KR20120047858A - 그람-양성 박테리아의 전세포 분석 방법 - Google Patents

그람-양성 박테리아의 전세포 분석 방법 Download PDF

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헨릭 스텐더
얀 트르노브스키
리사 엘. 클리마스
앤 케이. 아이. 라스무쎈
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어드밴딕스, 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 그람-양성 박테리아의 전세포 분석 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로 샘플 (예를 들어, 임상 샘플)이 하나 이상의 선택적 그람-양성 박테리아를 포함하는지 여부, 및 또한 예를 들어 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아가 전혀 또는 이들의 일부 또는 모두가, 또는 가능하게는 상기 샘플 내 다른 박테리아가 관심있는 선택적 형질 또는 형질들을 갖는지 여부를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법을 이용하여 샘플 내 메티실린-내성 (선택적 형질) 스타필로코쿠스 아우레우스 (선택적 그람-양성 박테리아), 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (또다른 선택적 그람-양성 박테리아) 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA)를 결정할 수 있다. 전세포 분석은, 예를 들어 계내 혼성화 (ISH), 형광 계내 혼성화 (FISH), 면역세포화학 (ICC), 또는 이들 중 둘 이상의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.

Description

그람-양성 박테리아의 전세포 분석 방법{METHODS FOR WHOLE-CELL ANALYSIS OF GRAM-POSITIVE BACTERIA}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 5월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/179,900호 및 2010년 1월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/293,674호를 우선권 주장하며; 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
해당사항 없음.
공동 연구 계약에 관한 관계자 명칭
해당사항 없음.
본원에서 사용된 단락 제목은 단지 체계화 목적을 위한 것으로, 어떠한 방식으로든 기재된 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도면의 간단한 설명
본 특허 또는 출원 파일은 하나 이상의 유색 도면을 함유하고 있다. 유색 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부 후에 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
당업자는 하기 기술된 도면이 단지 예시 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 어떠한 방식으로든 본 발명의 교시의 범주를 제한하고자 하지 않는다.
도면에서, 도면 내 요소의 크기 및 상대적인 위치는 반드시 일정한 비례로 그려진 것은 아니다. 예를 들어, 각종 요소의 모양 및 각도는 일정한 비례로 그려질 수 없으며, 도면 판독성을 개선하기 위해 이들 요소 중 일부를 임의로 확대하여 배치한다. 또한, 도시된 바와 같은 요소의 특정 모양은 특정 요소의 실제 모양에 관한 임의의 정보를 전달하고자 할 수 없으며, 도면에서의 인지 용이성만을 위해 선택될 수 있다.
도 1은 박테리아를 포함하는 5개의 상이한 슬라이드 (슬라이드 A 내지 E)의 5개의 현미경 영상 (녹색 (FITC) 필터로 관찰함)을 함유하며, 여기서 각각의 슬라이드는 그의 박테리아 및/또는 처리 조건이 상이하다.
도 2는 (다른 슬라이와 비교시) 동일하게 처리된 염색 박테리아를 포함하는 2개의 상이한 슬라이드 (슬라이드 A 및 슬라이드 B)의 4개의 현미경 영상을 함유하며, 여기서 각각의 슬라이드는 상이한 박테리아를 함유한다. 각각의 슬라이드의 영상은 이중 대역 필터 (영상 A1 및 B1) 및 녹색 (FITC) 필터 (영상 A2 및 B2)를 사용하여 얻어졌다.
도 3은 염색 박테리아를 포함하는 단일 슬라이드의 3개의 현미경 영상을 함유하며, 여기서 각각의 영상은 슬라이드의 동일한 부분으로부터 취하였고, 녹색/적색 이중 대역 필터 (영상 A, FITC & 텍사스 레드 (Texas Red)), 청색 (DAPI) 필터 (영상 B) 또는 녹색 (FITC) 필터 (영상 C)를 사용하여 얻어졌다.
도 4는 2개의 현미경 영상을 함유한다. 영상 A에서는 신호 증폭이 없어 박테리아가 보이지 않는다. 영상 B에서는 신호 증폭이 있어 박테리아가 가시화된다.
이들로 한정되지는 않지만, 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 비롯한 본 출원에서 언급된 모든 문헌 및 유사 자료는 이러한 문헌 또는 유사 자료의 형식에 상관 없이 임의의 및 모든 목적을 위해 이들의 전문이 명백히 본원에 참고로 포함된다.
1. 분야
본 출원은 전세포 분석 분야에 관한 것이며, 일부 실시양태에서 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (staphylococcus aureus) (MRSA) 박테리아 및/또는 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS)의 분석에 관한 것이다.
2. 도입
임상 샘플 (예를 들어, 비강 또는 상처 스웝, 혈액 또는 요 샘플/배양물 등) 내 박테리아는 보통 표현형으로, 유전자형으로 또는 면역-기반 방법을 이용하여 확인된다. 특정 유형의 박테리아, 예컨대 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA)는 전세계적으로 병원에서 및 보다 최근에는 공동 사회에서 급속히 확산되고, 따라서 인간 건강에 심각한 위험성을 내포한다. 박테리아, 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스 (에스. 아우레우스) 내 메타실린 (및 모든 β-락탐 항생제)에 대한 내성은 페니실린-결합 단백질 2a (PBP2a, PBP2'로도 알려짐)를 코딩하는 mecA 유전자의 획득과 주로 연관된다. PBP2a 단백질은 박테리아 세포벽 합성에 관여한다 (문헌 [Pinho et al., "An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci", PNAS, 98(19): 10886-10891 (Sept. 2001)] 참조). MRSA의 신속하고 정확한 확인이 에스. 아우레우스에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료에 있어서 결정적인 것으로 고려된다.
표현형 검정은 종종 항생제의 존재 하에 유기체를 배양하고, 박테리아의 성장을 검사하는 것을 포함한다. 이러한 시험은 통상 결과를 얻기 위해 적어도 2일 (단리 1일 및 민감도 시험 1일)을 필요로 한다. 일부 표현형 특성 (예를 들어, MRSA의 약물 내성)은 복잡한 메카니즘을 통해 나타나며, 배양 조건 (염도, 온도, 접종원 크기 등)이 결과에 상당히 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우, 이는 진단을 지연시키거나, 심지어는 오진을 일으킬 수 있다.
PBP2a 단백질의 검출을 위한 면역-기반 방법이 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cavassini et al., "Evaluation of MRSA-Screen, a Simple Anti-PBP 2a Slide Latex Agglutination Kit, for Rapid Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus", J. Clinical Microbiology, 37(5): 1591-1594 (May, 1999)]). 이러한 세포- 무함유 검정은 세포-용해물의 샘플 내 PBP2a 단백질의 신속한 검출을 가능하게 하고, 이에 따라 샘플의 유기체의 적어도 일부의 메티실린-내성을 확인한다. 그러나, 상기 검정은 종종 배양물에서 성장시킨 유기체를 분석하는 데 이용되며 (이는 성장을 위해 1일 또는 2일이 요구됨), 매우 민감하지 않다 (신뢰성 있는 확인을 위해 대략 107개의 콜로니 형성 단위가 요구됨).
가장 신속하고 민감한 유전자형 확인 방법은 핵산 증폭 기술과 함께 박테리아의 핵산 분석을 이용한다. 예를 들어, 다수의 검정은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 표적 증폭 방법 (예를 들어, 리가제 연쇄 반응)을 이용한다. MRSA 검출을 위해 변형된 PCR 검정의 일부 예는 US 5,702,895 (마쯔나가 (Matsunaga) 등), 6,156,507 (히라마쯔 (Hiramatsu) 등) 및 7,074,599 (울 (Uhl) 등)에서 찾을 수 있다. 이러한 PCR 검정은 세포- 무함유 검정이다. MRSA 및 MSSA를 결정하기 위한 PCR 검정은 또한 문헌 [Groebner et al., "Evaluation of the BD GeneOhm StaphSR Assay for Detection of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Isolates from Spiked Positive Blood Culture Bottles", J. Clin. Microbiol., 47(6): 1689-1694 (2009)]에서 발견된다.
세포-무함유 검정의 한가지 단점은 박테리아 확인시 종종 유용한 세포 형태의 손실이다. 세포-무함유 검정은 또한 유기체의 혼합 집단을 결정하는 데 있어서 덜 유용할 수 있다 (또는 적어도 이를 결정하기 위해 보다 복잡한 고안을 필요로 함) (혼합 집단 결정을 위한 PCR 검정의 결함의 논의에 대해서는 문헌 [Groebner et al. (2009) at 1691. col. 1, second paragraph under the heading: "Analysis of blood culture bottles spiked with mixtures of staphylococcal isolates"]을 참조함). 형태의 보존 뿐만 아니라, 샘플 내 박테리아의 혼합 집단을 보다 용이하게 확인하고/거나 혼합 진단으로 인한 위양성 결과의 잠재적인 위험을 없애기 위한 한가지 방법은 전세포 분석, 예컨대 계내 (세포 내부) 분석을 수행하는 것이다.
전세포 분석으로 박테리아 내부의 형질 (예컨대, 메티실린-내성)을 결정하기 위해서, 박테리아의 염색체 데옥시리보핵산 (DNA), mRNA 또는 세포 단백질을 통상 분석한다. 일부 형질은 또한 천연 플라스미드와 관련된다. 본원에 개시된 발명은 세포 단백질의 분석에 따른 형질 결정에 관한 것은 아니다.
진핵 세포 내 mRNA의 계내 혼성화 (in-situ hybridization; ISH) 분석에 관한 많은 보고서가 존재하지만, 박테리아 내 mRNA 또는 염색체 DNA의 ISH-기반 분석에 관한 보고서는 별로 없는 것으로 보인다. 적어도 일부 이들의 세포벽의 특성으로 인해 그람-양성 박테리아의 ISH-기반 분석은 특히 문제가 있는 것으로 입증되었다 (예를 들어, 문헌 [Furakawa et al., "Comprehensive Analysis of Cell Wall-Permeabilizing Conditions for Highly Sensitive Fluorescence In Situ Hybridization", Microbes Environ., 21(4): 227-234 (2006)] 참조). 게다가, mRNA 및 염색체 DNA의 ISH-기반 분석은 또한 박테리아 내부 mRNA의 적은 카피수 및 불안정성에 의해 복잡하게 된다 (예를 들어, 문헌 [Coleman et al., "mRNA-targeted fluorescent in-situ hybridization (FISH) of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification", J. Microbiological Methods, 71: 246-255 (2007)]의 도입부 참조).
그람-양성 박테리아 내 mRNA의 성공적인 ISH-기반 분석에 관한 보고서가 적어도 3개는 존재한다 (문헌 [Hahn et al., "Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes", Applied and Environmental Microbiology, 59(8): 2753-2757 (Aug. 1993)]; [Wagner et al., "In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria", FEMS Microbiol. Lett, 160(1): 159-168 (Mar. 1998)]; 및 [Hoenerlage et al., "Detection of mRNA of nprM in Bacillus megaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization", Arch. Microbiol., 163: 235-241 (1995)] 참조).
한 (Hahn) 등의 문헌에서, 스트렙토마이세스 비올라셀라투스 (Streptomyces violacelatus) (에스. 비올라셀라투스) 박테리아를, 표적이 될 티오스트렙톤 내성 (tsr) 유전자 (리보솜 RNA (rRNA) 및 메신저 RNA (mRNA; mRNA는 삽입된 플라스미드에 의해 많은 카피수로 생성됨) 둘 다 가능함)를 포함하는 삽입된 플라스미드 (플라스미드 pIJ673)를 함유하도록 조작하였다 (초록) (2753면, 컬럼 2 참조). 따라서, 상기 박테리아는 자연 발생하지 않았다. 그러나, 천연 박테리아 (즉, 플라스미드가 삽입되지 않은 박테리아)는 임의의 혼성화 신호를 나타내지 않았다 (2755-2756면, 연결 단락 참조). 샘플을 효소 처리하여 그람-양성 박테리아를 투과화하였다. mRNA-지정된 프로브와의 혼성화 반응을 16시간에 걸쳐 수행하였다 (2754면, 컬럼 2, 하단 참조). 플라스미드의 사용에 의한 박테리아의 mRNA 함량의 증가 이외에 신호 증폭이 여전히 필요하였다는 점이 또한 주목할 만하다. 구체적으로, (프로브 당) 다수의 디곡시게닌 표지와의 상호작용을 통해 전사 프로브에 연결된 항-디곡시게닌 항체에 접합된 알칼리 포스파타제의 활성에 의해 생성되는 수-불용성 염료를 사용하여 ISH 분석용 세포를 염색하였다 (2754-2755면, 연결 단락 참조).
유사하게, 와그너 (Wagner) 등의 문헌에서, 세포벽의 효소 소화를 수행하여 박테리아를 투과화하였다. 또한, 4개의 단일 표지된 iap-mRNA-지정된 프로브를 사용하여 mRNA 표적을 검출하려는 시도, 및 매우 밝은 형광 염료는 성공하지 못하였다는 점이 주목할 만한다 (166면, 컬럼 1-2, 연결 단락 참조). 또한, 플루오레세인 티라미드와 함께 단일 (호스래디쉬 퍼옥시다제) 효소 표지된 프로브를 사용하여 mRNA 표적을 검출하려는 시도 (신호 증폭 기술)는 만족스럽지 못한 것으로 입증되었다 (166-167면 참조). 그러나, 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시게닌 항체 단편과 결합하는 다수의 디곡시게닌 표지를 포함한 전사 프로브 (신호 증폭 기술)를 사용하여, 플루오레세인 티라미드의 촉매 침착을 통해 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes) 세포 내 iap (칩입 관련 단백질)-mRNA를 검출하였다 (초록 및 167면 참조). 디곡시게닌-표지된 mRNA-지정된 프로브와의 혼성화 반응을 5시간에 걸쳐 수행하였다 (162면, 컬럼 2, 마지막 단락 참조).
외너라게 (Hoenerlage) 등의 문헌에서도 또한, 바실루스 메가테륨 (Bacillus megaterium)을 효소 처리하여 박테리아를 투과화하였다 (237면, 컬럼 1, "전세포 혼성화"의 제목 참조). 또한, 알칼리 포스파타제에 접합된 항-디곡시게닌 항체 단편과 결합하는 다수의 디곡시게닌 표지를 포함한 전사 프로브 (236면 컬럼 2 "프로브" 참조) (신호 증폭 기술)를 (니트로블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트와 함께) 사용하여 세포를 염색하고 바실루스 메가테륨 내 nprM의 mRNA를 검출하였다. 전사 프로브와의 혼성화를 16시간 동안 수행하였다.
상기로부터, 그람-양성 박테리아 내 mRNA의 성공적인 분석을 위해 한 등, 와그너 등 및 외너라게 등은 모두 다음을 이용하였음이 명백하다: 1) 박테리아 세포를 투과화하기 위한 효소 처리; 2) 다수의 디곡시게닌 표지를 갖는 (통상 긴 (즉, 100bp 초과 길이의)) 전사 프로브; 3) 효소-기반 신호 증폭 기술에 의한 상기 다수의 디곡시게닌 표지의 간접 검출; 및 4) 상당히 긴 프로브 혼성화 단계 (즉 5-16시간).
다수의 표지를 포함하는 표지된 전사 프로브의 간접적 검출의 이용 및/또는 증폭 기술 (예를 들어, 신호 증폭 및/또는 계내 핵산 증폭, 예컨대 계내 PCR)의 이용 없이 그람-양성 박테리아의 전세포 내 mRNA의 명백한 검출에 관한 문헌 기록은 전혀 없는 것으로 보인다. 게다가, 스타필로코쿠스 박테리아의 전세포 내 mRNA의 검출에 관한 보고서도 전혀 없는 것으로 보인다. 과학 문헌 내 이러한 명백한 과오는 적어도 부분적으로, 박테리아 내 mRNA (및 또한 염색체 DNA)의 적은 카피수 및 그의 불안정성, 및 또한 전세포 (예를 들어, ISH 및 형광 계내 혼성화 (FISH)) 분석 기술을 복잡하게 하는 그람-양성 박테리아의 세포벽의 투과화와 관련된 어려움 때문일 수 있다.
3. 정의
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위를 설명하기 위해서 하기 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함할 것이며, 그 반대의 경우도 가능하다. 하기 제시된 임의의 정의가 임의의 다른 문헌 내 용어의 사용과 상충하는 경우, 하기 제시된 정의는 항상 본 명세서 및 그의 관련 특허청구범위의 범주 및 취지를 설명하기 위해 관리되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 본원에 참고로 포함된 임의의 문헌의 범주 및 의미는 하기 제시된 정의에 의해 변경되지 않아야 한다. 오히려, 상기 본원에 포함된 문헌은 여기서 제공된 기재 내용과 관련한 그의 내용 및 개시물에 기초하여 통상의 개업의에 의해 해석되는 바와 같이 해석되어야 한다.
"또는"의 사용은, 달리 언급되거나 "및/또는"의 사용이 명백히 부적합하지 않은 한 "및/또는"을 의미한다. "a"의 사용은, 달리 언급되거나 "하나 이상"의 사용이 명백히 부적합하지 않은 한 "하나 이상"을 의미한다. "포함하다", "포함하고 있다", "포함하는", "포함된다", "포함되고 있다" 및 "비롯한"의 사용은 상호교환적이며, 제한하고자 하지 않는다. 게다가, 하나 이상의 실시양태의 기재가 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정 예에서 실시양태 또는 실시양태들을 다르게는 용어 "~로 본질적으로 이루어진" 및/또는 "~로 이루어진"을 사용하여 기재할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 "항체"는 항체/항원 결합 상호작용(들)에 참여할 수 있는 이뮤노글로불린 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체를 지칭한다. 항체, 그의 단편, 항체/항체 단편의 검출 방법 및 관련 주제의 기술적 특징의 논의는 문헌 [Pierce Catalog and Handbook, 1994 (Section T)]에서 찾아볼 수 있다. 항체에는, 예를 들어 이뮤노글로불린의 각종 부류 및 이소형, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM이 포함된다. 항체 단편에는 Fab, scFv, F(ab')2 및 Fab' 분자와 같은 분자들이 포함된다. 항체 유도체에는 부가 또는 치환을 갖는 항체 또는 그의 단편, 예컨대 키메라 항체가 포함된다. 항체는 인간 또는 동물 공급원으로부터, 하이브리도마로부터, 재조합 방법을 통해 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방식으로 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 "세포 투과화 시약 또는 시약들"은, 박테리아 세포를 처리하여 세포벽/외막을 변형시킴으로써 다른 분석 시약 (예를 들어, 프로브, 검출기 시약, 항체 등)이 상기 박테리아 세포를 투과 (및 이로써 진입) 할 수 있게 하는 데 사용되는 하나의 시약, 둘 이상의 시약, 시약의 혼합물 또는 제제를 지칭한다. 세포 투과화 시약으로 사용될 수 있는 효소의 일부 예에는 리소스타핀, 리소자임 및 프로테이나제 (예를 들어, 프로테이나제-K 및/또는 아크로모펩티다제)와 같은 효소가 포함된다. 하나 초과의 시약을 사용하여 박테리아 세포를 투과화하는 경우, 투과화 시약은 순차적으로, 동시에, 또는 일부 시약의 순차적 첨가 및 일부 시약의 동시 첨가의 조합으로 첨가될 수 있다. 요컨대, 박테리아 세포를 충분히 투과화하는 한, 시약 또는 시약들과 박테리아를 접촉시키는 방식에 제한은 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시켜 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "키메라"는 2개 이상의 상이한 소단위 부류의 소단위를 포함하는 올리고머를 지칭한다. 예를 들어, 키메라는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 잠금 핵산 (LNA)의 소단위를 포함할 수 있거나, DNA 및 리보핵산 (RNA)의 소단위를 포함할 수 있거나, DNA 및 펩티드 핵산 (PNA)의 소단위를 포함할 수 있거나, DNA, LNA 및 PNA의 소단위를 포함할 수 있거나, 또는 RNA 및 LNA의 소단위 등을 포함할 수 있다. "LNA 프로브"는 일반적으로 단 하나의 또는 소수의 LNA 뉴클레오티드를 올리고머에 혼입하므로, 문헌에서 LNA 프로브로 언급되는 것은 (상기 정의에 따라) 통상 키메라인 것으로 이해되어야 한다. 나머지 뉴클레오티드는 통상 표준 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 "염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들"은 각각 하나 이상의 표지들로 표지된 프로브 또는 프로브들을 지칭하며 (일부 실시양태에서, 프로브 또는 프로브들은 단 하나의 표지만을 포함할 것임), 여기서 상기 프로브 또는 프로브들은 검정에서 결정하고자 하는 박테리아 (예를 들어, 선택적 그람-양성 박테리아)의 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드 내 표적과 높은 정도의 특이성으로 결합하는 것으로 선택된다. 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드 표적은 검정에서 결정하고자 하는 선택적 형질을 코딩하므로 (및/또는 이와 관련되므로) 선택된다.
본원에서 사용된 "결정하는"은 조사, 데이터, 이론 및/또는 계산에 기초하여 결정하는 것을 지칭한다. 결정의 일부 예에는, 적절한 경우 본원의 용어의 맥락/사용에 기초하여 (박테리아 및/또는 형질의) 검출, 확인 및/또는 위치 결정이 포함된다.
본원에서 사용된 "고정화"는 세포 핵산 (DNA 및 RNA) 완전성 및 세포 형태가 실질적으로 유지되는 표본 보존 및/또는 멸균을 지칭한다. 고정화는 하나 이상의 고정화제(들)을 함유하는 하나 이상의 용액을 사용하여 화학적으로, 및/또는 기계적으로, 예컨대 현미경 슬라이드 상에서 도말 제조, 및 이어서 상기 슬라이드를 화염에 통과시키거나 슬라이드를 히트 블록 (heat block) 상에 두어 도말을 가열함으로써 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "고정화 시약 또는 시약들"은, 박테리아 세포를 처리하여 이에 의해 상기 박테리아 세포를 현미경 분석용으로 보존하고/거나 제조하는 하나의 시약, 둘 이상의 시약, 시약의 혼합물, 제제 또는 심지어는 방법 (시약(들) (혼합물(들) 또는 제제(들) 포함)을 관련하여 사용하거나 사용하지 않음)을 지칭한다. 고정화 시약의 예에는 파라포름알데히드, 글루테르알데히드, 메탄올 및 에탄올이 포함된다. 하나 초과의 시약을 사용하여 박테리아를 고정하는 경우, 시약은 순차적으로, 동시에, 또는 순차적으로 첨가될 일부 시약과 동시에 첨가될 일부 시약의 조합으로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 고정화 시약 또는 시약과 접촉시켜 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "불균일" 및 "균일"은 박테리아의 균주와 관련하여 사용되며, 이는 동일한 균주의 일부 또는 모든 박테리아가 선택적 형질의 발현 (또는 동일한 정도의 발현)을 나타내는지 여부를 지칭한다. 특히, 균일 균주의 박테리아는 상기 형질의 발현 (또는 대략 동일한 정도의 발현)을 나타내는 반면에, 불균일 균주는 그렇지 않다.
본원에서 사용된 "전체적으로"는 단편적이기 보다는 전체적으로 관련 내용을 고려하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 "표지"는 조성물 (예를 들어, 혼성화 프로브)을 기기 및/또는 방법에 의해 검출가능하게 하는 조성물의 구조적 단위 (또는 가능한 경우 구조적 단위들)를 지칭한다. 표지의 비제한적인 예에는 형광단, 발색단, 햅텐, 방사성동위원소 및 양자점이 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 중 2개 이상을 조합 사용하여 조성물을 검출가능하게 또는 독립적으로 (독특하게) 검출가능하게 할 수 있다. "표지"와 동일한 의미의 (즉, 상호교환가능한) 일부 용어는 "검출가능한 잔기", "태그" 및 "마커"이다.
본원에서 사용된 "mRNA 유도 시약 또는 시약들"은, (예를 들어, 배양물 내) 살아있는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아와 접촉시 박테리아가 mRNA를 생성하도록 유도하여 상기 박테리아 세포 내 mRNA의 농도를 증가시키는 하나의 시약, 둘 이상의 시약, 시약의 혼합물 또는 제제를 지칭한다. 박테리아 내 mRNA의 농도가 증가함에 따라, 전세포 검정에서 프로브/mRNA 복합체 (및 박테리아의 관련 염색)의 형성 및 이에 따른 결정이 잠재적으로 증가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉시켜 수행될 수 있다. "mRNA 유도 시약 또는 시약들"의 예는 항생제이다.
본원에서 사용된 "혼합 집단"은 둘 이상의 상이한 박테리아 균주의 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용된 "천연 플라스미드"는 천연 상태의 박테리아 (즉, 박테리아가 환경 및/또는 천연 공급원 (예를 들어, 숙주 유기체, 예컨대 인간)으로부터 수득된 바와 같음) 내에 존재하는 플라스미드를 지칭한다. 천연 플라스미드는 인간의 개입/조작에 의해 박테리아에 계획적으로 삽입된 플라스미드 (예를 들어, 문헌 [Hahn et al., Applied and Environmental Microbiology, 59(8): 2753-2757 (Aug. 1993)]에 기재된 바와 같은, 삽입된 플라스미드를 갖는 조작된 에스. 비올라셀라투스 박테리아 참조)와 구분되어야 한다.
본원에서 사용된 "핵산"은 핵염기, 리보스 또는 2'-데옥시리보스 당, 및 포스페이트 기로 이루어진 뉴클레오티드 소단위로부터 형성된 핵염기 함유 중합체를 지칭한다. 핵산의 일부 예는 DNA 및 RNA이다.
