CN108624653A - 一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ。本发明的有益效果在于：提供了一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，比现有的显色法基因芯片步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低，利于临床的推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。
背景技术
血流感染(Blood Stream Infection，BSI)主要是包括败血症和菌血症。败血症(septicemia)是由各种病原微生物(细菌或真菌)和毒素侵人血流所引起的血液感染，主要临床表现为：骤发寒战，高热，心动过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神，神志改变等一系列严重临床症状，严重者可引起休克，弥散性血管内凝血(DIC)和多脏器功能衰竭。若细菌仅短暂侵入人血，而无临床明显的毒血症状(如血管相关性感染)则称为菌血症(bacteremia)。血流感染(BSI)常病情危重，是导致患者死亡的重要原因之一。近年来，随着创伤性诊疗技术的广泛开展以及广谱抗生素，激素的广泛应用，血流感染的发病率有逐年增高趋势。血流感染病死率高，且延长住院时间，增加住院费用，危害严重。因此，血流感染的控制越来越受到人们的关注。
引起血流感染的病原菌主要分为三类：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，主要包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和假丝酵母菌等。
量子点(Quantum dot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。
量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：
1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；
2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；
3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；
4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；
5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；
6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；
7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。
8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。
量子点材料在20世纪80年代分别由Alexey I.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，形成微阵列，所以可以一次性对临床样品中大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。由于基因芯片技术具有高通量、高速度、高效率的检测特征，所以为高通量的病原菌检测鉴定提供了强有力的检测工具。但是目前基因芯片主要以有机荧光染料、BCIP/NBT及DAB为检测方法，有机荧光染料存在很多缺陷：荧光强度不高、稳定性差、易被光漂白，发射波峰宽大，斯托克斯位移小，BCIP/NBT及DAB方式存在操作步骤繁琐，检测灵敏度低，重复性差等技术上的缺陷。
目前血流感染的检测的金标准是血培养法。血培养法有很多不足的地方：培养的时间比较长(24-48h)、从样本采集到结果出来耗时长(3-5d)，对于需要立即采取有效治疗的患者来说时间过长)、假阳性比较高(污染)、一些在采集样本前已经用过抗生素治疗的情况，存在病原菌获取量不足及出现培养困难的病原菌、一些难培养的病原菌不易培养等会影响患者及时治疗，这种延误会造成患者的死亡率增加，同时使用广谱抗生素会造成细菌耐药性的形成。随着技术发展，现在更多研究偏向于分子诊断，利用分子技术可以快速准确检测到病原菌种类及耐药情况，极大降低患者死亡率。目前国内外的所涉及到技术主要包括基因芯片、高分辨溶解曲线法、实时荧光PCR、质谱法等，但基于目前的实时荧光定量PCR仪的通量受限问题，高分辨溶解曲线法、实时荧光PCR检测方法无法做到高通量检测，而质谱法所涉及的质谱仪设备价格昂贵，无法普及。
现有的相关专利如下：
公开号CN1414112A的中国发明专利公开了用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法，其基质为尼龙膜，检测区域为23S，能同时检测约40种病原菌，显色方法BCIP/NBT或DAB，探针设计3端加T尾巴。
公开号CN1814797A的中国发明专利公开了用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，检测区域为23S，通过30种不同的荧光微球进行检测，通过链霉亲和素-藻红蛋白复合物进行荧光检测。
公开号CN102453752A的中国发明专利运用高分辨率溶解曲线法对血流感染的细菌快速鉴定，首先对血培养阳性的培养瓶进行涂片，革兰氏染色，区分阳性菌和阴性菌，然后针对阴性菌和阳性菌选择扩增16S不同片段，同时高分辨率溶解曲线方法分析，其检测的血流感染常见的病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、产酸克雷伯菌、洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌，共计15种。
公开号CN101824470A的中国发明专利公开了一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应的PCR通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测。
公开号CN102471798A的中国发明专利主要涉及利用来自血流感染的血培养物中病原体的质谱鉴定，所述方法在血培养瓶中经过相对短暂的培养之后从血液中分离纯化微生物病原体，并采用质谱进行鉴定。
从上述专利文献及其现有技术中可以看出，目前还没有利用量子点材料的光学特性及基因芯片的特性配合建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的核酸检测血流感染的检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；
所述反应液I包含以下检测引物：
引物JSF23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.1)；
引物LG23F1：GCGATGTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.2)；
引物BK23F1：ACGATTTCCGAATGGGGCAACCCA(SEQ No.3)；
引物CS23F1：AAGATATCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.4)；
引物NZ23F1：GTCAGAGGCGATGAAGGGCG(SEQ No.5)；
引物Z23F1：GTAATGTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.6)；
引物BMTLF1：CGGCAAATATCCTTTGATCCG(SEQ No.7)；
引物JSFZNBCY23R1：CCTTTCCCTCACGGTAC(SEQ No.8)；
