JP2002542792A

JP2002542792A - ホスホ−ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド転移酵素活性を検出するためのアッセイ

Info

Publication number: JP2002542792A
Application number: JP2000614421A
Authority: JP
Inventors: ダス，カヴェリ; ラマチャンドラン，ジャナキラマン
Original assignee: アストラゼネカアクチボラグ
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2002-12-17
Also published as: AU769842B2; EP1171631B1; DE60014879T2; ATE279531T1; US6537770B1; DE60014879D1; EP1171631A1; CN1348503A; CA2370469A1; CN1157484C; WO2000065087A1; HK1044027A1; AU4446100A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド転移酵素活性を検出するためのアッセイであって：（１）水性媒体中に、Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート置換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド、Ｎ−スクシンイミジルプロピオネート置換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド（非放射性）、二価金属イオンの供給源、ウンデカプレニルリン酸の供給源、転移酵素の供給源および界面活性剤を含む、反応混合物を、酵素活性が起こるのに適した条件下で、インキュベーションし；（２）ｐＨ〜４．２で、第四級アンモニウム塩を含む、適切な緩衝液で反応混合物を酸性化し、工程（１）の酵素反応を停止し；そして（３）形成されたいかなるウンデカプレノール−ピロリン酸−［２，３−³Ｈ］プロピオネート−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド産物も抽出し、そしてシンチレーションカウンターを用い、放射能を測定する工程を含む、前記アッセイ、およびまた、それに使用するためのキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド転移酵素活性（以
後「転移酵素」と称する）検出のための新規アッセイに関する。

【０００２】ペプチドグリカンは、細菌細胞壁の主要な構成要素であり、細胞壁に形状およ
び強度を与える。これは細菌に特有であり、そしてグラム陽性およびグラム陰性
両方のすべての細菌種にみられる。ペプチドグリカンは、短いペプチド架橋を通
じて架橋されるグリカン鎖のポリマーである。ペプチドグリカンは、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ
）の交互のβ１−４結合残基からなる。ペンタペプチド鎖は、ＭｕｒＮＡｃに結
合し（ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド）そしてペプチドグリカンポリマーは、こ
れらのペプチド鎖を通じて架橋される。

【０００３】ペプチドグリカンの生合成は、３つの段階に分けることが可能である：まず、
細胞質における前駆体の合成、次に、脂質キャリアー分子への前駆体の移動、そ
して第三に、細胞壁への前駆体の挿入および存在するペプチドグリカンへのカッ
プリングである。

【０００４】細菌細胞壁のペプチドグリカン構成要素の生合成に責任がある酵素は、新規抗
生物質設計の新規標的である。現在の抗生物質に抵抗性である細菌株が世界的に
発生しているため、新規抗微生物剤を開発することが必要になってきている。転
移酵素は、ペプチドグリカン生合成の膜周期の最初の段階、すなわち、ウリジン
５’−二リン酸ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−
ｍ−ジアミノピメリン酸−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ（以後「ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡ
ｃ−ペンタペプチド」または「ＵＤＰ−ＭＰＰ」と称する）から膜結合脂質キャ
リアー、ウンデカプレニルリン酸への、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａ
ｌａ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−ｍ−ジアミノピメリン酸−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの転
移を触媒する。転移酵素は、大腸菌において、ｍｒａＹ遺伝子にコードされる。

【０００５】転移酵素は、細菌生存能力に必須である（Ｄ．Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕ
ｌｘ，Ｌ．Ｔｅｘｉｅｒ，Ｍ．ＲｏｕｓｓｅａｕｅおよびＪ．Ｖａｎ
Ｈｅｉｊｅｒｎｏｏｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９９１），
１７３，４６２５−４６３６を参照されたい）。

