JP2540482B2

JP2540482B2 - ポリヌクレオチド配列の生体内標識化

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Publication number: JP2540482B2
Application number: JP59137381A
Authority: JP
Inventors: スタブリアンオポロスジヤニス; ラングヤングヒユーイ; イーケルカーノーマン
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1983-07-05
Filing date: 1984-07-04
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-10-02
Also published as: EP0133473A3; JP2607058B2; EP0133473B1; AU581620B2; ES542287A0; DE3486290D1; ES534014A0; JPH08224084A; ATE103327T1; DK328084D0; JPS6076667A; ES8606651A1; CA1338856C; EP0133473A2; NO842720L; DE3486290T2; AU3020584A; IL72302A0; ES8606229A1; DK328084A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の要約〕生体内標識されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ドの生体内標識方法、検出方法および標識されたポリヌ
クレオチドを特徴とするキツトにつき開示する。本発明
の生体内生物学標識ポリヌクレオチドを種々の分析物を
検出する際、或いは他の実験上、工業上または医薬上の
用途において有用である。

〔発明の属する技術分野〕

本発明は、ポリヌクレオチド配列の生体内標識に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は分析物に対す
るヒブリド化に際し検出を可能にするDNA配列の生物学
的標識化に関するものである。

以下の説明から判るように、本発明の方法により産生
されかつ生物学標識されたポリヌクレオチド配列は多く
の実験上、工業上または医薬上の用途において分析物の
検出が望ましい場合に重要である。

〔従来の技術とその問題点〕

以下の記載において、次の用語を使用する：分析物：存在を検出しかつ所望ならば定量すべき物質
もしくは複数の物質のそれぞれ単独または混合物。この
分析物は小分子量または高分子量のDNAもしくはRNA分
子、これらの分子を含む分子複合体またはたとえばウイ
ルス、細胞もしくは細胞群のような核酸を含有する生物
系とすることができる。一般的な分析物には核酸（DNA
およびRNA）もしくはその断片、単一鎖もしくは二重鎖
のもの、ウイルス、細菌、培養細胞などがある。グラム
陽性細菌およびグラム陰性細菌を含め全体としてもしく
はその断片としての細菌、真菌類、藻類およびその他の
微生物も分析物であり、さらに動物（たとえば、哺乳動
物）および植物の細胞および組織も包含される。

プローブ：特定分析物のポリヌクレオチド配列に対し
補完的でありかつこの分析物ポリヌクレオチド配列ヘヒ
ブリド化する標識されたポリヌクレオチド配列。

標識：そのままで、または信号部分もしくは架橋部分
と信号部分との組合せが共有結合した後に、または信号
部分もしくは架橋部分と信号部分との組合せが非共有結
合した後に、検出しうるまたは或る場合には定量化しう
る信号を発生するポリヌクレオチド配列に結合された部
分。この種の標識を有する化合物はたとえばグルコシル
化ヌクレオチド、グリコシル化ヌクレオチド、５−ヒド
ロキシメチルウラシル、ＢγdURおよび５−メチルシト
シンを包含する。

架橋部分：ポリヌクレオチド配列の標識へ共有結合ま
たは非共有結合する際、標識と信号部分との間で結合手
または架橋として作用する部分。

信号部分：ポリヌクレオチド配列の標識へまたはこの
標識に結合された架橋部分へ共有結合または非共有結合
する際に、標識を検出するための信号を発生する部分。

信号：信号を持たない配列から検出されうる標識また
は信号部分の特徴。

生物試料および非生物試料における微量の物質の分析
および検出は、臨床実験および分析実験において日常の
手段となつた。これらの検出技術は次の２つの主たる分
類に分けることができる：（１）リガンドー受容体の相
互作用に基づくもの（たとえば免疫分析に基づく技術）
および（２）核酸ヒブリド化に基づくもの（ポリヌクレ
オチド配列に基づく技術）。

免疫分析に基づく技術は、抗体とそれに補完的な抗原
との非共有結合からなる一連の工程を特徴とする。たと
えば、テイー・チヤード、「放射免疫分析および関連技
術の初歩」（1978）を参照することができる。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術は、標識され
たポリヌクレオチド配列またはプローブをアデニン
（Ａ）とチミジン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）とシチ
ジン（Ｃ）とワトソン−クリツク塩基対にしたがつてヒ
ブリド化条件下で分析物の補完配列へ非共有結合させ、
かつそのヒブリド化を検出することからなる一連の工程
を特徴とする。〔エム・グルンシユタインおよびデイー
・エス・ホグネス、「コロニーヒブリド化：特異遺伝子
を含有するクローン化DNAの単離方法」、プロシーデイ
ング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・USA、第7
2巻、第3961−65頁（1975）〕。

一般的意味において、分析物の補完配列に対する標識
配列もしくはプローブの非共有結合は、ポリヌクレオチ
ド配列に基づく検出技術の主たる識別過程である。この
結合過程は、プローブと分析物との補完ヌクレオチド配
列の正確な分子整列および相互作用により行なわれる。
これは非共有結合の自由エネルギ、たとえば水素結合自
由エネルギ、積層自由エネルギなどの放出によりエネル
ギ的に促進される。

主たる識別過程の他に、さらに標識ヌクレオチド配列
と分析物の補完配列との間で結合が生ずる時点を検出す
ることが必要である。この検出は信号過程で行なわれ
る。信号過程は定量的もしくは定性的な検出を可能に
し、たとえば主たる識別過程の発生をヒトまたは装置の
検出系で検知することを可能にする。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術の主たる識別
過程および信号過程は、直接的にまたは間接的に、或い
は比例的にまたは逆比例的に結合することができる。た
とえば充分量の放射能標識したプローブによる核酸ヒブ
リド化のような系において、放射能の量は一般に存在す
る分析物の量に比例する。逆比例の技術は、たとえば検
出される信号の量が試料中に存在する分析物の量が多く
なるにつれて低下するような競合免疫分析を包含する。

信号過程を主たる識別過程に対し1:1より大きい比で関
連させるよう検出を向上させるために増幅技術を使用す
ることもできる。たとえば、分析の信号成分を各識別成
分に対し10:1の比で存在させて、10倍の感度増加を与え
ることもできる。

主たる識別過程の発生を検出するには多くの種類の信
号過程を使用することができる。選択する信号過程は、
主たる識別過程で使用されるポリヌクレオチド配列の標
識または信号部分を特徴とする特定信号に依存する。標
識はこれへ信号部分または架橋部分と信号部分との組合
せを結合させる処理なしにそれ自身で検出されうるが、
この標識に対しそれ自身で検出されうるまたはさらに改
変した後に検出されうるようになる信号部分または架橋
部分と信号部分との組合せを共有結合または非共有結合
させるのがより一般的である。

