NO842720L - In vivo markering av polynukleotidsekvenser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører in_ vi vo markering av polynukleotidsekvenser. Nærmere bestemt vedrører den biologisk markering av DNA-sekvenser som gjør det mulig å påvise dem etter hybridisering til analytter. Som man vil forstå er de biologisk markerte polynukleotidsekvenser fremstilt ifølge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse anvendelige for mange laboratorie, industrielle og medisinske formål hvor man ønsker å påvise analytter.

I beskrivelsen anvendes de følgende uttrykk:

Analytt - en substans eller substanser, enten alene eller i blandinger, hvis nærvær skal påvises og om ønsket kvantifi-seres. Analytten kan være et DNA- eller RNA-molekyl med liten eller stor molekylvekt, et molekylkompleks som inneholder slike molekyler, eller et biologisk system inneholdende nukleinsyrer, såsom en virus, en celle eller gruppe av celler. Blant de vanlige analytter er nukleinsyre (DNA og

■ RNA) eller segmenter derav, enten enkelt- eller dobbelt-kjedet, virus, bakterier, celler i kultur og lignende. Bakterier, enten hele eller fragmenter derav, omfatter både gram-positive og gram-negative bakterier, sopp, alger og andre mikroorganismer er også analytter, samt dyr (f.eks. pattedyr) og planteceller og -vev.

Sonde - en markert polynukleotidsekvens som er komplementær til en polynukleotidsekvens i en bestemt analytt, og som hybridiserer til denne analyttens polynukleotidsekvens.

Markør - den rest som er knyttet til en polynukleotidsekvens som etter kovalent feste til den av en signaliserende rest eller en kombinasjon av brodannende rest og signaliserende rest, eller som etter ikke-kovalént binding til den av en signaliserende rest eller en kombinasjon av brodannende rest og signaliserende rest gir opphav til et signal som er påviselig og i noen tilfeller kvantifiserbart. Forbindelser med slike markører omfatter f.eks. glukosylerte nukleotider., glykosylerte nukleotider, 5-hydroksymetyl-

uracil, BrdUR og 5-metylcytosin.

Brodannende rest - den rest som etter kovalent feste eller ikke-kovalent binding til markøren i en polynukleotidsekvens virker som et bindeledd eller en bro mellom markøren og en signalgivende rest.

Signalgivende rest - den rest som etter kovalent feste eller ikke-kovalent binding til markøren i en polynukleotidsekvens eller til en brodannende rest festet eller bundet til denne markør gir et signal for påvisning av markøren.

Signal - det karakteristiske ved en markør eller signaliserende rest som gjør det mulig å påvise dem i sekvenser som ikke bærer signalet.

Analyse og påvisning av ørsmå mengder av substanser i biologiske og ikke-biologiske prøver har blitt en rutineprak-• sis i kliniske og analyttiske laboratorier. Disse påvisningsteknikker kan oppdeles i to hovedgrupper: (1) slike basert på ligandereseptorsamvirkning (f.eks.

immunologisk baserte måleteknikker), og

(2) slike basert på nukleinsyrehybridisering (polynukleotidsekvensbaserte teknikker).

Immunologisk baserte måleteknikker erkarakterisert veden trinnsekvens omfattende ikke-kovalent binding av et antistoff og antigen som er komplementær til det. Se f.eks. T. Chard, An Introduction To Radioimmunoassay And Related Techniques (1978).

Polynukleotidsekvensbaserte påvisningsteknikker erkarakterisert veden trinnsekvens omfattende ikke-kovalent binding av en markert polynukleotidsekvens eller sonde til en komplementær sekvens av analytten under hybridiserings-betingelser ifølge Watson-Crick baseparring av adenin (A), thymidin (T), guanin (G) og cytidin (C), og påvisningen av denne hybridisering. (M. Grunstein og D.S. Hogness, "Col.ony . Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, s. 3961-65 (1975)).

I generalisert henseende er den ikke-kovalente binding av en markert sekvens eller sonde til en komplementær sekvens av en analytt den primære gjenkjennelseshendelse for polynukleotidsekvensbaserte påvisningsteknikker. Denne binding tilveiebringes ved en nøyaktig molekylær innretning og sam-virke av komplementære nukleotider i sonden og analytten. Den er energetisk begunstiget ved frigjøring av ikke-kovalent fri bindingsenergi, f.eks. hydrogenbinding, fri opp-stablingsenergi og lignende.

I tillegg til den primære gjenkjennelseshendelse er det også nødvendig å påvise når bindingen finner sted mellom • den markerte polynukleotidsekvens og den komplementære sekvens hos analytten. Denne påvisning utføres gjennom et signaltrinn eller -hendelse. Et signaltrinn eller -hendelse • tillater påvisning på en kvantitativ og kvalitativ måte, f:eks. et menneske- eller instrumentpåvisningssystem, av forekomst av den primære gjenkjennelseshendelse.

Den primære gjenkjennelseshendelse og signalet fra polynukleotidsekvensbaserte påvisningsteknikker kan enten kobles direkte eller indirekte, proporsjonalt eller omvendt proporsjonalt. Således er i slike systemer som nukleinsyre-hybridiseringer med tilstrekkelige mengder av radioaktivt markerte sonder, mengden av radioaktivitet normalt direkte proporsjonal med mengden av tilstedeværende analytt. Omvendt proporsjonal!tetsteknikker omfatter f.eks. kompeti-tive immunologiske målinger, hvor mengden av det påviste signal avtar med større mengde analytt som er tilstede i prøven.

Fo.rsterkningsteknikker anvendes også for å forsterke påvisning, hvori signalhendelsen har sammenheng med den primære gjenkjennelseshendelse i et forhold større enn 1:1. F.eks. kan signalkomponenten i målingen være tilstede i et forhold på 1:10 til hver gjenkjennelseskomponent, hvilket gir en 10 gangers økning i sensitivitet.

En rekke signalhendelser kan anvendes for å påvise forekomst av den primære gjenkjennelseshendelse. Signalhendelsen som velges avhenger av det spesielle signal som karakteriserer markøren eller signalrest av polynukleotidsekvensen som anvendes i den primære gjenkjennelseshendelse. Selv om markøren selv uten ytterligere behandling for å feste eller binde den sammen med en signalrest eller en kombinasjon av brodannende rest og signalrest kan være påviselig, er det vanligere enten å feste kovalent eller å binde ikke-kovalent til markøren en signalrest eller en kombinasjon av brodannende rest og signalrest som i seg selv er påviselig eller blir påviselig etter ytterligere modifisering.

Det bør selvfølgelig være klart at kombinasjonen av brodannende rest og signalrest som er beskrevet ovenfor kan kon-• strueres før feste eller binding til markøren, eller den kan være sekvensielt festet eller bundet til markøren. F.eks. kan den brodannende rest først være bundet eller festet til markøren, og deretter signalresten kombinert med den brodannende rest. Dertil bør det være klart at flere brodannende rester og/eller signalrester kan anvenes sammen i enhver kombinasjon av brodannende rest og signalrest.