본원에서 사용된 "핵산 유사체"는, 핵염기, 및 리보스 또는 2'-데옥시리보스가 아닌 당 잔기, 및/또는 포스페이트 기가 아닌 (당 단위 사이의) 연결기를 포함하는 소단위로부터 형성된 핵염기 함유 중합체를 지칭한다. 핵산 유사체의 비제한적인 예는 잠금 핵산 (LNA: 예를 들어, US 6,043,060, 7,053,199, 7,217,805 및 7,427,672 참조)이다. LNA의 화학적 특성의 요약에 대해서는 문헌 [Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules", Chapter 7, "Chemistry of Locked Nucleic Acids (LNA)", Springer Science & Business, 2006]을 참조한다.
본원에서 사용된 "핵산 모방체"는, 핵염기, 및 당 잔기가 아니지만 (또는 당 잔기를 포함하지만) 그럼에도 불구하고 핵산과 서열 특이적으로 결합할 수 있는 주쇄 구조를 포함하는 소단위로부터 형성된 핵염기 함유 중합체를 지칭한다. 핵산 모방체의 예는 펩티드 핵산 (PNA: 예를 들어, 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,718,262, 5,736,336, 5,773,571, 5,766,855, 5,786,461, 5,837,459, 5,891,625, 5,972,610, 5,986,053, 6,107,470, WO92/20702 및 WO92/20703 참조)이다. 핵산 모방체의 또다른 예는 모르폴리노 올리고머이다. PNA과 모르폴리노의 차이의 논의에 대해서는 문헌 [Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules", Chapter 6, "Morpholinos and PNAs Compared", Springer Science & Business, 2006]을 참조한다. 핵산 모방체의 추가 예는 피롤리디닐 폴리아미드 (PP)이다. PP는 미국 특허 6,403,763, 6,713,603, 6,716,961 및 7,098,321, 및 또한 문헌 [Vilaivan et al., "Hybridization of Pyrrolidinyl Peptide Nucleic Acids and DNA: Selectivity, Base-Pairing Specificity and Direction of Binding", Organic Letters, 8(9): 1897-1900 (2006)]에 기재된 바와 같이 핵염기 및 폴리아미드 주쇄를 포함하는 올리고머 중합체이다.
본원에서 사용된 "핵염기"는 핵산과 서열 특이적으로 결합할 수 있는 중합체를 생성하는 것으로 통상 공지된 천연 발생 및 비-천연 발생 헤테로시클릭 잔기를 지칭한다. 적합한 핵염기의 비제한적인 예에는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 5-프로피닐-우라실, 2-티오-5-프로피닐-우라실, 5-메틸시토신, 슈도이소시토신, 2-티오우라실 및 2-티오티민, 2-아미노퓨린, N9-(2-아미노-6-클로로퓨린), N9-(2,6-디아미노퓨린), 하이포크산틴, N9-(7-데아자-구아닌), N9-(7-데아자-8-아자-구아닌) 및 N8-(7-데아자-8-아자-아데닌)이 포함된다. 적합한 핵염기의 다른 비제한적인 예에는 부차트 (Buchardt) 등 (WO92/20702 또는 WO92/20703)의 도 2(A) 및 2(B)에 예시된 핵염기가 포함된다.
본원에서 사용된 "하나 이상의 프로브/염색체 DNA, 프로브/mRNA 및/또는 프로브/플라스미드 복합체"는 1) 프로브 또는 프로브들과 샘플의 박테리아 세포 또는 세포들의 염색체 DNA의 분자 또는 분자들 내 표적의 결합; 2) 프로브 또는 프로브들과 샘플의 박테리아 세포 또는 세포들의 mRNA의 분자 또는 분자들 내 표적의 결합; 및/또는 3) 프로브 또는 프로브들과 샘플의 박테리아 세포 또는 세포들의 천연 플라스미드의 핵산의 분자 또는 분자들 내 표적의 결합에 의해 형성된 복합체 또는 복합체들을 지칭한다. 전형적으로, 프로브/염색체 DNA, 프로브/mRNA 및/또는 프로브/플라스미드 복합체 또는 복합체의 형성은 본원에서 샘플의 박테리아 내부의 선택적 형질을 결정하는 데 사용된다.
본원에서 사용된 "하나 이상의 프로브/rRNA 복합체"는 프로브 또는 프로브들 (예를 들어, 혼성화 프로브 또는 프로브들)과 샘플의 박테리아 세포 또는 세포들의 rRNA의 결합에 의해 형성된 복합체 또는 복합체들을 지칭한다. 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들의 형성은 본원에서 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정하는 데 사용될 수 있다. 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들의 형성은 또한 본원에서 샘플 내 다른 박테리아가 그람-양성인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "하나 이상의 제2 프로브/rRNA 복합체"는 제2 프로브 또는 제2 프로브들 (즉, 먼저 언급된 임의의 프로브 또는 프로브들과 상이한 프로브)과 샘플의 박테리아 세포 또는 세포들의 rRNA 분자 또는 분자들 내 표적의 결합에 의해 형성된 복합체 또는 복합체들을 지칭한다. 전형적으로, 제2 프로브/rRNA 복합체의 형성은 본원에서 샘플 내 또다른 (또는 제2) 선택적 그람-양성 박테리아 또는 또다른 박테리아 (예를 들어, 그람-음성 박테리아)를 결정하는 데 사용된다. (관심 박테리아의) rRNA에 대해 지정된 제3, 제4, 제5, 제6 (등) 프로브가 본원에 기재된 임의의 검정 방법에서 사용될 수 있으며, 여기서 rRNA에 대해 지정된 각각의 상이한 프로브는 샘플 내에 존재할 수 있는 다양한 선택적 박테리아 (이들 중 일부는 그람-양성 박테리아가 아닐 수 있음)를 결정하기 위해 선택될 수 있음을 이해해야 한다. 종종 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 (등) 프로브는 각각 방법의 수행에서 사용되는 다른 프로브로부터 독립적으로 검출가능므로, 본 방법은 멀티플렉스 방법으로서 수행된다. 또한, 제3 프로브가 제3 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들을 형성하고, 제4 프로브가 제4 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들을 형성하고, 제5 프로브가 제5 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들을 형성하며, 제6 프로브가 제6 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들을 형성하는 것 등을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 "하나 이상의 세척 시약"은 샘플 및/또는 샘플의 박테리아 세포로부터 다양한 시약 및/또는 조성물을 제거하는 데 사용되는 하나의 시약, 둘 이상의 시약, 시약의 혼합물 또는 제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 하나 이상의 세척 시약과 접촉시키는 것에 관한 하나 이상의 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "전-혼성화 단계"는 샘플을 혼성화 프로브 또는 프로브들을 함유한 혼성화 완충액으로 처리 (예를 들어, 접촉)하기 전에 일정 기간 동안 샘플을 혼성화 프로브 또는 프로브들이 없는 혼성화 완충액으로 처리 (예를 들어, 접촉)하는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 전-혼성화 단계와 함께 또는 전-혼성화 단계 없이 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "프로브" 또는 "혼성화 프로브"는 선택적 표적과 결합하는 조성물을 지칭한다. "혼성화 프로브"는 혼성화에 의해 그의 각각의 표적과 결합하는 프로브이다. 프로브의 비제한적인 예에는 핵산 올리고머 (예를 들어, DNA, RNA 등), 핵산 유사체 올리고머 (예를 들어, 잠금 핵산 (LNA)), 핵산 모방체 올리고머 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA)), 키메라, 항체 및 항체 단편이 포함된다.
본원에서 사용된 "양자점"은 직경이 약 1 nm 내지 약 1000 nm 사이 또는 이들 사이의 임의의 정수 또는 정수의 분수, 일반적으로 약 2 nm 내지 약 50 nm 사이 또는 이들 사이의 임의의 정수 또는 정수의 분수, 보다 전형적으로 약 2 nm 내지 약 20 nm (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 nm)인 무기 결정질을 지칭한다. 반도체 나노결정은 여기시에 전자기 방사선을 방출할 수 있고 (즉, 반도체 나노결정은 발광성임), 하나 이상의 제1 반도체 물질의 "코어"를 포함하고, 제2 반도체 물질의 "쉘"로 둘러싸일 수 있다. 반도체 쉘에 의해 둘러싸인 반도체 나노결정 코어를 "코어/쉘" 반도체 나노결정이라 칭한다. 둘러싼 "쉘" 물질은 전형적으로 코어 물질의 밴드갭 (bandgap) 에너지보다 더 큰 밴드갭 에너지를 가지며, "코어" 기재의 원자 간격과 유사한 원자 간격을 갖도록 선택될 수 있다. 코어 및/또는 쉘은, 이들로 한정되지는 않지만, II-VI족 (ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe 등) 및 III-V족 (GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb 등) 및 IV족 (Ge, Si 등) 물질, 및 이들의 합금 또는 혼합물을 비롯한 반도체 물질일 수 있다. 과학 및 특허 문헌에서, 용어 "반도체 나노결정", "양자점", "Qdot™ 나노결정" 또는 간단히 "나노결정"은 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서의 목적을 위해, 이들 용어는 또한 상기 정의된 "양자점"의 동등물이다.
본원에서 사용된 "rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들"은 rRNA의 분자 또는 분자들 내부의 표적 또는 표적들과 결합하도록 선택된 프로브 또는 프로브들을 지칭한다. rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은 검출가능한 잔기 또는 잔기들로 표지될 수 있거나, 또는 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 경우, rRNA 프로브와 박테리아 내부의 그의 표적과의 결합에 의해 형성된 복합체는, 예를 들어 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들에 대한 표지 항체를 사용하여 검출될 수 있다 (예를 들어, 힐디그-닐슨 (Hyldig-Nielsen)의 미국 특허 5,612,458 참조).
전형적으로, rRNA 표적을 샘플 내 박테리아 간에 구별되도록 선택하여, 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 (또는 다른 박테리아)의 결정을 가능하게 한다. 샘플 내 박테리아 간에 구별되는 (및 이로써 박테리아를 결정하는) 박테리아의 rRNA 내부의 표적에 대해 지정된 프로브가 ISH 및 FISH-기반 검정에서 오랫동안 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Amann, R., "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization", Bioscience Microflora, 19(2): 85-91 (2000)] 및 [Pernthaler et al., "Fluorescence in situ Hybridization (FISH) with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes", Methods in Microbiology, 30: 207-226 (2001)] 참조). FISH에서의 rRNA-지정된 PNA 및 LNA 프로브의 사용에 대해서는 문헌 [Cerqueira et al., "DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)", Int. J. Mol. Sci., 9: 1944-1960 (2008)]을 참조한다. 혈액 샘플 내 스타필로코쿠스의 결정을 위한 rRNA-지정된 PNA 프로브의 사용에 대해서는 문헌 [Forrest et al., "Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58: 154-158 (2006)]을 참조한다.
본원에서 사용된 "제2 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들"은 rRNA의 분자 또는 분자들 내부의 상이한 (즉, 제2) 표적 또는 표적들과 선택적으로 결합하는 제2 프로브 또는 프로브들을 지칭한다. 제2 rRNA 표적은 검정에서 사용된 또다른 (제1) 프로브 또는 프로브들과 같이 동일한 박테리아에 존재할 수 있지만, 보다 전형적으로 제2 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은, 제2 프로브/rRNA 복합체 또는 복합체들의 형성 및 결정이 샘플 내 제2 (상이한) 선택적 박테리아를 결정하는 데 사용될 수 있도록 상이한 관심 박테리아 내 표적에 대해 지정될 것이다. 제2 선택적 박테리아는 그람-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아일 것이다.
본원에서 사용된 "선택적 그람-양성 박테리아"는 본원에 기재된 방법의 수행에 의해 결정될 수 있는 관심 박테리아 (예를 들어, 본원에 개시된 방법의 수행에 의해 결정하고자 하는 그람-양성 박테리아)를 지칭한다. 전형적으로, 그람-양성 박테리아는 선택적 형질을 가질 수 있으므로, 분석을 위해 선택된다. 예를 들어, 선택적 형질은 임상적 의의가 될 수 있다. 선택적 그람-양성 박테리아는, 예를 들어 특정 종, 하위 종 또는 속일 수 있다. 선택적 그람-양성 박테리아는, 예를 들어 또한 공인된 군, 예컨대 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (CNS) 또는 그람-양성 구균일 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택적 그람-양성 박테리아는 에스. 아우레우스이고, 선택적 형질은 메티실린-내성이다.
본원에서 사용된 "선택적 형질"은 본원에 기재된 방법의 수행에 의해 결정될 관심 형질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 형질은 메티실린-내성이다.
본원에서 사용된 "신호 증폭"은 프로브와 (직접 또는 간접) 연결된 표지 또는 표지들과 관련하여 논의되며, 이는 프로브와 연결된 각각의 표지에 대한 둘 이상의 요인에 의해 신호를 증폭시키는 특이적 검출 방법의 이용을 지칭한다. 신호 증폭은 종종 (필수적이지는 않지만) 효소의 사용을 포함한다. 신호 증폭의 일부 비제한적인 예에는 티라미드 신호 증폭 (TSA, 촉매 리포터 침착법 (CARD)으로도 알려져 있음), 효소 표지된 형광 (ELF-97 - 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 이용가능한 제품 및 정보), 분지형 DNA (bDNA) 신호 증폭 (문헌 [Collins et al., "A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml", Nucl. Acids Res., 25(15): 2979-2984 (1997)] 및 [Zheng et al., "Direct mecA Detection from Blood Culture Bottles by Branched-DNA Signal Amplification", J. Clin. Microbiol., 37(12): 4192-4193 (1999)] 참조), 및 회전-환형 증폭 (rolling-circle amplification; RCA - 문헌 [Maruyama et al., "Visualization and Enumeration of Bacteria Carrying a Specific Gene Sequence by In Situ Rolling Circle Amplification", Applied and Environmental Microbiology, 71(12): 7933-7940 (Dec. 2005)] 및 [Smolin et al., "Detection of Low-Copy-Number Genomic DNA Sequences in Individual Bacterial Cells by Using Peptide Nucleic Acid-Assisted Rolling-Circle Amplification and Fluorescence In Situ Hybridization", Applied and Environmental Microbiology, 73(7): 2324-2328 (2007)] 참조)이 포함된다.
본원에서 사용된 "염색된"은 박테리아 세포를 검출을 위해 표지 또는 표지들로 직접 또는 간접적으로 표시하는 것을 의미한다. 예를 들어, US 6,664,045 (특히, (US 6,664,045의) 도 3 및 컬럼 24-25의 실시예 10에서의 이와 관련한 논의)에 기재된 바와 같이, 박테리아를 하나 이상의 형광 표지된 혼성화 프로브로 염색하여, 박테리아 세포 또는 세포들이 예를 들어 형광 현미경의 사용에 의해 검출될 수 있도록 할 수 있다. US 6,664,045의 도 3의 여러 패널에서 명백한 바와 같이, 샘플의 상이한 박테리아를 독립적으로 검출가능한 표지 (또는 독립적인 표지의 조합)로 염색하여, 샘플 내 상이한 유형의 박테리아가, 예를 들어 상이한 색상을 나타내도록 (또는 다르게는 다른 검출가능한 특성을 갖도록) 할 수 있다. US 6,664,045의 도 3과 구체적으로 관련하여, 에스. 아우레우스 박테리아는 적색 염색 (단독)으로 특성화되고, 이. 콜라이 (E. coli)는 녹색 및 적색 염색으로 특성화되고, 피. 에어루기노사 (P. aeruginosa)는 녹색 염색 (단독)으로 특성화되며, 에스. 티피무리움 (S. typimurium)은 청색 염색으로 특성화된다. 따라서, 상이한 rRNA 지정된 표지된 프로브를 사용하고, 각각의 상이한 박테리아에 대한 프로브를 독특한 표지 또는 표지들의 조합물로 표지함으로써 US 6,664,045의 도 3에서 4종의 상이한 박테리아가 결정된다. 본 출원의 도 2 및 3도 또한 독특한 독립적으로 검출가능한 (형광) 염색을 포함하는 상이한 유형의 박테리아를 나타낸다.
본원에서 사용된 "표적" 또는 "선택적 표적"은 상호교환적이며, 박테리아의 분자 (또는 분자의 일부, 예컨대 선택적 핵산 서열), 예컨대 rRNA, mRNA, 염색체 DNA, 플라스미드 DNA 또는 항원을 지칭하고, 프로브는 이들과 특이적으로 결합하도록 고안된다.
본원에서 사용된 "형질"은 상기 박테리아의 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드 DNA의 분석에 의해 결정될 수 있는 박테리아의 임의의 특질 또는 특성을 지칭한다. 이러한 한 형질의 예는 메티실린-내성이다. 상기 형질은 mecA 유전자 (즉, 염색체 DNA) 및 상기 유전자의 발현 (예를 들어, 상기 유전자로부터 mRNA의 생성)에 의존적이다.
본원에서 사용된 "프로브가 표적과 결합하기에 적합한 조건 하"는 프로브가 그의 각각의 표적과 특이적 방식으로 결합하여 프로브와 비-표적 잔기의 비-특이적 결합을 최소화하거나 없애는 조건을 지칭한다. 또한, (본 명세서의 상기 및 그 밖의 임의의 부분에서) 선행 기재를 나타내고/알리는 "본"은 적절한 경우 "상기"로 대체될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 어구 "독특하게 확인가능한"은 2개 이상의 관심 조건이 구분가능한 상황과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 2종 이상의 박테리아를 포함하는 샘플에서, 한 박테리아는 적색 형광 마커를 포함할 수 있고, 또다른 박테리아는 녹색 형광 마커를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 2종의 박테리아는 현미경을 사용하여 구분가능하므로, 이러한 2종의 박테리아는 예를 들어 적절히 설비를 갖춘 현미경 (예를 들어, 상기 논의된 US 6,664,045의 도 3 참조)을 사용하여 "독특하게 확인가능"하다 (즉, 독특하게 염색됨).
박테리아는 형태와 같은 다른 이유로 독특하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 박테리아의 한 유형은 막대형이고, 나머지는 구균일 수 있다. 일부 실시양태에서, 색상 및 모양을 이용하여 샘플 내 독특하게 확인가능한 박테리아를 구분/결정할 수 있다.
본원에서 사용된 "전세포"는 형태학상 인식가능한 형태의 세포 (예를 들어, 박테리아)를 지칭한다. 세포가 투과화되었을 때 세포 구성 요소를 "누출한다"는 것이 널리 공지된 바와 같이 (문헌 [Hoshino et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(16): 5068-5077 (2008) at page 5074, col. 1] 및 [Maruyama et al., Applied and Environmental Microbiology, 71(12): 7933-7940 (Dec. 2005) at page 7937, col. 1] 참조), "전세포"는 세포가 그의 원래 성분을 모두 포함하는 것을 의미하고자 하지 않는다. 이러한 "누출"은 누출된 세포를 이용하여 수행된 검정이 본원에서 논의된 전세포 검정이 아님을 의미하지 않는다. 오히려, "전세포"는 그의 형태학상 인식가능한 형태를 보유한 실질적으로 무손상인 세포를 지칭하고자 한다. 예를 들어, 구균은 구형인 반면에 다른 박테리아는 막대형일 수 있다.
본원에서 사용된 "박테리아 내부" 또는 "상기 박테리아 내부"는 전체 (무손상) 박테리아의 임의의 구조 (여러 구조 포함), 예컨대 외막, 핵막, 세포벽, 세포질 및/또는 핵의 내부를 지칭한다. 예를 들어, 샘플의 박테리아 내부의 하나 이상의 프로브/rRNA 복합체의 형성은 상기 박테리아의 외막, 핵막, 세포벽 및/또는 핵 내부의 하나 이상의 프로브/rRNA 복합체의 형성을 지칭할 수 있다. 유사하게, 프로브/rRNA 복합체(들)은 세포질에서 형성될 수 있고, 이들의 존재를 이용하여 샘플 내 다른 박테리아로부터 선택적 그람-양성 박테리아 (예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스)를 결정할 수 있다 (예를 들어, 도 3 및 실시예 3의 도 3의 논의 참조). 그러나, 본원에서 사용된 "박테리아 내부"는 또한 적절한 경우 무손상 박테리아의 외부 표면과 접촉하는 구조를 포함하고자 한다. 예를 들어, "박테리아 내부"는 또한, 예를 들어 (예를 들어, 표면 단백질과의 결합의 결과로서) 박테리아의 외부 표면과 연결된 항체 프로브를 포함하고자 하며, 여기서 상기 항체 프로브는 예를 들어 샘플 내 선택적 박테리아를 결정하는 데 사용된다.
4. 일반 사항
이 "일반 사항" 단락에서 하기 설명하는 논의는 본원에서 기재된 본 발명의 여러 실시양태 중 일부 또는 모두에 관한 것일 수 있는 것으로 이해된다.
핵산 및 핵산 유사체의 합성, 변형 및 표지:
핵산 올리고머 (올리고뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오티드) 합성은 통상적인 것이 되었다. 핵산 합성의 상세한 설명에 대해서는, 문헌 [Gait, M. J., "Oligonucleotide Synthesis: a Practical Approach" IRL Press, Oxford England (1984)]을 참조한다. 당업자들은 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드 (DNA, RNA 및 이들의 합성 유사체)를 쉽게 이용가능하다는 것을 이해할 것이다. 이들은 시판되는 기기 및 시약들을 사용하여 합성할 수 있거나, 또는 주문 제작된 올리고뉴클레오티드의 시판 제조사로부터 구매할 수 있다.
PNA 합성 및 표지:
PNA의 화학적 조립을 위한 방법은 잘 알려져 있다 (미국 특허 번호 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,718,262, 5,736,336, 5,773,571, 5,766,855, 5,786,461, 5,837,459, 5,891,625, 5,972,610, 5,986,053 및 6,107,470 참조; 이들 모두는 펩티드 핵산 합성, 변형 및 표지에 관한 그의 정보에 대하여 본원에 참조로 포함됨). PNA 표지에 대한 몇몇 비-제한적인 방법은 미국 특허 번호 6,110,676, WO99/22018, WO99/21881, WO99/49293 및 WO99/37670에 기재되어 있으며, 그 외에 PNA 합성 분야에서 잘 알려져 있다. 펩티드 핵산의 지지체 결합된 자동화된 화학적 조립을 위한 화학 물질 및 기기는 시판된다. 유사하게, 표지 및 표지되지 않은 PNA 올리고머는 주문 PNA 올리고머의 시판 제조사로부터 입수가능하다 (www.panagene.com/pna-oligomers.php, www. biosyn.com/pna_custom.aspx 또는 www.crbdiscovery.com/pna/ 참조). PNA 합성 및 표지에 대한 추가의 정보는 문헌 [Peter E. Nielsen, "Peptide Nucleic Acids", Taylor and Francis, (2004)]에서 찾아볼 수 있다.
PNA가 폴리아미드이기 때문에, 이는 C-말단 (카르복실 말단) 및 N-말단 (아미노 말단)을 갖는다. 표적에의 역평행 결합 (바람직한 배향)에 적합한 혼성화 프로브의 설계 목적을 위하여, PNA 올리고머의 N-말단은 동등한 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실 말단의 등가물이다.
키메라 합성 및 표지/변형:
키메라는 다양한 단량체 유형의 소단위를 포함하는 올리고머이다. 일반적으로, 키메라를 구축하기 위해 사용되는 단량체 유형에 대해 적용될 수 있는 표지 기법을 (변화시키거나 또는 변화시키지 않고) 사용하는 것이 가능하다. 여러 표지 및 표지되지 않은 키메라 분자는 과학 문헌에 보고되어 있거나, 또는 상업적 공급원으로부터 이용가능하다 (US 6,316,230, www.biosyn.com/PNA_Synthesis.aspx, WO2001/027326, 및 www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dna-probes/product-lines/lna-probes.html 참조). 따라서, 당업자들은 표지된 키메라 분자를 제조하거나 또는 쉽게 이용가능한 공급원으로부터 구매할 수 있다.
표지:
본 발명의 실시에서 사용되는 프로브들의 표지에 적합한 표지 (즉, 검출가능한 잔기 또는 마커)의 비-제한적인 예에는 발색단, 형광단, 스핀 표지, 방사성동위원소, 효소, 합텐, 화학발광 화합물, 양자점, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물이 포함된다.
합텐의 몇몇 예에는 5(6)-카르복시플루오레세인, 2,4-디니트로페닐, 디곡시게닌 및 비오틴이 포함된다.
플루오로크롬 (형광단)의 몇몇 예에는 5(6)-카르복시플루오레세인 (Flu), 6-((7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세틸)아미노)헥산산 (Cou), 5(및 6)-카르복시-X-로다민 (Rox), 시아닌 2 (Cy2) 염료, 시아닌 3 (Cy3) 염료, 시아닌 3.5 (Cy3.5) 염료, 시아닌 5 (Cy5) 염료, 시아닌 5.5 (Cy5.5) 염료, 시아닌 7 (Cy7) 염료, 시아닌 9 (Cy9) 염료 (시아닌 염료 2, 3, 3.5, 5 및 5.5는 지이 헬스케어 (GE Healthcare; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 라이프 사이언시즈 소재)로부터 NHS 에스테르로 이용가능함), JOE, 타라마 (Tamara) 또는 알렉사 (Alexa) 염료 시리즈 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))가 포함된다.