勿論、上記の架橋部分と信号部分との組合せは標識へ
結合させる前に作成しうること、或いは標識へ順次に結
合させうることを了解すべきである。たとえば、架橋部
分を先ず標識へ結合させ、次いで信号部分をその架橋部
分へ結合させることができる。さらに、幾つかの架橋部
分および／または信号部分を一緒に、架橋部分と信号部
分との組合せにおいて使用することもできる。

標識に対する信号部分または架橋部分と信号部分との
組合せの共有結合の例は、たとば放射性部分、螢光性部
分または検出手段となりうる信号をそれ自体で与える他
の部分のような信号部分による標識の化学的改変、或い
は信号を与えるための架橋部分と信号部分との少なくと
も１つの組合せによる標識の化学的改変である。

標識に対する信号部分または架橋部分と信号部分との
組合せの非共有結合の例は、適当な手段によりそれ自身
で検出されうる信号部分の標識に対する非共有結合、或
いはこれら手段の１つにより検出されうる信号を発生す
る架橋部分と信号部分との組合せの標識に対する非共有
結合である。たとえば、ポリヌクレオチド配列の標識を
抗体、螢光性部分または適当な手段により検出しうる他
の部分へ非共有結合させることができる。或いは、標識
を架橋部分（たとえばレクチン）へ結合させ、次いでレ
クチン、すなわち架橋部分を介して適当な手段により検
出しうる他の部分へ結合させることもできる。

分析物検出系においてプローブとして有用なポリヌク
レオチド配列の標識へ共有結合させまたは非共有結合さ
せるのに使用しうる極めて多くの種類の信号部分および
架橋部分が存在する。これらは多くの種類の放射性およ
び非放射性信号部分を包含し、さらに多くの種類の非放
射性架橋部分を包含する。必要とされることは、信号部
分が適当な手段により検出されうる信号を与えること、
並びに存在すれば架橋部分が標識に対し共有結合または
非共有結合する能力および信号部分と結合する能力を特
徴とすることである。

放射性の信号部分並びに各種の架橋部分と放射性信号
部分との組合せは、たとえばP³²，I¹³¹，C¹⁴，H³，C
o⁶⁰，Ni⁵⁹，Ni⁶³などのような１種もしくはそれ以上の
放射性同位元素を特徴とする。好ましくは、使用する同
位元素はβ線またはγ線を放出し、かつ長い半減期を有
する。次いで、特に一般的には放射能信号の検出は、た
とえばフイルムへ露出するような放射能検出器によつて
行なわれる。

非放射性信号部分、並びに架橋部分と非放射性信号部
分との組合せは、研究および臨床分野においてますます
その使用が増大しつつある。これらの信号および架橋部
分は放射能を含まないので、これらを使用する技術およ
び標識プローブは安全、綺麗かつ一般的に貯蔵の際より
安定であり、その結果安価に使用できる。さらに、非放
射性信号部分の検出感度は、放射能標識技術と同程度に
高いかまたはそれ以上である。

非放射性標識と共に使用しうる好適な非放射性信号部
分または架橋−信号部分の組合せのうちには、ビオチン
／アビジン結合系に基づくものがある〔ピー・アール・
ランガー等、「ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的
合成：新規な核酸親和性プローブ」、プロシーデイング
・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・USA、第78
巻、第6633−37頁（1981）；ジエー・スタブリアノポウ
ロス等、「同族配列のヒブリド化／検出に対するグリコ
シル化DNAプローブ」、組換DNA研究に対する第３回会議
（1983年）で提出；アール・エツチ・シンガーおよびデ
イー・シー・ウオード、「ビオチン化ヌクレオチド同族
体によりその場でヒブリド化させることによりニワトリ
筋肉組織培養物で肉眼化させたアクチン遺伝子発現」、
プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
ス・USA、第79巻、第7331−35頁、（1982）〕。非放射
性信号系および架橋−信号系、ビオチン／アビジンなど
については、デイー・シー・ウオード等、改良ヌクレオ
チド並びにその製造および使用方法」、ヨーロツパ特許
出願第63879号明細書を参照することができる。

非放射能標識ポリヌクレオチドは、検出系においてそ
れ程広く使用されていない。何故なら、検出系において
プローブとして有用なポリヌクレオチド配列に対する標
識（ヒブリド化を阻害しない）の結合が高価となるから
である。

第１に、標識を加えるようポリヌクレオチド重合体を
改変するのに有用である化学反応条件は、しばしば苛酷
すぎて特定ヌクレオチドについては選択することができ
ない。さらに重要なことに、ポリヌクレオチド配列の化
学的標識は、しばしばヒブリド化を阻害する。何故な
ら、この標識はヒブリド化に必要な水素結合を阻害する
からである。たとえば、ケトキサールまたはグリオキサ
ールのようなジカルボニル試薬はグアニン残基と反応す
る〔シヤピロ等、バイオケミストリー、第５巻、第2799
−2807頁（1966）；エム・リツト、バイオケミストリ
ー、第８巻、第3249−53頁（1969）；ポリツツ等、バイ
オケミストリー、第20巻、第372−78頁（1981）〕。し
かしながら、ケトキサールおよびグリオキサールで標識
したヌクレオチドは、分析物における補完配列に対しヒ
ブリド化しない。何故なら、この標識はヒブリド化に必
要な水素結合を阻害するからである。

したがつて、プローブとして使用するポリヌクレオチ
ド配列を標識するためには、標識された単量体ヌクレオ
チドを合成し、次いでこれをポリヌクレオチド配列中に
組込まねばならない。標識がヒブリド化を阻害しないよ
うな方法で個々のヌクレオチドを標識するには種々の方
法が使用できる。これら標識された単量体ヌクレオチド
をポリヌクレオチドプローブへ結合させるにも、種々の
化学的および酵素的方法が使用できる。たとえば、２′
−デオキシウリジン５′−トリホスフエート５−アリル
アミンビオチンのような標識されたヌクレオチドを、DN
Aプローブにおいてニツク翻訳によつて置換することが
でき〔ピー・アール・ランガー等、「ピオチン標識した
ポリヌクレオチドの酵素的合成；新規な核酸親和性プロ
ーブ」、プロシーデイング・シヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第78巻、第6433−37頁（1981）〕また
は末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用
いるDNAプローブへの末端付加により置換することがで
きる。