Eksempler på kovalent feste av en signalrest eller en kombinasjon av brodannende rest og signalrest til en markør er kjemisk modifisering av markøren med signalgivende rester, såsom radioaktive rester, fluorescensgivende rester eller andre rester som i seg selv gir signaler til tilstedeværende påvisningsanordninger, eller kjemisk modifisering av markøren med minst en kombinasjon av brodannende rest og signalrest for å gi dette signal.

Eksempler på ikke-kovalent binding av en signalgivende rest eller en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest til en markør er ikke-kovalent binding til markøren, i en signalgivende rest som i seg selv kan påvises ved de riktige anordninger, eller den ikke-kovalente binding til markøren av en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest som gir et signal som kan påvises ved en av disse anordninger. F.eks. kan markøren i polynukleotidsekvensen være ikke-kovalent bundet til et antistoff, en fluorescensgivende rest eller en annen rest som er påviselig ved tilsvarende anordninger. Alternativt kunne markøren være bundet til en brodannende rest, f.eks. et lectin, og deretter bundet gjennom lectinet, eller brodannende rest, til en annen rest som er påviselig ved tilsvarende anordninger .

Det finnes en lang rekke signalgivende rester og brodannende rester som kan anvendes for kovalent feste eller ikke-kovalent binding til markørene i polynukleotidsekvenser som er anvendelige som sonder i analyttpåvisnings-systemer. De inneholder både en lang rekke radioaktive og ikke-radioaktive signalgivende rester, og en lang rekke ikke-radioaktive brodannende rester. Alt som kreves er at den signalgivende rest gir et signal som kan påvises ved tilsvarende anordninger og at den brodannende rest, om sådan foreligger, erkarakterisert veden evne til å bindes kovalent eller å binde ikke-kovalent til markøren og også evne til å kombinere med en signalgivende rest.

Radioaktive signalgivende rester og kombinasjoner av forskjellige brodannende rester og radioaktive signalgivende rester erkarakterisert vedén eller flere radioisotoper, . o 32n 131T 14_ 3U 60„ 59K1. 63KT.

såsom P, I, C, H, Co, Ni, Ni og lignende. Fortrinnsvis emitterer den anvendte isotop beta-eller gamma-stråling og har en lang halveringstid. Påvisning av det radioaktive signal utføres deretter som regel ved hjelp av en radioaktivitetsdetektor, såsom eksponering av en film.

Ikke-radioaktive signalgivende rester og kombinasjoner av brodannende rester og ikke-radioaktive signalgivende rester brukes i tiltagende grad både i forskning og kliniske undersøkelser. Fordi disse signalgivende og brodannende rester ikke innbefatter radioaktivitet, er teknikkene og markerte sonder som anvender dem sikrere, renere, generelt mere stabile ved lagring, og følgelig billigere i bruk. Påvisningssensitiviteter av de ikke-radioaktive signalgivende rester er også høye eller høyere enn radioaktive markeringsteknikker.

Blant de foretrukne ikke-radioaktive signalgivende rester eller kombinasjoner av brodannende-signalgivende rester som er anvendelige med ikke-radioaktive markører er sådanne basert på biotin-/avidinbindingssystemet. (P.R.Langer et al., "Enzymatic Synthesis Of Biotin-Labeled Polynucleo-tides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, s. 6633-37 (1981); J. Stavrianopoulos et al., "Glycosylated DNA Probes For Hybridization/-

■ Detection Of Homologous Sequences", presentert ved "Third Annual Congress For Recombinant DNA Research" (1983); R.H. Singer og D.C. Ward, "Actin Gene Expression Visualized In • Chicken Muscle Tissue Culture By Using I_n_ Si tu Hybridization With A Biotinated Nucleotide Analog", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 2. 7331-35 (1982)). For en oversikt over ikke-radioaktive signalgivende og brodannende-signalgivende systemer, både biotin/avidin og ellers, se D.C. Ward et al., "Modified Nucleotides And Methods Of Preparing And Using Same", europeisk patentansøkning nr. 63879.

Ikke-radioaktivt markerte polynukleotider brukes ikke lenger meget i påvisningssystemer, fordi feste av en mar-kør, som ikke interfererer med hybridiseringen, til poly-nukleotidsekvensene som er anvendelige som sonder i slike påvisningssystemer er kostbare.

For det første er de kjemiske reaksjonsbetingelser som kan anvendes for modifikasjon av en polynukleotid polymer for å addere den til en markør, ofte for drastiske til å være tilstrekkelig selektive for et bestemt nukleotid. Enda viktigere er det at kjemisk markering av polynukleotidsekvenser ofte interfererer med hybridisering, fordi markøren interfererer med den nødvendige hydrogenbinding for hybridisering. F.eks. reagerer dikarbonylreagenser, såsom ketoksal og glyoksal med guaninrester (Shapiro et al., Biochemistry, 5, s. 2799-2807 (1966); M. Litt, Biochemistry,

8, s. 3249-53 (1969); Politz et al., Biochemistry, 20, s. 327-78 (1981)). Imidlertid hybridiserer de ketoksal- og glyoksalmarkerte nukleotider ikke med komplementære sekvenser i analytten, fordi markøren interfererer med den nød-vendige hydrogenbinding for hybridisering.

Følgelig må et markert monomert nukleotid syntetiseres og deretter innføres i en polynukleotidsekvens for å markere en polynukleotidsekvens for bruk som sonde. Forskjellige metoder foreligger for å markere et individuelt nukleotid på en slik måte at markøren ikke interfererer med hybridisering. Forskjellige metoder, både kjemiske og enzymatiske, • foreligger også for å feste slike markerte monomere nukleotider til en polynukleotidsonde. F.eks. kan et markert nukleotid såsom 2'-deoksyuridin 5'-trifosfat 5-allylamin-•biotin innføres i DNA-sonder ved nikktranslasjon (P.R. Langer et al., "Enzymatic Synthesis Of Biotin-Labeled Poly-nucleotides: Novel Nucleic Acid Afinity Probes", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, s.6633-37 (1981)) eller ved terminal addisjon til DNA-sonder ved bruk av terminal deoksy-nukleotidyl transferase.

Det foreligger imidlertid produksjonsbegrensninger med disse prosesser. F.eks. er det nødvendig å syntetisere de markerte monomere nukleotider før de innføres i polynukleo-tidsondene. Denne syntesen kan noen ganger medføre kostbare kjemiske prosesser. Koblingen av de markerte monomere nukleotider til et polynukleotid er også kostbar. F.eks. er enzymene som anvendes i enzymatisk kobling kostbare. Be-slektede begrensninger er vanskeligheter og kostnader ved scale-up av slike prosesser til teknisk skala. Følgelig gir disse prosesser ofte ikke radioaktivt markerte polynukleotider som er mer kostbare enn ønsket.

Foreliggende oppfinnelse overvinner produksjonsbegrens-ningene som er nevnt ovenfor ved å tilveiebringe i_n vivo eller biologisk markerte polynukleotidsekvenser som kan anvendes som sonder ved påvisning av analytter. Disse sekvenser kan benyttes i metoder og sett for påvisning av analytter av interesse.