효소의 몇몇 예에는 중합효소 (예를 들어, Taq 중합효소, 클레나우 (Klenow) PNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 시쿼나제 (Sequenase), DNA 중합효소 1 및 phi29 중합효소), 알칼리 포스파타제 (AP), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 및 대두 퍼옥시다제 (SBP)가 포함된다.
방사성 동위원소의 몇몇 예에는 14C, 32P, 129I 및 99Tc가 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 스핀 표지들을 표지들로서 사용할 수 있다. 스핀 표지들은 보통 질소 원자 상에서 쌍을 이루지 않은 전자 스핀을 갖는 유기 분자이다. 예를 들어, 프로브들은 미국 특허 출원 번호 7,494,776에 기재된 것과 같이 스핀 표지로 표지할 수 있다. 이후, 상기 표지된 프로브를 예를 들어 결정을 위해 박테리아를 염색하기 위해 사용할 수 있다.
독립적으로 검출가능한 표지들/멀티플렉스 분석:
몇몇 실시양태에서, 멀티플렉스 방법 (검정)을 수행한다. 멀티플렉스 검정에서, 여러 관심 조건들을 동시에 또는 순서대로 조사한다. 멀티플렉스 분석은 검정이 완료되는 도중 또는 이후에 샘플 성분 또는 그와 관련된 데이터를 분류하는 능력에 의존한다. (본원에서 사용되는) 멀티플렉스 검정은 보통 2종 이상의 독특하게 인식가능한 프로브들의 사용에 의존한다.
멀티플렉스 검정에서, 하나 이상의 구별되는 독립적으로 검출가능한 표지들 (통상적으로, 각각의 구별되는 표지 (또는 구별되는 표지들의 조합)는 상이한 프로브에 연결됨)이 관심 있는 2종 이상의 상이한 박테리아를 독특하게 표시 (즉, 염색)하기 위해 사용된다. 몇몇 경우에서, 2종 (이상)의 독특한 표지들이 동일한 박테리아에 지정되어, 이에 의해 박테리아에서의 2종 (이상)의 독특한 표지들의 존재로부터 생성되는 독특한 염색을 생성할 수 있다. 각각의 독특하게 염색된 박테리아를 구별하고/거나 정량하는 능력은 검정을 멀티플렉싱하기 위한 수단을 제공하는데, 각각의 독특하게 표시된 (즉, 염색된) 박테리아와 상호관련된 데이터가 결정하고자 하는 조건 또는 조건들 (예를 들어, 선택적 박테리아 또는 선택적 형질)과 상호관련될 수 있기 때문이다.
본원에서 기재된 방법의 실시에서, 박테리아를 독특하게 표시하여, 2가지 (이상)의 관심 있는 조건들이 샘플의 박테리아에 대하여 결정될 수 있도록 하는 것이 가능하다. 예를 들어, 몇몇 실시양태의 실시에서, 샘플에서 에스. 아우레우스 박테리아를 표시하기 위해 독특한 표지를 사용하는 것이 가능하며, 또한 메티실린-내성인 샘플에서 박테리아를 표시하기 위해 독특한 표지를 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 샘플의 분석에 의해, 샘플이 1) 에스. 아우레우스 박테리아 (메티실린-내성이 아님); 2) 비-에스. 아우레우스 메티실린-내성 박테리아 (예를 들어, MR-CNS); 및/또는 3) 메티실린-내성 에스. 아우레우스 박테리아를 함유하는지를 결정하는 것이 가능하다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 이들 3가지 조건들에 대하여 불균일하거나 또는 균일한 것으로 특성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 각 군에서의 박테리아의 수는 샘플의 박테리아의 특정 백분율을 나타내어 추정하거나, 정량하거나 또는 확인할 수 있다.
방법은 여러 방식으로 멀티플렉싱될 수 있으며, 멀티플렉싱은 검정에서 사용되거나 또는 검출될 수 있는 독립적으로 검출가능한 표지들 (또는 독립적으로 검출가능한 프로브들)의 수에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 몇몇 검정은 샘플에서의 여러 (예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 이상의) 상이한 박테리아 (몇몇 실시양태에서 모든 그람-양성, 몇몇 실시양태에서 그람-양성 및 그람-음성 박테리아의 혼합물)의 존재를 검출 및 확인하고, 또한 임의의 이들 박테리아가 2가지 (이상)의 상이한 관심 있는 형질들 중 하나 또는 둘 모두를 갖는지를 결정하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 5종의 박테리아 및 2가지 형질들에 대한 멀티플렉스 검정은 7개 (5 + 2) 이상의 독특하게 표지된 프로브들 (또는 7개의 독특한 표지들의 조합), 및 10개 (5×2) 이상 또는 무려 20개 (5×4)나 되는 가능한 상이한 유형의 염색된 박테리아를 구별하기 위한 능력을 요구할 것이다. 본 발명의 실시양태의 관점에서, 방법은 5개의 독특하게 표지된 rRNA-지정된 프로브들을 사용하여 각각의 5종의 상이한 박테리아를 결정할 수 있으며, 2개의 독특하게 표지된 mRNA-지정된 표지된 프로브들을 사용하여 각각의 상이한 형질을 결정할 수 있다.
몇몇 대표적인 멀티플렉스 검정은 실시예 3에서 기재되어 있으며, 각각의 박테리아의 독특하게 확인가능한 특징은 도 3을 참조하여 알아볼 수 있다.
전세포 검정:
본원에 개시된 방법은 전세포 검정을 포함한다. 전세포 검정은 무손상 세포 또는 실질적으로 무손상 세포에서 수행된다. 전세포 검정의 몇몇 예에는 계내 혼성화 (ISH), 형광 계내 혼성화 (FISH) 및 면역세포화학 (ICC) 검정이 있다. 몇몇 실시양태에서, 전세포 검정은 엄격하게는 ISH, FISH 또는 ICC 검정이 아니다. 예를 들어, 전세포 검정은 2종 이상의 이들 상이한 검정 방식의 조합을 포함할 수 있다 (골드바드 (Goldbard) 등의, 제목이 "High Efficiency Methods For Combined Immunocytochemistry And In-Situ Hybridization"인 미국 특허 번호 6,524,798 참조). 보다 구체적으로, 본 발명의 몇몇 실시양태는 예를 들어 항체 프로브들과 함께 사용되는 올리고머 (혼성화) 프로브들의 사용을 고려한다. 상기 검정에서 사용되는 검정 방식 및/또는 성분이 상호간에 비상용성이지 않을 정도로, 본 발명은 조합된 전세포 검정 방식의 임의의 조합을 고려한다. 하기에 보다 상세히 논의되는 것과 같이, 검정의 조합은, 상이한 프로브 유형이 방법 단계의 실시에서 사용되는 경우에 결합 조건들의 어느 정도의 조화를 포함할 수 있다. 다르게는, 샘플의 재프로브 주기 (reprobe cycling)는 또한 사용될 수 있으며, 여기서 조건들은 하나의 프로브 유형에 대해 고정되어, 재프로브 주기 (제1 주기는 사실상 프로브 주기일 것임)가 상기 프로브 유형으로 완성되고, 새로운 재프로브 주기가 제2 (상이한) 프로브 유형으로 수행되도록 한다 (순차적 분석 단계를 사용하는 전세포 분석의 논의에 대하여, 윌리암스 (Williams) 등의 미국 특허 번호 2005/0123959 참조 - 본원에서 "재프로브 주기 또는 재프로브 주기들"로 사용됨)). 방법에 따라서, 프로브/표적 복합체들은 각각의 재프로브 주기 후에, 재프로브 주기 중 일부 이후에, 또는 모든 재프로브 주기 이후에 결정할 수 있다.
ISH :
본원에서 사용되는 "계내 혼성화 (ISH)"는 핵산 표적에 지정되는 혼성화 프로브를 사용하여 실시되는 방법에 관한 것이다. 프로브는 핵산 (예를 들어, RNA, DNA), 핵산 유사체 (예를 들어, LNA), 핵산 모방체, 예컨대 PNA, 모르폴리노 또는 PP, 또는 키메라 (예를 들어, DNA-RNA 키메라, PNA-DNA 키메라, PNA-RNA 키메라, LNA-DNA 키메라 등)일 수 있다. 가장 널리 사용되는 ISH 방법은 "형광 계내 혼성화" 또는 "FISH"이며, 여기서 프로브는 하나 이상의 형광 표지들을 포함한다.
간단히 말하면, 통상적인 계내 혼성화 검정은 일반적으로 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다: (1) 표적 DNA 또는 RNA의 접근성을 증가시키기 위한 세포의 전-혼성화 처리 (예를 들어, 열 또는 알칼리로의 변성, 및/또는 세포 투과화 시약 또는 시약들로의 처리); (2) (예를 들어, 인간 게놈 DNA를 사용하여 반복 서열의 혼성화 능력의 차단에 의해) 비특이적 결합을 감소시키기 위한 단계; (3) 샘플을 혼성화 프로브를 함유하지 않은 혼성화 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 전-혼성화; (4) 박테리아 내에서의 하나 이상의 혼성화 프로브들과 핵산과의 혼성화; (5) 세척에 의해 각각의 표적들과 결합되지 않은 프로브들의 제거; 및 (6) (예를 들어, 염색된 박테리아의 결정에 의한) 프로브/표적 복합체들의 검출/결정. 이들 단계 각각에서 사용되는 시약들, 및 그의 사용에 대한 조건들은 특정 용도에 따라 변한다.
ISH는 세포 핵산 서열을 혼성화할 수 있는 여러 검출가능한 또는 검출가능하게 표지된 프로브들 (예를 들어, 35S-표지된 프로브들, 형광 표지된 프로브들, 효소 표지된 프로브들)을 사용하여 수행될 수 있다. 형광 표지된 프로브들을 사용하는 경우에, 기법은 FISH로 불린다. ISH 프로브들은 직접적으로 (예를 들어, 공유 결합 연결된 형광-표지의 사용에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들어, 리간드-표지된 안티리간드 시스템을 통해) 표지될 수 있다.
면역세포화학 ( ICC ):
본원에서 사용되는 면역세포화학은 박테리아 내부에서의 항체 프로브 (또는 항체 단편 프로브)와 항원과의 상호작용을 통해 샘플의 박테리아를 염색하기 위한 항체 또는 항체 단편의 사용을 의미한다. 염색은 1차 항체만을 사용하여 일어날 수 있거나, 또는 (표지된) 2차 항체의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 어떠한 의혹도 피하기 위하여, 본 발명은 박테리아 내에서의 단백질 항원에 지정되는 1차 항체의 사용에 관한 것이 아니며, 여기서 단백질 항원은 선택적 형질과 관련되어 있으며, 상기 항체/항원 복합체의 결정은 상기 선택적 형질을 결정하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 면역세포화학 (사용되는 정도로)은 통상적으로 샘플에서의 선택적 박테리아를 결정하는 것에 관한 것일 것이다. 따라서, 항체 (또는 항체 단편) 프로브는 선택적 박테리아에 특이적인 항원 표적에 지정될 수 있다. 항체 프로브는 표지될 수 있거나 (즉, 직접 검출), 또는 박테리아 내부에서의 항체 프로브와 그의 각각의 항원 표적과의 결합에 의해 형성된 항체 프로브/항원 표적 복합체를 상기 항체 프로브/항원 표적 복합체와 결합하는 표지된 2차 항체의 사용에 의해 결정할 수 있다 (즉, 간접 검출).
상기에도 불구하고, 면역세포화학은 박테리아 내부의 형질들을 결정하는데 사용할 수 있다. 그러나, 형질들의 결정에 대하여, 항체 프로브(들)는 박테리아 내에서의 염색체 DNA, mRNA 또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들과 그의 각각의 표적(들)과의 결합에 의해 형성되는 프로브/표적 복합체들에 지정된다. 따라서, 이러한 맥락에서, 면역세포화학은 박테리아의 형질(들)과 관련된 상기 프로브/표적 복합체들의 간접 염색을 위해 사용된다.
무엇이 표적화되던지 간에, 하나 이상의 항체가 하나 이상의 검출가능한 잔기로 표지되어, 상기 표지된 항체가 결합하는 경우에 박테리아가 염색되도록 한다. 게다가, ICC를 ISH 또는 FISH 절차와 조합하여, 이에 의해 본원에 개시된 방법에 따라 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질들을 결정할 수 있다.
샘플:
박테리아는 어느 곳에나 있다. 박테리아를 포함하는 샘플은 임의의 공급원으로부터 비롯될 수 있다. 샘플의 공급원이, 본원에 개시된 임의의 방법의 실시와 관련하여 제한사항이 되고자 하는 의도는 아니다.
샘플은 환경 관련 샘플, 예컨대 토양 또는 물로부터의 샘플일 수 있다. 샘플은 소비자 상품, 예컨대 식품, 음료 또는 화장품으로부터 비롯될 수 있다. 샘플은 범죄 현장으로부터 비롯될 수 있다 (예를 들어, 법의학적 분석). 샘플은 전쟁 구역으로부터 비롯되거나 또는 수상한 테러리스트 공격 현장으로부터 비롯될 수 있다 (예를 들어, 무기화된 박테리아 (예를 들어, 비. 안트라시스 (B. anthracis))를 비롯한 병원성 박테리아의 시험). 샘플은 임상 공급원으로부터 비롯될 수 있다. 임상 공급원으로부터의 샘플은 임의의 공급원, 예컨대 인간, 식물, 어류 또는 동물로부터 비롯될 수 있다. (임상 공급원으로부터의) 임상 샘플의 몇몇 비-제한적인 예에는 혈액, 고름, 가래, 척수액, 양수, 대변, 소변, 비내 표본, 인후 표본 등이 포함된다. 샘플 (임상 샘플 포함)은 박테리아 배양물 및 2차 배양물 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 샘플은 특정 분석을 위해 제조되거나 또는 부분적으로 제조된 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 소정 기간 동안 고정 및/또는 보관된 표본일 수 있다.
프로브들 :
본원의 구체적인 표현 또는 논의에 의해 명시적으로 제한되지 않는다면, 프로브들과 그의 각각의 표적과의 선택적 결합을 기초로 관심 있는 원하는 조건 (예를 들어, 선택적 박테리아 또는 선택적 형질)에 대해 선택하는데 사용될 수 있는 임의의 프로브를 본 발명의 실시양태의 실시에서 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브는 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용되는 프로브는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 핵산 유사체 (예를 들어, LNA), 핵산 모방체 (예를 들어, PNA, PP 또는 모르폴리노) 또는 키메라일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브 또는 프로브들은 10 내지 20개 핵염기 소단위 길이이다. 프로브들은 "핵염기 소단위 길이"의 측면에서 본원에 기재되어 있는데, 핵산만이 뉴클레오티드를 포함하며, 반면에 이들 상이한 올리고머 유형 모두는 소단위 당 하나의 핵염기를 포함하기 때문이다. 본 발명의 실시양태들에서 사용되는 프로브들은 드 노보 합성 (de novo synthesis) 또는 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
여러 프로브들이 특정 박테리아 또는 형질들의 검출을 위한 생물학적 분야에서 존재한다고 이해된다. 따라서, (본 발명의 목적을 위한) 프로브의 성질은 본원에서 명시적으로 기재된 것 이외로 제한되려고 하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 실시에서 사용되는 프로브들은 표지되지 않을 수 있지만, 단 프로브와 그의 각각의 표적과의 결합에 의해 형성되는 프로브/표적 복합체의 결정에 대한 이용가능한 메카니즘이 있다. 예를 들어, 표지되지 않은 (1차) 항체-기반 프로브는 상기 표지되지 않은 (1차) 항체-기반 프로브와 결합하는 2차 검출가능하게 표지된 항체를 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, US 6,524,798의 컬럼 3의 28 내지 40줄, 및 US 7,455,985의 컬럼 12의 12 내지 63줄 참조). 예를 들어, 상기 표지되지 않은 (1차) 항체-기반 프로브를 사용하여 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있다. 따라서, 모든 분자의 결합 시에 형성되는 복합체 (즉, 표지된 2차 항체/1차 항체/표적 복합체)는 상기 2차 항체의 상기 표지를 결정하여 결정될 수 있다 (따라서, 선택적 박테리아가 결정될 수 있음). 유사하게, 다른 유형의 표지되지 않은 프로브들은 상기 표지되지 않은 프로브와 선택적으로 결합하는 표지된 분자 또는 상기 표지되지 않은 프로브와 그의 각각의 표적과의 결합에 의해 형성되는 복합체를 사용하여 결정할 수 있다 (예를 들어, PNA-DNA 복합체들 등에 대한 항체의 사용을 논의하는 힐디그-닐슨의 미국 특허 번호 5,612,458 참조).
몇몇 실시양태에서, 프로브들은 하나 이상의 검출가능한 잔기 (즉, 하나 이상의 표지)로 표지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 각 프로브는 하나의 표지만을 포함할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 선택적 형질 (예를 들어, 메티실린-내성)을 결정하기 위해 사용되는 프로브 또는 프로브들은 하나의 표지만을 포함할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 프로브들의 혼합물 (예를 들어, mRNA-지정된 프로브들의 혼합물)이 사용되며, 여기서 각 프로브는 하나의 표지 또는 2개의 표지들 (즉, 단일 표지되고/거나 이중 표지된 프로브들의 혼합물)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 각 프로브는 다수의 표지들 (예를 들어, 2개 표지들, 3개 표지들, 4개 표지들, 5개 표지들, 6개 표지들 등)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 프로브들은 단일 표지를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 프로브들은 다수의 표지들을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 프로브들은 표지되지 않을 수 있으며, 하나 이상의 프로브들은 하나 이상의 표지들을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 표지 또는 표지들은 직접적으로 결정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표지 또는 표지들은 간접적으로 결정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 일부 표지들은 직접적으로 결정하고, 일부는 간접적으로 결정할 수 있다.
직접적으로 표지를 결정하는 것은 또 다른 분자/화합물의 사용 없이 표지의 특성을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 형광 표지를 결정하는 것은 형광 현미경을 사용하거나, 슬라이드 스캐너 (slide scanner)를 사용하거나 또는 유세포분석기 (flow cytometer)를 사용하여 처리된 샘플을 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 현미경, 스캐너 또는 세포측정기에서 관찰/측정되는 것이 표지 자체의 형광이기 때문에, 결정은 직접적인 것으로 표현된다.
그에 비해, 간접 결정은 표지된 프로브들의 표지를 인식하는 보조적인 분자/화합물을 사용하여, 이에 의해 보조적인 분자/또는 화합물 (또는 그에의 표지)이 표지된 프로브의 표지를 결정하기 위한 대용물로서 결정되는 것을 포함한다. 예를 들어, 표지는 디곡시게닌과 같은 합텐일 수 있다. 하기 단락 8에서 열거되는 여러 참조문헌은 디곡시게닌을 결정하기 위한 간접 방법을 기재한다. 일반적으로, 이들 방법은 2차 표지 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소, 알칼리 포스파타제 또는 플루오레세인과 같은 형광단)에 컨쥬게이션된 항-디곡시게닌 분자 (항체)의 사용을 포함한다. 결정되는 보조적인 분자 (즉, 항-디곡시게닌 분자)의 2차 표지의 특성이기 때문에, 이는 간접 검출 방법으로서 특성화된다.
실제로, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 일부 프로브들이 샘플에서의 선택적 박테리아를 결정하기 위해 선택된다. 본 발명자들은 이들을 "박테리아-지정된" 프로브 또는 프로브들로 지칭한다. "박테리아-지정된"에 대하여, 본 발명자들은 박테리아, 선택적 박테리아 또는 선택적 그람-양성 박테리아 내의 표적에 특이성을 갖는 것으로 발견되는 프로브 또는 프로브들을 지칭한다. 게다가, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 "샘플에서의 선택적 박테리아를 결정할 수 있는" 것으로 표현되는데, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 박테리아 내의 표적에 선택적으로 결합하여, 상기 선택적 박테리아가 프로브/표적 복합체의 형성을 기초로 (예를 들어, 형광 현미경 또는 유세포분석에 의해) 결정될 수 있도록 하기 때문이다. 따라서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 상기 샘플에서 상기 선택적 박테리아를 결정하는데 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 선택적 박테리아는 선택적 그람-양성 박테리아 (예를 들어, 에스. 아우레우스)이고, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 "샘플에서 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는" 것으로 표현되거나, 또는 보다 구체적으로 스타필로코쿠스 아우레우스에 대하여 "샘플에서 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아를 결정할 수 있는" 것으로 표현된다. 몇몇 실시양태에서, 다른 선택적 박테리아 (필요에 따라 하나 이상의 그람-음성 박테리아를 포함함) 또한 결정을 위해 선택될 수 있다. 이 경우에, 샘플은 또한 방법의 실시에 의해 결정하려고 하는 각각의 추가의 선택적 박테리아에 대한 하나 이상의 추가의 박테리아-지정된 프로브들과 접촉한다. 종종, 샘플에서의 다수의 선택적 박테리아의 결정은 멀티플렉스 검정의 사용에 의해 달성되며, 여기서 각각의 상이한 유형의 박테리아를 독특한 염색, 염색의 조합 및/또는 염색 및 세포 형태의 독특한 조합으로 염색한다.
선택적 박테리아를 결정하기 위해 선택된 프로브 또는 프로브들 (즉, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들)은 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들일 수 있다. 상기 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은 선택적 박테리아의 rRNA에서의 표적과 특이성을 가지고 결합한다. 그러나, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 rRNA-지정될 필요는 없다. 그보다는, 이들은 예를 들어 mRNA-지정될 수 있다. "mRNA-지정된"에 대하여, 본 발명자들은 mRNA에서의 표적과 특이성을 가지고 결합하는 프로브 또는 프로브들을 의미한다. 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 또한 상기 박테리아에 특이적인 다른 조절 RNA (예를 들어, 소형 RNA (sRNA) 또는 안티센스 RNA (aRNA))에 지정될 수 있다.
게다가, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 혼성화 프로브들일 필요가 없다. 예를 들어, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 예를 들어 항체-기반일 수 있는데 (예를 들어, US 6,231,857 및 US 7,455,985 참조), 항체가 한 유형의 박테리아를 또 다른 것들과 구별하기 위해 사용될 수 있는 것으로 알려져 있기 때문이다.
선택적 형질을 결정하기 위해 선택되는 프로브 또는 프로브들은 1) 염색체 DNA 내의; 2) mRNA 내의; 및/또는 3) 샘플에 존재할 수 있는 박테리아의 천연 플라스미드 내의 표적 또는 표적들에 지정되며, 여기서 상기 표적 또는 표적들은 선택적 형질과 관련되어 있다. 따라서, 상기 프로브 또는 프로브들은 표적 또는 표적들의 성질을 기초로 "염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된" 것으로 표현된다. 추가적으로, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 "선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는" 것으로 표현되는데, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들이 상기 선택적 형질과 관련된 각각의 표적 또는 표적들과 선택적으로 결합하기 때문이다. 따라서, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 상기 샘플의 박테리아의 상기 선택적 형질을 결정하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 선택적 형질은 메티실린-내성이다.
그러나, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 형질과 관련된 표적 단백질에 지정 (결합)되지 않는 것으로 이해된다. 그보다는, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들에 대한 표적 또는 표적들은 통상적으로 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드의 DNA의 핵산 서열 내에 위치하고 있다.
상기 표현으로부터 추론되는 것과 같이, 선택적 형질을 결정하기 위해 사용되는 프로브 또는 프로브들이 1) 염색체 DNA; 2) mRNA; 및 3) 천연 플라스미드 모두에 지정되는 것을 요구하지는 않는다. 그보다는, 선택적 형질을 결정하기 위해 사용되는 프로브 또는 프로브들은 1) 염색체 DNA; 2) mRNA; 및 3) 천연 플라스미드 중 하나에서만, 또는 이들 중 2종 이상의 임의의 조합에 지정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 선택적 형질을 결정하기 위해 사용되는 프로브 또는 프로브들은 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된다. 몇몇 실시양태에서, 선택적 형질을 결정하기 위해 사용되는 프로브 또는 프로브들은 mRNA-지정된다.
게다가, 몇몇 실시양태에서, 본원에서 기재된 방법은 멀티플렉스 방식으로 실시될 수 있으며, 이에 의해 다수의 형질들 (예를 들어, 2가지 형질들, 3가지 형질들, 4가지 형질들 등)이 단일 샘플의 박테리아에 대하여 결정된다. 상이한 형질들에 대한 프로브 또는 프로브들이 동일한 표적 유형에 지정될 필요는 없다. 상이한 형질들에 대한 프로브 또는 프로브들이 동일한 표적 유형 (예를 들어, 1) 염색체 DNA; 2) mRNA; 또는 3) 천연 플라스미드 중 하나)에 지정되는 것이 허용될 수 있지만, 상이한 형질들에 대한 프로브들이 상이한 표적 유형에 지정되는 것 또한 허용될 수 있다. 또한, 상이한 형질들에 대한 몇몇 프로브들이 동일한 표적 유형에 지정되고, 상이한 형질들에 대한 몇몇 프로브들이 동일한 검정에서 상이한 표적 유형에 지정되는 것이 허용될 수 있다. 실제로, 상이한 표적 유형에 대한 프로브들의 임의의 가능한 조합이 허용될 수 있다.
염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 핵산, 핵산 유사체, 핵산 모방체, 또는 키메라일 수 있다. 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 프로브들을 사용하여 형성된 프로브/표적 복합체들은 본원에서 상기 기재된 것과 같이 결정될 수 있다. 그러나, 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브 또는 프로브들은 통상적으로 하나 이상의 표지들로 표지된다. 몇몇 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브는 하나의 표지만을 포함할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 프로브는 다수의 표지들을 포함할 수 있다. 또한, 동일한 검정에서 단일 표지된 프로브들 및 다-표지된 프로브들을 혼합하는 것이 허용될 수 있다.