しかしながら、これらの方法には製造上の制約があ
る。たとえば、標識された単量体ヌクレオチドをポリヌ
クレオチドプローブ中へ組込む前に、これらヌクレオチ
ドを合成する必要がある。この合成は、しばしば高価な
化学的方法を含む。ポリヌクレオチド中への標識された
単量体ヌクレオチドの結合も高価につく。たとえば、酵
素的結合に使用する酵素は高価である。これに関連する
制約は、この方法を工業的規模まで拡大するのに困難を
伴いかつ費用が嵩むことである。その結果、これらの方
法は、現在希望するよりも高価につく非放射能標識した
ポリヌクレオチドを生産する。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、分析物の検出においてプローブとし
て有用である生体内または生物学的に標識したポリヌク
レオチド配列を提供することにより、上記の製造上の制
約を解決することである。これらの配列は、問題とする
分析物を検出するための方法およびキツトに使用するこ
とができる。

〔発明の要点〕

本発明の標識したDNA配列の製造方法は、一般にその１
具体例において、所望ポリヌクレオチド配列の生体内標
識化を含む。或いは、本発明の方法を使用して、予め標
識された塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを所
望のポリヌクレオチド配列中へ生体内で組込むこともで
きる。本発明のこれら両具体例は、従来のポリヌクレオ
チド標識方法に対する改良である。さらに、これら両者
は非放射能標識したプローブを種々の検出系に使用する
のに一層低価格で容易に供給することを可能にする。

より詳細には、本発明のポリヌクレオチド配列の生体
内標識方法における第１の具体例は、標識することが望
ましいポリヌクレオチド配列と少なくとも１種の他のポ
リヌクレオチド配列とを特徴とする宿主を培養する工程
からなり、前記他のポリヌクレオチド配列は培養宿主の
複製に際し所望のポリヌクレオチド配列を標識する産生
物を発現する。好ましくは、この方法はさらに標識され
たポリヌクレオチド配列からなる少なくとも１種のポリ
ヌクレオチド配列を培養宿主から単離する工程をも含
む。より好ましくは、培養宿主から単離されたDNA配列
は、標識されたポリヌクレオチド配列自身の１部または
全部である。

本発明の１つの好適具体例においては、標識すること
が望ましい異質DNA配列をT4バクテリオフアージゲノム
（これは一般にヒドロキシルメチル化されかつグルコシ
ル化されたDNAを含有する）中へ挿入する。宿主T4フア
ージは、ヒドロキシメチル化されかつグルコシル化され
たDNAを産生する条件下で増殖される。挿入されたプロ
ーブDNA配列を含有するT4フアージを収穫し、そしてプ
ローブDNA配列を好ましくは周知のその場におけるもし
くは試験管内のヒブリド化法においてヒブリド化プロー
ブとして使用するために切断する（たとえば、サウザン
ブロツト、ノーザンブロツト、ドツトブロツト、コロニ
ーヒブリド化またはブラツクリフト法）。或いは、挿入
された生体内標識したプローブDNA配列を含有するT4フ
アージゲノムをプローブとして使用することもできる。

次いで分析物へヒブリド化したプローブの存在を、た
とえば架橋部分と信号部分との組合せを用いて検出す
る。たとえば、コンカナバリンＡ（「Con A」）をグル
コシル化プローブDNA配列に結合させ、そして天然グリ
コシル化酵素に対する架橋として作用させる。酵素（た
とえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）は適当な基質
（たとえば、H₂O₂）とジアミノベンジジンとに接触する
と比色分析しうる生成物を生成し、これを検出すること
ができる。さらに、他の検出系または抗体、或いは周知
の方法を用いる他の検出系も、ヒブリド化DNA配列を検
出するために使用することができる。

本発明による方法の他の具体例においては、所望の標
識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドま
たはその同族体もしくは先駆体を生体内でポリヌクレオ
チド配列中へ組込む。この具体例において、本発明のポ
リヌクレオチド配列の生体内標識方法は、標識すること
が望ましいポリヌクレオチド配列を特徴とする宿主をそ
の宿主が成長するのに必要とする標識を有する塩基、ヌ
クレオシドもしくはヌクレオチドまたはその同族体もし
くは先駆体の存在下で培養して、この標識をポリヌクレ
オチド配列中へ組込む工程を含む。ここでも標識された
ポリヌクレオチド配列からなる少なくとも１種のポリヌ
クレオチド配列を培養宿主から単離するのが好ましい。
さらに好ましくは、培養宿主から単離された配列は、標
識されたポリヌクレオチド配列自身の一部または全部で
ある。

標識を有する塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチ
ドまたはその同族体もしくは先駆体をポリヌクレオチド
配列中へ生体内で組込むための本発明による１つの好適
具体例において、標識することが望ましいポリヌクレオ
チド配列を特徴とするイー・コリのチミンもしくはチミ
ジン要求性の突然変異種をチミジンもしくはチミンの代
りにＢγdURを補充した培地で増殖させて、所望のポリ
ヌクレオチド配列をＢγdURによつて生物学的に標識す
る。

この標識プローブのその後の使用は実質的に上記した
通りである。プローブ検出／分析物ヒブリド化の過程
は、ＢγdUR標識したプローブDNA配列のビオチン化と幾
つかの公知方法のいずれかによるビオチン成分の検出を
介して行なうことができる。或いは、抗体または他の検
出方式を使用して、ＢγdUR置換したDNAを直接に検出す
ることもできる〔エツチ・ジイー・グラツナー、「５−
ブロム−および５−イオド−デオキシウリジンに対する
モノクローナル抗体:DNA複製を検出するための新規な試
薬」、サイエンス、第218巻、第474−75頁（1982）。〕〔発明の実施例〕本発明を一層よく理解するよう、以下詳細に説明す
る。

生体内標識されるポリヌクレオチドの原料多数のポリヌクレオチド配列を本発明の方法に使用し
て標識しかつ分析物の検出に使用することができる。た
とえば、これには各種のウイルス性、擬似ウイルス性、
真菌性、寄生性もしくは細菌性の感染、遺伝障害または
検出することが望ましい分析物における他の配列を特徴
とするポリヌクレオチド配列が包含される。これらは合
成、半合成または天然の起源とすることができる。