Fremgangsmåtene for fremstilling av de markerte DNA-sekvenser i foreliggende oppfinnelse innbefatter generelt i en utf ørelsesf orm _iri vi vo markering av ønskede polynukleotidsekvenser. Alternativt kan fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen anvendes for å innføre in vivo i en forut markert base, nukleosid eller nukleotid i en ønsket polynukleotidsekvens. Begge utførelsesformer av denne oppfinnelse er forbedringer fremfor tidligere kjente prosesser for markering av polynukleotider. Begge gjør ikke-radioaktivt mar-• kerte sonder lettere tilgjengelig til lavere pris for bruk i forskjellige påvisningssystemer.

■ Nærmere bestemt omfatter den første utførelsesform av fremgangsmåten for in vivo markering av polynukleotidsekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse at man dyrker en vertkarakterisert veden polynukleotidsekvens som man ønsker å markere og minst en annen polynukleotidsekvens som uttrykker et produkt som markerer den ønskede polynukleotidsekvens etter replikasjon i den dyrkede vert. Fortrinnsvis innbefatter metoden også trinnet isolering fra den dyrkede vert av minst en polynukleotidsekvens omfattende den markerte polynukleotidsekvens. Fortrinnsvis er DNA-sekvensen som isoleres fra den dyrkede vert en del av eller hele selve den markerte polynukleotidsekvens.

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse ønsker man at en heterolog DNA-sekvens innsettes i T4 bak-teriofaggenomet (hvilket normalt inneholder hydroksymetylert og glukosylert DNA). Vert T4-fagen dyrkes under betingelser hvori den produserer hydroksymetylert og glukosylert DNA. T4-fagen som inneholder den innsatte sonde-DNA-sekvens isoleres, og sonde-DNA-sekvensen adskilles fortrinnsvis for. bruk som hybridi seringssonde i hvilken som helst velkjent in situ eller i_n vi tro hybridiseringsmetode (f .eks. South-ern blot, Northern blot, dot blot, kolonihybridisering eller plateløft). Alternativt kan hele T4-faggenomet som inneholder den innsatte, in_ vivo markerte sonde-DNA-sekvens brukes som sonde.

Nærværet av sonden hybridisert til analytten påvises deretter, f.eks. ved å bruke en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest. F.eks. bindes Concanavalin A ("Con A") til den glukosylerte sonde-DNA-sekvens og virker der som en bro til et naturlig glukosylert enzym. Enzymet, f.eks. pepperrotperoksydase, gir etter kontakt med det riktige substrat, f.eks. ^ 2°2°^diaminobenzidin, kolori-metriske produkter som kan påvises. I tillegg kan andre lectin-påvisningssystemer eller antistoff eller andre på-■ visningssysterner som anvender velkjente fremgangsmåter også brukes for å påvise den hybridiserte DNA-sekvens.

■ I en annen utførelsesform av fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse innføres en base, nukleosid eller nukleotid, eller analog eller forstadium derav, som bærer den ønskede markør, i_n vivo i en polynukleotidsekvens. I denne utfør-elsesform omfatter fremgangsmåten for i_n vivo markering av polynukleotidsekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse trinnet dyrking av en vertkarakterisert vedpolynukleotidsekvensen som man ønsker å markere i nærvær av en base, nukleosid eller nukleotid, eller analog eller forstadium derav, som bærer markøren, idet verten trenger basen, nukleosidet eller nukleotidet for sin vekst, og derved inn-fører markøren i polynukleotidsekvensen. Igjen foretrekkes det i det minste å isolere fra den dyrkede vert en polynukleotidsekvens omfattende den markerte polynukleotidsekvens. Helst er den isolerte sekvens fra den dyrkede vert en del av eller hele den markerte polynukleotidsekvens.

I en foretrukket utførelsesform av denne fremgangsmåten for in vivo innføring av en base, nukleosid eller nukleotid, eller analog eller forstadium derav, som inneholder en markør i en polynukleotidsekvens, dyrkes en tymin- eller tymidinkrevende mutant av E. colikarakterisert vedden polynukleotidsekvens som man ønsker å markere på et medium tilsatt BrdUR i stedet for tymidin eller tymin for biologisk å markere denønskede polynukleotidsekvens med BrdUR.

Etterfølgende bruk av denne markerte sonde er vesentlig som angitt ovenfor. Påvisning av sonde/analytthybridiserings-forløpet kan utføres ved biotinylering av den BrdUR markerte sonde-DNA-sekvens og etterfølgende påvisning av biotinrestene ved flere kjente metoder. Alternativt kan antistoff eller andre påvisningssystemer også brukes for å påvise BrdUR-substituert DNA direkte. (H.G. Gratzner, "Monoclonal Antibody To 5-Bromo- and 5-Iodo-deoxyuridine: A New Reagent For Detection Of DNA Replication", Science, 218, s. 474-75 (1982)).

Figur 1 viser skjematisk en utførelsesform av fremgangsmåten for feste av et Ahalll restriksjonsendocukleasepunkt • til begge ender av en sonde-DNA-sekvens for bruk i i_n vivo markeringsmetodene ifølge foreliggende oppfinnelse.

For at oppfinnelsen som her er beskrevet skal bli mer full-stendig forståelig følger en detaljert beskrivelse.

Kilder til in vivo markerte polynukleotider.

Hvilken som helst av et stort antall polynukleotidsekvenser kan anvendes i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfin-'neise når disse skal markeres og brukes ved påvisning av analytter. Inbefattet er f.eks. polynukleotidsekvenser som karakteriserer forskjellige virus, viroider, sopp, para-sitt- eller bakterieinfeksjoner, genetiske forstyrrelser eller andre sekvenser i analytter som man ønsker å påvise. De kan være av syntetisk, halvsyntetisk eller naturlig opp-rinnelse .

Hvilken som helst av et stort antall tilgjengelige kilder kan brukes for å produsere jLn vivo markerte polynukleo tider. Innbefattet er f.eks. T-like fag (dvs. T2 , T4 og T6), som naturlig erstatter glukosylert hydroksymetylde-oksycytidinmonofosfat med cytidinmonofosfat (I.R. Lehman et al., J. Biol. Chem., 235, s. 3254-59 (1960)); Bacillus subtilis fag SP01 som erstatter tymidinrester med 5-hydroksy-metyluracil (R.G. Kallen et al., J. Mol. Biol., 5, s. 248-50 (1962) ) ; Xanthomonus oryzae fagen XP12 erstatter C-rester med 5-metylcytosin (T.T. Kuo et al., J. Mol. Biol., 34, s. 373-75 (1968)); Bacillus subtilis fagen SP15, hvori 62 % av T-resten er erstattet med fosfoglukuronert og glukosylert 5-(4',5'-dihydroksypentyl) uracil (H. Hayashi et al., J. Amer. Chem. Soc., 95, s. 8749-57 (1973)); og i en variasjon av oppfinnelsen markering av sonde-DNA-sekvenser med 5-bromdeoksyuridin (BrdUR) eller andre markerte baser, nukleosider eller nukleotider ved å dyrke mutanter som krever slike baser, nukleosider eller nukleotider for

■ vekst i nærvær av dem.