앞서 수회 언급한 것과 같이, 본원에서 기재된 방법은 멀티플렉스 방식으로 실시될 수 있으며, 이에 의해 예를 들어 1) 2종 이상의 선택적 박테리아가 단일 샘플에서 결정되거나; 2) 2가지 이상의 선택적 형질들이 단일 샘플에서 결정되거나; 또는 3) 2종 이상의 선택적 박테리아 및 2가지 이상의 선택적 형질들이 단일 샘플에서 결정된다. 일반적으로, 이러한 멀티플렉스 검정은 샘플을 추가의 프로브들과 필요에 따라 접촉시켜 수행되어, 추가의 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질(들)을 결정한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 접촉은 동시에 실시되어, 모든 다양한 박테리아 및/또는 형질들이 단일 절차의 종료시에 결정되도록 할 수 있다. 이 실시양태에 대하여, 각각의 상이한 선택적 박테리아 및/또는 상이한 선택적 형질에 지정된 프로브 또는 프로브들은 독립적으로 검출가능할 수 있다. 일반적으로, 방법의 실시에서 사용되는 다양한 프로브들의 표지들을 선택하여 박테리아 및/또는 형질(들)의 유형을 기초로 다양한 염색된 박테리아를 생성한다. 그러나, 몇몇 경우에서, 몇몇 동일하게 염색된 박테리아를 가져, 이에 의해 하나 이상의 선택적 박테리아 및/또는 형질들이 (가능하게는 염색의 결정과 함께) 박테리아의 형태를 기초로 결정되는 것이 가능할 것이다.
다양한 (독립적으로 검출가능한) 표지들 (또는 독특하게 염색된 박테리아)로의 멀티플렉싱보다는, 재프로브 주기 방법의 사용에 의해 다수의 결과를 얻는 것 또한 가능하다 (윌리암스 등에 의해 공개된 미국 특허 출원 번호 2005/0123959 참조). 재프로브 주기 방법에서, 결과가 얻어진 후, 제2, 제3, 제4, 제5 결과 등을 결정하기 위해 샘플을 재분석한다. 통상적으로, 재프로브 주기 방법에서, 다음 결과를 얻기 위해 샘플을 처리하기 이전에 이전 결과를 제거 (소거)한다.
본원에 개시된 방법에 대하여, 재프로브 주기 방법의 사용에 의해 2종 이상의 선택적 박테리아 및/또는 2가지 이상의 선택적 형질들을 결정하기 위해 동일한 표지 유형 (예를 들어, 플루오레세인)을 사용하는 것이 가능하다. 몇몇 실시양태에서, 동일한 재프로브 주기에서 선택적 박테리아 및 선택적 형질을 결정하는 것이 가능하다. 몇몇 실시양태에서, 상이한 재프로브 주기에서 선택적 박테리아 및 선택적 형질을 결정하는 것이 가능하다. 일반적으로, 당업자들은 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질(들)이 특정 재프로브 주기에서 상기 재프로브 주기 동안에 샘플에 적용되는 프로브 또는 프로브들의 선택에 의해 결정되는 것을 선택할 수 있다.
표적들:
일반적으로, 표적은 각각의 프로브를 사용하여 결정될 수 있는 전세포 검정 동안 박테리아 (또는 효모) 내부에 존재하는 임의의 표적 분자 (또는 그의 부분)일 수 있다. 표적들의 몇몇 비-제한적인 예에는 박테리아의 임의의 핵산 내에 존재하는 핵산 서열 (예를 들어, rRNA, mRNA, 염색체 DNA 또는 플라스미드 DNA 내의 선택적 서열), 항원, 항체, 단백질, 펩티드 및/또는 호르몬이 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 1) 샘플에 존재할 수 있는 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및 2) 샘플에서의 박테리아에 존재할 수 있는 선택적 형질 (이 형질은 상기 선택적 그람-양성 박테리아에 존재하거나 존재하지 않을 수 있음)과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드를 결정할 수 있는 형질-지정된 프로브 또는 프로브들을 사용하여 실시된다. 그러나, 의혹을 피하기 위해, 본 발명은 형질을 결정하기 위해 단백질인 표적을 사용하는 것에 관한 것은 아니다.
본원에 개시된 방법은 샘플에서의 관심 있을 수 있고 본원에 개시된 방법의 실시 동안 결정될 수 있는 추가의 표적(들)을 (예를 들어, 멀티플렉싱 또는 재프로브 주기에 의해) 결정하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 상기 샘플을 상기 추가의 표적(들)에 지정되는 하나 이상의 추가의 프로브들과 접촉시켜 샘플로부터 추가의 정보를 얻는 것이 가능하며, 여기서 샘플의 박테리아 (또는 효모) 내의 이들의 존재는 관심 있는 또 다른 조건 (예를 들어, 환자의 정확한 진단을 위한 임상적 관심의 또 다른 조건)의 지표이다. 상기 추가의 관심 있는 조건은 샘플에서의 또 다른 박테리아 (이러한 박테리아는 그람-양성 또는 그람-음성일 수 있음)의 존재일 수 있다. 상기 추가의 관심 있는 조건은 샘플에서의 효모의 존재일 수 있다. 상기 추가의 관심 있는 조건은 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아에서의 플라스미드의 존재일 수 있다. 상기 추가의 관심 있는 조건은 샘플의 박테리아 (선택적 그람-양성 박테리아가 포함됨)에서의 또 다른 형질 또는 형질들의 존재일 수 있다. 본원에 개시된 방법은 다양한 표적들에 대한 다양한 프로브들과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법을 실시하여 표적들 (및 각 표적에 대한 각각의 프로브 또는 프로브들)의 적합한 선택을 기초로 하나 이상의 추가의 관심 있는 조건을 결정하는 것이 가능하며, 이에는 예를 들어 1) 추가의 박테리아; 2) 플라스미드; 3) 효모; 4) 형질들; 또는 5) 상기 중 2종 이상의 임의의 가능한 조합을 결정하는 것이 포함될 수 있다.
당업자들은 통상적인 실험 및 시판되는 물질 및/또는 정보를 사용하여 적합한 선택적 표적들을 설계할 수 있을 것이다 (또한 상기 적합한 표적들에 대한 적절한 프로브를 설계할 수 있을 것이다). 예를 들어, ISH는 스타필로코쿠스 아루레우스 박테리아 (미국 특허 번호 6,664,045의 도 3, 및 미국 특허 출원 번호 2008/0008994; 문헌 [Cerqueira et al., "DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)", Int. J. Mol. Sci., 9: 1944-1960 (2008)]; 및 [Forrest et al., "Impact of rapid in situ Hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58: 154-158 (2006)] 참조)를 비롯하여 선택적 박테리아 (문헌 [Amann, R., "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization", Bioscience Microflora, 19(2): 85-91 (2000)] 및 [Pernthaler et al., "Fluorescence in situ Hybridization (FISH) with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes", Methods in Microbiology, 30: 207-226 (2001)])를 결정하기 위해 통상적으로 사용된다. 상기 언급된 것과 같이 (상기 "프로브들" 제목의 단락 참조), 이러한 결정을 위한 표적들은 예를 들어 rRNA일 수 있다. 그러나, 이는 제한하기 위한 것은 아닌데, 박테리아의 선택을 위한 표적은 예를 들어 표면 항원일 수 있기 때문이다 (US 7,455,985 참조).
프로브 /표적 복합체들의 형성:
선택적 박테리아 (예를 들어, 선택적 그람-양성 박테리아) 및 선택적 형질은 샘플의 박테리아 내에서의 적절한 프로브/표적 복합체들의 형성의 결정에 의해 결정된다. 간단히 말해서, 샘플을 선택적 박테리아 및/또는 형질과 관련된 (및 그에 특이적인) 것으로 알려진 그의 각각의 표적들에 대한 그의 친화성에 대하여 선택된 프로브들과 접촉시켜, 적절한 프로브/표적 복합체들이 샘플의 박테리아 내에서 형성될 것이다.
프로브/표적 복합체의 성질은 프로브 및 그의 각각의 표적의 성질에 의해 결정된다. 여러 유형의 프로브/표적 복합체들이 고려된다. 예를 들어, 박테리아 결정을 위한 혼성화 프로브들은 rRNA-지정되거나 또는 mRNA-지정될 수 있다. 따라서, 프로브와 그의 표적과의 결합시 형성되는 각각의 복합체는 각각 프로브/rRNA 복합체 또는 프로브/mRNA 복합체이다.
유사하게, 형질 결정을 위한 혼성화 프로브들은 염색체 DNA-지정되거나, mRNA-지정되거나 또는 천연 플라스미드-지정될 수 있다. 따라서, 프로브와 그의 각각의 표적과의 결합시에 형성되는 각각의 복합체는 각각 프로브/염색체 DNA 복합체, 프로브/mRNA 복합체 또는 프로브/플라스미드 복합체이다.
항체 프로브들에 대하여, 항체와 그의 항원 표적과의 결합은 항체/항원 복합체를 생성한다.
당업자들은 박테리아에서의 프로브/표적 복합체들이 적합한 결합 조건들 (또는 보다 정확하게는 혼성화 프로브들에 대한 "적합한 혼성화 조건들"로 지칭됨) 하에 형성된다는 것을 이해할 것이다. 각각의 프로브/표적 복합체에 대한 적합한 결합 조건들은 프로브 및 표적의 성질을 기초로 결정될 것이다. 적합한 결합 조건들이 프로브 및 그의 각각의 표적의 상호작용이 명확한 경우의 조건들에 반영된다고만 해도 충분하다. 게다가, 당업자들은 여러 유형의 프로브/표적 복합체들의 형성을 위한 적합한 결합 조건들을 결정할 수 있다. 실제로, 다양한 혼성화 완충액 (예를 들어, 계내 혼성화 절차에 대하여 최적화된 바로 사용가능한 혼성화 용액 참조, 예컨대 www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?N4=H7782|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC 참조) 및/또는 결합 완충액 (예를 들어, www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=01010401&WT.mc_id=go_AbPur_Bind_pf&gclid=CNyJ-4uxgJoCFdxM5Qod1Vt5Fw에 기재된 것과 같은, 써모사이언티픽 (ThermoScientific)으로부터의 시판되는 바로 사용가능한 항체 결합 완충액 참조)이 여러 검정 방식에서 사용하기 위해 시판된다. 결합 조건들이 완전하게 최적화될 필요는 없고, 그보다는 조건들은 단지 프로브와 그의 각각의 표적과의 특이적 결합에 적합하여, 검정이 정확하고 재현가능한 결과를 생성하도록 한다는 것으로 이해된다. 게다가, 상이한 유형의 프로브들 (예를 들어, 혼성화 프로브들 및 항체-기반 프로브들)이 동일한 접촉 단계에서 사용되는 경우에, 결합 조건들은 각 유형의 프로브와 그의 각각의 표적과의 결합에 적합하여야 한다. 이 문제의 보다 구체적인 논의에 대해서는, 하기 "전세포 검정에서의 결합 조건들의 조화" 제목의 단락을 참조한다.
프로브 /표적 복합체들의 결정:
일단 형성되면, 프로브/표적 복합체들은 결정될 수 있다. 프로브/표적 복합체들은 각각 상이한 (또는 상이한 유형의) 프로브/표적 복합체와 관련된 표지를 사용하여 결정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상이한 (또는 상이한 유형의) 프로브/표적 복합체들과 관련된 모든 표지들은 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 상이한 표지들 (또는 표지들의 조합)은 각각 상이한 (또는 상이한 유형의) 프로브/표적 복합체와 관련되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 몇몇 상이한 (또는 상이한 유형의) 프로브/표적 복합체들 (예를 들어, 세포 형태가 박테리아 종을 구별하기 위해 사용될 수 있는 경우의 박테리아-지정된 프로브들)과 관련된 동일한 표지 및 다른 상이한 (또는 상이한 유형의) 프로브/표적 복합체들 (예를 들어, 상이한 형질들을 결정하기 위해 사용되는 프로브들)과 관련된 상이한 표지들의 혼합물이 있다.
프로브/표적 복합체는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "직접적으로"에 대하여, 본 발명자들은 프로브/표적 복합체의 프로브가 연결된 표지를 포함하는 것을 의미하며, 이 표지는 그 자체의 특성을 기초로 결정된다 ("프로브들" 제목의 단락에서 상기 표지들의 직접 및 간접 결정의 결정에 대한 논의 참조). "간접적으로"에 대하여, 본 발명자들은 프로브/표적 복합체가 표지를 포함하며 프로브/표적 복합체 (또는 프로브/표적 복합체들에 연결된 표지)와 결합하는 (또는 상호작용하는) 2차 조성물 (예를 들어, 표지된 항체)를 사용하여 결정되는 것을 의미하며, 여기서 상기 표지는 프로브/표적 복합체의 지표로서 결정된다 (상기 문헌 참조). 여하튼, 표지의 결정은 프로브/표적 복합체의 결정과 상관관계가 있다.
전세포 검정에서, 프로브/표적 복합체들의 결정은 몇몇 실시양태에서 세포 (즉, 박테리아)가 염색되는 방법을 검사하여 수행될 수 있다. 간단히 말해서, 표지가 직접적인지 또는 간접적인지에 무관하게, 세포는 염색되게 되는데, 프로브/표적 복합체 또는 복합체들과 (직접적으로 또는 간접적으로) 관련된 표지(들)이 무손상 세포 (즉, 박테리아) 내에 (또는 적어도 표면에) 동화되기 때문이다. 앞서 언급된 것과 같이, 상이한 박테리아 및/또는 형질들에 대하여 독특한 표지들 및/또는 독특한 표지들의 조합을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 샘플에서의 염색된 박테리아를 결정할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질들을 결정할 수 있다.
예를 들어, 선택적 박테리아 및/또는 형질들은 그의 시각적 외관을 기초로 현미경 하에 결정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 자동화되어 결과가 컴퓨터 및 알고리즘을 사용하여 결정되도록 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 선택적 박테리아 및/또는 형질들은 슬라이드 스캐너를 사용하여 결정할 수 있다. 유사하게, 슬라이드 스캐너는 자동화되어 결과가 컴퓨터 및 알고리즘을 사용하여 결정되도록 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 선택적 박테리아 및/또는 형질들은 유세포분석기를 사용하여 결정할 수 있다. 유사하게, 유세포분석기는 자동화되어 결과가 컴퓨터 및 알고리즘을 사용하여 결정되도록 할 수 있다.
게다가, 염색된 세포의 결정에 적합한 임의의 다른 기기 또는 방법을 사용하여 본원에 개시된 본 발명 방법을 사용하여 형성된 프로브/표적 복합체들을 결정할 수 있다.
세포 형태:
여러 유형의 박테리아가 독특한 형태를 갖는다는 것에 본 발명의 장점이 있다. 박테리아의 표시에 사용되는 표지들 (예를 들어, 염색들) 이외에, 세포의 형태를 사용하여 박테리아의 정체를 확인하거나 또는 가능하게는 예를 들어 멀티플렉스 검정에서의 제2 수준의 분화를 도입할 수 있다.
예를 들어, 바실러스는 막대형인 경향이 있으며, 반면 스트렙토코쿠스는 구형인 경향이 있다 (www.en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_cell_structure#Cell_morphology 및 www.en.wikipedia.org/wiki/File:Bacterial_morphology_diagram.svg 참조). 몇몇 검정에서, 예를 들어 황색 염색된 막대형 세포를 결정하여 샘플에서의 선택적 그람-양성 박테리아의 존재, 위치 및/또는 양을 확인할 수 있다. 이 경우에서, 박테리아의 형태는 검정에서의 잡음 (다른 박테리아)으로부터 신호 (선택적 그람-양성 박테리아)를 구별 (따라서 진술)하는데 사용된다.
몇몇 (예를 들어, 멀티플렉스) 검정에서, 예를 들어 다수의 세포 유형들이 사용될 수 있으며, 여기서 상이한 형태의 2종 이상의 박테리아가 예를 들어 황색 마커로 염색된다. 이 경우에서, 2종의 선택적 박테리아의 존재, 위치 및/또는 양은 예를 들어 이들이 황색으로 염색되는지, 및 형태가 막대형 또는 구형인지를 기초로 결정될 수 있다. 물론, 이 방법론을 사용하는 분석은 다른 알려지고 구별가능한 형태의 박테리아를 사용하여 추가로 진전 (추가로 멀티플렉싱)될 수 있다.
형태와 관련하여 (비록 반드시 엄격한 세포 형태의 예를 필요로 하진 않지만), 몇몇 실시양태에서 염색 과정의 특징을 사용하여 결과를 확인하거나 또는 결정할 수도 있다. 예를 들어, 항체 프로브가 표면 항원과 상호작용하여 박테리아의 표면을 염색하고 (예를 들어, 항체-기반 박테리아-지정된 프로브의 사용), 제2의 독특하게 표지된 표적-지정된 것 (예를 들어, mRNA-지정된 프로브)이 박테리아 내부의 (예를 들어, 세포질에서의) 표적과 상호작용하여 이에 의해 박테리아의 내부를 염색하는 경우에, 독특한 염색 패턴이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 프로브가 적색이고, 표적 프로브가 녹색인 경우, 현미경을 사용하여 관찰되는 경우에 박테리아는 녹색 몸통 주변을 덮는 (또는 주위를 둘러싼) 적색으로서 나타날 것이다. 따라서, 샘플의 박테리아는 이들이 그의 특정 염색 패턴을 나타내는지를 기초로 확인 또는 결정된다.
상기로부터, 세포-형태 (및 염색 패턴)가 본원에 개시된 임의의 방법에서 결정하려고 하는 선택적 그람-양성 박테리아 또는 다른 선택적 박테리아의 결정에 사용될 수 있는 본 발명의 특징이라는 점이 명백하다. 그에 비해, 세포 형태는 무세포 분석에서 이용가능하지 않은데, 박테리아가 파괴되기 때문이다.
형질들:
상기 정의된 것과 같이, (본 발명의 목적을 위한) 형질은 박테리아의 염색체 DNA, mRNA 및/또는 천연 플라스미드의 분석에 의해 결정될 수 있는, 박테리아의 임의의 특징 또는 특성을 의미한다. "선택적 형질"은 특정 검정에서의 결정을 위해 선택되는 형질이다. 검정은 하나 초과의 선택적 형질을 결정하기 위해 설계될 수 있다.
형질이 박테리아의 유전자 구성을 기초로 하기 때문에, 박테리아는 박테리아에 의해 발현되는 (예를 들어, 나타나는)지 아니든지 간에 형질 (즉, 특징 또는 특성)을 갖는다고 표현된다 (즉, 형질은 본질적인 특성이다). 따라서, 상기 박테리아에서의 형질의 발현과 상이한 형질의 소유는 형질을 소유할 수 있지만 형질과 관련된 특징 또는 특성을 나타내지는 않을 수 있는데, 발현은 박테리아가 형질과 관련된 특징 또는 특성 (즉, 표현형)을 나타내는 경우를 의미하기 때문이다. 따라서, 이는 박테리아가 형질을 나타내는 경우에 이는 형질을 소유 (즉, 형질을 나타내는데 필요한 유전자 물질을 함유)하지만, 상기 박테리아는 형질을 나타내지 않는 형질을 소유할 수 있다는 점이 명백하다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 결정될 수 있는 많은 박테리아 형질들이 있다. 결정될 수 있는 형질들의 몇몇 비-제한적인 예에는 1) 항생제 내성; 2) 독소 생성; 및/또는 3) 병독성 (virulence)이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 형질 또는 형질들의 예는 각각 박테리아의 1) mecA 유전자, 또는 vanA 또는 vanB 유전자; 2) tcbD 유전자; 및/또는 3) lukF 및 lukS 유전자에서의 표적들을 사용하여 결정될 수 있다.
형질들이 염색체 DNA, mRNA 및 천연 플라스미드와 관련되어 있기 때문에, 몇몇 형질들에 대한 표적 분자(들)은 선택적 박테리아에서 매우 적은 카피수로 생성될 수 있다. 그람-양성 박테리아에 대한 과학 문헌에서, 이는 통상적으로 간접 표지들의 신호 증폭과 함께 다수의 표지들을 포함하는 프로브들의 사용에 의해 해결된다 (예를 들어, 문헌 [Hahn et al., Applied and Environmental Microbiology, 59(8): 2753-2757 at page 2754, col. 2]; [Wagner et al., "In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria", FEMS Microbiol. Lett., 160(1): 159-168 (Mar. 1998)]; 및 [Hoenerlage et al., "Detection of mRNA of nprM in Bacillus megaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization", Arch. Microbiol., 163: 235-241 (1995)] 참조; 또한 그람-음성 박테리아에 대한 검정에 대하여 문헌 [Coleman et al., J. Microbiological Methods, 71: 246-255 (2007)] (이 문헌에서, 단일 표지를 포함하는 mRNA-지정된 프로브가 사용되지만, 단 상기 표지는 근적외선 형광 염료이고, 긴 카메라 노출 시간이 이용되었음) 참조). 그러나, 출원인은, 예를 들어 단일 표지된 프로브들만을 사용 (여기서, 표지는 근적외선 형광 염료가 아님)하며 증폭 기법 (예를 들어, 신호 증폭 또는 핵산 증폭)을 사용하지 않고 전세포 검정 방식에서 그람-양성 박테리아에서의 적은 카피수의 mRNA 표적들의 결정과 관련된 형질들을 결정하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 몇몇 경우에서, 이는 전세포 검정 수행 이전에 (살아있는) 박테리아에서의 mRNA 생성의 관련된 유도로 달성되었다 (하기 "mRNA 생성 유도" 제목 참조).
특이성:
상기 언급된 것과 같이, 프로브/표적 복합체들은 결합의 특이성이 허용되는 조건들 하에 형성된다. 혼성화의 특이성 (즉, 혼성화 프로브와 핵산 표적과의 서열 특이적 결합)은 엄격성 (stringency) 및/또는 차단 전략(들)과 관련된 여러 요소의 기능이다. 또한, 결합의 특이성은 항체 결합 또는 임의의 다른 유형의 리간드-리간드 쌍의 구성원들의 결합에 적용된다. 혼성화 특이성과 마찬가지로, 항체와 항원과의 결합 (또는 리간드 쌍의 한 구성원과 또 다른 구성원과의 결합)의 특이성은 또한 조건 의존적이다. 실제로, 조건들이 특이성의 최적화를 위해 선택되어, 비-특이적 결합이 최소화되거나 또는 제거되도록 한다. 그럼에도 불구하고, 결합의 특이성은 결합 복합체를 형성하는 조성물의 성질 (예를 들어, 친화성)을 비롯한 많은 요소에도 의존하는 상대적인 용어인 것으로 이해된다. 하기에는 여러 조건들/고려사항의 비-제한적인 논의가 있다. 본원에서 제공되는 기재내용과 함께 단지 일반적인 실험만을 사용하여, 당업자들은 특이적 프로브들과 그의 각각의 표적과의 결합 (또한 혼성화)이 특이적이도록 하는 적합한 조건들을 달성할 수 있을 것이다 (따라서 방법의 시행이 정확하고 재현가능한 결과를 생성하도록 한다). 많은 경우에서, 이는 시판되는 완충액을 사용하여 달성될 수 있다.
차단 프로브들 :
혼성화 반응에서, 차단 프로브들 (핵산, 핵산 유사체, 핵산 모방체 또는 키메라로 제조됨)를 사용하여 프로브들과 비-표지와의 결합을 억제할 수 있으며, 이에 의해 프로브/표적 복합체들의 형성의 특이성을 개선시킬 수 있다. 특히 효과적인 차단 프로브들은 PNA 올리고머이다 (코울 (Coull) 등의 미국 특허 번호 6,110,676 (본원에 참조로 포함됨), 및 문헌 [Fiandaca et al. "PNA Blocker Probes Enhance Specificity In Probe Assays", Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, pp. 129-141, Horizon Scientific Press, Wymondham, UK, 1999)] 참조).
혼성화 조건들/엄격성:
당업자들은 혼성화의 엄격성을 도입하거나 또는 제어하는데 통상 사용되는 요소에는 포름아미드 농도 (또는 다른 화학 변성 시약), 염 농도 (즉, 이온 강도), 혼성화 온도, 계면활성제 농도, pH, 및 무질서제 (chaotrope)의 존재 또는 부재가 포함된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 차단 프로브들 (차단 프로브들의 논의에 대하여 직전의 단락 참조)은, 단지 엄격성 요소를 최적화하여 가능한 한계 이상으로 식별을 개선하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 프로브/표적 복합체를 형성하기 위한 최적의 엄격성은 흔히 여러 상기 언급된 엄격성 요소를 정하고 이후 단일 엄격성 요소의 변화의 효과를 결정하는 잘 알려진 기법에 의해 발견된다. 동일한 엄격성 요소를 조절하여, 이에 의해 핵산 모방체, 핵산 유사체 또는 키메라와 핵산 표적 (예를 들어, rRNA, mRNA 또는 염색체 DNA 내의 서열)과의 혼성화의 엄격성을 제어할 수 있지만, 단 몇몇 이들 변형 올리고머 (예를 들어, PNA)에 대하여 혼성화는 이온 강도에 상당히 독립적일 수 있는 것이 제외된다. 검정을 위한 최적의 또는 적합한 엄격성은 원하는 정도의 식별이 달성될 때까지 각 엄격성 요소의 조사에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 최적의 엄격성이 요구되지는 않는다. 그보다는, 요구되는 모든 것은 정확하고 재현가능한 결과를 수득하는데 필요한 정도까지 프로브들과 그의 각각의 표적들 이외와의 비-특이적 결합이 검정에서 최소화되는 것이다.
