS, LEDGSPTTAQIFKQTYS, LEDGSPTATQIFKQTYS, LEDGSPTQGAMFKQTYS, LEDGSPTQGAIFKQTYS, LEDGSPTQGQIFKQTYS, LEDGSPTTLYVFKQTYS, LEDGSPTINTIFKQTYS, LEDGSPTTVSIFKQTYS, LEDGSPRTGQIPTQTYS, LEDGSPRTGQIPTQAYS, LEDGSPTTLQIFKQTYS, LETETPRTGQIFKQTYS, LVTETPRTGQIFKQTYS, LETQSPRTGQIFKQTYS, LVTQSPRTGQIFKQTYS, LVTETPATGQIFKQTYS, LEDGSPTQGAMPKQTYS 및 LEDGSPTTTQIFKQTYS로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리펩티드.
  28. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 IFN 알파 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  29. 제 28 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 변이체 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 서열을 가지며, 펩티드 서열은 SEQ NO: 22로 나타낸 서열을 가지는 INF 알파 2 영역에 상응하고, 변이체 아미노산 서열은 INF 알파 2의 T106에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 세린 아미노산에 대한 돌연변이를 함유하는 폴리펩티드.
  30. 제 29 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 IFN 알파, IFN 알파 4, IFN 알파 5, IFN 알파 6, IFN 알파 7, IFN 알파 8, IFN 알파 10, IFN 알파 14, IFN 알파 16, IFN 알파 17 및 IFN 알파 21로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리펩티드.
  31. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVMQEERVTETPLMNADSIL118, 99CVMQEEGVTETPLMNADSIL118 및 99CVMQGVGVTETPLMNADSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  32. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMKEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 4 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  33. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CMMQEVGVTDTPLMNVDSIL118, 99CMMQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CMMQGVGVTDTPLMNVDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 5 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  34. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVMQEVWVTGTPLMNEDSIL118, 99CVMQEVGVTGTPLMNEDSIL118 및 99CVMQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 6 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  35. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGVTETPLMNEDFIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDFIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 7 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  36. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVMQEVGVTESPLMYEDSIL118 및 99CVMQGVGVTESPLMYEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 8 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  37. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 10 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  38. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 14 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  39. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVTQEVGVTEIPLMNEDSIL118, 99CVTQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVTQGVGVTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 16 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  40. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGMTETPLMNEDSIL118, 99CVIQEVGVTETPLMNEDSIL118 및 99CVIQGVGMTETPLMNEDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 17 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  41. 제 30 항에 있어서, IFN 알파 폴리펩티드가 99CVIQEVGVTETPLMNVDSIL118 및 99CVIQGVGVTETPLMNVDSIL118로 구성된 그룹중에서 선택된 변이체 아미노산 서열을 포함하는 IFN 알파 21 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  42. 제 1 항의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  43. 제 42 항의 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  44. 제 42 항의 핵산을 포함하는 세포.
  45. 제 1 항에 있어서, 다음 중에서 선택되는 식을 갖는 폴리펩티드.
    Figure 112006055848460-PCT00093
    상기 식에서,
    AA는 변이체 폴리펩티드 서열내에 존재하는 하이드록실 부분을 포함하는 아미노산 측쇄이고;
    X는 변형 그룹 또는 사카릴 부분이다.
  46. 제 45 항에 있어서, X가 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia 부분중에서 선택되는 그룹을 포함하고, 여기에서 상기의 시알릴, 갈락토실 및 Gal-Sia중의 적어도 하나는 변형 그룹을 포함하는 폴리펩티드.
  47. 제 45 항에 있어서, X가 하기 식의 부분을 포함하는 폴리펩티드.
    Figure 112006055848460-PCT00094
    상기 식에서,
    D는 -OH 및 R1-L-HN-중에서 선택되는 멤버이고;
    G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬중에서 선택되는 멤버이며;
    R1은 직쇄 또는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 부분중에서 선택되는 멤버를 포함하는 부분이고;
    L은 결합, 치환되거나 비치환된 알킬 및 치환되거나 비치환된 헤테로알킬중에서 선택되는 멤버인 링커이며, 여기에서, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L-NH-이다.
  48. 제 45 항에 있어서, X가 하기 화학식의 구조를 포함하는 폴리펩티드.
    Figure 112006055848460-PCT00095
    상기 식에서,
    L은 치환되거나 비치환된 알킬 또는 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 그룹이고;
    n은 0 내지 약 500의 정수중에서 선택된다.
  49. 제 45 항에 있어서, X가 하기 화학식의 구조를 포함하는 폴리펩티드.
    Figure 112006055848460-PCT00096
    상기 식에서,
    s는 0 내지 20의 정수중에서 선택된다.
  50. (a) 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하고;
    (b) 폴리펩티드를 O-결합 글리코실화 부위에서 변형 당으로 효소에 의해 글리코실화하는 단계를 포함하여, 제 1 항의 폴리펩티드의 글리코콘쥬게이트를 제조하는 방법.
  51. 변형된 당에 의해서 글리코콘쥬게이트된 제 2 항의 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 과립구 집락 자극인자 (G-CSF)의 약제학적 조성물.
  52. 제 51 항에 있어서, 변형된 당이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된 약제학적 조성물.
  53. 변형된 당에 의해서 글리코콘쥬게이트된 제 16 항의 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 인간 성장호르몬 (hGH)의 약제학적 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서, 변형된 당이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된 약제학적 조성물.
  55. 야생형 과립구 대식세포 집락 자극인자 (GM-CSF) 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 변이체 펩티드 서열을 포함하며, 변형된 당에 의해서 글리코콘쥬게이트된 GM-CSF 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 과립구 대식세포 집락 자극인자 (GM-CSF)의 약제학적 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 변형된 당이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된 약제학적 조성물.
  57. 변형된 당에 의해서 글리코콘쥬게이트된 제 28 항의 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 인테페론 알파-2b의 약제학적 조성물.
  58. 제 57 항에 있어서, 변형된 당이 폴리(에틸렌 글리콜) 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(m-PEG)중에서 선택된 멤버로 변형된 약제학적 조성물.
  59. 치료를 요하는 피실험자(subject)에 유효량의 제 51 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 피실험자에게 G-CSF 요법을 제공하는 방법.
  60. 치료를 요하는 피실험자에 유효량의 제 55 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 피실험자에게 과립구 대식세포 집락 자극인자 요법을 제공하는 방법.
  61. 치료를 요하는 피실험자에 유효량의 제 57 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 피실험자에게 인터페론 요법을 제공하는 방법.
  62. 치료를 요하는 피실험자에 유효량의 제 53 항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 피실험자에게 성장 호르몬 요법을 제공하는 방법.
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