Polynukleotidsekvensen man ønsker å markere og markørkilden kan kombineres i verten på mange måter. F.eks. kan polynukleotidsekvensen som skal markeres opprinnelig være en del av stamgenomet til en spesiell vert, eller den kan innsettes i dette genom ved f.eks. å bruke metodikken fra rekombinant DNA teknologi. Alternativt kan polynukleotidsekvensen som skal markeres være en del av en kloningsbærer, fag DNA eller annen DNA-sekvens som brukes for å transfektere en vert for replikasjon deri og markering.

Markørkilden kan også foreligge i verten på forskjellige måter. Når f.eks. markørkilden er en DNA-sekvens som uttrykker et produkt som markerer denønskede polynukleotidsekvens etter dens replikasjon i en vertkarakterisert veddenne polynukleotidsekvens, kan denne DNA-sekvens foreligge i verten fordi den opprinnelig var en del av det naturlige genom hos verten, eller fordi det ble innsatt i dette genom. Alternativt kan DNA-sekvensen som er markørkilden være en del av en kloningsbærer, fag DNA eller annen DNA-sekvens som brukes for å transfektere verten for replikasjon deri. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen foreligger polynukleotidsekvensen som skal markeres i den samme kloningsbærer eller fag DNA som DNA-sekvensen som er markørkilden. Alternativt kan de to DNA-sekvenser være tilstede separat i verten. Helst klones polynukleotidsekvensen som skal markeres inn i DNA-sekvensen som er markørkilden. I alle tilfeller markeres etter dyrking av verten den

ønskede DNA-sekvens under eller etter replikasjon som et resultat av produktet som uttrykkes ved DNA-sekvensen som er markørkilden.

Når markørkilden er en base, nukleosid eller nukleotid, eller analog eller forstadium til dette, som innføres i denønskede polynukleotidsekvens etter replikasjon i en vert, fordi verten er en variant som krever at markøren inneholder resten for vekst, tilsettes basen, nukleosidet eller nukleotidet eller en analog eller et forstadium derav, som inneholder denønskede markør, til dyrkningsmediet. Deretter markeres etter dyrkning ifølge fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse denønskede polynukleotidsekvens • in vivo etter sin replikasjon i verten ved innføring av markøren.

Verter som kan anvendes i fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse kan velges ut fra en rekke kjente organismer. Disse omfatter f.eks. forskjellige mikroorganismer såsom E. coli, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, samt en rekke sopp, alger og plante- og menneskeceller i kultur. Det er bare nødvendig at polynukleotidsekvensen som man ønsker å markere, vil replikere i verten, og at den vil markeres av markørkilden under dyrkningsbetingelsene som velges for dyrkning av verten.

Kilder og påvisning av analytter.

De biologisk fremstilte sonde-DNA-sekvenser i foreliggende oppfinnelse har mange praktiske anvendelser. En anvendelse er ved påvisning av analytter. Analytten som skal påvises kan foreligge i enhver biologisk eller ikke-biologisk prøve, såsom kliniske prøver, f.eks. blod, urin, avføring, spytt, puss, sæd, serum, annet vev, fermenteringsvæsker, dyrkningsmedier og lignende.

Om nødvendig kan analytten forekstraheres eller renses ved kjente metoder for å konsentrere dens nukleinsyrer. Slike nukleinsyrekonsentrasjonsmetoder innbefatter f.eks. fenol-ekstraksjon, behandling med kloroform-isoamylalkohol eller kloroform-oktanol, kolonnekromatografi (f.eks. Sephadex, hydroksylapatitt) , og CsCl-1 ikevektssentrifugering. Analytten kan sammen med kontaminerende materialer som måtte være tilstede, undersøkes i blandingen etter rensing, eller analytten kan immobi1 i seres før analyse.

Det er også mange anvendelser av påvisningsmetodene og settene ifølge foreliggende oppfinnelse. Enhver analytt man måtte ønske å påvise og analysere i en prøve kan være gjen-• stand for metodene og settene ifølge oppfinnelsen. F.eks. kan metodene og settene anvendes for å påvise og å identi-fisere virale og bakterielle DNA-sekvenser, f.eks. påvis-■ ning av herpesvirus.

Fremgangsmåtene og settene i foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å diagnostisere genetiske forstyrrelser hos mennesker ved å fremstille en sonde komplementær til en DNA-sekvens som har tilknytning til den genetiske forstyr-relse og påvise nærvær eller fravær av hvilken som helst primær gjenkjennelseshendelse. Blant slike genetiske forstyrrelser er f.eks. talassemi. Diagnose av talassemi kan foretas ved hybridisering av sondenukleotidsekvenser til genomisk DNA.

En annen bruk av fremgangsmåten og settene ifølge foreliggende oppfinnelse er i kromosomal karyotyping, som omfatter bruk av en rekke markerte polynukleotidsekvenser svarende til en rekke definerte DNA-sekvenser som kun befinner seg på hvert av kromosomene, og deretter påvise primære gjen-kjennelsesforløp der.

Fremgangsmåter for hybridiseringsanalyse

For prøving inkuberes blandingen som er mistenkt for å inneholde analytten med den markerte sondepolynukleotid-sekvens i et tilstrekkelig tidsrom og under betingelser som muliggjør hybridisering mellom polynukleotidsekvensen i analytten og den gjenkjennende polynukleotidsekvens på sonden. Disse betingelser vil variere avhengig av analyttens natur og mengde og av sonden (D.E. Kennell, "Princip-les And Practices Of Nucleic Acid Hybridization", Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 11, 2. 259-301 (1971)).

En rekke signalgivende hendelser kan anvendes for å påvise forekomst av den primære gjenkjennelseshendelse — hybridiseringen av den markerte DNA-sekvens til en komplementær sekvens i analytten. Den spesielle signalgivende hendelse som velges avhenger av det spesielle signal som karakteriserer markøren eller den modifiserte markør i polynukleotidsekvensen.

F.eks. kan markøren båret av polynukleotidsekvensen være påviselig uten ytterligere behandling for å feste eller binde den til en signalgivende rest eller minst en kombinasjon av brodannende rest og signaldannende rest. Imidlertid er det vanligere enten å binde en signalgivende rest eller minst en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest som i seg selv er påviselig eller blir påviselig etter ytterligere modifikasjno (ovenfor) til markøren.

Eksempler på signalgivende og brodannende rester som kan festes kovalent til markørene i polynukleotidsekvenser av radioaktive forbindelser, fluorescerende forbindelser, fluorescien, rodamin, dansyl, magnetiske forbindelser, chelatiserende midler og andre signalgivende og brodannende rester som kan festes kovalent til disse markører.

Eksempler på signalgivende og brodannende rester som kan være ikke-kovalent bundet til markørene i polynukleotidsek-vensene er polypeptider, proteiner, lectiner, Concanavalin A, enzymer, alkaliske fosfataser, sure fosfataser, antigener, antistoffer, polypeptider med strepatvidingrupper bundet til seg, beta-galactosidase, glukoseoksidase, pepperrotperoksydase, chelatiseringsmidler og andre signaliserende og brodannende rester som kan være ikke-kovalent bundet til disse markører.