하기 제공되는 실시예에서, 혼성화는 혼성화 완충액을 사용하여 수행되었다. 언급된 것과 같이, 여러 혼성화 완충액이 시판된다. 이러한 완충액은 온도 제어와 함께 종종 적합한 혼성화 조건들을 제공한다.
결과에 대한 시간이 임상 샘플에 대해 특히 중요한 요소일 수 있기 때문에, 하기 제공되는 실시예에서 수행되는 혼성화 반응은 특히 이들이 5 내지 16시간이 아닌 2시간 동안에 수행 (mRNA-지정된 프로브들에 대하여)된다는 점에서 문헌 [Hahn et al.], [Wagner et al.] 및 [Hoenerlage et al.]에서의 반응과는 상당히 다르다.
적합한 항체 결합 조건들:
적합한 항체 결합 조건들은 항체와 그의 항원과의 특이적 결합에 적합한 조건들을 포함한다. 그의 항원과의 항체 결합에 영향을 미치는 (또는 리간드들 또는 리간드-리간드 복합체의 결합에 대한) 요소들은 혼성화에 대하여 상기 기재된 것들과 실질적으로 유사하며, 유사한 방식으로 최적화될 수 있다. 여러 항체에 대한 적합한 항체 결합 조건들은 당업자들에게 알려져 있다. 알려지지 않은 경우에 대해서는 적합한 항체 결합 조건들이 결정될 수 있다. 상기 언급된 것과 같이, 적합한 결합 완충액은 또한 시판된다.
따라서, 본원에서 제공되는 개시내용을 추가의 통상의 실험과 함께 또는 없이 사용하여, 당업자들은 적합한 항체 결합 조건들을 결정할 수 있다. 실무자에 대한 추가의 일반 지침을 목적으로, 항체의 제조 및 사용 방법은 문헌 [Molecular Probes Of The Nervous System, Volume 1, "Selected Methods For Antibody and Nucleic Acid Probes", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 by S. Hockfield et al.]을 비롯한 여러 참조문헌에서 발견할 수 있다.
전세포 검정에서의 결합 조건들의 조화:
본원에 개시된 방법을 실시하는 경우에, 당업자들은 혼성화 조건들, 항체 결합 조건들 및 다른 검정 조건들 (예를 들어, 리간드-리간드 결합에 대한 조건들)을 조화시키는 것이 유용하다는 것을 발견할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 혼성화 프로브들로의 세포의 염색은 항체 결합 사건과 동시에, 그 이전에 또는 그 이후에 수행될 수 있다. 동일한 변수 (pH, 염 농도 등)의 조정이 통상 수반되기 때문에, 통상의 실험의 도움만으로도, 당업자들은 조건들을 쉽게 조화시켜 검정이 만족스러운 결과를 생성하도록 할 수 있을 것이다. 단일 검정에서의 항체 프로브들 및 혼성화 프로브들의 사용에 대한 조건의 조화에 대한 몇몇 문제점 및 관련된 해결방안의 논의는 문헌 [Goldbard et al. (US 6,524,798)] 및 [Aβmus et al., "Improved In Situ Tracking of Rhizosphere Bacteria Using Dual Staining with Fluorescence-Labeled Antibodies and rRNA-Targeted Oligonucleotides", Microb. Ecol., 33: 32-40 (1997)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 비-핵산, 및 바람직하게는 PNA 프로브들의 사용이 조화 과정을 단순화시킬 수 있다는 것을 주목할 가치가 있는데, PNA 프로브들은 광범위한 조건들 하에서 상보적 핵산 (핵산/핵산 상호작용에 비해)과 결합하여, 이에 의해 조건들을 항체-항원 및/또는 다른 리간드-리간드 결합에 적합한 것들에 보다 근접하게 조정하도록 허용하기 때문이다.
RNase - 무함유 시약들:
RNase는 자연에서 발견되는, RNA를 분해하는 효소이다. 박테리아는 RNase 효소를 함유한다. 이들 RNase 효소는 박테리아가 사멸한 이후에도 오랫동안 예를 들어 고정화에 의해 활성을 유지할 수 있다. 선택적 박테리아 또는 선택적 형질을 결정하기 위해 사용되는 표적이 RNA 분자인 경우에, 전세포 검정에서 조사되는 박테리아에서의 잔류 RNase 활성은 표적 분자(들)을 활발히 분해할 수 있다. 표적 분자(들)이 적은 카피수의 분자인 경우에, 표적 분자들의 임의의 파괴는 검정의 신호를 유의하게 감소시킬 수 있다.
RNase 효소를 불활성화시키는 시판되는 여러 시약들이 있다. 이러한 시약들은 통상적으로 RNase 억제제로 지칭된다. 이러한 시판되는 한 RNase 억제제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드이다 (TCEP - 써모사이언티픽 (일리노이주 록포드 소재)으로부터의 제품 번호 77720).
RNase 억제제는 샘플을 처리하기 위해 사용되어, 박테리아 세포에서의 RNase 활성이 억제되어 RNA 표적들의 분해가 미연에 방지되도록 할 수 있다. RNase 억제제를 본 발명의 실시에서 사용되는 임의의 시약, 혼합물, 제제 및/또는 용액에 첨가하여, 상기 시약, 혼합물, 제제 및/또는 용액에서의 RNase 활성을 억제하고, 추가로 박테리아가 상기 시약, 혼합물, 제제 및/또는 용액과 접촉하는 경우에 박테리아에서의 임의의 분해 또는 표적 분자들을 억제할 수 있다. 상기 시약은 RNase-무함유인 것으로 표현된다. 그러나, RNase 억제제의 사용은 개시된 방법의 실시의 절대적인 요구사항은 아닌 것으로 이해된다.
mRNA 생성의 유도:
문헌은 표적으로서 mRNA가 박테리아 내부에서 결정되기 어렵다는 것을 시사하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Coleman et al., "mRNA-targeted fluorescent in-situ hybridization (FISH) of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification", J. Microbiological Methods, 71: 246-255 (2007)] 참조). 이는, 부분적으로는 박테리아 내부에서의 적은 카피수로부터 유발되며, 부분적으로는 mRNA의 고유한 불안정성으로부터 유발되는 것으로 보인다. 표적 mRNA 분자의 카피수를 증가시키기 위한 한 방법은 살아있는 박테리아에서 mRNA 생성을 유도하는 것이다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 일정 시간 동안 살아있는 박테리아를 mRNA 유도 시약 또는 시약들로 처리하고, 이후 이들을 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들로 처리하여 mRNA 생성이 박테리아 내부에서 유도된다. mRNA 유도 시약 또는 시약들로의 처리는 박테리아가 고정되기 전에 수행될 수 있다. mRNA 유도 시약 또는 시약들로의 처리는 다른 절차 (예컨대, RNase-무함유 시약들의 사용)와 조합되어, 박테리아 및/또는 형질들이 본원에 개시된 방법에 따라 결정되기 전에 박테리아에서의 mRNA 표적들이 실질적으로 분해되지 않도록 할 수 있다. 몇몇 경우에서, 박테리아는 검출가능하도록 (유도 없이) 충분한 mRNA를 생성할 것이라고 이해된다. 따라서, mRNA 유도는 개시된 방법의 실시의 절대적 요건은 아니다.
mRNA 안정화:
또한, mRNA 안정화 시약들을 사용하여 세포 mRNA를 안정화시키는 것이 가능하다. 따라서, mRNA 안정화 시약 또는 시약들을 본원에 개시된 방법의 실시에서 사용할 수 있다. mRNA 안정화 시약은, mRNA 안정화 시약이 세포에 존재하는 mRNA를 보존하는 반면, mRNA 유도 시약은 살아있는 세포가 보다 많은 mRNA를 생성하도록 한다는 점에서 mRNA 유도 시약과는 다르다. 그러나, 이러한 역할은 상호 배타적이지는 않은 것으로 이해된다. 즉, 시약이 mRNA 유도 시약이며 또한 mRNA 안정화 시약 둘 모두가 될 수 있는 것이 가능하다. 예를 들어, 몇몇 항생제는 mRNA 유도 시약 및 mRNA 안정화 시약 둘 모두일 수 있다. 그러나, mRNA 안정화 시약 또는 시약들의 사용은 개시된 방법의 실시의 절대적 요건은 아닌 것으로 이해된다.
박테리아 고정화:
전세포 검정은 고정된 박테리아를 사용하여 수행될 수 있다. 박테리아 고정화는 박테리아 세포를 처리하여 이에 의해 상기 박테리아 세포를 현미경 분석용으로 보존하고/거나 제조하는 과정이다. 고정된 박테리아는 이들을 분석하기 전에 소정 시간 동안 보관할 수 있다.
통상적으로 사용되는 고정화 시약은 파라포름알데히드이다. 다른 통상적으로 사용되는 고정화 시약들에는 글리옥살, 글루타르알데히드, 아연 염, 열, 알콜 (메탄올 및 에탄올), 산성 용액, 및 이들 중 임의의 2종 이상의 조합이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플과 고정화 시약 또는 시약들과의 접촉에 의해 실시될 수 있다. 세포를 고정하기 위한 통상적으로 사용되는 방법은 화력 고정 (flame fixation)으로도 불리며, 이 방법은 박테리아와 시약 또는 시약들과의 접촉을 수반할 수 있다 (또는 수반하지 않을 수 있음). 따라서, 본원에 개시된 방법은 샘플과 시약 또는 시약들과의 접촉을 포함할 수 있는 (또는 포함하지 않을 수 있는) 고정화 단계로 실시될 수 있다.
임의의 고정화 시약 또는 시약들은 고정화와 엄밀히 관련되지 않은 다른 조성물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 프로브들을 고정화 시약 또는 시약들에 첨가할 수 있다. 이 방식에서, 고정화 및 프로브/표적 형성은 동시에 수행될 수 있다. 시약들의 임의의 조합은 조합이 그의 의도된 목적에 대하여 개개의 시약 또는 시약들이 조합되지 않은 방식에 비해 보다 잘 수행되는 한 허용될 수 있다.
박테리아의 투과화 :
박테리아의 투과화는 세포막/세포벽을 변형시켜 검정을 수행하는데 필요한 시약들이 박테리아 내부로 (및 외부로) 통과할 수 있도록 하는 방법이다. 세포 투과화는 고정화와는 다르며, 여러 박테리아 종에 대하여, 세포 투과화가 요구되지는 않는다.
세포 투과화 시약들의 몇몇 비-제한적인 예에는 하나 이상의 효소, 예컨대 리소스타핀, 리소자임 및 프로테이나제 (예를 들어, 프로테이나제-K 및/또는 아크로모펩티다제 (achromopeptidase))를 포함하는 용액/제제가 포함된다. 박테리아의 투과화를 위하여, 상기 효소를 샘플과 접촉시키고, 이에 의해 세포막 및/또는 세포벽을 부분적으로 분해시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포 투과화 시약 또는 시약들은 화학 물질, 화학 물질의 혼합물 및 효소, 또는 임의의 순서로의 화학물질(들) 및 효소(들)로의 순차적 처리이다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 보통 박테리아에서 차단되는 (또는 서서히 통과하는) 시약들이 보다 자유롭게 박테리아 내부로 통과하도록 허용되며, 이에 의해 본원에 기재된 전세포 검정을 촉진하도록 하는 방식으로 그람-양성 박테리아 (예를 들어, 스타필로코쿠스 박테리아)를 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시킬 수 있다. 투과화 정도는 특정 검정의 실시를 위해 세포에 침투되어야 하는 시약들의 성질에 따른다. 일반적으로, 세포막/세포벽을 통과하여야 하는 분자의 크기가 증가할수록, 보다 큰 정도의 투과화가 수행되어야 한다. 너무 낮은 세포 투과성은 허위-음성 또는 허위-양성 결과를 유발할 수 있다 (문헌 [Pernthaler et al., "Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria", Applied and Environmental Microbiology, 70(9): 5426-5433 (Sept. 2004) at page 5429, col. 2] 참조). 그러나, 세포 투과화 시약 또는 시약들로의 과도한 처리는 박테리아 세포의 사멸을 유발할 수 있다 (문헌 [Furukawa et al., Microbes Environ, at page 231, col. 1-2] 참조). 박테리아 세포의 투과화를 위한 여러 프로토콜이 하기 단락 8에서 열거되는 여러 참조문헌에서 논의된다. 본원에서 제공되는 개시내용과 함께 통상의 실험을 사용하는 사람들은 임의의 특정 검정을 위한 박테리아의 투과화를 위한 적절한 조건들을 결정할 수 있다.
세척:
전세포 검정에서, 세척 단계는 앞선 단계 (또는 하위 단계)에서의 샘플에 적용되는 하나 이상의 성분 (또는 잉여 성분)을 제거하여 이에 의해 다음 방법 단계 (또는 하위 단계)에 대한 샘플을 제조하기 위해 방법의 하나 이상의 단계 (또는 하위 단계) 사이에서 통상적으로 수행된다. 세척 시약들은 종종 염 및/또는 계면활성제를 포함하는 완충 용액이다. 실제로, 세척 시약은 통상적으로 세척 완충액 또는 세척액으로도 지칭된다. 여러 세척 시약들이 시판된다.
세척 단계는 종종 샘플을 프로브들과 접촉시킨 이후에 실시되어, 그의 각각의 표적에 선택적으로 결합되지 않은 잉여 프로브가 세척 제거되도록 한다. 그러나, ISH-기반 검정에 대하여 세척이 없다는 보고가 있다 (미국 특허 번호 6,905,824 참조). 세척 단계가 필요한지의 여부는 부분적으로 검정에서 사용되는 고정화 시약 또는 시약들, 및 프로브 또는 프로브들의 성질, 및 결정이 이루어지는 수단에 따를 것이다.
증폭 기법:
본원에서 사용되는 "증폭 기법"은 검정에서 결정될 수 있는 표적 분자의 수를 증가시키거나 또는 표지로부터의 신호 방출량을 증가시켜 검출 방법을 개선시키기 위해 사용되는 방법/기법을 의미한다. 이에 따라, 이러한 특정 증폭 기법은 각각 표적 증폭 또는 신호 증폭으로도 지칭된다.
표적 증폭:
언급된 것과 같이, 표적 증폭에서, 표적 분자의 수는 증가된다. 통상 수행되는 표적 증폭 기법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이며, 이에 의해 표적 핵산 (또는 그의 부분)이 예를 들어 프라이머 쌍, 열안정성 중합효소, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 사용, 및 표적 분자 (및 그의 복제체)를 변성시키고 어닐링하는 열 주기를 수행하기 위한 방법에 의해 기하급수적 방식으로 카피된다. 표적 증폭 방법의 다른 비-제한적인 예에는 리가제 연쇄 반응 (LCR), 가닥 치환 증폭 (Strand Displacement Amplification; SDA) 및 전사-매개 증폭 (TMA)이 포함된다.
신호 증폭:
몇몇 실시양태에서, 표지의 신호 증폭은 방법의 검출 한계보다 나은 결과를 내기 위해 사용된다. 간단히 말해서, 신호 증폭은 세포 (즉, 박테리아)가 적은 카피수의 특정 표적을 가지며, 그로 인한 소수의 각각의 프로브/표적 복합체들을 갖는 경우에 통상적으로 사용된다. 특히, 결정 (예를 들어, 선택적 박테리아 또는 형질의 결정)이 박테리아 염색을 기초로 하는 경우에, 박테리아에서의 프로브/표적 복합체들의 수가 충분히 적은 경우에는 충분한 신호가 생성되지 않을 수 있다. 그러나, 프로브/표적 복합체와 관련된 단일 표지의 신호가 수배 증대 또는 증폭될 수 있는 경우에, 이는 박테리아 세포에서의 적은 카피수의 표적들에 대해서도 결정하는 것이 가능하게 된다.
여러 유형의 이용가능한 신호 증폭 기법이 있다. 신호 증폭은 직접 및 간접 표지 기법 모두에 적용될 수 있다. 신호 증폭의 몇몇 비-제한적인 예에는 티라미드 신호 증폭 (TSA, 촉매 리포터 침착법 (CARD)으로도 알려져 있음), 효소 표지된 형광 (ELF-97 - 제품 및 정보는 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 이용가능함), 분지형 DNA (bDNA) 신호 증폭, 및 회전-환형 증폭 (RCA)이 포함된다. 박테리아 내부에서 적은 카피수의 표적을 검출하기 위해 이들 신호 증폭 기법을 사용하기 위한 구체적인 방법은 하기 단락 8에서 열거되는 여러 참조문헌에서 보다 상세하게 논의된다.
5. 본 발명의 다양한 실시양태
본 교시가 지속적으로 작용가능하거나 또는 달리 명시되지 않는 한, 단계들의 순서 또는 특정 작용을 수행하는 순서는 중요하지 않다는 것을 이해해야 한다. 게다가, 일부 실시양태에서, 본 교시가 지속적으로 작용가능하거나 또는 달리 명시되지 않는 한, 2개 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
특히, 본 발명은 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및 박테리아의 선택적 형질의 결정 방법에 관한 것이다. 형질(들)은 샘플의 임의의 박테리아 (선택적 그람-양성 박테리아를 포함함)에서 발견될 수 있다. 형질(들)은 샘플의 그람-음성 박테리아에서 결정될 수 있다. 그러나 일반적으로 선택적 형질(들)은, (그람-음성 박테리아에서도 발견될 수 있지만) 전형적으로 선택적 그람-양성 박테리아와 공통적으로 관련된 형질일 것이다. 또한, 본원에 기재된 방법이 샘플 당 하나의 선택적 박테리아 및 하나의 선택적 형질의 결정으로 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 그보다는, 상기 방법은 샘플 내 다수의 박테리아 및/또는 샘플의 박테리아와 관련된 다수의 형질들의 결정에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 박테리아 및/또는 다수의 형질들은 멀티플렉스 검정을 이용하여 결정될 것이다. 멀티플렉스 검정은, 박테리아가 나타내는 상이한 염색 또는 염색들을 이용하여 박테리아 종류 및/또는 형질(들)을 결정하는 박테리아의 분별 염색법의 사용을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은, 샘플을, i) 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및 ii) 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 샘플은 종종 하나 이상의 그람-양성 박테리아를 포함하는 것으로 추정될 것이다. 하위단계 i) 및 ii)에서 확인되는 성분과 샘플을 접촉시키는 상기 단계가, 접촉시키는 순서가 제한적인 것으로 의도되지 않기 때문에 임의의 순서로 수행될 수 있거나 또는 동시에 접촉시킬 수 있음을 이해해야 한다. 상기 방법은, b) 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계; 및 c) 선택적 형질을 갖는 샘플 내 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은, i) 전세포 (즉, 무손상 세포)에 대해 수행되고; ii) 단계 (b) 및 (c)는 임의 순서로 또는 동시에 실행되고 (즉, 수행됨); iii) 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임).
일부 실시양태에서, 선택적 형질을 갖는 샘플의 박테리아를 결정하는 것에 초점이 맞춰진다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은, 박테리아를 포함하는 샘플을, 상기 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 상기 선택적 형질을 갖는 샘플의 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 i) 상기 방법은 전세포에 대해 수행되고; ii) 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다. 상기 방법은, 샘플을, 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기의 다양한 방법에 따르면, 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 선택적 형질의 결정은, 각각 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들 및 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들에 대한 프로브/표적 복합체 형성의 결정을 포함한다. 프로브/표적 복합체의 형성은 적합한 결합 조건 (또는 필요에 따라, 적합한 혼성화 조건) 하에서 달성된다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브/표적 복합체 또는 복합체들의 형성은, 박테리아의 염색의 성질에 기초하여 명백해질 것이다. 따라서, 상기의 실시양태에 대해, 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질은 개별 박테리아의 염색 분석에 의해 결정될 수 있다. 개별 박테리아의 염색은, 예를 들어 현미경, 슬라이드 스캐너 또는 유세포 분석기를 사용하여 모니터링 (결정)될 수 있다.
상기 방법은, 증폭 기법 (예를 들어, 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들에 연결된 표지 또는 표지들의 신호 증폭 또는 표적 증폭 기법, 예컨대 계내 PCR)을 사용하지 않으면서 수행될 수 있다. 상기 방법은, 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시키지 않으면서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단일 표지 (염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들 각각에 연결됨)는, 650 nm 미만의 최대 방출을 나타내는 형광 표지 또는 표지들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들만을 사용하여 수행될 수 있다 (여기서, 상기 프로브 또는 프로브들이 선택적 형질을 결정할 수 있음). 일부 실시양태에서, mRNA-지정된 단일 프로브만이 형질의 결정에 사용되거나, 또는 mRNA-지정된 단일 프로브가 관심있는 각각의 형질의 결정에 사용된다 (즉, 형질 당 하나의 프로브가 사용되어, 3종의 관심있는 형질을 가질 경우 3종의 프로브가 사용될 것임). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 mRNA-지정된 표지된 프로브들의 혼합물을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 각각의 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들은, 650 nm 미만의 최대 방출을 나타내는 형광 표지 또는 표지들이다.
일부 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브는 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들의 신호 증폭 없이 수행된다. 일부 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브는 단일 표지를 포함하고, 상기 방법은, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 단일 표지의 신호 증폭 없이 수행된다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 항체-기반이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은, 선택적 그람-양성 박테리아 내에서 또는 표면상에서 발견되는 항원이다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은 선택적 그람-양성 박테리아의 rRNA 내에서 발견되는 핵염기 서열이다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들이다. 일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 조절 RNA (예를 들어, sRNA 또는 aRNA)에 관한 것이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은, 각각 mRNA 또는 조절 RNA (예를 들어, sRNA 또는 aRNA)의 또는 이 내부의 핵염기 서열이다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 표지 또는 표지들로 표지된다. 일부 실시양태에서, 각각의 박테리아-지정된 프로브는 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지된다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들은 형광이고, 650 nm 미만의 최대 방출을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들 중 하나 이상은 형광이고, 650 nm 이상의 최대 방출을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기에 처음으로 기재된 방법의 수행은, 단계 (b) 및 (c)의 분석에 기초하여, 선택적 형질을 또한 갖는 샘플의 임의의 선택적 그람-양성 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함한다. "단계 (b) 및 (c)의 분석"은, 추론법을 적용하여, 상기 단계에서 선택적 형질을 또한 갖는 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아가 어떤 것인지 알아낼 수 있는, 단계 (b) 및 (c)에서의 결정(들)의 분석을 지칭한다.
샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 모두가 선택적 형질을 가지지는 않을 것이라는 것을 이해해야 한다 (사실, 어떠한 선택적 그람-양성 박테리아도 선택적 형질을 가지지 않을 수 있음). 예를 들어, 샘플은 혼합 집단일 수 있으므로, 선택적 형질을 갖는 선택적 그람-양성 박테리아뿐만 아니라 선택적 형질을 갖지 않는 선택적 그람-양성 박테리아 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택적 그람-양성 박테리아 중 모두가 또는 실질적으로 모두가 선택적 형질을 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 추가의 다양한 단계 및/또는 시약 없이 또는 이를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세척 단계는, 샘플을 하나 이상의 세척 시약들과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 고정화 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, mRNA 유도 시약 또는 시약들은 선택적 형질과 관련된 비-표면 단백질의 생성을 유도할 수 있고, 이는 선택적 형질에 대한 분석의 민감도 및/또는 정확도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상기 시약 각각을, 샘플과 1회 이상 접촉시키며 동일한 샘플에 적용할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 샘플을 다양한 시약과 접촉시키는 것은, 선택적 박테리아 및/또는 형질의 정확한 결정을 가능하게 하는 임의의 순서로 (또는 동시에) 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 RNase-무함유 검정으로서 수행될 수 있다. 전형적으로 이는, 샘플을 RNase 활성을 억제하는 시약 또는 시약들과 접촉시키는 데 사용되는 모든 시약의 사용을 포함한다. 유사하게, 샘플 그 자체가, RNase 활성을 억제하는 동일하거나 또는 상이한 시약 또는 시약들과 접촉될 수 있다.
일부 실시양태에서, 통상적으로 수행되는 하나 이상의 단계는 생략된다. 예를 들어, 혼성화 검정에서, 샘플을 혼성화 프로브 또는 프로브들과 접촉시키기 전에, 통상적으로 전-혼성화 단계가 수행된다. 하나 이상의 혼성화 프로브가 사용되는 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전-혼성화 단계 없이 수행된다. 항체 프로브 또는 프로브들이 사용되는 경우, 샘플을 상기 항체 프로브 또는 프로브들과 접촉시키기 전에 차단 단계가 종종 수행되지만 (또는 수행되지 않음), 이 단계는 생략될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 투과화 단계는 생략된다. 일부 실시양태에서, 세척 단계 또는 단계들은 생략된다. 실제로, 통상적으로 수행되는 모든 단계가 생략될 수 있으며, 이러한 생략은 상기 방법이 부정확한 결과를 내는 것의 원인이 되지 않는다.
일부 실시양태에서, 모든 프로브들은 표지된다. 일부 실시양태에서, 모든 표지들은 형광 표지들이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 모든 프로브들이 혼성화 프로브들이기 때문에 (즉, 이들은 이들 각각의 표적에 혼성화됨), 계내 혼성화 (ISH) 검정으로서 수행된다. 일부 실시양태에서, 모든 프로브들은 혼성화 프로브들이고, 모든 표지들은 형광 표지들이다. 이러한 경우에, 상기 방법은 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정으로서 수행된다.