引物LG23R1：TTCGCCTTTCCTTCACAGTACTG(SEQ No.9)；
引物HBBF1：TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.10)；
引物HBBR1：CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.11)；
所述反应液II包含以下检测引物：
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.12)；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.13)；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.14)；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.15)；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG(SEQ No.16)；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG(SEQ No.17)；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA(SEQ No.18)；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA(SEQ No.19)；
引物PTR1:AATATACCTCGGTGATATATTG(SEQ No.20)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.10)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.11)；
所述反应液III包含以下检测引物：
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC(SEQ No.21)；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT(SEQ No.22)；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA(SEQ No.23)；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA(SEQ No.24)；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC(SEQ No.25)；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG(SEQ No.26)；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG(SEQ No.27)；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC(SEQ No.28)；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG(SEQ No.29)；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ No.30)；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ No.31)；
引物CQF1:GGCGGTCTGCACGGCGTAG(SEQ No.32)；
引物CQR1:CCAGGCTTGGCCAGAAAC(SEQ No.33)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.10)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.11)；
所述反应液IV为Hotstart Taq DNA聚合酶。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述捕获探针包含：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG(SEQ No.34)；
探针CQP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT(SEQ No.35)；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG(SEQ No.36)；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA(SEQ No.37)；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT(SEQ No.38)；
探针RXP1：GACGTAGAAGTWGTTGAAGGTG(SEQ No.39)；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT(SEQ No.40)；
探针RXXP1：GTTGAAGTTRTTGATGGTG(SEQ No.41)；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC(SEQ No.42)；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC(SEQ No.43)；
探针FYLP1：TCAGCACTTAAAGCTCTTGAAG(SEQ No.44)；
探针CLP1：GTTCAGCTCTTAAAGCCCTTGAAG(SEQ No.45)；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC(SEQ No.46)；
探针CGP1：GTTGTGTTTGGTAGTGAGTG(SEQ No.47)；
探针CPP1：AAATCAGGTAGGACTACCCG(SEQ No.48)；
探针CTP1：AACTTTCAACAACGGATCTCTT(SEQ No.49)；
探针CKP1：GGACGACGTGTAAAGAGCG(SEQ No.50)；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA(SEQ No.51)；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC(SEQ No.52)；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC(SEQ No.53)；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC(SEQ No.54)；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG(SEQ No.55)；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG(SEQ No.56)；
探针BKP1：AGTGCGGCCATAGCAGGTG(SEQ No.57)；
探针ZSP1：TCGCGCAGTAAAGGGTGAT(SEQ No.58)；
探针NZP1：TTTCGACACACTATCATGTCA(SEQ No.59)；
探针CSP1：GTCGCAGGGTACAGGGTGAT(SEQ No.60)；
探针LGP1：GGAAGCACAATCAAAGAGG(SEQ No.61)；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT(SEQ No.62)；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT(SEQ No.63)；