F.eks. kunne et enzym bindes ikke-kovalent som en signalgivende rest til markøren på polynukleotidsondesekvensen. Deretter ville substratet tilsettes for å oppnå en farge-utvikling (fluorescens, radioaktivitet eller chelatiser-ingspåvisningssystemer kan også anvendes). Hvis resten som er bundet til markøren var en biotinrest, ville f.eks. alternativt et biotinbindende molekyl såsom avidin, strept-avidin eller antibiotin-antistoff tilsettes dette. Det biotinbindende molekyl ville så konjugeres til et enzym, en fluorescensforbindelse, en forbindelse med høy elektron-tetthet, eller en uoppløselig fast fase, og påvisningen utføres med tilsvarende midler.

For at denne oppfinnelse skal være lettere å forstå kommer de følgende eksempler. Disse eksempler skal bare illustrere oppfinnelsen, men ikke på noen måte begrense den.

Eksempel I

A) Produksjon av glukosylert sonde- DNA i bakteriofag T4

Ved å bruke teknikkene for rekombinant DNA-teknologi kan en sonde-DNA-sekvens settes inn i en T4-bakteriofag for markering med glukosylrester.

T4 DNA er naturlig glukosylert. Fordi de fleste vanlige brukte restriksjonsenzymer ikke hydrolyserer glukosulert DNA, kan det være nødvendig å fjerne glukoserestene fra T4 DNA før endonukleolytisk spaltning og innsetning av sonde-DNA. Hydroksymetylcytidinglukosylase, et fagindusert enzym, fjerner glukoserester fra glukosylert DNA og overfører dem til UDP i den reverse reaksjon (J. Josse et al., J. Biol.

■ Chem., 237, s. 1968-76 (1962); S.R. Zimmermann et al., J. Biol. Chem., 237, s. 512-18 (1962)). Alternativt kan T4-fager dyrkes under betingelser hvori cytosin erstatter hydroksymetylderivatene. (K. Carlson et al., J. Virol., 36, s. 1-17 (1979); P. 0'Farrell et al., Mol. Gen. Genet., 179, s. 421-35 (1980); L. Snyder et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73. s. 3098-3102 (1976)).

Så snart T4 DNA er blitt deglukosylert som ovenfor angitt, innsettes sonde-DNA-sekvensen i det deglukosylerte T4-genom. Selv om innsetningen av sonde-DNA-sekvensen i det deglukosylerte T4-genom kan utføres på en rekke kjente måter, foretrekker man å innsette det på en slik måte at det kan fjernes fra T4-DNA'et etter markering.

Fordi bare C-restene i T4-fager er glukosylerte, er res-triks jonsendonuklease Ahalll, som gjenkjenner og spalter DNA-sekvensen TTTAAA, en av de få endonukleaser som kan spalte opprinnelig T4 DNA. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen modifiseres følgelig sonde-DNA-sekvensen slik at den har et Ahalll restriksjonspunkt på begge ender før innsetning i det delvis deglukosylerte T4 DNA (figur 1). I en slik konstruksjon kan sonde-DNA-sekvensen isoleres.

etter markering fra T4 DNA'et ved restriksjon med Ahalll.

En generell forskrift for fremstilling og innsetning av en DNA-sonde i T4 DNA og fjerning av den etter markering er beskrevet nedenunder og illustrert i figur 1: 1) DNA-sekvensen pTTTAAAp (syntetisert ved kjente teknikker) festes først til 3 '-endene av sonde-DNA'et som skal innsettes i T4-genomet ved bruk av RNA-ligase. Fosfatene er nødvendige ved både 3'- og 5 ' -endene av DNA-sekvensen pTTTAAAp for å forhindre dannelse av sammenknytninger.

Primer DNA-sekvens TTTAAAp (syntetisert ved vanlige metoder) bindes så ikke-kovalent til den ovenfor fremstilte DNA-sekvens (figur 1). Denne DNA-sekvens (TTTAAAp) tjener som en primer, slik at etter replikasjon i nærvær av DNA-■ polymerase og deoksynukleotid-trifosfåtene dATP, dTTP, dGTP og deoksyhydroksymetyl CTP (dHMCTP) dannes to DNA-sekvenser (figur 1). Disse sekvenser har Ahalll restriksjonsendonuk-■leasepunktet på motsatte ender av sonde-DNA-sekvensen (figur 1) . De har også en markør (?) på én av DNA-kjedene.

For å tilsette et andre Ahalll punkt på de andre ender av sonde-DNA-sekvensen utføres en lignende serie trinn. Igjen festes DNA-sekvensen pTTTAAAp til 3'-endene av de forut fremstilte DNA-sekvenser (figur 1). Deretter anvendes igjen DNA-sekvensen TTTAAAp som en primer for å binde ikke-kovalent til de dannede sekvenser (figur 1) og de primede sekvenser replikert i nærvær av DNA-polymerase og de fire deoksynukleotid-trif osf ater som forut (figur 1).

Som et resultat av denne trinnrekken dannes en DNA-sekvens omfattende sonde-DNA-sekvensen flankert på begge ender av et Ahalll restriksjonsendonukleasepunkt og med en markør på begge DNA-kjeder (figur 1). Som et biprodukt av disse trinn dannes også to enkeltkjedede DNA-sekvenser. Disse enkeltkjedede DNA-sekvenser kan lett skilles fra den ønskede sondesekvens med de to AhaIII restriksjonspunkter. Fosfatgrupper fjernes deretter fra endene av sonde-DNA-sekvensen med alkalisk fosfatase før innsetning av sonde-DNA-sekvensen i T4-genomet. 2) Partielt deglukosylert fag-T4 DNA fremstilt som ovenfor angitt, spaltes med restriksjonsendonukleaser forut for innsetning av sonde-DNA1 et i en ikke-essensiell del av T4-genomet, dvs. slike gener som ikke er nødvendige for fag-replikasjon, hydroksymetylcytosinproduksjon og DNA-gluko-sylering. BamHI spalter T4 DNA på et slikt punkt. Etter restriksjon fylles.om nødvendig de enkeltkjedede haler opp med DNA-polymerase I i nærvær av ATP, TTP, GTP og deoksyhydroksymetyl CTP. 3) Sonde-DNA-sekvensen påhengt Ahalll gjenkjennelsespunk-ter, er stump og ligert til det forut begrensede ikke- ■ essensielle området av T4-genomet (V. Sgaramella, "Enzymatic Oligomerization Of Bakteriophage P22 DNA And Of Linear Simian Virus 40 DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, ■69, s. 3389-93 (1972)).. 4) Etter sonden er satt inn i T4-genomet, glukosyleres fortrinnsvis hele rekombinant DNA-molekylet med alfa- og beta-glukosyltransferaser i nærvær av UDP-glukose (J. Josse et al., ovenfor) in_ vi tro for å beskytte rekombinant DNA-molekylet mot fagendonukleolyttisk angrep. 5) In_ vitro innkapsling av rekombinant T4-sonde-DNA-molekylet kan foretas ifølge fremgangsmåten til L.W. Black, " In Vitro Packaging Of Bacteroiphage T4 DNA", Virology, 113, s. 336-44 (1981). 6) Utprøvning av de tranformerte vert T4-fager med hensyn

til slike kloner som inneholder sonde-DNA-sekvenser foretas ved hybridisering med komplementære biotinylerte DNA-sonder, eller med hvilken som helst annen vanlig undersøk-elsesmetode.