多数の入手しうる原料のいずれかを使用して、生体内
標識されたポリヌクレオチドを産生させることができ
る。たとえば、Ｔ−偶数フアージ（すなわちT2、T4およ
びT6）が包含され、これらは天然においてモノ燐酸シチ
ジンの代りにグルコシル化されたモノ燐酸ヒドロキシメ
チルデオキシシチジンを有する〔アイ・アール・レーマ
ン等、ジヤーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
235巻、第3254−59頁（1960）〕；さらに５−ヒドロキ
シメチルウラシルによりチミジン残基を置換する枯草菌
フアージSPO1〔アール・ジイー・カレン等、ジヤーナ
ル、モレキユラー・バイオロジー、第５巻、第248−50
頁（1962）〕;5−メチルシトシンによりＣ残基を置換す
るキサントモナス・オリゼ（Xanthomonus oryzea）フア
ージXP12〔テイー・テイー・クオ等、ジヤーナル、モレ
キユラー・バイオロジー、第34巻、第373−75頁（196
8）〕；並びにＴ残基の62％がホスホグルクロン化され
かつグルコシル化された５−（４′,5′−ジヒドロキシ
ペンチル）ウラシルにより置換された枯草菌フアージSP
15〔エツチ・ハヤシ等、ジヤーナル・アメリカン・ケミ
カル・ソサエテイ、第95巻、第8749−57頁（1973）〕が
包含される。本発明の変法において、５−ブロム−デオ
キシウリジン（ＢγdUR）または他の標識された塩基、
ヌクレオシドもしくはヌクレオチドによるプローブDNA
配列の標識化は、これらの塩基、ヌクレオシドもしくは
ヌクレオチドを成長に必要とする突然変異種をこれらの
存在下で増殖させて行なう。

標識することが望ましいポリヌクレオチド配列と標識
の原料とは、多くの方法で宿主中において組合せること
ができる。たとえば、標識すべきポリヌクレオチド配列
は、元来、特定宿主の原ゲノムの１部とすることがで
き、或いはたとえば組換DNA技術の方法を用いてそのゲ
ノム中へ挿入することもできる。或いは、標識すべきポ
リヌクレオチド配列は、複製させかつ標識するよう宿主
を形質変換させるのに使用するクローン化ベヒクル、フ
アージDNAまたはその他のDNA配列の１部とすることもで
きる。

さらに標識の原料を、種々の方法で宿主中に存在させ
ることもできる。たとえば、標識の原料がポリヌクレオ
チド配列を特徴とする宿主において複製させる際にこの
所望のポリヌクレオチド配列を標識する産生物を発現す
るDNA配列である場合、このDNA配列を宿主中に存在させ
ることができる。何故なら、これは宿主の天然ゲノムの
１部であつたか、或いはそのゲノム中に挿入されたもの
であるからである。或いは、標識の原料であるDNA配列
は、複製のために宿主を形質転換させるのに使用するク
ローン化ベヒクル、フアージDNAまたはその他のDNA配列
の１部とすることもできる。本発明の１つの好適具体例
において、標識すべきポリヌクレオチド配列は、標識の
原料であるDNA配列と同じクローン化ベヒクルまたはフ
アージDNAに存在する。或いは、２種のDNA配列が宿主中
に別々に存在してもよい。特に好ましくは、標識すべき
ポリヌクレオチド配列を、標識の原料であるDNA配列中
にクローン化させる。いずれにせよ、宿主を培養する
際、所望DNA配列を複製中にまたは複製後に標識の原料
であるDNA配列により発現された産生物の結果として標
識する。

標識の原料が塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレオチ
ドまたその同族体もしくは先駆体である場合、これは宿
主における複製の際に所望ポリヌクレオチド配列中に組
込まれる。何故なら、この宿主は、所望の標識を有する
増殖用の標識保持部分、塩基、ヌクレオシドもしくはヌ
クレオチドまたはその同族体もしくは先駆体を培養培地
へ加えることを必要とする変種であるからである。次い
で、本発明の方法により培養する際、所望のポリヌクレ
オチド配列が宿主における複製に際し標識の組込みによ
つて生体内標識される。

本発明の方法に有用な宿主は、極めて多くの公知生物
から選択することができる。これらは、たとえばイー・
コリ、バチルス、シユードモナス、ストレプトミセス並
びに各種の真菌類、藻類のような各種の微生物並びに植
物およびヒトの培養細胞を包含する。必要なことは、標
識することが望ましいポリヌクレオチド配列を宿主中で
複製させ、かつ宿主の増殖のために選択された培養条件
下で標識の原料により標識することだけである。

分析物の原料および検出本発明の生物学的に産生されたプローブDNA配列は、
多くの実用的用途を有する。１つの用途は分析物の検出
である。検出すべき分析物は任意の生物学的または非生
物学的試料、たとえば臨床試料（たとえば血液、尿、
糞、唾液、膿、精子、血清、その他の組織）、発酵用ブ
ロス、培養倍地などに存在することができる。

必要に応じ、分析物は、その核酸を濃縮するために公
知方法により予備抽出し或いは精製することができる。
この種の核酸濃縮法は、たとえばフエノール抽出、クロ
ロホルム−イソアミルアルコールもしくはクロロホルム
−オクタノールによる処理、カラムクロマトグラフイー
（たとえば、セフアデツクス、ヒドロキシルアパタイ
ト）およびC_sCl平衡遠心分離を包含する。分析物は、存
在する汚染物質と一緒に混合物中で或いは精製した状態
で試験することができ、或いは分析物は分析前に固定化
することもできる。

本発明の検出方法およびキツトについても多数の用途
がある。試料中において検出しかつ分析することが望ま
しい任意の分析物を本発明の方法およびキツトにかける
ことができる。たとえば、この方法およびキツトを使用
して、ウイルス性および細菌性のDNA配列を検出しかつ
同定することができ、たとえばヘルペスウイルスの検出
が可能である。

さらに本発明の方法およびキツトを使用してヒトの遺
伝障害を診断することができ、その際遺伝障害に関連す
るDNA配列に対し補完的なプローブを作成し、かつ主た
る標識過程の存在または不存在を検出する。これらの遺
伝障害には、たとえば海洋貧血がある。この海洋貧血の
診断は、プローブポリヌクレオチド配列をゲノムDNAへ
ヒブリド化させて行なうことができる。

本発明の方法およびキツトの他の用途は染色体の核型
分類であり、これは染色体のそれぞれに特異的に位置す
る一連の所定DNA配列に対応する一連の標識ポリヌクレ
オチド配列を使用し、次いで主たる識別過程を検出する
ことからなつている。

ヒブリド化分析の方法試験を行なうため、分析物を含有すると思われる組成
物を、標識されたプローブポリヌクレオチド配列と一緒
に、分析物のポリヌクレオチド配列をプローブ上の識別
用ポリヌクレオチド配列との間のヒブリド化を行なわせ
るのに充分な時間および条件の下で培養する。これらの
条件は分析物およびプローブの性質および量に応じて変
化する〔デイー・イー・ケネル、「核酸ヒブリド化の原
理および実施」、プログレス・ヌクレイツク・アシド・
リサーチ・モレキユラー・バイオロジー、第11巻、第25
9−301頁（1971）〕。