探针PTP1：TTGTRAAATCACTCGTTTACTGA(SEQ No.64)；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA(SEQ No.65)。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.66)。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
优选的，上述的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述量子点为CdSe/ZnS。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，解决目前检测培养方法耗时长(3-5d)，阳性率低等问题。首次建立血流感染病原体的量子点核酸检测方法，其具有如下优点：
1)使用本发明试剂盒比现有的显色法基因芯片检测步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低(光源要求低)，并且现有的荧光基因芯片的载体为玻璃，其制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。
2)本发明采用多重PCR方法，多达8重，在一次检测中，能同时检测并鉴定29种血流感染病原菌及3种耐药基因检测，比培养法时间短，并且解决一些难养菌无法培养的问题。本发明还可以指导抗生素的使用，避免由于抗生素的滥用而导致的耐药，同时对混合感染或者是早期临床表现不明显患者早期诊断提供依据。
3)本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒灵敏度高，所有检测靶标均能达到0.1-0.01pg/ul基因组。
4)本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒特异性高。针对各个检测靶标的核酸信息进行生物信息学分析，目前公开的现有技术无法满足特异性要求，会出现假阳性，本发明根据不同病原菌特异性基因单独设计引物及探针，保证每种病原菌的高特异性，具体涉及的基因为16S rRNA、23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gyrB、gap、tuf等，不同于现有的文献里面公开的针对唯一靶标才能达到鉴定效果。
5)本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，同时增加一个内控靶标的检测，其为样本内源性的核酸(人源基因组管家基因)，每份样本检测均能得到有效的信号，保证每份样本从核酸提取到PCR扩增及量子点核酸检测的全程监控，有效避免假阴性的出现。
6)本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒可以使用简单的紫外成像仪器进荧光-信号的检测，最大程度地避免人为判读导致的误差。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的本发明试剂盒检测各个基因组DNA的灵敏度的结果示意图；
图2A-D分别为本发明具体实施方式的本发明试剂盒检测各个基因组DNA的特异性的结果示意图；
图3A-C分别为本发明具体实施方式的本发明试剂盒检测3份临床样本的检测准确性检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：利用量子点材料的光学特性及基因芯片特性建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的量子点核酸检测血流感染病原体的检测试剂盒，可同时检测常见的29种血流感染病原菌及3种耐药基因的血流感染病原体。
本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的检测谱为：产酸克雷伯菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌感染、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌群、化脓链球菌、肺炎链球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、产气肠杆菌、大肠杆菌以及3种耐药基因(VanA介导的耐万古霉素基因、VanB介导的耐万古霉素基因及mecA介导的耐甲氧西林基因)。
本发明根据不同病原菌核酸信息设计能鉴定到相应病原菌的检测引物及探针，并且根据灵敏度筛选引物及探针，将满足要求的引物进行单重到多重的组合及相关优化，确定最佳的引物组合及不同的反应体系，减少引物之间的相关影响。最后确定各个反应体系的引物组合形式，将反应体系分为3管(5-8重PCR)。
实施例1
本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的制备和使用
一、量子点核酸检测原理：
将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
捕获探针为寡核苷酸单链DNA 3’端或5’端标记有氨基，且氨基与寡核苷酸单链DNA间有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligo dT(n)n数量为1～30。
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50uM)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。
量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(CdSe/ZnS)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm。所述量子点的尺寸1-200nm。
所核酸扩增产物为5’端带有生物素标记，具体为核酸扩增的一条引物5’端被修饰有生物素标记，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligo dT(n)n数量为1～30。
核酸扩增方法为聚合酶链式反应(如PCR等)、恒温扩增(如TMA/RPA/LAMP等)。
量子点核酸检测流程：
1)首先使用若干对引物进行核酸扩增，并且某一基因扩增的一对引物中其中一条引物5’端修饰有生物素，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligodT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligodT(n)n数量为1～30。
2)核酸扩增后，将产物进行核酸变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
3)将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至一定温度(40-55度)的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
4)杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至一定温度(40-55度)的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
5)洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入到一定温度的孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述温度为20-37度，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nMSA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