7 ) DNA isoleres fra T4-kloner som inneholder sonde-DNA' e.t ved hvilken som helst av de mange kjente metoder (se f.eks. G.L. Cantoni og D.R. Davies (Eds.), Procedues in Nucleic Acid Research, New York: Harper og Row (1966)).

8) De in vivo markerte sonde-DNA-sekvenser kan adskilles

fra rekombinant T4-genomet for etterfølgende bruk i påvisningssystemer ved spaltning med Ahalll restriksjonsendonuk-leasen ved de flankerende sekvenser danned som ovenfor angitt. Alternativt kan hele rekombinant T4-genomet som inneholder sonde-DNA-sekvensen anvendes som sonde.

B. Påvisning av glukosylerte DNA-sekvenser: bruk av

Concanavilin A - glykosylert enzymkomplekser

Con A, en brodannende rest, binder til både glukosylert DNA og til glykosylerte proteiner (en signalgivende rest). Ved

■pH 5 og temperaturer under romtemperatur er Con A en dimer med to glykosylbindende punkter. Ved fysiologisk pH og romtemperatur, eller litt over (37°) er Con A en tetramer og

inneholder fire bindingspunkter. Ved alkalisk pH (8,5 og høyere) og høyere temperaturer, dissosierer Con A. i innak-tive underenheter. Mangan eller magnesium og kalsium kreves for at Con A skal binde til glykosylrester. Stamløsninger av Con A holdes i glassrør ved en konsentrasjon på 1-5 mg/ml i TCMN-buffer (5 mM Tris HCl, pH 7,0, 1 mM CaCl2,

IM NaCl) fordi Con A kleber til plastflater og aggregerer ved konsentrasjoner større enn 5 mg/ml. Con A kan lagres ved 4°C i ca. 3 måneder.

1) Sekvensbehandling av glukosylerte DNA-sekvenser med Con A og glykosylert enzym

Nitrocellulosepapir inneholdende glukosylert T4 DNA-punkter ble blokket natten over ved 42°C i et fuktig kammer i en buffer inneholdende 2 % surgjort bovin serum albumin (BSA), 1 X TCMN og 0,1 % v/v Triton X-100. Nitrocellulosefilterene ble så renset tre ganger i 5 minutter hver gang med en buffer inneholdende 1 % BSA og 1 X TCMN. Nitrocellulosefilterene ble så inkubert i en Con A løsning bestående a<y>100-200 pg Con A/ml i 0,1 % BSA og 1 X TCMN. Løsningen ble påført i 0,018 ml/cm<2>på nitrocellulosefil ter eller 0,2 ml/cm<2>på "Whatman" 3 MM papir, og ble inkubert i 1 time ved 37°c. Etter inkubering ble filterene renset 3-4 ganger i 5 minutter hver gang i en 0,1 % BSA og 1 X TCMN buffer. Filterene ble inkubert i en løsning av 0,1 % BSA og 1 X TCMN inneholdende 2-10 enheter enzym. Løsningene ble påført i 0,018 ml/cm<2>på ni trocellulose og 0,2 ml/cm<2>på "Whatman" 3 MM filtere. Inkubering var ved 37°C i 1 time. Filterene ble så renset 3 ganger, 5 minutter hver gang i NBTT buffer (0,5 M NaCl, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween 20, 10 mM Tris HC1, pH 7,2) og 2 ganger i 5 minutter hver gang i NCBT buffer (0,3 M NaCl, 0,03 M Na sitrat, 0,1 % BSAog 0,05 % Tween 20).

De glykosylerte enzym-Con A-derivatiserte DNA-.sekvenser ble

• påvist som følger:

A) Pepperrotperoksydase

- Filteret inneholdende Con A-gluksylert DNA og glykosylert enzym ble dyppet i en nyfremstilt løsning inneholdende 5 mg di aminobenzidin, 0,01 % H2°2*~ 10 ml 5 mM Tris HC1 ved pH 7,5 og beskyttet mot lys. En brun farge ble dannet som indikator.

B) Sur fosfatase

- Filteret inneholdende Con A-glukosylert DNA og glykosylert enzym ble dyppet i en substratløsning inneholdende 0,1 mg naftol AS-MX fosforsyre/ml av 0,2 M NaOAc ved pH 5,8 og inkubert ved 37°C i mørket. En roserir-rød farge ble dannet som indikator.

C) Glukoseoksydase

- 6,7 mg beta-D glukose og 0,67 mg nitro blå tetrazoli-um/ml av 50 mM Tris/HCl (pH 7,5) ble inkubert ved 37°C i 1 time. 100 pl 100 x PMS (fenazinmetosulfat;

0,0167 mg/ml i destillert H20) ble tilsatt og løs-ningene ble blandet. Filteret inneholdende Con A-glukosylert DNA og glykosylert enzym ble så inkubert i.

denne blanding i mørket i 1 time ved 37 C eller natten over ved romtemperatur. En sterk blåfarge ble dannet som indikator.

Sensitiviteter for reaksjonene:

A) Pepperrotperoksydase

- 150-250 picogram DNA ble påvist. Fargen bleknet ved 1agring.

B) Sur fosfatase

- Bare hybridisérte DNA-flekker ble analysert, 7-15 picogram DNA ble påvist.

C) Glukoseoksydase

- Bare glukosylerte DNA-flekker ble undersøkt, 150-250 picogram DNA ble påvist. Denne forskriften for Con A-påvisning ble funnet å være •ikke-optimal. Den gradvise tilsetning av Con A etterfulgt av enzym ble funnet å gi for sterk bakgrunn i påvisnings-målesystemet. Fremgangsmåten var også relativt tidkrevende og påvisningssensitiviteten var lavere enn ønsket. Derfor ble en annen fremgangsmåte for kontakt av Con A, glukosylert DNA og enzym anvendt.

2) Behandling av glukosylerte DNA-sekvenser med kompleksert Con A/ glykosylert enzym

Con A og glykosylert enzym ble blandet i et 1:1 molart forhold i TCMN buffer og inkubert ved 37°C i 2 timer eller ved 25°C i 4-6 timer eller ved 4°C natten over til 48 timer. (Ved slutten av inkubasjonsperioden bør blandingen være klar. Hvis dette ikke er tilfelle, foreligger Con A i overskudd og mer enzym må tilsettes.)

Blokkeringen av nitrocellulosefi 1tere inneholdende T4-glukosylert DNA ble foretatt som ovenfor beskrevet. Filterene ble så renset 3 ganger i 5 minutter hver gang i TCMN buffer og 1 % BSA. Con A-enzymkomplekset fremstilt ovenfor ble så bragt i kontakt med filteret ved et volum på 0,018 ml/cm2 , eller i en mengde inneholdende ca. 2-10 enheter av enzymet. Inkubering var ved 37°C i 1 time. Etter inkubering ble filterene først renset 3 ganger i 5 minutter hver gang i NBBT og deretter 2 ganger i 5 minutter hver gang i NCBT.