일부 실시양태에서, 선택적 형질은, 1) 항생제 내성; 2) 독소 생성; 및/또는 3) 병독성과 관련될 수 있다. 예를 들어, 선택적 형질은 각각 박테리아의 1) mecA 유전자, 또는 vanA 또는 vanB 유전자; 2) tcdB 유전자; 및/또는 3) lukF 및 lukS 유전자의 존재와 관련될 수 있다. 따라서, 선택적 형질은, 선택적 그람-양성 박테리아 (또는 샘플의 다른 박테리아) 내 각각의 박테리아의 1) mecA 유전자, 또는 vanA 또는 vanB 유전자; 2) tcdB 유전자; 및/또는 3) lukF 및 lukS 유전자가 존재하는지를 결정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 초과의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 선택적 형질이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 멀티플렉싱에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 샘플의 재프로빙 순환에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 샘플의 멀티플렉싱 및 재프로빙 순환 둘 모두에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 상기 방법은, 샘플을, 1) 샘플 내 제2 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및/또는 2) 샘플의 임의의 박테리아 ((제1) 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 제2 선택적 그람-양성 박테리아를 포함함)가 가질 수 있는 제2 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 제2 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 상기 방법이 또한, 샘플을 하나 이상의 추가의 선택적 박테리아 및/또는 선택적 형질에 고정된 추가의 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계에 의해 수행될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 보다 구체적으로는, 샘플 내 하나 이상의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아, 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA)의 결정에 관한 것이다. 상기의 "도입"에서 제시된 바와 같이, 임상 샘플 내의, 특히 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아 및 임의로 다른 메티실린-내성 박테리아 (예컨대, 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA))를 효율적으로 결정할 수 있는 것은 많은 영역의 환자 치료에 있어서 중요하다.
따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은, a) 샘플을, i) 샘플 내 에스. 아우레우스 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및 ii) 샘플의 박테리아 내 메티실린-내성을 결정할 수 있는 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법 또는 방법들에 관한 것이다. 샘플은 종종 하나 이상의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아를 포함하는 것으로 추정될 것이다. 샘플을 단계 a), 하위단계 i) 및 ii)에서 확인되는 성분과 접촉시키는 상기 단계는, 접촉시키는 순서가 제한적인 것으로 의도되지 않기 때문에, 임의의 순서로 수행될 수 있거나 또는 동시에 접촉시킬 수 있음을 이해해야 한다. 상기 방법은, b) 샘플 내 하나 이상의 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아 (즉, 선택적 그람-양성 박테리아)를 결정하는 단계; 및 c) 메티실린-내성 (즉, 형질)을 갖는 샘플의 하나 이상의 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기의 결정은, 적합한 결합 조건 (또는 필요에 따라, 적합한 혼성화 조건) 하에서, 박테리아 내 프로브와 이들 각각의 표적 사이의 프로브/표적 복합체 형태의 형성을 결정함으로써 수행된다.
상기 방법은 i) 전세포 (즉, 무손상 세포)에 대해 수행되고; ii) 단계 (b) 및 (c)는 임의 순서로 또는 동시에 실행된다. 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 각각 단일 표지 또는 이중 표지를 포함하는 것 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임)은, 상기 방법의 요구사항은 아니다 (그러나, 이는 선택적 제한사항일 수 있음).
일부 실시양태에서, 선택적 형질 (즉, 메티실린-내성)을 갖는 샘플의 박테리아를 결정하는 것에 초점이 맞춰진다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은, 샘플을 상기 샘플의 박테리아 내 메티실린-내성을 결정할 수 있는 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계; 및 메티실린-내성을 갖는 상기 샘플의 하나 이상의 박테리아를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 전세포에 대해 수행된다. 박테리아는 그람-양성 박테리아일 수 있다. 상기 방법은, 샘플을, 상기 샘플 내 에스. 아우레우스 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계 및 상기 샘플 내 하나 이상의 에스. 아우레우스 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은, 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들에 연결된 표지 또는 표지들의 신호 증폭을 사용하지 않으면서 수행될 수 있다. 그러나, 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함하는 경우, 상기의 표지 또는 표지들은 형광일 수 있고, 650 nm 미만, 650 nm, 또는 650 nm 초과의 최대 방출을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 어떠한 증폭 기법도 이용하지 않으면서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시키지 않으면서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들만을 사용하여 수행될 수 있다 (상기 프로브 또는 프로브들은 메티실린-내성과 관련된 mRNA를 결정할 수 있음). 일부 실시양태에서, mRNA-지정된 단일 프로브만이 메티실린-내성의 결정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 mRNA-지정된 프로브들 (즉, 각각 하나 또는 2개의 표지들로 표지될 수 있는, mRNA-지정된 프로브들의 혼합물)이 메티실린-내성의 결정에 사용된다.
일부 실시양태에서, 각각의 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들은 형광이고, 650 nm 미만, 650 nm, 또는 650 초과의 최대 방출을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브는 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함한다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들의 신호 증폭 없이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브는 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함하고 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임), 상기 방법은, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 단일 표지의 신호 증폭 없이 수행된다. 일부 실시양태에서, 각각의 염색체 DNA-및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브는 하나 이상의 표지를 포함하고, 상기 방법은, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들의 신호 증폭을 (직접 또는 간접적으로) 이용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 항체-기반이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은, 선택적 그람-양성 박테리아 내에서 또는 표면상에서 발견되는 항원이다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 rRNA-지정된 프로브 또는 프로브들이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은, 선택적 그람-양성 박테리아의 rRNA 내에서 발견되는 핵염기 서열이다. 임상 샘플 내 에스. 아우레우스 박테리아의 결정에 적합한 rRNA-지정된 프로브가 시판되고 있고, 그의 용도를 기재하는 연구는 문헌 [Forrest et al., "Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58: 154-158 (2006)]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은, mRNA-지정되거나 또는 다른 조절 RNA (예를 들어, sRNA 또는 aRNA)에 지정된 프로브 또는 프로브들이다. 이에 따라, 각각의 프로브에 대한 표적은, 각각 mRNA 또는 조절 RNA (예를 들어, sRNA 또는 aRNA)의 (또는 이 내부의) 핵염기 서열이다.
일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 표지 또는 표지들로 표지된다. 일부 실시양태에서, 각각의 박테리아-지정된 프로브는 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지된다 (즉, 각각의 프로브는 단일 표지되거나 또는 이중 표지된 프로브임). 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들은 형광이고, 650 nm 미만의 최대 방출을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 표지 또는 표지들 중 하나 이상은 형광이고, 650 nm 이상의 최대 방출을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 처음 개시된, 구체적으로 메티실린 내성 결정에 관련된 방법의 수행은, 단계 (b) 및 (c)의 분석에 기초하여 샘플의 임의의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함한다. "단계 (b) 및 (c)의 분석"은, 추론법을 적용하여, 상기 단계에서 샘플의 에스. 아우레우스 박테리아가 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아임을 알아낼 수 있는, 단계 (b) 및 (c)에서의 결정(들)의 분석을 지칭한다.
일부 샘플에서, 샘플의 에스. 아우레우스 박테리아 모두가 메티실린-내성은 아닐 것이라는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 샘플은 혼합 집단일 수 있으므로, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아, 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS), 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA) 박테리아를 포함할 수 있다. 문헌 [Groebner et al. at page 1691, col. 1]에서 언급된 바와 같이, 비디 진옴TM스타프에스알 (BD GeneOhm™ StaphSR) 검정은 MRSA와 MSSA의 혼합 집단을 포함하는 샘플을 구별할 수 없다. 본원에 개시된 전세포 방법 (예를 들어, 실시예 10을 참고함)을 이용하여 혼합 집단을 적절히 특성화할 수 있는 것은 개별 박테리아의 종류 및 형질을 결정할 수 있기 때문에, 본 발명의 장점이다.
일부 실시양태에서, 샘플의 박테리아의 모두가 또는 실질적으로 모두가 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아일 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플의 박테리아 중 어떤 것도 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아가 아닌 경우, 병원 비용을 감소시키도록 환자 (샘플을 채취했을 수 있음)의 치료 체제를 변경할 수 있다 (문헌 [Forrest et al.]을 다시 참고함).
일부 실시양태에서, 상기 방법은 추가의 다양한 단계 및/또는 시약 없이 또는 이를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세척 단계는, 샘플을 하나 이상의 세척 시약과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 고정화 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉된다. 일부 실시양태에서, mRNA 유도 시약 또는 시약들은 선택적 형질과 관련된 비-표면 단백질의 생성을 유도할 수 있고, 이는 선택적 형질에 대한 분석의 민감도 및/또는 정확도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상기 시약 각각을, 샘플과 1회 이상 접촉시키며 동일한 샘플에 적용할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 샘플을 다양한 시약과 접촉시키는 것은, 선택적 박테리아 및/또는 형질의 정확한 결정을 가능하게 하는 임의의 순서로 (또는 동시에) 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 RNase-무함유 검정으로서 수행된다. 전형적으로 이는, RNase 활성을 억제하는 시약 또는 시약들과 샘플을 접촉시키는 데 사용되는 모든 시약의 사용을 포함한다. 유사하게, 샘플 그 자체가, RNase 활성을 억제하는 동일하거나 또는 상이한 시약 또는 시약들과 접촉될 수 있다.
일부 실시양태에서, 통상적으로 수행되는 하나 이상의 단계는 생략된다. 예를 들어, 혼성화 검정에서, 샘플을 혼성화 프로브 또는 프로브들과 접촉시키기 전에, 통상적으로 전-혼성화 단계가 수행된다. 하나 이상의 혼성화 프로브가 사용되는 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전-혼성화 단계 없이 수행된다. 항체 프로브 또는 프로브들이 사용되는 경우, 샘플을 상기 항체 프로브 또는 프로브들과 접촉시키기 전에 차단 단계가 종종 수행되지만 (또는 수행되지 않음), 이 단계는 생략될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 투과화 단계는 생략된다. 일부 실시양태에서, 세척 단계 또는 단계들은 생략된다. 실제로, 통상적으로 수행되는 모든 단계는 생략될 수 있으며, 이러한 생략은 상기 방법이 부정확한 결과를 내는 것의 원인이 되지 않는다.
일부 실시양태에서, 모든 프로브들은 표지된다. 일부 실시양태에서, 모든 표지들은 형광 표지들이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 모든 프로브들이 혼성화 프로브들이기 때문에 (즉, 이들은 이들 각각의 표적에 혼성화됨), 계내 혼성화 (ISH) 검정으로서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모든 프로브들은 혼성화 프로브들이고, 모든 표지들은 형광 표지들이다. 이러한 경우에, 상기 방법은 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정으로서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 처음 개시된, 구체적으로 메티실린 내성 결정에 관련된 방법의 수행은, α) 샘플을, 샘플 내 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (CNS) 박테리아를 결정할 수 있는 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계 (여기서, 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 샘플 내 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아를 확인할 수 있는 상기 박테리아-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들로부터 독립적으로 검출가능함); β) 샘플 내 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (CNS) 박테리아 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 이외의 스타필로코쿠스인, 통상적 피부 박테리아인 에스. 에피데르미디스 (S. epidermidis)를 결정하는 단계; 및 χ) 단계 (β) 및 (c) 및 임의로 단계 (b)의 분석에 기초하여 샘플 내 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함한다. "단계 (β) 및 (c) 및 임의로 단계 (b)의 분석"은, 추론법을 적용하여, 상기 단계에서 샘플 내 박테리아가 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS)임을 알아낼 수 있는, 단계 (β) 및 (c) 및 임의로 단계 (b)에서의 결정(들)의 분석을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 및 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아 둘 모두가 동일한 샘플에서 결정된다. 일부 실시양태에서, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아 또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA)가 동일한 샘플에서 결정된다. 일부 실시양태에서, 샘플의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아, 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA)의 혼합 집단이 결정된다 (실시예 10을 참고함). 일부 실시양태에서, 이러한 결정은 동시에 수행될 수 있다. 이러한 검정 (멀티플렉스 형식으로 수행됨)의 예는 실시예 3에서 발견할 수 있다. 도 3의 영상을 이용한 박테리아 및 형질의 결정 (실시예 3에서 논의되는 바와 같음)이 자동화될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 단계 (b), (β), (c) 및 (χ)의 분석에 기초하여 샘플을 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 및/또는 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아에 대해 분균일 또는 균일로서 특성화하는 단계를 더 포함한다. "단계 (b), (β), (c) 및 (χ)의 분석"은, 추론법을 적용하여, 상기 단계에서 샘플의 메티실린-내성 박테리아가 메티실린-내성 형질에 대해 불균일한지 균일한지를 알아낼 수 있는, 단계 (b), (β), (c) 및 (χ)에서의 결정(들)의 분석을 지칭한다.
상기 분석의 수행 시, 이는, 샘플 내 다른 선택적 박테리아와 비교하여, 선택적 형질에 관하여 샘플 내 선택적 박테리아가 나타낸 염색의 양 (예를 들어, 강도)을 결정함으로써 가능할 수 있다. 다양한 선택적 박테리아에 대하여, 선택적 형질에 관한 염색의 강도가 실질적으로 동일한 경우, 샘플의 다양한 박테리아 내 형질의 발현은 균일하다. 그러나, 다양한 선택적 박테리아에 대하여, 선택적 형질에 관한 염색의 강도가 샘플의 다양한 박테리아 간에 상이한 경우, 샘플의 다양한 박테리아 내 형질의 발현은 불균일하다.
게다가, 일부 실시양태에서, 샘플이 MRSA에 대해 불균일한지 균일한지를 결정하는 것은, 예를 들어 샘플의 박테리아를 상이한 배지 (여기서, 각각의 상이한 배지는 상이한 농도의 항생제 또는 항생제들을 포함함)의 배양액에서 성장시키는 것과 같은 추가의 시험에 대한 언급을 요구할 수 있다 (또는 적어도 언급하는 것이 바람직할 수 있음). 이러한 방식으로, 배지 내 상이한 수준의 항생제(들)의 콜로니 수에 기초하여, 샘플의 선택적 박테리아가 상이한 수준의 메티실린-내성 형질의 발현을 나타내는 것을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 샘플을 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 샘플을 RNase 억제제로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전-혼성화 단계는 수행되지 않는다.
일부 실시양태에서, 모든 표지들은 형광 표지들이고, 상기 방법은 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정이다. 일부 실시양태에서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들은 직접 결정된다.
일부 실시양태에서, 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 PNA이다. 일부 실시양태에서, 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 10 내지 20 핵염기 소단위 길이이다. 일부 실시양태에서, 신호 증폭은, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들의 신호를 직접 또는 간접적으로 증폭시키는 데 사용된다.
본 출원인은 놀랍게도, 본원에 개시된 다양한 방법이 세포 투과화 단계를 수행하지 않으면서 수행될 수 있다는 것을 결정했다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은, a) 샘플을, i) 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및 ii) 상기 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, b) 상기 샘플 내 상기 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계; 및 c) 상기 선택적 형질을 갖는 상기 샘플의 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서, i) 상기 방법은 전세포에 대해 수행되고; ii) 단계 (b) 및 (c)는 임의 순서로 또는 동시에 실행되고; iii) 상기 방법은 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들로 처리하지 않으면서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 어떠한 신호 증폭도 수행하지 않으면서 수행된다. 일부 실시양태에서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들 및 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 각각 단일 또는 이중 표지를 포함하고, 상기의 결정은 상기 표지의 직접적인 검출에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 에스. 아우레우스 박테리아 및 메티실린-내성을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 따라서, 단계 (a)는 보다 구체적으로는, a) 샘플을, i) 상기 샘플 내 에스. 아우레우스 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및 ii) 상기 샘플의 박테리아 내 메티실린-내성을 결정할 수 있는 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계에 관련될 것이다. 유사하게, 단계 (b) 및 (c)는 보다 구체적으로는, 상기 샘플 내 하나 이상의 에스. 아우레우스 박테리아를 결정하는 단계; 및 c) 메티실린-내성을 갖는 상기 샘플의 하나 이상의 박테리아를 결정하는 단계에 관련될 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 샘플 내 박테리아의 형질 또는 형질들의 결정에 초점을 맞추는 것에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서 상기 방법은, 박테리아를 포함하는 샘플을, 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계; 및 상기 선택적 형질을 갖는 상기 샘플의 박테리아를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법은 전세포에 대해 수행되며; ii) 상기 방법은 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들로 처리하지 않으면서 수행된다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 선택적 형질 및/또는 선택적 그람-양성 박테리아의 결정에 유용한 프로브 혼합물, 조성물 및/또는 제제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 혼합물의 각각의 mRNA-지정된 프로브는 단일 표지된 프로브 또는 이중 표지된 프로브이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은, 샘플의 선택적 박테리아, 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아에 존재하는 것으로 공지된 선택적 형질을 결정할 수 있는 2종 이상의 mRNA-지정된 프로브들을 포함하는 혼합물, 조성물 및/또는 제제에 관한 것이다. 상기 mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들은 상기 박테리아의 mRNA의 분자 또는 분자들 내에서, 상기 선택적 형질과 관련된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 혼합물은, 하나 이상의 박테리아-지정된 프로브 (예를 들어, 샘플 내 선택적 박테리아를 결정할 수 있는 rRNA-지정된 박테리아-지정된 프로브)를 더 포함할 수 있다. mRNA-지정된 프로브 또는 프로브들 및/또는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은, PNA 프로브일 수 있다. 상기 혼합물, 조성물 및/또는 제제는, 예를 들어 본원에 개시된 방법의 혼성화 (접촉) 단계에 사용되어 샘플을 상기 혼합물, 조성물 또는 제제와 접촉시킴으로써, 적절하게 박테리아 종류 및 형질을 나타내는 것으로 결정될 수 있는 프로브/표적 복합체를 생성할 수 있다.
6. 본 발명의 실시양태의 다른 장점
전세포 검정 형식을 이용하여, 단일 샘플 내 박테리아의 선택적 그람-양성 박테리아 및 선택적 형질(들) 둘 모두를 (선택적 형질이 선택적 그람-양성 박테리아와 관련되는지에 대하여) 효율적으로 결정할 수 있는 것이, 본 발명의 일부 실시양태의 장점이다. 전세포 검정 형식을 이용하여, 특히, 1) 세포 형태에 관한 정보를 유지하여, 박테리아 종과 같은 정보를 추가로 확인하는 것 (즉, 결정된 선택적 박테리아가 예상되는 세포 형태를 갖는 것을 확인하는 것); 2) 샘플이, 박테리아의 혼합 집단 또는 관심있는 박테리아를 포함하는지에 대해 결정하는 것; 3) 샘플이 선택적 박테리아 또는 선택적 형질에 대하여 불균일한지 균일한지에 대하여 결정하는 것; 및/또는 4) 샘플 내 다양한 종류의 박테리아를 (절대적으로 또는 샘플 내 다른 박테리아에 대하여) 수량화하는 것이 가능하다. 이러한 모든 것은, 예를 들어 검정에서 결정되어야 하는 특성들에 기초하여, 박테리아의 분별 염색법에 의한 멀티플렉스 형식으로 달성될 수 있다. 또한, 상기 방법은 결정 단계(들)의 자동화 (멀티플렉스 수행 모드의 자동화를 포함함)를 허용하여, 알고리즘의 실행에 따라 결과가 제공될 수 있다.
본 출원인은, 일부 실시양태에서, 1) 효소 처리에 의한 세포 투과화; 2) 증폭 기법 (예를 들어, 신호 증폭 또는 표적 증폭); 및/또는 3) 650 nm 이상의 최대 방출을 나타내는 형광 표지를 사용하지 않고, 단일 표지되고/거나 이중 표지된 프로브 (프로브는 드 노보 방법에 의해 생성된 짧은 (10 내지 20 소단위 길이) 프로브일 수 있음)를 사용하여 무손상 그람-양성 박테리아 내 mRNA의 결정이 가능함을 증명하였다. 일부 실시양태에서, mRNA-지정된 프로브들의 혼합물은, 박테리아 내 mRNA 표적의 수가 매우 적을 것으로 예상되는 신호를 증가시키는 데 사용될 수 있다.
게다가, 일부 실시양태에서, 드 노보 합성에 의해 제조된 짧은 (효소 방법에 의해 제조된 전사 프로브와 비교하여) 프로브를 사용하여 박테리아 내 mRNA 표적의 결정이 가능하다는 것이 장점이다. 또한, 일부 실시양태에서, 프로브 혼성화 단계를, 하기에 열거된 다양한 참고문헌에 기재되어 있는 5 내지 16시간과 비교하여 2시간 미만으로 줄이는 것이 가능하다.
실제로, 과학 문헌은 그람-양성 박테리아 내 mRNA 검출의 어려움을 인정했다 (문헌 [Hahn et al., "Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Diqoxiqenin-Labeled Probes", Applied and Environmental Microbiology, 59(8): 2753-2757 (Aug. 1993)]; [Wagner et al., "In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria", FEMS Microbiol. Lett, 160(1): 159-168 (Mar. 1998)]; 및 [Hoenerlage et al., "Detection of mRNA of nprM in Bacillus meqaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization", Arch. Microbiol., 163: 235-241 (1995)]의 관련 논의 위의 "도입" 부분을 참고함).
문헌은, 일반적으로 그람-양성 박테리아 상에서의 전세포 검정 수행의 어려움과 관련된 다양한 보고를 함유하고 있지만 (그리고 메티실린-내성 박테리아 (예를 들어, MRSA) 결정의 임상적인 유의성에도 불구하고), MRSA 및/또는 MR-CNS 결정에 대한 전세포 검정의 어떠한 예도 나타내지 않는다. 무손상 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아 내 메티실린-내성 형질의 증거 결정이 매우 어려울 수 있다. 그럼에도, 전세포 검정 형식으로, 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들 (선택적-박테리아에 대한 프로브 또는 프로브들과 조합함)을 사용하여 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 (적절하게 MRSA 및 MR-CNS를 포함함) 내 메티실린-내성의 형질의 결정이 가능하다는 것이, 본 발명의 장점이다. 상기 방법은, 병원 내 MRSA를 갖는 환자의 확산 및 치료와 관련한 우려를 고려할 때, 임상적 검정으로서 큰 유용성을 가질 수 있다.
샘플의 박테리아의 불균일성/균일성이 샘플의 시각적 분석에 기초하여 결정될 수 있다는 것이 전세포 형식의 장점이다. 따라서, 본원에 개시된 방법을 수행하여 샘플의 박테리아의 형질 또는 형질들의 불균일성/균일성을 결정할 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 환자 치료에 관한 그의 임상적 중요성에 대하여, 이러한 장점은, 샘플의 박테리아의 메티실린-내성의 불균일성/균일성의 결정에 대하여 특히 유용한 것으로 입증될 수 있다.
7. 실시예
본 교시의 측면들은 하기 실시예의 관점에서 추가로 이해될 수 있고, 하기 실시예는 어떠한 방식으로도 본 기법의 범주를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
실시예 1: MRSA 의 결정
달리 언급되지 않는 한, 모든 절차를 실온에서 (RT)에서 수행하였다. 혼성화 완충액 (HB), 세척 완충액 (WB), 파라포름알데히드 (PAF), RNase-무함유 투과화 용액 (PS), 검경용 매질 (Mounting Media) (MM)의 조성 뿐만 아니라, 하기 실시예 1 내지 4에 사용된 다양한 박테리아 균주 (예를 들어, 에스. 아우레우스 및 다른 스타필로코쿠스 균주), PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM)의 기재가 부록 I (하기)에 제공된다.
세포 성장, 고정화 및 투과화 :
에스. 아우레우스 박테리아를 트립틱 소이 브로스 (Tryptic Soy Broth) (TSB)내로 접종하고, 37℃에서 밤새 (16시간) 성장시켰다. 이어서, TSB로 희석된 (10배) 배양액에서, 0.5 μg/mL 옥사실린을 사용하여 밤새 mecA mRNA가 생성되도록 유도하였다. 옥사실린-유도된 세포를 2％ 멸균 글루코스 용액 중에 희석시키고 (20배), 세포원심분리에 의해 유리 슬라이드 상에 침착시켰다. 침착된 세포를 30분 동안 10％ 파라포름알데히드 (PAF)로 고정하였다. 이어서, 유리 알데히드 기를 30분 동안 0.1 M 글리신을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS, 10 mM 포스페이트 pH=7.4, 0.9％ NaCl)로 차단하였다. 이어서, 슬라이드를 0.05％ 트윈(Tween) 20 (PBS-트윈)을 함유하는 PBS로 세정하고, 대기 건조시켰다. 이어서, RNase-무함유 투과화 용액 (PS) 0.075 mL를 침착된 세포 상에 도포하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 70％ 메탄올로 세정하고, 대기 건조시켰다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
이어서, PNA 프로브 (프로브 농도는 하기를 참고함)를 함유하는 혼성화 완충액 (HB) 25 μL를 슬라이드 상에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 이어서, 세포 를 혼성화 챔버에서 2시간 동안 55℃에서 혼성화하였다. 혼성화 후, 슬라이드를 55℃에서 30분 동안 세척 완충액 (WB)으로 세척하였다. 1 μg/mL 4'-6-디아미도-2-페닐인돌 (DAPI)을 함유한 검경용 매질 (MM) 한 방울과 커버 슬립을 건조된 표본 상에 도포한 다음, 슬라이드-침착된 세포를 FM으로 조사하였다.