6)孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
7)洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
二、引物的设计与筛选
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个病原菌的23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gyrB、gap、tuf基因，经BLAST比对找出各个靶标同源性最高的区域，设计扩增引物。通过大量的试验测试筛选(单重扩增及多重组合扩增)灵敏度满足要求的引物。具体的检测引物序列及序列编号如下：
引物JSF23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.1)；
引物LG23F1：GCGATGTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.2)；
引物BK23F1：ACGATTTCCGAATGGGGCAACCCA(SEQ No.3)；
引物CS23F1：AAGATATCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.4)；
引物NZ23F1：GTCAGAGGCGATGAAGGGCG(SEQ No.5)；
引物Z23F1：GTAATGTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.6)；
引物BMTLF1：CGGCAAATATCCTTTGATCCG(SEQ No.7)；
引物JSFZNBCY23R1：CCTTTCCCTCACGGTAC(SEQ No.8)；
引物LG23R1：TTCGCCTTTCCTTCACAGTACTG(SEQ No.9)；
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.12)；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.13)；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.14)；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.15)；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG(SEQ No.16)；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG(SEQ No.17)；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA(SEQ No.18)；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA(SEQ No.19)；
引物PTR1:AATATACCTCGGTGATATATTG(SEQ No.20)；
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC(SEQ No.21)；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT(SEQ No.22)；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA(SEQ No.23)；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA(SEQ No.24)；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC(SEQ No.25)；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG(SEQ No.26)；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG(SEQ No.27)；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC(SEQ No.28)；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG(SEQ No.29)；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ No.30)；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ No.31)；
引物CQF1:GGCGGTCTGCACGGCGTAG(SEQ No.32)；
引物CQR1:CCAGGCTTGGCCAGAAAC(SEQ No.33)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.10)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.11)；
每条反向引物均被修饰有生物素标记。
三、扩增反应液体系的确认
通过大量的多重组合测试及体系优化测试，确定各个反应液体系的组成，具体情况如下：
反应液I的反应体系(48人份)如表1；
表1
反应液II的反应体系(48人份)如表2；
表2
反应液III的反应体系(48人份)如表3；
表3
每个样本的检测需要同时进行三个反应体系进行扩增，每个反应体系21ul，提取的核酸模板为4ul，总体积为25ul。
四、PCR反应程序的确定
经过大量的试验测试，本扩增程序能有效使各个反应体系中的引物最大程度得到有效扩增，并且使各个病原体检测灵敏度达到0.1-0.01pg/ul基因组浓度。具体程序如下表4(采用了降落PCR程序)；
表4
五、捕获探针的设计
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个病原菌的23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gyrB、gap、tuf基因，经BLAST比对找出各个靶标特异性最高的区域，同时兼顾各个捕获探针能在同一杂交温度进行杂交测试设计探针，并经过大量的灵敏度试验测试及特异性测试，确定各个病原菌及耐药基因的探针序列，具体序列及编号如下：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG(SEQ No.34)；
探针CQP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT(SEQ No.35)；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG(SEQ No.36)；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA(SEQ No.37)；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT(SEQ No.38)；
探针RXP1：GACGTAGAAGTWGTTGAAGGTG(SEQ No.39)；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT(SEQ No.40)；
探针RXXP1：GTTGAAGTTRTTGATGGTG(SEQ No.41)；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC(SEQ No.42)；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC(SEQ No.43)；