Pepperrotperoksydasereaksjonen ble utført som ovenfor angitt. Med denne fremgangsmåte var det mulig å påvise 31,25 picogram DNA, og det var betydelig mindre bakgrunn enn med den forut beskrevne påvisningsteknikk. Lignende påvisningsmetoder kan også utføres ved bruk av et Con A-syrefosfot-asekompleks, et Con A-glukoseoksydasekompleks samt andre lignende Con A-enzymkomplekser.

Lectin/antistoff og andre påvisningssystemer kan også brukes (se Ward et al., ovenfor).

EKSEMPEL II

Biotinylering av glukosylert T4 DNA

For å hjelpe påvisningen av hybridiseringsreaksjoner mellom glukosylert sonde-DNA og analytter, kan de glukosylerte sonde-DNA derivatiseres videre med biotinrester, for hvilke standardpåvisningssystemer er kjente.

En ml av 1 mg/ml T4 DNA i 0,1 M natriumacetatbuffer (pH 4,3) ble blandet med 0,1 ml av en nyfremstilt 1 M NalO^løsning. Blandingen ble inkubert i 3 timer ved romtemperatur i mørket.

Etter at oksydasjonsreaksjonen var avsluttet, ble løsningen dialysert ved 4°C i mørket mot 2 forandringer av 0,05 M natriumacetat ved pH 4,0, 0,1 M NaCl og 2 forandringer av 0,3 M natriumborat ved pH 9,0-9,3, 0,1 M NaCl. Løsningen ble så innstilt på 0,4, M i 1 , 6-diaminoheksan fra en pH 9,3 stamløsning av diamin. Blandingen ble inkubert i mørket i 90 minutter. Den resulterende Schiffske base ble redusert

med NaBH^. NaBH^, nyoppløst i vann ved en konsentrasjon

på 2 M, ble satt til blandingen i fire 30 minutters inter-valler, hvilket ga konsentrasjonsøkninger av NaBH^fra 0,025 M til 0,1 M. Total inkuberingstid var 3 timer. NaBH^ble behandlet ved å justere pH til 5,0-5,5 ved tilsetning av 4 M natriumacetat, pH 4,0. Den DNA-holdige løsning ble dialysert 12 timer i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,7, og deretter gjort 40 % v/v DMF og 20 mM biotin NHS ester. Denne løsning ble inkubert i 12 timer. Biotinoverskudd og biotin NHS ester ble fjernet ved filtrering gjennom en G50 Sephadex kolonne ved bruk av 1 x SSC som elueringsbuffer. Fraksjoner inneholdende DNA ble samlet fra kolonnen, slått sammen og dialysert mot en løsning inneholdende 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA, pH 7,0, og lagret inntil videre bruk ved -20°C.

EKSEMPEL III

Fremstilling av BrdUR-markerte DNA-sekvenser i transform-' erte tyminkrevende E. coli mutanter

I dette eksempel innføres en markør in vivo i en polynukleotidsekvens ved å dyrke en vert som inneholder den ønskede polynukleotidsekvens som skal markeres i nærvær av en analog av et nukleotid, base eller nukleosid med denne markør, fordi verten er en variant som krever den markør-holdige analog. Som forut beskrevet kan den ønskede polynukleotidsekvens som skal markeres være en del av genomet til verten eller settes til genomet. Det kan også være en del av en DNA-sekvens eller annen kloningsbærer eller fag anvendt for å transfektere verten.

En tyminkrevende mutant av E. coli ( thy A)karakterisert veden DNA-sekvens som man ønsker å markere, dyrkes i et medium tilsatt 5-bromdeoksyuridin (BrdUR) i stedet for tymidin ifølge teknikken til Miller, Experiments In Molecular Gene-tics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972). Cellene høstes og en DNA-sekvens som inneholder den markerte sonde-DNA-sekvens isoleres. Denne DNA-sekvens kan brukes direkte for Lybridiseringsstudier. Alternativt kan hele eller en del av denne markerte sondesekvens først fjernes fra resten av DNA-sekvensen ved endonukleolytisk spaltning, og brukes alene for påvisning av analytter.

Hybridisering av markert sonde til analytt kan påvises ved omsetning med monoklonale eller polyklonale antistoffer til BrdUR (Gratzner, "Monoclonal Antibody To 5-Bromo- And 5-Iododeoxyuridine: A New Reagent For Detection Of DNA Replication", Science, 218, s. 474-75 (1982)). Alternativt kan sonden derivatiseres videre kjemisk ved tilsetning av en rest såsom tiobiotln. Den tiobiotiniser te DNA-sonde kan så påvises når den er hybridisert til analytter ved bruk av biotinpåvisningssystemer såsom "Detek" I-hrp, eller andre slike biotinpåvisningssystemer.

EKSEMPEL IV

Biotinylering av DNA- holdig 5- bromdeoksyuridin

For å påvise BrdUR-markert sonde-DNA fremstilt i eksempel III hybridisert til en analytt, kan BrdUR-markert sonde-DNA ytterligere derivatiseres med biotin.

200 ug trietylammoniumsalt av DNA-holdige bromdeoksyuridin-rester ble oppløst i 2 ml vannfritt dimetylformamid (DMF). Denne løsning ble tilsatt 0,5 ml 50 mM tiobiotin i vannfritt DMF og blandingen ble inkubert i 2 timer ved 60°C under argongass. Løsningsmiddelet ble fjernet ved fordamp-ning under redusert trykk ved 40°C. Resten ble oppløst i 0,5 ml 1 x SSC. Uoppløst materiale ble fjernet ved sentri-fugering. Biotinoverskudd ble fjernet fra supernantanten ved filtrering på en G50 Sephadex kolonne ved bruk av 1 x SSC som elueringsbuffer. DNA-holdige fraksjoner ble samlet fra kolonnen, slått sammen og lagret ved -70°C for frem-tidig bruk.

Selv om det her er presentert en rekke utførelsesformer av oppfinnelsen, er det klart at grunntanken kan varieres og gi andre utførelsesformer som anvender fremgangsmåter og blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse. Derfor vil det være klart at omfanget av denne oppfinnelse er definert av de etterfølgende krav og ikke av spesifike utførelsesformer som forut er fremlagt kun som eksempler.