프로브 농도:
1) 5종의 플루오레세인-표지된 PNA 프로브들 (각각 220, 280, 120, 95 및 79 nM 농도의 프로브 1, 2, 3, 4 및 5 (하기 표 1을 참고함))의 혼합물. 프로브의 조합 농도는 794 nM이었다. (슬라이드 A 및 C)
2) 플루오레세인-표지된 이. 콜라이 특이적 rRNA-지정된 단일 프로브 (프로브 6, 농도 750 nM). 이를 대조 프로브로서 사용하였다. (슬라이드 B)
3) 플루오레세인-표지된 단일 PNA 프로브 (프로브 2, 농도 750 nM). (슬라이드 D)
4) 바이오틴-표지된* PNA 프로브 (프로브 7, 농도 5000 nM)와 조합한 플루오레세인-표지된 단일 PNA 프로브 (프로브 2, 농도 300 nM). 혼성화의 특이성을 입증하기 위해, 16.6배 과량의 비-표지된 프로브를 대조 실험에 사용하였다. (슬라이드 E)
* 상기의 경우, 프로브를 바이오틴으로 우발적으로 표지하였다. 분석을 FISH 검정으로서 수행하였고 바이오틴이 비-형광이기 때문에, 이러한 프로브는 비-표지된 프로브와 기능적으로 동등하다.
FM 분석으로부터 얻은 영상을 도 1에 나타냈고, 이는 5개의 슬라이드 (슬라이드 A 내지 E)로부터 얻은 영상을 함유한다. 슬라이드 내 가시성 콜로니 중 일부 (모두는 아님)에 동그라미를 표시하였다 (슬라이드 C 및 D의 동그라미 표시된 부분을 참고함). 이는, 컬러 사본 대신에 도면의 흑백 사본이 제공되는 슬라이드 분석에 도움이 될 것이다. 도 1에서 조사된 각각의 슬라이드에 대한 조건은 하기와 같다:
A) 5종의 PNA 프로브들 (프로브 1 내지 5)로 프로빙된 MSSA 29213
B) 이. 콜라이-지정된 프로브 (프로브 6)로 프로빙된 MRSA 43300
C) 5종의 PNA 프로브들 (프로브 1 내지 5)로 프로빙된 MRSA 43300
D) 단일 PNA 프로브 (프로브 2)로 프로빙된 MRSA 43300
E) 16.6배 과량의 바이오틴 표지된 프로브 2 (즉, 프로브 7)의 존재하에 단일 PNA 프로브 (프로브 2)로 프로빙된 MRSA 43300.
결과:
상기 실시예의 결과는 도 1을 언급하며 논의된다. 녹색 형광 박테리아가 슬라이드 C 및 D에서 관찰되었다. 이러한 결과는, PNA 프로브 (슬라이드 D) 또는 프로브들 (슬라이드 C)로 처리한 (접촉시킨) MRSA 박테리아의 존재와 일치하였다. 스타필로코쿠스의 박테리아 균주 (MSSA)가 mecA 유전자를 함유하지 않는 슬라이드 A에서는 어떠한 박테리아도 관찰되지 않았다 (슬라이드 A). 이. 콜라이 박테리아와 관련된 것으로 공지된 rRNA 표적에 관한 프로브로 처리한 MRSA 박테리아에 대해서는 어떠한 신호도 관찰되지 않았다 (슬라이드 B). 표지된 mRNA-지정된 프로브 (프로브 2) 및 많은 과량의 바이오틴 표지된 (기능적으로 비표지됨) 형태의 동일한 프로브 (프로브 7) 둘 모두로 처리한 MRSA 박테리아에 대해서는 어떠한 신호도 관찰되지 않았다 - 슬라이드 E를 참고함.
실시예 2: 에스 . 아우레우스의 PNA FISH .
세포 성장, 고정화 및 세포 투과화를, 하기 언급된 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
테트라메틸로다민 (TAMRA)-표지된 에스. 아우레우스-특이적 rRNA-지정된 하나의 프로브 (500 nM 농도의 프로브 8) 이외에 5종의 플루오레세인-표지된 PNA 프로브들 (실시예 1에 기재된 농도의 프로브 1 내지 5)을 함유하는 HB 25 μL를 슬라이드 상에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 절차 중 나머지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. FM 분석으로부터 얻은 영상을 도 2의 슬라이드 A1, A2, B1 및 B2로 나타냈다. 슬라이드 내 가시성 콜로니 중 일부 (모두는 아님)를 동그라미 (슬라이드 A) 또는 사각형 (슬라이드 B)으로 표시하였다. 이는, 컬러 사본 대신에 도면의 흑백 사본이 제공되는 슬라이드 분석에 도움이 될 것이다. 영상 A-1 및 A-2에서, 비교를 간단히 하기 위해, 동일한 콜로니에 동그라미를 표시하였다. 도 2에서 조사된 각각의 슬라이드에 대한 조건은 하기와 같다:
A-1) MRSA 43300, 이중 대역 필터
B-1) MSSA 29213, 이중 대역 필터
A-2) MRSA 43300, FITC 필터
B-2) MSSA 29213, FITC 필터
결과:
상기 실시예의 결과는 도 2를 언급하며 논의된다. 슬라이드 A-1 및 B-1의 적색 형광 염색된 박테리아는, rRNA 표적으로의 TAMRA 표지된 프로브 8의 혼성화를 기초로 하여, 에스. 아우레우스가 존재함을 확인시켰다. MRSA 및 MSSA 둘 모두가 스타필로코쿠스 박테리아이기 때문에, 이러한 결과가 예상된다. 슬라이드 A-2의 녹색 형광 염색된 박테리아는, 프로브 1 내지 5의 이들 각각의 표적으로의 혼성화를 기초로 하여, MRSA가 존재함을 제시한다. A-1 및 A-2의 영상은 동일한 슬라이드의 영상이고 (상이한 필터 세트, 즉 적색 또는 녹색을 사용함), 가시성 콜로니의 정렬에 의해 보여질 수 있는 바와 같이 거의 동일한 슬라이드 부분이다. 슬라이드 B-2의 녹색 형광 염색된 박테리아의 부재는, 박테리아가 메티실린-내성이 아님을 나타낸다. 이러한 (음성) 결과는 검정에 사용된 MSSA 박테리아의 성질 (메티실린-내성이 아님)과 일치한다. 영상 B-1 및 B-2는, 상이한 필터 세트 (각각, 적색 및 녹색)를 사용한, 동일한 슬라이드의 상이한 부분이다.
실시예 3: PNA FISH 에 의한, 에스 . 아우레우스 및 에스 . 에피데르미디스 에 서의 동시적 이중 (멀티플렉스) 결정.
본 실시예에서, MRSA 43300과 MRSE 51625의 혼합물을 제조하고, 하기 기재된 바와 같이 3개의 형광 필터를 사용하여 조사하였다. 에스. 아우레우스 세포의 성장 및 옥사실린 유도를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그러나, 상기 세포 mRNA 내 mecA mRNA가 지속적으로 발현되기 때문에, 에스. 에피데르미디스 세포는 옥사실린에 의해 유도되지 않았다. 에스. 에피데르미디스는, 실질적으로 실시예 1에서 에스. 아우레우스에 대해 기재된 바와 같이 성장하였다. MRSA 43300 및 MRSE 51625 둘 모두의 세포 고정화 및 투과화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법
이어서, 5종의 플루오레세인-표지된 PNA 프로브들 (실시예 1에 기재된 농도의 프로브 1 내지 5), TAMRA-표지된 에스. 아우레우스-특이적 rRNA-지정된 하나의 프로브 (실시예 2에 기재된 농도의 프로브 8) 및 퍼시픽 블루 (Pacific Blue)-표지된 에스. 에피데르미디스-특이적 rRNA-지정된 하나의 프로브 (농도 500 nM의 프로브 9)를 함유하는 혼성화 완충액을, MRSA 43300과 MRSE 51625의 혼합물을 함유한 슬라이드 상에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 절차 중 나머지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. FM 분석으로부터 얻은 영상을 도 3의 영상 A 내지 C로 나타냈다. 상기의 영상은 슬라이드의 동일한 부분의 영상이다. 각 경우에, 형광 필터만이 변경되었다. 이는, 2종의 상이한 선택적 박테리아가 독립적으로 결정되며, 하나의 형질 (메티실린-내성)이 단일 샘플의 박테리아에 대해 또한 결정되는 멀티플렉스 검정의 한 예이다.
상기 영상에서, 가시성 콜로니 중 일부 (반드시 모두는 아님)를 적절하게 동그라미 (MRSA 박테리아) 또는 직사각형 (MRSE)으로 표시하였다. 이는, 컬러 사본 대신에 도면의 흑백 사본이 제공되는 슬라이드 분석에 도움이 될 것이다. 영상 A에서, MRSA 박테리아 (동그라미)는 오렌지색이며, MRSE 박테리아 (직사각형)은 녹색이다. 영상 B에서, MRSA 박테리아는 가시적이지 않지만, MRSE 박테리아 (직사각형)는 파란색이다. 영상 C에서, MRSA (동그라미) 및 MRSE 박테리아 (직사각형) 둘 모두가 녹색이다.
결과:
상기 실시예의 결과는 도 3을 언급하며 논의된다. 영상 A (이중 대역 필터)에서, 오렌지색으로 염색된 박테리아 및 녹색으로 염색된 박테리아 둘 모두가 가시적이다. 상기 영상에서, 프로브 1 내지 5 (플루오레세인으로 표지된 프로브 1 내지 5)의 녹색 형광 및 프로브 8 (TAMRA로 표지된 rRNA-지정된 에스. 아우레우스-특이적 프로브)의 적색 형광의 조합으로 인하여, MRSA는 오렌지색을 나타낸다. MRSE 박테리아는 이들이 에스. 아우레우스가 아니기 때문에 (즉, TAMRA 신호가 없음), 오직 녹색이다. 상기 영상 (영상 C와 조합함)은, 모든 가시성 박테리아가 메티실린-내성임을 제시한다.
영상 B에서는, DAPI (파란색) 필터를 사용하였다. 파란색으로 염색된 MRSE 박테리아는, 프로브 9가 퍼시픽 블루로 표지되고, 상기 프로브는 에스. 에피데르미디스의 표적 rRNA를 프로빙하기 때문에, 상기 영상에서 가시적이다.
영상 C에서는, FITC (녹색) 필터를 사용하였다. MRSA 및 MRSE 박테리아 둘 모두가 상기 영상에서 녹색 형광 염색으로 나타났다. 박테리아의 두 종 모두 녹색으로 염색되었다.
상기에서 언급한 바와 같이, 영상 A 내지 C는, 동일한 샘플 및 대략적으로 동일한 시야 범위의 영상이었다. 따라서, 각각의 영상의 박테리아를 비교하여, 이들이 또다른 영상에서 가시적인지를 직접 결정하는 것이 가능하다. 이는, 간단한 가시적 분석에 기초하여, 박테리아 및 이들의 형질을 쉽게 (그리고 잠재적으로 자동화하여) 결정가능하게 한다.
실시예 4: PNA FISH 및 티라미드 신호 증폭 ( TSA )을 이용한 MRSA 의 향상된 결정.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법
MRSA 33591 세포의 성장 및 옥사실린 유도를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, 혼성화 전에 슬라이드를 75 ㎕의 TE 완충액 (트리스-HCl 100 mM, EDTA, 10 mM, pH 8.0)과 함께 5분 동안 80℃에서 처리하는 것 외에는 세포 고정화 및 투과화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 혼성화를 위해, 5개의 바이오틴-표지된 PNA 프로브 (프로브 11, 12, 13, 14 및 15 (각각의 프로브의 농도는 500 nM의 총 농도를 위해 100 nM이었음))를 함유하는 25 ㎕의 HB**를 하나의 슬라이드에 도포하였다. 대조군 실험에서 또다른 슬라이드를 하나의 바이오틴-표지된 씨. 알비칸스 (C. albicans)-특이적 rRNA-지정된 프로브 (프로브 10, 농도가 500 nM임)로 프로빙하였다. 혼성화 및 세척을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이어서, 슬라이드를 몰레큘라 프로브즈 (Molecular Probes, 미국 오리건주 유진 소재, TSA 키트 #25) 사로부터 시판되는 시약으로 제조사의 프로토콜에 따라 처리하였다. 구체적으로, 우선 슬라이드-침착 세포를 30분 동안 0.075 mL의 차단 완충액 (Blocking Buffer) (BB)과 함께 인큐베이션하고, 이어서 30분 동안 0.1 mL의 BB 중의 희석된 스트렙타비딘-HRP (streptavidin-HRP)와 함께 인큐베이션하였다. PBS-트윈 (PBS-Tween)으로 세척 (3 x 5분 세척)한 후, 세포를 0.075 mL의 알렉사플루오르 (AlexaFluor) 594-표지된 티라미드 용액과 함께 10분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척 (3 x 5분 세척)하였다. 이어서, 한 방울의 MM 및 커버 슬립을 공기 건조시킨 슬라이드에 도포하고, 세포를 FM에 의해 조사하였다. 도 4에 조사된 각각의 슬라이드의 구체적인 조건은 하기와 같다.
A) 하나의 rRNA-지정된 씨. 알비칸스-특이적 바이오틴 표지된 PNA 프로브 (프로브 10)를 갖는 MRSA 33591.
B) 5개의 바이오틴 표지된 PNA 프로브 (프로브 11 내지 15)를 갖는 MRSA 33591.
** 단지 이 실시예의 경우, 시그마 (Sigma) P/N R5636 (1 mL), 빵 효모로부터 전이된 리보핵산, 트레비젠 (Trevigen), P/N 9600-5-D, 송아지 흉선 DNA를 혼성화 완충액에 희석 (20x)하였다.
결과:
이 실시예의 결과를 도 4를 참조로 하여 논의하였다. 영상에서, 일부 (전체가 아님) 가시성 콜로니가 원으로 둘러싸여 있다 (영상 B). 이는, 컬러 사본 대신에 도면의 흑백 사본이 제공되는 슬라이드 분석에 도움이 될 것이다.
영상 B의 강한 적색 형광으로 염색된 박테리아는, 신호 증폭과 함께 바이오틴 표지의 간접적인 측정이 프로브 11 내지 15와 함께 이용될 수 있음을 입증하였다. 영상 A의 샘플은 샘플에 존재하지 않는 박테리아에 대한 rRNA-지정된 프로브를 사용한 대조군이었다. 따라서, 영상 A (영상 B의 결과와의 비교에 의함) 중 가시성 박테리아의 부재는 mecA 검출이 특이적이고, 적절하게 신호 증폭됨을 제시하였다.
부록 I
박테리아 균주의 설명:
에스. 아우레우스 ATCC 43300 (MRSA 43300); 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 29213 (MSSA 29213); 메티실린-민감성 균주
에스. 에피데르미디스 ATCC 51625 (MRSE 51625); 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 33591 (MRSA 33591); 메티실린-내성 균주
[ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collections)을 나타내고, 다양한 유기체의 공급원이다. - 참조: atcc.org/CulturesandProducts/Microbiology/BacteriaandPhages/tabid/176/Default.aspx의 월드와이드 웹 참조]
완충액 /용액의 조성:
혼성화 완충액 ( HB ): 50 mM 트리스-HCl pH=7.6; 0.1％ (w/v) 나트륨 파이로포스페이트; 10 mM NaCl; 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 10％ 덱스트란 술페이트 MW 500,000; 0.2％ (w/v) 피콜 (Ficoll) 400 K; 30％ 포름아미드; 1％ (v/v) 트리톤 (Triton) X-100; 0.2％ (w/v) 폴리비닐 피롤리돈 MW 360,000; 100％로 조정된 물.
세척 완충액 ( WB ): 5 mM 트리스-HCl pH=10.0; 15 mM NaCl; 0.1％ (v/v) 트리톤 X-100; 100％로 조정된 물.
RNase - 무함유 투과화 용액 ( PS ): 50 mM 트리스-HCl pH=7.6; 5 mM MgSO4; 0.1 mg/mL 리소스타핀; 5 mM TCEP (터모 사이언티픽 (Thermo Scientific, 미국 일리노이주 락포드 소재) 사의 제품 # 77720). 용액은 새로 제조되었다. 사용 전에, 이 용액을 15분 동안 65℃에서 가열하고, 실온으로 냉각시켰다.
10％ 파라포름알데히드 ( PAF ): 5 g의 파라포름알데히드를 25 mL의 탈이온수에서 분산시켰다. 2 mL의 2 M NaOH를 첨가한 후, 모든 파라포름알데히드 분말이 용해될 때까지 (때때로 수동 교반함) 55℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 용액에 10 mL의 10x PBS 농축액 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 사의 제품, P/N P7059)을 첨가함으로써, 용액을 1x PBS로 만들고, 50 mL 이하의 충분한 양의 총 부피가 되도록 하였다. 용액의 pH를 2 M HCl로 조정하여 3.5가 되게 하였다.
차단 완충액 ( BB ): 몰레큘라 프로브즈 (미국 오리건주 유진 소재) 사의 TSA 키트 #25로 제공됨.
검경용 매질 ( MM ): 어드밴딕스, 인코포레이티드 (AdvanDx, Inc., 미국 매사추세츠주 우번 소재) 사의 제품 번호 CP 0023.
PNA 프로브 :
PNA 프로브를 파나진 (Panagene, 한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 모든 프로브 (프로브 7 제외)는 단일 표지를 포함한다 (표지 유형은 표 1을 참조). 사용된 PNA 프로브의 속성을 표 1에 열거하였다. 모든 PNA 프로브 (본원에 기재된 다른 표에 열거된 추가의 PNA 프로브를 포함)를 화학적 드 노보 방법 (전사에 의한 것이 아님)에 의해 제조하였다.
표 1
Figure pct00001
사용된 약어: Flu = 플루오레세인, MR = 메티실린-내성. 모든 표지를 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 링커 (때때로, O-링커 또는 단지 "O"로서 과학 문헌에서 지칭함)를 통해 프로브의 N-말단에 연결하였다. 퍼시픽 블루는 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 반응성 N-숙신이미딜 에스테르로서 입수가능하다.
형광 현미경법 ( FM ):
DP 70 현미경 디지털 카메라를 갖춘 올림푸스 (Olympus) 시스템 현미경 BX 51을 모든 현미경 조사에 사용하였다. 카메라는 올림푸스 DP 70 소프트웨어를 작동시키기 위해 윈도우 (Windows) XP/2000/NT 4.0 조작 시스템을 사용하였다. 영상을 60x (UPlanFI) 오일 침지 대상체와 함께 취하였다. 오메가 (Omega) 광학 필터 XF53, XF202, XF06 및 XF102-2를 각각의 FITC/텍사스 레드 (이중 밴드), 플루오레세인에 대한 FITC (단일 밴드), DAPI (단일 밴드) 및 텍사스 레드 또는 TAMRA (단일 밴드)의 형광 신호를 가시화하기 위해 사용하였다. 1 내지 2초 및 약 1/10초의 노출이 각각의 다른 프로브 및 rRNA-지정된 신호를 가시화하기 위해 필요하였다.
주의: 실시예 5 내지 10을 모두 그람-양성 박테리아 세포를 투과화하고자 하는 효소의 처리 없이 (즉, 세포 투과화 단계 없이) 수행하였다.
실시예 5: 에스 . 아우레우스 중의 PNA FISH 에 의한 MRSA -특이적 mecA mRNA 의 결정.
달리 언급되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 5에서 사용된 다양한 박테리아 균주 (예컨대, 스타필로코쿠스의 염색체 카세트 mec (staphylococcal chromosome cassette mec) (SCCmec) 유형 I 내지 V 및 다른 스타필로코쿠스 균주), PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM)의 설명 이외에도 고정화 용액 (FS), 혼성화 완충액 (HB2) 및 세척 완충액 (WB), 검경용 매질 (MM)의 조성을 모든 실시예 1 내지 5 모두에 대해 공통적인 시약용으로 부록 II (하기) 또는 부록 I (상기)에 제공하였다.
세포 성장 및 고정화:
에스. 아우레우스 박테리아를 트립틱 소이 브로스 (TSB) 또는 혈액 배양병으로 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35℃ 내지 37℃에서 진탕시키면서 성장시키고, 미리 가온시킨 TSB에서 1:9로 희석하고, 또다른 1.5시간 동안 성장시켰다 (OD600 nm = 0.5). 이 전배양물을 또다른 40분 동안 35℃ 내지 37℃에서 진탕시키면서 3 ㎍/mL 세폭시틴으로 유도하였다. 세폭시틴-유도된 세포를 유리 슬라이드에 첨가 (20 ㎕)하고, 20분 동안 80℃에서 고정화 용액 (FS)으로 열 고정시켰다. 열 고정 후, 슬라이드를 5분 동안 100％ 메탄올에서 침지시키고, 대략 5분 동안 공기-건조시키도록 두었다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법:
이어서, PNA 프로브 (하기의 프로브 농도 참조)를 함유하는 25 ㎕의 혼성화 완충액 2 (HB2)를 PNA FISH 워크스테이션 (Workstation) (어드밴딕스, 파트 번호: AC005)에 있는 슬라이드에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 이어서, 세포를 2시간 동안 55℃에서 혼성화시켰다. 혼성화 후, 슬라이드를 30분 동안 55℃에서 세척 완충액 (WB)으로 세척하였다. 한 방울의 검경용 매질 (MM) 및 커버 슬립을 건조시킨 시료에 도포하고, 이어서 슬라이드-침착 세포를 표지된 형광 현미경법 2 (FM2) 절차에 따라 조사하였다.
프로브 농도:
각각 500 nM 프로브 농도의 6개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브 (프로브 16, 17, 18, 19, 20 및 21 (참조: 하기의 표 3)); 프로브의 조합 농도는 3000 nM이었다.
결과:
이 실시예의 결과를 표 2에 요약하였다. m-RNA-지정된 프로브 16 내지 21을 사용한 PNA FISH 검정의 경우, 현미경 분석에서 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA)에 대해 녹색 형광 박테리아 (양성)가 나타났다. 이러한 것들을 양성 (녹색 박테리아가 관찰된다면) 또는 음성으로서 기록하였다. mecA 유전자가 메티실린-내성과 관련이 있다고 알려져 있기 때문에, MRSA 균주는 mecA 유전자와 관련된 표적 mRNA를 포함한다. mecA 유전자를 함유하지 않고, 신호가 없는 메티실린-민감성 에스. 아우레우스 (MSSA) (음성)를 관찰하였다. mecA 유전자는 21- 내지 67-kb의 게노믹 아일랜드 (genomic island) (스타필로코쿠스의 염색체 카세트 (SCCmec)로 칭함)에 위치한다. SCCmec 유형 I, 유형 II 및 유형 III (병원내-감염 MRSA) 및 CA-MRSA (병원외 감염 MRSA 및 SCCmec 유형 IV 및 V)가 나타났다. SCCmec 유형 I, II, III, IV 및 V로 알려진 균주들은 이러한 절차에 의해 모두 양성이었다. 불균일 또는 균일한 것으로 알려진 균주, 즉 에스. 아우레우스 ATCC 43300 (불균일 옥사실린 내성), SCCmec II) 및 에스. 아우레우스 ATCC 33591 (균일 옥사실린 내성), SCCmec III) 둘 모두를 이러한 절차에 의해 검출하였다. 시판되는 mecA 에비진® (EVIGENE®) 제품 (세포-무함유 검정)을 사용하여 수득한 자료는 다음 둘 모두와 일치하였다: 1) 단리물의 공지된 특성; 및 2) 상기에 기재된 바와 같이 수행된 전세포 FISH 검정으로 수득된 결과.
표 2
Figure pct00002
Figure pct00003
1 mecA 에비진® (어드밴딕스, 파트 번호 KT102-96)에서의 mecA 유전자의 존재에 대해 균주를 시험하였다. 이 검정은 세포-무함유 검정에서의 mecA 유전자의 검출에 의한 메티실린-내성 스타필로코쿠스를 확인하고자 한 것이었다.
2 민감성 시험을 세폭시틴 이테스트® 스트립스 (Etest® strips) (바이오메리욱스 (bioMerieux), 파트 번호 541000658)와 함께 수행하였다. 임상 및 실험 표준 기관 (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI)에 따른 에스. 아우레우스의 민감성의 분류를 위한 구분점은, S는 4 ㎍/mL 이하 및 R은 8 ㎍/mL 이상이었다.
NA = 해당사항 없음.
부록 II
박테리아 균주의 설명:
에스. 아우레우스 COL (MRSA COL); SCCmec I; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 EU (MRSA EU); SCCmec Ia; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 NCTC 10422 (MRSA 10422); SCCmec Ib; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 43300 (MRSA 43300); SCCmec II; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 33591 (MRSA 33591); SCCmec III; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 DK (MRSA DK); SCCmec IIIa; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 USA500 (MRSA USA500); SCCmec IV; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 USA300 (MRSA USA300); SCCmec IV; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 DK (MRSA DK); SCCmec V; 메티실린-내성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 11632 (MSSA 11632); 메티실린-민감성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 25923 (MSSA 25923); 메티실린-민감성 균주
에스. 아우레우스 ATCC 29213 (MSSA 29213); 메티실린-민감성 균주
[ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션을 나타내고, 다양한 유기체의 공급원이다. - 참조: atcc.org/CulturesandProducts/Microbiology/BacteriaandPhages/tabid/176/Default.aspx의 월드와이드 웹 참조. NCTC는 내셔널 콜렉션 오브 타입 컬쳐 (National collection of Type Cultures)를 나타내고, 다양한 유기체의 공급원이다. - ukncc.co.uk/index.htm의 월드와이드 웹 참조]
완충액의 조성:
혼성화 완충액 2 ( HB2 ): 50 mM 트리스-HCl pH=7.5; 0.1％ (w/v) 나트륨 파이로포스페이트: 10 mM NaCl; 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 10％ 덱스트란 술페이트 MW 500,000; 0.2％ (w/v) 피콜 400 K; 30％ 포름아미드; 1％ (v/v) 트리톤 X-100; 0.2％ (w/v) 폴리비닐 피롤리돈 MW 360,000; 100％로 조정된 물.