【０００６】現在使用される商業的抗生物質で、転移酵素に対して向けられるものはない。
したがって、該酵素は、いまだ利用されていない新規抗細菌剤の標的を代表する
。

【０００７】転移酵素は、通常、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドを放射標識し、そ
して脂質中間体、脂質Ｉの形成を生じる、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチ
ドからウンデカプレニルリン酸へのホスホ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチ
ドの転移をモニターすることにより、アッセイされる。放射標識は、通常、酵素
リガーゼを用い、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン端を標識することにより、または
膜へのｉｎｖｉｖｏ取り込みにより、行われる。これらの方法はどちらも、低
収率を生じ、そしてしたがって、高処理スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを開
発するのには、費用効率が高くない。

【０００８】転移酵素活性は別に、蛍光基質、例えば、Ｂｒａｎｄｉｓｈら，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９６），２７１，７６０９−７６１４に記載
されるような塩化ダンシルを用いてアッセイしてもよい。しかし、特定の化合物
は、蛍光を消光する可能性があり、したがって、その結果、酵素反応の偽阻害剤
を拾う可能性がある。

【０００９】高処理スクリーニングに適した転移酵素のためのアッセイを開発するのが望ま
しいであろう。したがって、本発明にしたがい、ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプ
チド転移酵素活性を検出するためのアッセイであって：（１）水性媒体中に、Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート置
換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド、Ｎ−スクシンイミジルプロピオネー
ト置換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド（非放射性）、二価金属イオンの
供給源、ウンデカプレニルリン酸の供給源、転移酵素の供給源および界面活性剤
を含む、反応混合物を、酵素活性が起こるのに適した条件下で、インキュベーシ
ョンし；（２）ｐＨ〜４．２で、第四級アンモニウム塩を含む、適切な緩衝液で反応混合
物を酸性化し、工程（１）の酵素反応を停止し；そして（３）形成されたいかなるウンデカプレノール−ピロリン酸−［２，３−³Ｈ］
プロピオネート−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド産物も抽出し、そしてシ
ンチレーションカウンターを用い、放射能を測定する工程を含む、前記アッセイが提供される。

【００１０】工程（１）において、用いるＵＤＰ−ＭＰＰは、天然発生ペプチドグリカンに
通常存在するいかなるものであってもよい。ＵＤＰ−ＭＰＰは、細菌から好都合
に精製され、または、例えばＢｌａａｕｗｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．（１９９０），１７２，６３−７０に記載されるものと類似の方法により
、細菌由来の前駆体を用いて酵素的に作成される。あるいは、Ｌｕｇｔｅｎｂｅ
ｒｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７２），１０９，３２６−
３３５に記載される方法論により、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｔｓ）Ｗ２３
の細胞から単離してもよい。使用に好ましいＵＤＰ−ＭＰＰは、バチルス・セレ
ウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）由来の、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−
アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミノピメリン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ
−アラニンである。

【００１１】こうして得られたＵＤＰ−ＭＰＰを、Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］
プロピオネート（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｔｄ．より商業的に入手可能）と反応さ
せ、Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート置換ＵＤＰ−Ｍｕｒ
ＮＡｃ−ペンタペプチド（以後「³Ｈ−プロピオネート化ＵＤＰ−ＭＰＰ」と称
する）を得る。

【００１２】本アッセイで用いる、³Ｈ−プロピオネート化ＵＤＰ−ＭＰＰの濃度は、典型
的には、２ないし５０μＭ、好ましくは、２ないし４０μＭ、そしてより好まし
くは、２ないし２５μＭの範囲であろう。

【００１３】やはり反応中に用いられる、非標識、非放射性Ｎ−スクシンイミジルプロピオ
ネート置換ＵＤＰ−ＭＰＰ（以後「プロピオネート化非放射性ＵＤＰ−ＭＰＰ」
と称する）は、５ないし７０μＭ、好ましくは、５ないし５０μＭ、そして特に
８ないし３０μＭの範囲にあってもよい。