探针FYLP1：TCAGCACTTAAAGCTCTTGAAG(SEQ No.44)；
探针CLP1：GTTCAGCTCTTAAAGCCCTTGAAG(SEQ No.45)；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC(SEQ No.46)；
探针CGP1：GTTGTGTTTGGTAGTGAGTG(SEQ No.47)；
探针CPP1：AAATCAGGTAGGACTACCCG(SEQ No.48)；
探针CTP1：AACTTTCAACAACGGATCTCTT(SEQ No.49)；
探针CKP1：GGACGACGTGTAAAGAGCG(SEQ No.50)；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA(SEQ No.51)；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC(SEQ No.52)；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC(SEQ No.53)；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC(SEQ No.54)；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG(SEQ No.55)；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG(SEQ No.56)；
探针BKP1：AGTGCGGCCATAGCAGGTG(SEQ No.57)；
探针ZSP1：TCGCGCAGTAAAGGGTGAT(SEQ No.58)；
探针NZP1：TTTCGACACACTATCATGTCA(SEQ No.59)；
探针CSP1：GTCGCAGGGTACAGGGTGAT(SEQ No.60)；
探针LGP1：GGAAGCACAATCAAAGAGG(SEQ No.61)；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT(SEQ No.62)；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT(SEQ No.63)；
探针PTP1：TTGTRAAATCACTCGTTTACTGA(SEQ No.64)；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA(SEQ No.65)；
探针ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.66)。
其中ICP1探针为一条内控探针，用于监控样本核酸提取及扩增反正出现假阴性。
所述的各条探针的5’端标记有氨基，并且氨基与寡核苷酸链间有oligodT10。
六、检测膜条的制备
每条捕获探针由引物合成单位进行合成，然后采用稀释液稀释成所需的浓度，再通过氨基与羧基的缩合反应固定在尼龙膜上，制备成检测膜条。
检测膜条的布局图如下表5；
表5
膜条上位点对应的病原菌及耐药基因如下表6；
表6
七、杂交条件的确定
PCR扩增完成后，将三管扩增产物混合后进行95度10min变性处理，然后进行杂交、洗涤、孵育、洗涤、荧光检测。在杂交步骤中，杂交温度对结果的判读有着很大的影响，杂交温度过低，会出现非特异捕获导致假阳性，杂交温度过高，会出现目的产物与捕获探针的结合率下降，最终到时灵敏度下降而导致误判阴性。后续的洗涤温度、孵育时间的长短、孵育液中SA-QD的浓度也会有对结果同样的影响。
杂交：
将变性后的PCR产物与检测膜条加入到预先孵育至48度的1ml杂交液中，48度轻摇杂交1.5h。同时将1ml洗涤液进行预热至48度。
所述的杂交液为2*SSC与0.1％SDS。所述的洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
洗涤：
取出检测膜条，转移至预先预热至48度的洗涤液中，轻摇洗涤5min。
孵育：
按照1ml杂交液加入浓度为1uM SA-QD配制孵育液。将检测膜条转移至孵育液中室温孵育轻摇30min。
洗涤：
取出检测膜条，转移至洗涤液中，室温轻摇洗涤5min。
综上，本实施例提供一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ。
本实施例用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的使用流程如下：
1、将反应液I、反应液II、反应液III与反应液IV按20.75ul：0.25ul比例混合。
2、向上述混合好的反应液中加入4ul的样本核酸，置于PCR仪中进行PCR扩增。所述扩增程序如表4；
3、PCR扩增后，将产物混合后进行变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
4、将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至48度的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
5、杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至48度的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
6、洗涤结束后，将洗涤液去除后，在室温加入孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nM SA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
7、孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
8、洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
实施例2
本发明用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的效果验证分析
1、灵敏度检测
按照实施例1配制反应体系，并且按21ul进行分装，向每个反应体系加入4ul基因组DNA，基因组DNA浓度为10pg/ul、1pg/ul、0.1pg/ul。
PCR扩增程序：按照实施例1所述的程序进行PCR扩增。
检测按照实施1中的试剂盒使用流程进行测试。检测结果参见图1。检测结果显示每种检测靶标灵敏度均能达到0.1pg/ul。
2、特异性检测
按照实施例1配制反应体系，并且按21ul进行分装，向每个反应体系加入4ul基因组DNA，检测的基因组DNA分别为白色念珠菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌及表皮葡萄球菌基因组DNA。
PCR扩增程序：按照实施例1所述的程序进行PCR扩增。
杂交检测按照实施例1中试剂盒使用流程进行测试。检测结果分别参见图2A、图2B、图2C、图2D。其中，A为本发明检测白色念珠菌特异性，B为本发明检测粘质沙雷菌特异性，C为本发明检测阴沟肠杆菌特异性，D为本发明检测表皮葡萄球菌特异性。结果显示只有相应的检测点位有相应的荧光信号，说明检测探针特异性满足要求。
3、临床样本检测
取临床血培养样本三例，先进行基因组DNA提取，具体提取试剂采用杭州千基生物科技有限公司生产的1.2M山梨醇及循环游离核酸提取试剂盒(磁珠法)、天根生化生产的溶壁酶，提取流程如下：
1)取200ul血培养液至1.5ml EP管，12000r离心5min，弃上清；
2)加入600ul 1.2M山梨醇buffer，重悬沉淀后，加入5ul溶壁酶，30℃水浴30min；
3)水浴后，12000r离心5min，弃上清，再加入200ul生理盐水重悬沉淀；
4)向EP管中加入300ul裂解结合液，加入5ul mag，混匀后，常温下孵育10min；