多くの種類の信号過程を用いて、主たる識別過程の発
生、すなわち分析物における補完配列に対する標識DNA
配列のヒブリド化を検出することができる。選択する特
定の信号過程は、ポリヌクレオチド配列の標識または改
変標識を特徴とする特定の信号に依存する。

たとえば、ポリヌクレオチド配列により担持される標
識は、これに信号部分または架橋部分と信号部分との少
なくとも１つの組合せを結合させる処理なしに検出する
ことができる。しかしながら、より一般的にはそれ自身
で検出しうる或いはさらに改変した後に検出しうるよう
になる（上記）信号部分或いは架橋部分と信号部分との
少なくとも１つの組合せを共有結合させ、または非共有
結合させる。

ポリヌクレオチド配列の標識に共有結合させうる信号
部分および架橋部分の例は放射性化合物、螢光性化合
物、フルオレシン、ローダミン、ダンシル、磁性化合
物、キレート剤並びにこれら標識に対し共有結合させう
るその他の信号部分および架橋部分を包含する。

ポリヌクレオチド配列の標識に対し非共有結合させう
る信号部分および架橋部分の例はポリペプチド、蛋白
質、レクチン、コンカナバリンＡ、酵素、アルカリホス
フアターゼ、酸ホスフアターゼ、抗原、抗体、結合され
たストレプトアビジン基を有するポリペプチド、β−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、キレート剤並びにこれら標識に対し
非共有結合させうるその他の信号部分および架橋部分を
包含する。

たとえば、酵素を信号部分としてポリヌクレオチドプ
ローブ配列の標識へ非共有結合させることができる。次
いで、基質を加えて発色させる（螢光、放射能もしくは
キレート検出の方式も使用することができる）。或い
は、標識に結合された部分がビオチン成分であれば、た
とえばアビジン、ストレプトアビジンまたはアンチ−ビ
オチン抗体のようなビオチン結合分子を次いでこれに加
えることもできる。次いで、ビオチン結合分子が酵素、
螢光性化合物、電子濃密化合物または不溶性固体相へ結
合させて、適当な手段により検出を行なうことができ
る。

本発明を一層よく理解するよう、以下に実施例を示
す。これら実施例は説明の目的であつて、本発明はこれ
らのみに限定されない実施例Ｉ（Ａ）バクテリオフアージT4におけるグルコシル化プロ
ーブDNAの産生組換DNA技術を用いて、プローブDNA配列を、グルコシ
ル残基で標識するためT4バクテリオフアージ中へ挿入す
ることができる。

T4DNAは天然グルコシル化されている。一般的に使用
される制限エンドヌクレアーゼの殆んどはグルコシル化
DNAを加水分解しないので、エンドヌクレオ分解および
プローブDNAの挿入の前にT4DNAからグルコース残基を除
去する必要がある。ヒドロキシメチルシチジングルコシ
ダーゼ、すなわちフアージ誘発酵素はグルコース部分を
グルコシル化DNAから除去して、これをその逆反応でUDP
へ移動させる〔ジエー・ジヨツセ等、ジヤーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第237巻、第1968−76頁（1
962）；エス・アール・チンメルマン等、ジヤーナル・
バイオロジカル・ケミストリー、第237巻、第512−18頁
（1962）〕。或いはT4フアージを、シトシンがヒドロキ
シメチル誘導体を置換するような条件下で増殖させるこ
ともできる〔ケー・カールソン等、ジヤーナル・バイロ
ロジー、第36巻、第１−17頁（1979）；ピー・オーフア
レル等、モレキユラー・ゼネラル・ジエネテイツクス、
第179巻、第421−35頁（1980）；エル・シンダー等、プ
ロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス
・USA、第73巻、第3098−3102頁（1976）〕。

T4DNAが上記のように脱グルコシル化された後、プロ
ーブDNA配列を脱グルコシル化されたT4ゲノム中へ挿入
する。脱グルコシル化T4ゲノム中へのプローブDNA配列
の挿入は各種の公知方法で行なうこともできるが、これ
は標識の後にT4DNAから除去しうるような方法で挿入す
るのが好適である。

T4フアージにおいてはＣ残基のみがグルコシル化され
ているので、DNA配列TTTAAAを識別しかつ開裂する制限
エンドヌクレアーゼAhaIIIが原T4DNAを開裂しうる数少
ないエンドヌクレアーゼの１種である。したがつて、本
発明の１つの好適具体例において、プローブDNA配列
は、部分脱グルコシル化されたT4DNA中へ挿入する前に
両末端にAhaIII制限部位を有するように改変される（第
１図）。このような作成において、プローブDNA配列は
次いでAhaIIIでの制限によりT4DNAから標識の後に単離
することができる。

DNAプローブの作成、T4DNA中へのその挿入および標識
後におけるその除去に関する一般的方法を下記に説明し
かつ第１図に示す：（１）先ず最初にDNA配列pTTTAAAp（公知技術により合
成）をプローブDNAの３′末端に結合させ、これをRNAリ
ガーゼを用いてT4ゲノム内に挿入する。コンカテマーの
生成を防止するにはDNA配列pTTTAAApの３′末端と５′
末端との両者に燐酸を必要とする。

次いで、プライマDNA配列TTTAAp（常法により合成）
を、上記で作成されたDNA配列へ非共有結合させる（第
１図）。このDNA配列（TTTAAp）はプライマとして作用
し、したがつてDNAポリメラーゼとデオキシヌクレオチ
ド三燐酸dATP,dTTP,dGTPおよびデオキシヒドロキシメチ
ルCTP（dHMCTP）の存在下で複製する際、２つのDNA配列
が生成される（第１図）。これらの配列は、プローブDN
A配列の対向末端にAhaIII制限エンドヌクレアーゼ部位
を有する（第１図）。これらはさらに、DNA鎖の１つに
標識（）を有する。

第２のAhaIII部位をプローブDNA配列の他方の末端へ
付加させるため、同様な一連の工程を行なう。ここでも
DNA配列pTTTAAApを、予め作成されたDNA配列の３′末端
へ結合させる（第１図）。次いで、DNA配列TTTAAApをプ
ライマとして使用して生成配列へ非共有結合させ（第１
図）、そして処理された配列をDNAポリメラーゼおよび
４種のデオキシヌクレオチド三燐酸の存在下で前記のよ
うに複製させる（第１図）。