Claims (35)

e

1. Fremgangsmåte for in_ vi vo markering av polynukleotidsekvenser, karakterisert ved at man dyrker en vert karakterisert ved en polynukleotidsekvens (a) som man ønsker å markere og minst en annen polynukleotidsekvens (b) som uttrykker et produkt ved dyrkning av verten som markerer den ønskede polynukleotidsekvens (a) når den re-plikerer i den dyrkede vert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidsekvens (a) er valgt fra gruppen en DNA-sekvens som er en del av vertens opprinnelige genom, en DNA-sekvens som er innsatt i det opprinnelige genom hos verten, og DNA-sekvenser som omfatter minst en del av en DNA-sekvens anvendt for å transfektere verten.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den anvendte DNA-sekvens for å transfektere

verten er valgt fra gruppen kloningsvehikler og fager karakterisert ved den ønskede polynukleotidsekvens som skal markeres, hvilke kloningsvehikler og fager er i stand til å replikere i verten.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidsekvens (b) er valgt fra gruppen en DNA-sekvens som er en del av det opprinnelige genom hos verten, en DNA-sekvens som innsatt i det opprinnelige genom hos verten, og DNA-sekvenser som omfatter minst en del av en DNA-sekvens anvendt for å transfektere verten.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at DNA-sekvensen som anvendes for å•transfektere verten velges fra gruppen kloningsvehikler og fager karakterisert ved den polynukleotidsekvens som uttrykker et produkt ved dyrkning av verten som markerer den ønskede polynukleotidsekvens ved sin replikering i den dyrkede vert, hvilke kloningsvehikler og fager kan replikere i verten..

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidsekvensen (b) er avledet fra fager som markerer polynukleotidsekvenser i denne fag.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at disse fager velges fra gruppen T-like tall E. coli bakteriofager.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at fagene velges fra gruppen bakteriofag T2 , bakteriofag T4 og bakteriofag T6.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidsekvensen (b) er tatt ut fra Xanthomonas oryzae bakteriofag XP12.

• 10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidsekvensen (b) stammer fra Bacillus fag SP01.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at markøren sitter på en forbindelse valgt fra gruppen glykosylerte nukleotider, glukosylerte nukleotider, deoksyhydroksymetyluridin og 5-metylcytosin.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man videre isolerer fra den dyrkede vert en DNA-sekvens omfattende minst den polynukleotidsekvens man ønsker å markere.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at man isolerer en DNA-sekvens som er en del eller hele polynukleotidsekvensen man ønsker å markere.

14 . Fremgangsmåte ved i_n vi vo markering av polynukleotidsekvenser, karakterisert ved at man dyrker en vert inneholdende en polynukleotidsekvens som man ønsker å markere, i nærvær av en base, nukleosid eller nukleotid, eller analog eller forstadium derav, at verten eller en variant derav kreves for dens vekst, hvilken base, nukleosid eller nukleotid eller analog eller forstadium derav bærer den ønskede markør.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at polynukleotidsekvensen man ønsker å markere velges fra gruppen DNA-sekvenser som er en del av det opprinnelige genom i verten, DNA-sekvenser som er innsatt i det opprinnelige genom i verten, og DNA-sekvenser som omfatter minst en del av en DNA-sekvens anvendt for å transfektere verten.

16.. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at DNA-sekvensen som brukes til å transfektere verten velges fra gruppen kloningsbærere og fager karakterisert ved den polynukleotidsekvens man ønsker å markere, hvilke bærer og fager kan replikere i verten.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at verten velges fra gruppen tymin eller

tymidin minus mutanter og den markørbærende analog er BrdUR.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 14, karakterisert ved at man videre knytter eller binder en signalgivende rest, en brodannende rest eller i det minste en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest til markøren i polynukleotidsekvensen.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den signalgivende rest, brodannende rest eller kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest bindes kovalent til markøren.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at den signalgivende rest og brodannende rest velges fra gruppen radioaktive forbindelser, biotin, fluorescerende forbindelser, fluorescein, rodamin, dansyl,

.magnetiske forbindelser, chelatiserende forbindelser og andre signalgivende og brodannende rester som kan knyttes kovalent til markerte polynukleotidsekvenser.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den signalgivende rest, brodannende rest eller kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest er ikke-kovalent bundet til markøren.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den signalgivende rest og brodannende rest velges fra gruppen polypeptider, proteiner, lectiner, Concanavalin A, enzymer, alkaliske fosfataser, sure fosfataser, antigener, antistoffer, beta-galaktosidase, glukoseoksydase, pepperrotperoksydase, chelatiserende reagenser og andre signalgivende og brodannende rester som kan bindes ikke-kovalent til markerte polynukleotidsekvenser.

23. Polynukleotidsekvens, karakterisert ved at den er markert ved fremgangsmåten ifølge hvert

■ av kravene 1-17.

24. Polynukleotidsekvens ifølge krav 23, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av DNA og RNA.

25. Polynukleotidsekvens ifølge krav 23, karakterisert ved at markøren på polynukleotidsekvensen videre er knyttet eller bundet til en signalgivende rest, en brodannende rest eller minst en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest, hvilken signalgivende rest, brodannende rest eller kombinasjon ikke interfererer med hybridiseringen av den markerte polynukleotidsekvens .

26. Polynukleotidsekvens ifølge krav 25, karakterisert ved at den signalgivende rest, brodannende rest eller kombinasjonen av brodannende rest og signalgivende rest er kovalent bundet til markøren.

27. Polynukleotidsekvens ifølge krav 26, karakterisert ved at den signalgivende og brodannende rest velges fra gruppen radioaktive forbindelser, fluorescerende forbindelser, biotin, fluorescein, rodamin, dansyl, magnetiske forbindelser, chelatiserende reagenser og andre signalgivende og brodannende rester som kan knyttes kovalent til markø ren.

28. Polynukleotidsekvens ifølge krav 25, karakterisert ved at den signalgivende rest, brodannende rest eller kombinasjonen av signalgivende rest og brodannende rest er ikke-kovalent bundet til markøren.

29. Polynukleotidsekvens ifølge krav 28, karakterisert ved at den signalgivende rest og brodannende rest er valgt fra gruppen polypeptider, proteiner,

■lectiner, Concanavalin A, enzymer, alkalisk fosfatase, sur fosfatase, antigener, antistoffer, beta-galaktosidase, glukoseoksydase, pepperrotperoksydase, chelatiserende reagen-

■ ser og andre signalgivende og brodannende rester som kan være ikke-kovalent knyttet til markøren.

30. Påvisningssett for analytter, karakterisert ved en polynukleotidsekvens ifølge krav 23.

31. Påvisningssett for analytter, karakterisert ved en polynukleotidsekvens ifølge krav 25.

32. Fremgangsmåte ved påvisning av en polynukleotidsekvens i en analytt, karakterisert ved at man hybridiserer analytten til den markerte polynukleotidsekvens ifølge krav 23 som er komplementær til den ønskede polynukleotidsekvens i analytten og påvise denne hybridisering.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at man videre knytter eller binder en signalgivende rest eller minst en kombinasjon av brodannende rest og signalgivende rest til markøren på polynuk leotidsekvensen etter hybridisering av denne sekvens til den komplementære sekvens i analytten.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at den signalgivende rest eller kombinasjonen av brodannende rest og signalgivende rest knyttes kovalent eller ikke-kovalent til markøren.

35. Fremgangsmåte ved påvisning av en polynukleotidsekvens i en analytt, karakterisert ved at analytten hybridiseres til en markert polynukleotidsekvens ifølge krav 25, som er komplementær til den ønskede polynukleotidsekvens i analytten og påvise denne hybridisering.