5)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清；
6)向EP管中加入1ml洗涤液，充分洗涤；
7)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清，晾干2-5min；
8)向EP管中加入60ul洗脱液，重悬磁珠，56℃加热5min；
9)EP管置于磁力分离器上，分离上清并转至一个干净的EP管中，-20℃保存备用。
按照实施例1配制反应体系再按照21ul/反应分装反应液，每个反应液中加入4ul提取的核酸，然后按照实施例1进行PCR扩增，扩增后的产物按照实施例1方法进行杂交测试。检测结果见图3A、图3B、图3C。检测结果一例为大肠杆菌、一例为阴沟肠杆菌、一例为阴性，与培养法鉴定结果一致。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 杭州千基生物科技有限公司
杭州博芯生物技术有限公司
<120> 一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atgtatactt tgtatacgtg 20
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agtgcggcca tagcaggtg 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcgcgcagta aagggtgat 19
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tttcgacaca ctatcatgtc a 21
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gtcgcagggt acagggtgat 20
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggaagcacaa tcaaagagg 19
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cacatacwta agtatgcttc gt 22
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
agtgctcaca cagattgtct 20
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ttgtraaatc actcgtttac tga 23
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gttaaagtcc aatcaggcct a 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tttgctaatc atgttcatac c 21
Claims (7)
1.一种用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；
所述反应液I包含以下检测引物：
引物JSF23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA；
引物LG23F1：GCGATGTCCGAATGGGGAAACCCA；
引物BK23F1：ACGATTTCCGAATGGGGCAACCCA；
引物CS23F1：AAGATATCCGAATGGGGAAACCCA；
引物NZ23F1：GTCAGAGGCGATGAAGGGCG；
引物Z23F1：GTAATGTCCGAATGGGGAAACCCA；
引物BMTLF1：CGGCAAATATCCTTTGATCCG；
引物JSFZNBCY23R1：CCTTTCCCTCACGGTAC；
引物LG23R1：TTCGCCTTTCCTTCACAGTACTG；
引物HBBF1：TATGGTTGGGATAAGGCTGG；
引物HBBR1：CGAGCTTAGTGATACTTGTG；
所述反应液II包含以下检测引物：
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA；
引物PTR1:AATATACCTCGGTGATATATTG；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；
所述反应液III包含以下检测引物：
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC；
引物CQF1:GGCGGTCTGCACGGCGTAG；
引物CQR1:CCAGGCTTGGCCAGAAAC；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.10)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.11)；
所述反应液IV为Hotstart Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针包含：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG；
探针CQP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT；
探针RXP1：GACGTAGAAGTWGTTGAAGGTG；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT；
探针RXXP1：GTTGAAGTTRTTGATGGTG；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC；
探针FYLP1：TCAGCACTTAAAGCTCTTGAAG；
探针CLP1：GTTCAGCTCTTAAAGCCCTTGAAG；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC；
探针CGP1：GTTGTGTTTGGTAGTGAGTG；
探针CPP1：AAATCAGGTAGGACTACCCG；
探针CTP1：AACTTTCAACAACGGATCTCTT；
探针CKP1：GGACGACGTGTAAAGAGCG；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG；
探针BKP1：AGTGCGGCCATAGCAGGTG；
探针ZSP1：TCGCGCAGTAAAGGGTGAT；
探针NZP1：TTTCGACACACTATCATGTCA；
探针CSP1：GTCGCAGGGTACAGGGTGAT；
探针LGP1：GGAAGCACAATCAAAGAGG；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT；
探针PTP1：TTGTRAAATCACTCGTTTACTGA；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA。
3.根据权利要求2所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC。
4.根据权利要求2所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
5.根据权利要求1所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
6.根据权利要求1所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
7.根据权利要求1所述用于血流感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述量子点为CdSe/ZnS。
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