【００１４】反応に用いる二価金属イオンは、好ましくはマグネシウムイオンである。マグ
ネシウムイオンの適切な供給源は、塩化マグネシウムである。用いる二価金属イ
オンの濃度は、２０ｍＭないし１００ｍＭ、好ましくは、２０ｍＭないし
８０ｍＭ、より好ましくは、２０ｍＭないし５０ｍＭの範囲内、例えば２
５ｍＭであってもよい。

【００１５】さらに、５０ｍＭないし１００ｍＭの範囲の濃度の塩化カリウムを、反応
混合物に添加してもよい。大腸菌細菌の膜を好都合に用いてもよく、そして実際、これは、ウンデカプレ
ニルリン酸および転移酵素の供給源として好ましい。用いる膜の量は、反応混合
物５０μｌ当たり、典型的には、５ないし２００μｇの範囲内、好ましくは、５
０μｇであろう。膜は、当該技術分野に知られる方法により、調製してもよい。

【００１６】工程（１）で用いる水性媒体は、好ましくは、緩衝溶液、例えば約７．５のｐ
Ｈを有するＴｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸（「Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ」）の溶液である。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｏ
．Ｌｔｄ．より商業的に入手可能である。

【００１７】反応混合物は、さらに、０．０１単位のアルカリホスファターゼを含んでもよ
い。用いる界面活性剤は、例えば、０．１％ｗ／ｖの濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−
１００であってもよい。界面活性剤は、これらを用いた場合、細菌膜を可溶化す
るのに有効である可能性がある。

【００１８】アッセイを、転移酵素のアンタゴニストである抗細菌化合物を同定するための
スクリーニングとして用いることを意図する場合、工程（１）の反応混合物は、
さらに、１つまたはそれ以上の試験化合物を、多様な濃度で含んでもよい。転移
酵素は、ペプチドグリカン合成の第一の段階で必要とされる酵素であるため、こ
れは、抗細菌薬剤の開発の適切な標的を代表する。

【００１９】工程（１）の反応混合物は、２０℃ないし３７℃の範囲の温度、好ましくは２
５℃に、短時間、例えば１０分間まで、特に６−８分間維持する。酵素反応は、例えば、６Ｍ酢酸ピリジニウムおよびｎ−ブタノール（ｐＨ
〜４．２）の２：１混合物の添加により停止する。これは工程（２）を構成する
。

【００２０】工程（３）において、例えば、ｎ−ブタノールを用い、産物を抽出する。これ
をその後、シンチレーションカウンターで定量化する。本発明は、以下の実施例に関係し、さらに例示されるであろう。

【００２１】

【実施例】実施例１エッペンドルフチューブを、まず、各々、総量４０μｌの反応混合物で個々に
満たした。反応混合物は、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ［ヒドロ
キシメチル］アミノメタン塩酸）、２５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ
の塩化カリウム、０．１％ｗ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００、８μＭのプロ
ピオネート化非放射性ＵＤＰ−ＭＰＰ、室温の２μＭの³Ｈ−プロピオネート化
ＵＤＰ−ＭＰＰ、１ｍｌ当たり５μｇの濃度の１０μｌの酵素および１７．５
μｌの水からなった。これに、多様な濃度の試験化合物（例えば、ツニカマイシ
ン）の溶液を添加する。ツニカマイシンは、転移酵素の既知のアンタゴニストで
ある。酵素の添加により、反応を開始する。