この一連の工程の結果、各端部においてAhaIII制限エ
ンドヌクレアーゼ部位により整列され、かつ両DNA鎖に
標識を有するプローブDNA配列からなるDNA配列が生成さ
れる（第１図）。これら工程の副産物として、２種の単
一鎖DNA配列も生成される。これらの単一鎖DNA配列は、
２つのAhaIII制限部位を有する所望のプローブDNA配列
から容易に分離することができる。

次いで、燐酸基をプローブDNA配列の末端からアルカ
リホスフアターゼにより除去した後、プローブDNA配列
をT4ゲノム中へ挿入する。

（２）上記のように作成された部分脱グルコシル化され
たフアージT4DNAを制限エンドヌクレアーゼにより開裂
させた後、プローブDNAをT4ゲノムの非必須部分中へ挿
入し、すなわちフアージ複製、ヒドロキシメチルシトシ
ン生成およびDNAグルコシル化に必要とされない遺伝子
中へ挿入する。BamHIは、このような部位においてT4DNA
を開裂する。制限の後、必要に応じ単一鎖末端をDNAポ
リメラーゼＩによつてATP,TTP,GTPおよびデオキシヒド
ロキシメチルCTPの存在下で埋め込む。

（３）AhaIII識別部位を有するプローブDNA配列を、T4
ゲノムの予め制限された非必須領域へ鈍端結合させる
〔ブイ・スガラメラ、「バクテリオフアージP22 DNAお
よび線状猿ウイルス40DNAの酵素的オリゴマー化」、プ
ロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス
・USA、第69巻、第3389−93頁（1972）〕。

（４）プローブをT4ゲノム中へ挿入した後、好ましくは
全組換DNA分子をαおよびβグルコシルトランスフエラ
ーゼによつてUDP−グルコースの存在下で〔ジエー・ジ
ヨツセ等、上記〕試験管内にてグルコシル化することに
より、組換DNA分子をフアージによりエンドヌクレオ分
解攻撃から保護する。

（５）組換T4プローブDNA分子の試験管内カプセル化
は、エル・ダブリユウ・ブラツクの方法にしたがつて行
なうことができる〔「バクテリオフアージT4DNAの試験
管内充填」、バイロロジー、第113号、第336−44頁（19
81）〕。

（６）プローブDNA配列を含有するこれらクローンに関
する形質転換宿主T4フアージの選別は、補完的ビオチン
化DNAプローブによつて、またはその他任意の慣用の選
別法によつてヒブリド化により行なわれる。

（７）DNAを、多くの公知方法のいずれかによりプロー
ブDNAを含有するT4クローンから単離する〔たとえば、
ジー・エル・カントニおよびデイー・アール・ダビエス
（編）、フロセジユアー・イン・ヌクレイツク、アシツ
ド・リサーチ、ニューヨーク：ハーバー・アンド・ロー
（1966）〕。

（８）生体内標識されたプローブDNA配列を組換T4ゲノ
ムから切除した後に、これを上記のように作成された整
列した配列にてAhaIII制限エンドヌクレアーゼで開裂す
ることにより検出系で使用することができる。或いは、
プローブDNA配列を含有する全組換T4ゲノムをプローブ
として使用することもできる。

（Ｂ）グルコシル化DNA配列の検出：コンカナバリンＡ
−グルコシル化酵素錯体の使用 ConA、すなわち架橋部分は、グルコシル化DNAとグル
コシル化蛋白質（信号部分）との両者に結合する。pH5
が室温より低い温度にて、ConAはダイマであつて２つの
グルコシル結合部位を有する。生理学的pHかつ室温もし
くはそれより若干高い温度（37℃）にて、原ConAはテト
ラマであつて４つの結合部位を有する。アルカリ性pH
（8.5もしくはそれ以上）かつより高い温度にて、ConA
は不活性なサブ単位に解離する。ConAがグルコシル残基
に結合するには、マンガンもしくはマグネシウムとカル
シウムとが必要とされる。ConAの保存溶液をTCMN緩衝益
（5mMトリスHCl、pH7.0、1mM CaCl₂、1mM MnCl₂、1M Na
Cl）における１〜5mg/mlの濃度にてガラス管中に保つ。
何故なら、ConAは5mg/mlより大きい濃度にてプラスチツ
ク表面に付着しかつ凝固するからである。ConAは４℃に
て約３ケ月間貯蔵することができる。

（１）ConAおよびグルコシル化酵素によるグルコシル化
DNA配列の順次の処理グルコシル化されたT4DNAを打点したニトロセルロー
ス紙を、２％酸性化牛血清アルブミン（BSA）、１×TCM
Nおよび0.1％ v/vトリトンＸ−100を含有する緩衝液に
おいて湿潤室中で42℃にて１晩遮閉した。これらニトロ
セルロース紙を次いでそれぞれ１％BSAと１×TCMNと
を含有する緩衝液により５分間３回洗浄した。次いで、
これらニトロセルロース紙を0.1％BSAおよび１×TCMN
における100−200μgConA/mlよりなるConA溶液中で培養
した。この溶液をニトロセルロース紙１cm²当り0.018
mlまたはワツトマン（登録商標）3MM紙／cm²当り0.2ml
の量で塗布し、そして37℃にて１時間培養した。培養
後、これら紙をそれぞれ0.1％BSAおよび１×TCMN緩衝
液において５分間３〜４回洗浄した。これら紙を２〜
10単位の酵素を含有する0.1％BSAおよび１×TCMNの溶液
中で培養した。これら溶液をニトロセルース１cm²当り
0.018ml、或いはワツトマン（登録商標）3MM紙１cm²
当り0.2mlの量で塗布した。培養を37℃にて１時間行な
つた。次いで、これらの紙をそれぞれNBTT緩衝液（0.
5M NaCl、0.1％ BSA、0.05％ツイーン20、10mMトリスHC
l,pH7.2）にて５分間３回およびそれぞれNCBT緩衝液
（0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム、0.1％BSAおよ
び0.05％ツイーン20）にて５分間２回洗浄した。

グルコシル化された酵素−ConA−誘導化DNA配列は次
のように検出した：（Ａ）西洋ワサビペルオキシダーゼ ConA−グルコシル化DNAとグリコシル化酵素とを含有
する紙を、5mgのジアミノベンジジンと0.01％のH₂O₂
とを5mMトリスHCl（pH7.5）10ml中に含有する新たに調
製した溶液中に浸漬し、そして光から保護した。褐色が
インジケータとして生じた。

（Ｂ）酸ホスフアターゼ ConAグルコシル化DNAとグリコシル化酵素とを含有す
る紙を、0.2M NaOAc1ml当り0.1mgのナフトールAS−MX
燐酸を含有する基質溶液（pH5.8）に浸漬し、暗所で37
℃にて培養した。インジケータとしてバラ色が生じた。

（Ｃ）グルコースオキシダーゼ 50mMトリス/HCl（pH7.5）1ml中の6.7mgのβ−Ｄグル
コースおよび0.67mgののニトロ青テトラゾリウムを、37
℃にて１時間培養した。100μｌの100×PMS（フエナジ
ンメトサルフエート、0.0167mg/ml蒸留水中）を加え、
そして溶液を混合した。ConA−グルコシル化DNAおよび
グリコシル化酵素を含有する紙を、次いでこの混合物
中で暗所にて37℃で１時間、或いは室温で１晩培養し
た。インジケータとして強い青色が生じた。

反応の感度：（Ａ）西洋ワサビペルオキシダーゼ 150−250ピコグラムのDNAが検出された。貯蔵後に色
は褪色した。

（Ｂ）酸ホスフアターゼヒブリド化したDNAブロツトのみを分析し、７−15ピ
コグラムのDNAが検出された。

（Ｃ）グルコースオキシダーゼグルコシル化DNAフロツトのみを検査し、150−250ピ
コグラムのDNAが検出された。

ConA検出のこの方法は、最適でないことが判明した。
ConAに続く酵素の順次の添加は、分析検出系において過
度のバツクグランドを生ずることが判明した。さらに、
この方法は比較的時間がかかり、検出感度が所望より低
いものであつた。したがつて、ConAとグルコシル化DNA
と酵素とを接触させる第２の方法を使用した。

（２）複合ConA/グリコシル化酵素によるグルコシル化D
NA配列の処理 ConAとグリコシル化酵素とをTCMN緩衝液中で1:1のモ
ル比にて混合し、そして37℃で２時間、或いは25℃で４
〜６時間、或いは４℃で１晩乃至48時間培養した。（培
養期間の後、混合物は透明となる。もし透明でなけれ
ば、ConAが過剰に存在し、より多量の酵素を加えねばな
らない）。

T4グルコシル化DNAを含有するニトロセルロースフイ
ルタの遮閉を上記のように行なつた。次いで、これら
紙をそれぞれTCMN緩衝液および１％BSAで５分間洗浄し
た。次いで、上記のように作成したConA−酵素錯体を0.
018ml/cm²の容量にて紙に接触させ、或いは約２−10
単位の酵素を含有する量で接触させた。培養は37℃で１
時間行なつた。培養後、これら紙を先ずそれぞれNBTT
で５分間３回、次いでそれぞれNCBTで５分間２回洗浄し
た。

西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を上記と同様に行な
つた。この過程で31.25ピコグラムのDNAを検出すること
ができ、かつ上記の検出技術によるよりもずつとバツク
グランドが少なかつた。さらに同様な検出手順をConA−
酸ホスフアターゼ錯体、ConA−グルコースオキシダーゼ
錯体並びにその他の同様なConA−酵素錯体を用いて行な
うことができる。

さらに、レクチン／抗体およびその他の検出系も使用
することができる〔ワード等、上記〕。

実施例II グルコシル化T4DNAのビオチン化グルコシル化プローブDNAと分析物との間におけるヒ
ブリド化反応の検出を助けるため、グルコシル化プロー
ブDNAをさらにビオチン成分で誘導化させ、これに対し
ては標準検出系が知られている。

0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.3）における1mg/ml
のT4DNA1mlを0.1mlの新たに作成した1M NaIO₄溶液と混
合した。この混合物を暗所にて室温で３時間培養した。

酸化反応が完結した後、溶液を暗所中で４℃にて0.05
M酢酸ナトリウム（pH4.0）、0.1M NaClを２回取替えて
かつ0.3M硼酸ナトリウム（pH9.0−9.3）、0.1M NaClを
２回取替えて透析した。次いで、この溶液をpH9.3のジ
アミン貯蔵溶液からの1,6−ジアミノヘキサン中で0.4M
にした。この混合物を暗所で90分間培養した。得られた
シツフ塩基をNaBH₄で還元した。水中で2Mの濃度まで新
たに溶解させたNaBH₄をこの混合物へ30分間間隔で４回
加え、NaBH₄の濃度を徐々に0.025M〜0.1Mまで増加させ
た。全培養時間は３時間であつた。4M酢酸ナトリウム
（pH4.0）を加えることによりpHを5.0−5.5に調整し
て、NaBH₄を冷却した。このDNA含有溶液を0.1M燐酸ナト
リウム（pH6.7）において12時間透析し、次いで40％v/v
DMFおよび20mMビオチンNHSエステルにした。この溶液を
12時間培養した。過剰のビオチンおよびビオチンNHSエ
ステルを、溶出緩衝剤として１×SSCを用いるG50セフア
デツクスカラムを通しての過により除去した。DNAを
含有するフラクシヨンをカラムから集め、混合し、かつ
0.1M NaCl、0.001M EDTA（pH7.0）を含有する溶液に対
し透析し、そして後に使用するまで−20℃にて貯蔵し
た。

実施例III 形質転換されたチミン要求性イー・コリ突然変異種にお
けるＢγdUR標識されたDNA配列の作成この実施例においては、標識することが望ましいポリ
ヌクレオチド配列を含有する宿主をその標識を有するヌ
クレオチド、塩基もしくはヌクレオシドの同族体の存在
下で培養することにより、標識をポリヌクレオチド配列
中に生体内で組込んだ。何故なら、この宿主は標識担持
同族体を必要とする変種であるからである。上記のよう
に、標識することが望ましいポリヌクレオチド配列は宿
主のゲノムの１部とすることができ、或いはゲノムへ加
えることができる。さらに、これは宿主を形質転換させ
るのに使用するDNA配列または他のクローン化ベヒクル
もしくはフアージの１部とすることもできる。

標識することが望ましいDNA配列を特徴とするイー・
コリのチミン要求性突然変異種（thy A）を、チミジン
の代りに５−ブロムデオキシウリジン（ＢγdUR）を補
充した培地において、ミラー、エキスペリメント・イン
・モレキユラ・ジエネテイツクス、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラバトリー（1972）の技術にしたがつて
増殖させた。細胞を収穫し、そして標識されたプローブ
DNA配列を含有するDNA配列を単離した。このDNA配列
を、ヒブリド化の研究に直接使用することができる。或
いは、標識されたプローブ配列の全部または１部を先ず
DNA配列の残部からエンドヌクレオ分解によつて除去
し、そして分析物の検出用に単独で使用することができ
る。