【００２２】酵素の供給源として利用する大腸菌膜は、以下の方式で調製した。膜は、商業的に入手可能なスフェロプラストペレットから調製する。各ペレッ
トは、特定の量の大腸菌ＨｆｒＨを含む。ペレットを、４℃で一晩融解する。
ペレットの重量測定をし、そしてその数字に７．５を乗じる。これにより、添加
する緩衝溶液の体積が得られる。用いる緩衝溶液は、２０％スクロースを含む
、ｐＨ８．０の２０μＭＴｒｉｓ−ＨＣｌである。低温で、磁気攪拌装置を
用い、混合物を１０分間、穏やかに攪拌する。これに、濃度が０．２ｍｇ／ｍ
ｌの最終濃度になるまで、卵白リゾチーム溶液を添加する。氷上でさらに１０分
間攪拌する。これに、ｐＨ８．０の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の０．２
Ｍの濃度の、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．Ｌｔｄ．より商業的に入
手可能なエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、０．０２Ｍの最終濃度が得
られるまで、１時間の期間に渡り、ゆっくりと添加する。この添加は、温度４−
８℃の低温室で行う。その後、混合物を、１２，０００ｇで２０分間遠心分離
する。先の段落で計算されるのと同一体積の、２０μｇ／ｍｌＤＮアーゼ、２
０μｇ／ｍｌＲＮアーゼ、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ β−
メルカプトエタノールを含む、ｐＨ７．５の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝溶液に、ペレットを再び再懸濁する。これを、試料が均質になるまで、室温で
１時間、攪拌する。膜分画は、１，００，０００ｇで１時間、超遠心装置で回
転させることにより、回収する。

【００２３】基質として用いる³Ｈ−プロピオネート化ＵＤＰ−ＭＰＰは、以下の方式で調
製する。波長２６２ｎｍで４Ｏ．Ｄ．の固定体積、すなわち、およそ４５０−５０
０μｇの非標識ＵＤＰ−ＭＰＰを、空のエッペンドルフチューブに取る。別のエ
ッペンドルフチューブに、０．５ｍＣｉのトリチウム化Ｎ−スクシンイミジル
プロピオネート（Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート）を取
り、そしてこれに、約１８０μｌの１％ＮａＨＣＯ₃を添加する。第二のチュ
ーブをよく混合し、そして第一のチューブに移す。第二のチューブを、１８０μ
ｌの１％ＮａＨＣＯ₃でよくリンスし、そして再び第一のチューブに移す。混
合物を含むチューブは、室温で震蘯装置に一晩放置し、標識化を促進する。同様
の方式で、放射性化合物の代わりにＮ−スクシンイミジルプロピオネートを用い
、プロピオネート化非放射性ＵＤＰ−ＭＰＰを調製する。

【００２４】これは、以下のように精製する、（１）商業的に入手可能なセファデックスＡ−２５１ｍｌを、ガラスカラム
に装填する。（２）１０ベッド体積の水でカラムを洗浄する。（３）これをその後、１０ベッド体積の１％ＮａＨＣＯ₃で平衡化する。（４）カラムに反応混合物を装填し、そしてフロースルーを収集する。（５）フロースルーをカラムに２回通過させ、結合を促進する。（６）その後、カラムを０．５ｍｌの１％ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。（７）同一チューブに洗浄およびフロースルーを収集し、そして標識する。（８）カラムを６ｍｌの１％ＮａＨＣＯ₃で２回洗浄する。（９）２つの洗浄を同一チューブに収集し、そして標識する。（１０）０．４Ｍ塩化リチウムを含む１ｍｌの１％ＮａＨＣＯ₃でカラ
ムを溶出する。（１１）分画を収集し、そして標識する。（１２）分画をカウントし、そして最も純粋なものを反応に用いる。

【００２５】反応混合物を含むエッペンドルフチューブを、３７℃で約４ないし６０分間イ
ンキュベーションし、そしてその後、２分ごとに、酢酸ピリジニウムおよびｎ−
ブタノールの２：１混合物５０μｌを添加し、反応を停止する。