分析物に対する標識プローブのヒブリド化はＢγdUR
に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体と
の反応により検出することができる〔グラツナー、「５
−ブロム−および５−イオド−デオキシウリジンに対す
るモノクナール抗体:DNA複製を検出するための新規な試
薬」、サイエンス、第218巻、第474−75頁（1982）〕。
或いは、このプローブをさらに、たとえばチオビオチン
のような成分を加えることにより化学的に誘導化するこ
ともできる。次いで、このチオビオチン化したDNAプロ
ーブを検出することができ、この場合プローブは、たと
えばデテツク（登録商標）１−hrpのようなビオチン検
出系、或いは他のこの種のビオチン検出系を用いて分析
物にヒブリド化させる。

実施例IV ５−ブロムデオキシウリジンを含有するDNAのビオチン
化実施例IIIにおいて作成されかつ分析物にヒブリド化
されたＢγdUR標識プローブDNAを検出するため、このＢ
γdUR標識したプローブDNAをさらにビオチンで誘導体化
することができる。

ブロムデオキシウリジン残基を含有するDNAのトリエ
チルアンモニウム塩200μｇを、2mlの無水ジメチルホル
ムアミド（DMF）中に溶解させた。この溶液へ無水DMF中
の50mMチオビオチン0.5mlを加え、そして混合物をアル
ゴンガスの下で60℃にて２時間培養した。40℃にて減圧
下で蒸発させて溶剤を除去した。残渣を0.5mlの１×SSC
に溶解させた。未溶解物質を遠心分離により除去した。
溶出緩衝剤として１×SSCを用いるG50セフアデツクスカ
ラムでの過によつて過剰のビオチンを上澄液から除去
した。DMA含有フラクシヨンをカラムから回収し、混合
しかつ後に使用するまで−70℃にて貯蔵した。

以上、本発明を多数の具体例につき説明したが、この
基本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用す
る他の具体例を提供しうることが了解されよう。したが
つて、本発明は上記の具体例のみに限定されず、本発明
の範囲内において多くの改変をなしうることが了解され
よう。

〔発明の効果〕

本発明によれば、従来の製造上の制約なしに、興味あ
る分析物を検出するための方法およびキツトに使用しう
るプローブとして有用な生体内もしくは生物学的に標識
したポリヌクレオチド配列が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生体内標識方法に使用するためのプロ
ーブDNA配列の両末端へAhaIII制限エンドヌクレアーゼ
部位を結合させる方法の１具体例の工程略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ノーマンイーケルカーアメリカ合衆国、ニユーヨーク州 10016、ニユーヨーク、イースト 30番ストリート 343番

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヌクレオチドを生体内で標識する方法
であって、（ａ）標識しようとするポリヌクレオチドを、複製に際
し修飾ヌクレオチドを生成する適当なベクター中に挿入
する工程と、（ｂ）（ａ）で得られたベクターを、修飾ヌクレオチド
を生成して複製しうるように適当な宿主に感染させる工
程とから成り、前記標識しようとするポリヌクレオチドは、
前記宿主中で前記ベクターが複製される際に前記修飾ヌ
クレオチドから構成される修飾ポリヌクレオチドとして
複製されることによって標識される、ポリヌクレオチド
を生体内で標識する方法。
【請求項２】前記ベクターがバクテリオファージから成
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】標識しようとするポリヌクレオチドがDNA
である、特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方
法。
【請求項４】前記バクテリオファージが、Ｔ−偶数ファ
ージ、枯草菌ファージSP01、キサントモナス・オリゼ
（Xanthomonas oryzae）ファージXP12、および枯草菌フ
ァージSP15より成る群から選択される、特許請求の範囲
第２項または第３項に記載の方法。
【請求項５】前記バクテリオファージが、バクテリオフ
ァージT2、バクテリオファージT4、およびバクテリオフ
ァージT6より成る群から選択される、特許請求の範囲第
２項または第３項に記載の方法。
【請求項６】前記バクテリオファージがバクテリオファ
ージT4である、特許請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】前記宿主が細菌である、特許請求の範囲第
１項に記載の方法。
【請求項８】前記細菌がイー・コリである、特許請求の
範囲第７項記載の方法。
【請求項９】前記DNAが、前記宿主に元来存在するDNAの
１部である、特許請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項１０】前記DNAが、前記宿主の元来存在するDNA
中に挿入された異種DNAである、特許請求の範囲第３項
に記載の方法。
【請求項１１】信号部分、架橋部分、または架橋部分と
信号部分との少なくとも１つの組合せ物を、標識された
ポリヌクレオチドの修飾ヌクレオチドに結合させる工程
をさらに含む、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１２】前記信号部分、架橋部分、または架橋部
分と信号部分との組合せ物が、それぞれ独立して前記修
飾ヌクレオチドの修飾塩基に共有結合される、特許請求
の範囲第11項に記載の方法。
【請求項１３】前記信号部分、架橋部分、または架橋部
分と信号部分との組合せ物が、前記修飾塩基に非共有結
合される、特許請求の範囲第11項に記載の方法。
【請求項１４】前記信号部分および架橋部分が、それぞ
れ独立して放射性化合物、ビオチン、蛍光性化合物、フ
ルオレセン、ローダミン、ダンシル、磁性化合物、およ
びキレート剤より成る群から選択される、特許請求の範
囲第12項に記載の方法。
【請求項１５】前記信号部分および架橋部分が、それぞ
れ独立してポリペプチド、蛋白質、レクチン、コンカナ
バリンＡ、酵素、アルカリホスファターゼ、酸ホスファ
ターゼ、抗原、抗体、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、および
キレート剤より成る群から選択される、特許請求の範囲
第13項に記載の方法。
【請求項１６】前記バクテリオファージが天然に存在す
るバクテリオファージである、特許請求の範囲第２項に
記載の方法。
【請求項１７】前記バクテリオファージが、遺伝子修飾
を施されて複製に際し修飾ヌクレオチドを生成する能力
を獲得したバクテリオファージである、特許請求の範囲
第２項に記載の方法。
【請求項１８】前記修飾ヌクレオチドが、グリコシル化
ヌクレオチドまたはグルコシル化ヌクレオチドである、
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１９】前記修飾ヌクレオチドの修飾塩基が、デ
オキシヒドロキシメチルウリジン、ホスホグルクロン化
されかつグルコシル化された５−（４′,5′−ジヒドロ
キシペンチル）ウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシ
ル、および５−メチルシトシンより成る群から選択さ
れ、その修飾塩基によって標識しようとするポリヌクレ
オチドが標識される、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。
【請求項２０】さらに、前記宿主から標識されたポリヌ
クレオチドを単離する工程から成る、特許請求の範囲第
１項に記載の方法。