【００２６】産物を飽和ｎ−ブタノールで抽出し、そして５０μｌの水で洗浄する。これを
その後、２５−５０μｌずつ、シンチレーションカウンターでカウントする。酵素転移酵素により触媒される反応は、可逆性であることが知られる。可逆反
応を示すため、酵素反応を１０分間続け、放射性産物、ウンデカプレノール−ピ
ロリン酸−［２，３−³Ｈ］プロピオネート−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプ
チド、脂質Ｉを形成した。これをその有機相から分離する。放射性産物が形成さ
れたら、反応の１組を、先に記載されるように、２：１の酢酸ピリジニウムおよ
びｎ−ブタノール混合物を用い、停止する。反応の平行組において、１μＭＵ
ＭＰを添加する。その後、約３−４分後に、反応を停止する。両方の組の反応か
ら、脂質分画を抽出してもよい。有機相の放射性カウントが、ＵＭＰでの基底レ
ベルに減少するのが見られる。これは、脂質Ｉの水可溶性前駆体への逆転を示す
。

【００２７】本実施例は、本アッセイ系が、粒子からなる膜を酵素供給源として用いた場合
でさえ、転移酵素反応のみに特異的であることを示すのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、１００％コントロールから得た読み取り値に基づく時間に対する分当
たりのカウント（ｃｐｍ）を示すグラフである。

【図２】図２は、コントロール（黒四角により示される）に比較した０．３μｇ／ｍｌ
の濃度のツニカマイシンによる転移酵素の阻害率（▲により示される）を示す。
これは、ツニカマイシンが、転移酵素のアンタゴニストであることを立証する。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド転移酵素
活性を検出するためのアッセイであって：（１）水性媒体中に、Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート置
換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド、Ｎ−スクシンイミジルプロピオネー
ト置換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド（非放射性）、二価金属イオンの
供給源、ウンデカプレニルリン酸の供給源、転移酵素の供給源および界面活性剤
を含む、反応混合物を、酵素活性が起こるのに適した条件下で、インキュベーシ
ョンし；（２）ｐＨ〜４．２で、第四級アンモニウム塩を含む、適切な緩衝液で反応混合
物を酸性化し、工程（１）の酵素反応を停止し；そして（３）形成されたいかなるウンデカプレノール−ピロリン酸−［２，３−³Ｈ］
プロピオネート−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド産物も抽出し、そしてシ
ンチレーションカウンターを用い、放射能を測定する工程を含む、前記アッセイ。
【請求項２】置換されたＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド
が、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−アラニン−γ−Ｄ−グルタミン酸−ｍ−ジアミ
ノピメリン酸−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンである、請求項１記載のアッセイ。
【請求項３】塩化マグネシウムが二価金属イオンの供給源として用いら
れる、請求項１または請求項２記載のアッセイ。
【請求項４】細菌細胞膜が、ウンデカプレニルリン酸および転移酵素の
１つまたは両方の供給源として用いられる、請求項１ないし３のいかなる１つで
もよいもの記載のアッセイ。
【請求項５】細菌細胞膜が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）由来である、請求項４記載のアッセイ。
【請求項６】工程（１）の反応混合物が、さらに試験化合物を含む、請
求項１ないし５のいかなる1つでもよいもの記載のアッセイ。
【請求項７】試験化合物が、転移酵素のアンタゴニストである、請求項
６記載のアッセイ。
【請求項８】酢酸ピリジニウムおよびｎ−ブタノールの２：１混合物が
、工程（２）で反応を停止するのに用いられる、請求項１ないし７のいかなる１
つでもよいもの記載のアッセイ。
【請求項９】工程（３）の産物が、ｎ−ブタノールを用いて抽出される
、請求項１ないし７のいかなる１つでもよいもの記載のアッセイ。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載のアッセイを行うのに使
用するためのキットであって、（１）Ｎ−スクシンイミジル［２，３−³Ｈ］プロピオネート置換ＵＤＰ−Ｍｕ
ｒＮＡｃ−ペンタペプチド、（２）Ｎ−スクシンイミジルプロピオネート置換ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタ
ペプチド（非放射性）、（３）二価金属イオンの供給源、（４）ウンデカプレニルリン酸の供給源、（５）ホスホ−Ｎ−アセチルムラミル−ペンタペプチド転移酵素の供給源，およ
び（６）界面活性剤を含む、前記キット。