고정화 용액 ( FS ): 7 mM Na2HPO4, 7 mM NaH2PO4, 130 nM NaCl, 1％ (v/v) 트리톤 X-100 및 0.05％ (v/v) 프로클린 (ProClin) 300의 수용액.
PNA 프로브 :
PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 모든 프로브는 이중 표지를 포함하였다 (표지 유형은 표 3을 참조). 실시예 5에서 사용된 PNA 프로브의 속성을 표 3에 열거하였다.
표 3
Figure pct00004
사용된 약어: Flu = 플루오레세인, Lys = 라이신. 모든 표지를 2개의 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 링커 (때때로, O-링커로서 과학 문헌에서 지칭함)를 통해 프로브의 C-말단 및 N-말단에 연결하였다. Flu 표지를 라이신 측쇄의 아민 기를 통해 프로브의 C-말단에 부착하였다.
형광 현미경법 2 ( FM2 ):
DP 70 현미경 디지털 카메라를 갖춘 올림푸스 시스템 현미경 BX 51을 모든 현미경 조사에 사용하였다. 카메라는 올림푸스 DP 70 소프트웨어를 작동시키기 위해 윈도우 XP/2000/NT 4.0 조작 시스템을 사용하였다. 영상을 60x (UPlanSApo) 오일 침지 대상체와 함께 취하였다. 오메가 광학 필터 XF53을 FITC/텍사스 레드 (이중 밴드)의 형광 신호를 가시화하기 위해 사용하였다.
실시예 6: 혈액 배양물에 첨가한 박테리아 단리물을 사용한 mRNA -지정된 PNA FISH 에 의한 mecA mRNA 발현의 결정
mecA 검출의 평가를 혈액 배양물에 혼합/첨가한 172개의 표준 및 임상 단리물 (하기의 표 15에 열거하였음)에서 수행하였다. 본 연구는 127개의 MRSA 균주 (표준 및 임상 단리물)를 포함하였다. 표준 균주 중, 균주는 스타필로코쿠스의 염색체 카세트 (SCCmec) Ia, Ib, II 및 유형 III, IIIa (병원내-감염 MRSA), CA-MRSA (병원외 감염 MRSA, SCCmec IV 및 V)와의 균주이다. 또한, 본 연구에 포함된 15개의 메티실린-민감성 에스. 아우레우스 (MSSA) (표준 및 임상 단리물), 25개의 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 및 5개의 메티실린-민감성 CNS (MS-CNS, 에스. 에피데르미디스, 에스. 와르네리 (S. warneri), 에스. 캐피티스 (S. capitis), 에스. 해모리티쿠스 (S. haemolyticus) 및 에스. 호미니스 (S. hominis))가 있었다. mecA 에비진® (어드밴딕스, 파트 번호: KT102-96)을 사용한 mecA 유전자의 존재에 대해 모든 단리물을 시험하였다. 제품, mecA 에비진®으로 관심 있는 박테리아 샘플에서의 mecA 유전자의 검출에 의한 메티실린-내성 스타필로코쿠스를 확인하고자 하였다 (전세포 검정 형식에서는 아님). 세폭시틴 이테스트® 스트립스 (바이오메리욱스, 파트 번호 541000658)와 함께 57개의 단리물에 대한 민감성 시험을 수행하였다. 이러한 상업 제품을 사용한 시험을 판매업체의 설명에 따라 수행하였다. CLSI에 따른 에스. 아우레우스의 민감성의 분류를 위한 구분점은, S는 4 ㎍/mL 이하 및 R은 8 ㎍/mL 이상이었다. 달리 공지되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 6에서 사용된 PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM) 이외에도 고정화 용액 (FS), 혼성화 완충액 (HB2) 및 세척 완충액 (WB), 검경용 매질 (MM)의 조성을 부록 I, 부록 II 또는 부록 III (하기)에 제공하였다.
세포 성장 및 고정화:
각각의 균주로부터의 1 내지 2개의 콜로니를 음성 혈액 배양병으로 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35±2℃에서 진탕시키면서 성장시키고, 미리 가온시킨 TSB에서 1:9로 희석하고, 또다른 1.5시간 동안 성장시켰다. 이 전배양물을 또다른 40분 동안 35±2℃에서 진탕시키면서 3 ㎍/mL 세폭시틴으로 유도하였다. 세폭시틴-유도된 배양물을 유리 슬라이드에 첨가 (20 ㎕)하고, 20분 동안 80℃에서 고정화 용액 (FS)으로 열 고정시켰다. 열 고정 후, 슬라이드를 5분 동안 100％ 메탄올에서 침지시키고, 대략 5분 동안 공기-건조시키도록 두었다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
상업 제품과 함께 처리하지 않은 샘플의 경우, PNA 프로브 (하기의 프로브 농도 참조)를 함유한 25 ㎕의 혼성화 완충액 (HB2)을 혼성화 챔버에서 슬라이드 위에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 1.5시간 동안 55℃에서 혼성화시켰다. 혼성화 후, 슬라이드를 세척 완충액 (WB)으로 30분 동안 55℃에서 세척하였다. 한 방울의 검경용 매질 (MM) 및 커버 슬립을 건조시킨 시료에 도포하고, 슬라이드-침착 세포를 표지된 형광 현미경법 2 (FM2)의 절차에 따라 조사하였다.
프로브들 및 프로브 농도:
8 내지 11개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브 (하기의 표 4 참조)의 혼합물을 각각 500 nM 프로브 농도로 혼성화 완충액에서 사용하였다. 이 실시예 6에서 사용된 PNA 프로브를 표 4에 열거하였다. PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 이 실시예 6에서 사용된 PNA 프로브의 속성을 표 4에 열거하였다.
표 4
Figure pct00005
사용된 약어: Flu = 플루오레세인, Lys = 라이신. 서열 16 내지 25의 PNA 프로브의 경우, 모든 표지를 2개의 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 링커 (때때로, O-링커로서 과학 문헌에서 지칭함)를 통해 프로브의 C-말단 및 N-말단에 연결하였다. Flu 표지를 라이신 측쇄의 아민 기를 통해 프로브의 C-말단에 부착하였다. 서열 26 및 27을 N-말단에 있는 단일 플루오레세인 표지로 표지하였다.
프로브 풀 ( Pool ) 조성:
프로브 16, 17 및 22 내지 27을 함유한 8x 풀
프로브 16, 17, 20 및 22 내지 27을 함유한 9x 풀
프로브 16, 17, 19 내지 23 및 25 내지 26을 함유한 10x(a) 풀
프로브 16 내지 22 및 24 내지 26을 함유한 10x(b) 풀
프로브 16 내지 26을 함유한 11x 풀
결과:
표 5에 이 실시예를 수행함으로써 수득한 자료를 요약하였다. 혈액 배양병에 첨가한 m-RNA-지정된 PNA 프로브 16 내지 27을 사용한 FISH에 의한 mecA 유전자 발현의 검출을, 표현형 방법 (이테스트® 스트립스, 바이오메리욱스)에 의해 수득된 결과 및 mecA 에비진® (세포-무함유 검정; 어드밴딕스, 인코포레이티드 (미국 매사추세츠주 우번 소재))에 의한 mecA 유전자의 검출과 비교하였다. FISH 검정은 MRSA에 대한 100％ (127/127)의 민감성 및 MR-CNS에 대한 88％ (22/25)의 민감성을 나타내었다 (3개의 샘플 (25개의 MR-CNS 시험된 균주 중)이 검출되지 않았기 때문). 모든 시험된 MSSA 및 MS-CNS 균주는 관찰된 신호가 없었으므로 (음성), 거짓 양성으로 검출되지 않았다. 이테스트® 스트립스에 의한 세폭시틴 최소 억제제 농도 (MIC)의 검출은, 시험된 MRSA 균주가 12 내지 256 이상 사이의 MIC를 가지고, 모두 검출됨을 나타내었다.
8개의 PNA 프로브 (프로브 16 내지 17, 22 내지 27)와의 신호 강도는 대부분의 MRSA 균주 (127개 중 73개)를 검출하는데 충분했으나, 일부 MRSA 균주 및 특히, 대부분의 MR-CNS 균주의 경우, 모든 11개의 프로브의 세트가 mecA mRNA 결정을 필요로 하였다. 총 73개의 MRSA 균주가 8개의 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 풀을 사용하여 양성인 것으로 시험되었고, 6개의 MRSA 균주가 9개의 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 풀을 사용하여, 7개의 MRSA 균주가 10(a) mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 풀을 사용하여, 그리고 41개의 MRSA 균주가 11-프로브 풀을 사용하여 양성인 것으로 시험되었다. 시험된 MR-CNS 균주의 경우, 오직 7개의 균주만이 8-프로브 풀에 대해 양성이고, 1개의 균주가 9-프로브 풀에 대해 양성이고, 17개의 균주가 11-프로브 풀에 대해 양성이었다. MSSA 균주는 8-, 9- 및 11-프로브 풀에 대해 모두 음성이었다. 시험된 MS-CNS 균주는 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 10(b)-프로브 풀에 대해 음성이었다. 이들 자료는 결정이 균주 의존적이고, 검정에서의 m-RNA-지정된 프로브 성분을 조정함으로써 다양한 균주 또는 박테리아에 걸친 정확한 결과를 생성할 수 있음을 나타내었다.
표 5
Figure pct00006
주의: 이테스트®는 AB 바이오메리욱스 (AB bioMerieux, 스웨덴 달바에젠 소재) 사의 등록 상표명이다.
에비진®은 덴마크 코펜하겐 국립 혈청 연구소 (Statens Serum Institute)의 등록 상표명이다.
실시예 7: 비디 진옴 ™ 스타프에스알 검정에서 모순된 결과를 제공하는 단리물의 분석
본 연구에서는, 문헌 보고 (그뢰브너 (Groebner) 등, (2009))에 따라, 다른 실시간 PCR-기반 분자 접근 및 통상의 표준 실험 방법 (비텍2 (Vitek2), 바이오메리욱스)과 비교했을 때, 메티실린-민감성, 복귀돌연변이체 MRSA 균주 (n=3) 및 이 비디 진옴TM스타프에스알 검정에 의해 검출되지 않는 MRSA 균주 (n=2)의 존재 때문에, 시판되는 비디 진옴TM스타프에스알 검정을 사용할 때의 모순되는 결과를 제공하는 5개의 단리물을 조사하였다. 비디 진옴TM스타프에스알 검정은 에스. 아우레우스-특이적 표적 서열 및 스타필로코쿠스의 카세트 염색체 mec (SCCmec) 삽입 부위에 가까운 특이적 표적 및 MRSA에서의 orfX 연결지점을 결정함으로써, MSSA 및 MRSA를 구분한다 (그뢰브너 등 (2009)).
또한, 제조사의 설명에 따라, 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH® (어드밴딕스, 파트 번호: KT005)로 에스. 아우레우스 (16S rRNA)의 존재에 대해 5개의 균주를 시험하였다. 또한, mecA 유전자의 존재의 결정을 mecA 에비진® (어드밴딕스, 파트 번호: KT102-96)에 의해 확인하였다. 달리 언급되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 7에서 사용된 다양한 박테리아 균주, PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM)의 설명 이외에도 고정화 용액 (FS), 혼성화 완충액 (HB2) 및 세척 완충액 (WB), 검경용 매질 (MM)의 조성을 부록 I, 부록 II 또는 부록 III에 제공하였다.
주의: 비디 진옴™은 비디 월드와이드 (BD Worldwide)의 상표명이다.
PNA FISH®는 어드밴딕스, 인코포레이티드 (미국 매사추세츠주 우번 소재)의 등록 상표명이다.
세포 성장 및 고정화:
에스. 아우레우스 박테리아를 음성 혈액 배양물에 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35±2℃의 BacT/ALERT (바이오메리욱스)에서 성장시키고, 미리 가온시킨 TSB에서 세폭시틴 (3 ㎍/mL의 최종 농도)으로 1:2로 희석하고, 35±2℃에서 40분 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 세폭시틴-유도된 세포를 유리 슬라이드에 첨가 (5 ㎕)하고, 2분 동안 80℃에서 고정화 용액 (FS)으로 열 고정시켰다. 열 고정 후, 슬라이드를 5분 동안 100％ 메탄올에서 침지시키고, 대략 5분 동안 공기-건조시키도록 두었다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
상업 제품으로 처리하지 않은 샘플의 경우, PNA 프로브 (하기의 프로브 농도 참조)를 함유하는 25 ㎕의 혼성화 완충액 2 (HB2)를 PNA FISH 워크스테이션의 슬라이드에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 0.5시간 동안 55℃에서 혼성화시켰다. 혼성화 후, 슬라이드를 30분 동안 55℃에서 세척 완충액 (WB)으로 세척하였다. DAPI (3.3 ng/mL)와 함께 한 방울의 검경용 매질 (MM) 및 커버 슬립을 건조시킨 시료에 도포하고, 슬라이드-침착 세포를 표지된 형광 현미경법 2 (FM2) 절차에 따라 조사하였다.
PNA 프로브들 및 프로브 농도:
이 실시예 7에서 사용된 PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 이 실시예 7에서 사용된 PNA 프로브의 속성을 표 6에 열거하였다.
표 6
Figure pct00007
상기 표에서 사용된 모든 약어들을 앞서 정의하였다. 서열 16 내지 25, 28 내지 29 및 31 내지 33의 프로브의 경우, 모든 표지를 2개의 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 링커 (때때로, O-링커로서 과학 문헌에서 지칭함)를 통해 프로브의 C-말단 및 N-말단에 연결하였다. Flu 표지를 라이신 측쇄의 아민 기를 통해 프로브의 C-말단에 부착하였다. 서열 26 및 30의 프로브, 단일 Flu 표지를 사용하였다. 서열 8의 프로브의 경우, 단일 TAMRA 표지를 사용하였다 (TAMRA 표지를 프로브에 연결하는 데에 O-링커를 사용하지 않았음).
HB2 중 각각 500 nM 프로브 농도로 16개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브 (표 6 참조, 서열 16 내지 22, 24 내지 26, 28 내지 33)의 혼합물을 샘플 중의 박테리아가 메티실린-내성인지 아닌지를 결정하기 위해 사용하였다. 샘플 중의 에스. 아우레우스 박테리아를 결정하기 위해, 하나의 TAMRA-표지된 에스. 아우레우스-특이적, rRNA-지정된 프로브 (서열 8)를 HB2 중의 14 nM의 농도로 사용하였다.
결과:
표 7을 참조로 하여, 복귀돌연변이체 MRSA 균주에서의 FISH 형태 (mecA 유전자를 포함하는 부분이 SCCmec 유전자 카세트로부터 제거되었음), 및 신속한 분자의 진단학적 시험에서 빠진 것으로 보고된 SCCmec 유형 (그뢰브너 등 (2009))에서, 에스. 아우레우스 rRNA-지정된 프로브 (서열 8)와 함께 16개의 mRNA-지정된 mecA PNA 프로브 (즉, 서열 16 내지 22, 24 내지 26, 28 내지 33)를 사용할 때, 본 검정의 결과는 100％ 정확성을 나타내었다. 또한, 본 신규한 검정의 결과는 어드밴딕스 사의 mecA 에비진® 상업 제품 및 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH® 상업 제품을 사용하여 수득한 독립적인 결과와 일치하였다. 따라서, 이 실시예의 자료는 mRNA-지정된 PNA 프로브의 혼합물이, 에스. 아우레우스 박테리아 ("박테리아-지정된" 프로브를 포함함)를 결정하는 rRNA-지정된 프로브와 함께, 특정한 다른 상업 제품을 사용하여 구별할 수 없는 MRSA 및 MSSA 박테리아를 정확하게 구별하는 데에 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
표 7
Figure pct00008
부록 III
박테리아 균주의 설명:
# 1481, 에스. 아우레우스, 그뢰브너 등 (2009) 균주 #13; (MSSA); 메티실린-민감성 균주
# 1482, 에스. 아우레우스, 그뢰브너 등 (2009) 균주 #30; (MSSA); 메티실린-민감성 균주
#1483, 에스. 아우레우스, 그뢰브너 등 (2009) 균주 #114; (MSSA); 메티실린-민감성 균주
#1484, 에스. 아우레우스, 그뢰브너 등 (2009) 균주 #35; (MRSA) SCCmec II; 메티실린-내성 균주
#1485, 에스. 아우레우스, 그뢰브너 등 (2009) 균주 #126; (MRSA) SCCmec II; 메티실린-내성 균주
실시예 8: 세폭시틴으로 유도된 또는 유도되지 않은 TSB 중의 단리물의 분석
mecA 발현의 유도 및 검출을, 유도되지 않은 세포 및 세폭시틴-유도된 세포에서 600 nm (OD600 nm = 0.5)에서의 로그-기 (log-phase) 배양 광학 밀도로 수행하였다. 마찬가지로, 유도된 및 유도되지 않은 샘플을 상기의 실시예 7에서 논의한 바와 같이, 어드밴딕스 사의 상업 제품 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH® 및 mecA 에비진® 제품으로 조사하였다. 제조사의 설명에 따라 민감성 시험을 세폭시틴 이테스트® 스트립스 (바이오메리욱스, 파트 번호 541000658)와 함께 수행하였다.
달리 언급되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 8에서 사용된 다양한 박테리아 균주, PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM)의 설명 이외에도 고정화 용액 (FS), 혼성화 완충액 (HB2) 및 세척 완충액 (WB), 검경용 매질 (MM)의 조성을 부록 I, 부록 II 또는 부록 IV (하기)에 제공하였다.
세포 성장 및 고정화:
에스. 아우레우스 박테리아를 트립틱 소이 브로스 (TSB)로 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35℃ 내지 37℃에서 진탕시키면서 성장시키고, 미리 가온시킨 TSB에서 OD600 nm = 0.25로 희석시키고, OD600 nm = 0.5로 성장시켰다. 이 전배양물을 유도된 배양물 (3 ㎍/mL 세폭시틴과 함께) 및 유도되지 않은 배양물 (0 ㎍/mL 세폭시틴과 함께)의 2가지로 분리시켰다. 도말 표본을 제조하기 전에, 두 배양물 모두를 또다른 40분 동안 35℃ 내지 37℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 세폭시틴-유도된 및 세폭시틴-유도되지 않은 세포를 유리 슬라이드에 첨가 (20 ㎕)하고, 20분 동안 80℃에서 고정화 용액 (FS)으로 열 고정시켰다. 열 고정 후, 슬라이드를 5분 동안 100％ 메탄올에서 침지시키고, 대략 5분 동안 공기-건조시키도록 두었다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
이 절차를 상기 실시예 7에서 기재된 바와 같이 세폭시틴-유도된 및 세폭시틴-유도되지 않은 세포 둘 모두에서 수행하였다.
PNA 프로브들 및 프로브 농도:
PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 이 실시예 8에서 사용된 프로브의 서열 및 다른 측면을 표 9에 열거하였다.
표 9
Figure pct00009
상기 표에서 사용된 모든 약어들을 앞서 정의하였다. 표 9에서 열거된 11개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 혼합물을 각각 500 nM 프로브 농도로 HB2에서 사용하였다. 따라서, 합한 PNA 프로브의 농도는 5500 mM이었다.
결과:
이 실시예 8의 결과를 표 10에 요약하였다. 세폭시틴으로 유도한 후, 일부 균주들은 mRNA-지정된 PNA 프로브의 혼합물을 사용한 mecA 유전자 신호에만 양성이었기 때문에, mecA 발현의 유도는 균주 의존적이었다. 세폭시틴 유도는 SCCmec 유형 II 및 III 균주의 결과를 향상시켰다. 하지만, SCCmec 유형 I 및 IV의 일부 균주의 경우, 이 균주들은 세폭시틴으로 유도된 것 및 유도되지 않은 것에 대해 양성이었기 때문에 유도를 필요로 하지 않았다. 시험된 SCCmec 유형 V 균주는 심지어 TSB 중의 세폭시틴 유도 후에도 양성이 아니었다. 그러나, 혈액 배양물로 첨가했을 때, 동일한 균주가 양성으로 검출되었다. 이러한 균주는 매우 느린 세폭시틴 MIC (MIC = 12 ㎍/mL)를 가지고, 임상 및 실험 표준 연구소 (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI)에 따라 낮은 수준의 mecA 발현을 나타낼 수 있는 민감성 구분점 (S: 4 ㎍/mL 이하 및 R: 8 ㎍/mL 이상)에 가까웠다. 실시예 6과 같이, 상기 결과는 프로브 혼합물의 변동 (예컨대, 혼합물 중의 m-RNA 프로브의 수 또는 사용된 프로브의 농도를 증가시킴)이 균주 306에 대해 향상된 결과를 초래할 수 있었음을 제시한다.
세폭시틴을 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH® (어드밴딕스)로 유도한 후, 활성 에스. 아우레우스 (16S rRNA)를 확인하기 위해 모든 균주를 시험하고, mecA 유전자의 존재를 mecA 에비진® (어드밴딕스)으로 시험하였다. 세폭시틴 유도 후의 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH®의 결과는 모든 MRSA 및 MSSA 균주에 대해 양성이었으며, 이는 40분 동안의 세폭시틴 유도 후 MSSA 균주가 여전히 활성임을 제시한다.
표 10
Figure pct00010
부록 IV
박테리아 균주의 설명:
# 9, 에스. 아우레우스 EU (MRSA EU); SCCmec I; 메티실린-내성 균주
# 1468, 에스. 아우레우스 COL (MRSA COL); SCCmec I; 메티실린-내성 균주
#39, 에스. 아우레우스 ATCC 43300 (MRSA 43300); SCCmec II; 메티실린-내성 균주
#11, 에스. 아우레우스 EU (MRSA EU); SCCmec II; 메티실린-내성 균주
#2, 에스. 아우레우스 ATCC 33591 (MRSA 33591); SCCmec III; 메티실린-내성 균주
#13, 에스. 아우레우스 DK (MRSA EU); SCCmec IIIa; 메티실린-내성 균주
#320, 에스. 아우레우스 DK (임상 DK); SCCmec IV; 메티실린-내성 균주
#886, 에스. 아우레우스 USA300 (MRSA USA300); SCCmec IV; 메티실린-내성 균주
#306, 에스. 아우레우스 DK (MRSA DK); SCCmec V; 메티실린-내성 균주
#155, 에스. 아우레우스 ATCC 25923 (MSSA 25923); 메티실린-민감성 균주
#156, 에스. 아우레우스 ATCC 29213 (MSSA 29213); 메티실린-민감성 균주
[ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션을 나타내고, 다양한 유기체의 공급원이다 (atcc.org/CulturesandProducts/Microbiology/BacteriaandPhages/tabid/176/Default.aspx의 월드와이드 웹 참조). NCTC는 내셔널 콜렉션 오브 타입 컬쳐를 나타내고, 다양한 유기체의 공급원이다 (ukncc.co.uk/index.htm의 월드와이드 웹 참조)]
실시예 9: 용액 혼성화에 의한 mecA mRNA 의 검출
실험을 수행하여 임상 샘플이 처리될 수 있는 일의 흐름을 시뮬레이션하였다. 또한, 이 실험은 전세포 중 mecA mRNA의 검출을 위한, mRNA-지정된 PNA 프로브를 함유하는 조합 고정화 용액/혼성화 용액 (FLOW 혼성화 완충액)을 포함하였다. mecA 발현의 유도 및 검출을, 유도되지 않은 세포 및 세폭시틴-유도된 세포에서 로그-기 배양 (약 0.5의 OD600 nm)으로 수행하였다. 달리 언급되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 9에서 사용된 다양한 박테리아 균주 (예컨대, 스타필로코쿠스의 염색체 카세트 mec (SCCmec) 유형 I 내지 V 및 다른 스타필로코쿠스 균주), PNA 프로브 및 형광 현미경법 2 (FM2)의 설명 이외에도 FLOW 혼성화 완충액 (FHB), FLOW 세척 완충액 (FWB) 및 검경용 매질 (MM)을 부록 I, 부록 II 또는 부록 V (하기)에 제공하였다.
세포 성장:
에스. 아우레우스 박테리아를 트립틱 소이 브로스 (TSB)로 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35±2℃에서 진탕시키면서 성장시키고, 미리 가온시킨 TSB에서 약 0.25의 OD600 nm으로 희석시키고, 약 0.5의 OD600 nm으로 성장시켰다. 이 전배양물을 유도된 (3 ㎍/mL 세폭시틴과 함께) 배양물 및 유도되지 않은 (0 ㎍/mL 세폭시틴과 함께) 배양물의 2가지로 분리시켰다. 프로브 혼성화하기 전에, 두 배양물 모두를 또다른 40분 동안 35±2℃에서 진탕시키면서 성장시켰다.
PNA 프로브를 함유하는 수성 알콜 용액 중의 조합 고정화 및 혼성화 :
PNA 프로브 (하기의 프로브 농도 참조)를 함유하는 200 ㎕의 FLOW 혼성화 완충액 (FHB)을 튜브에서 20 ㎕의 유도된 또는 유도되지 않은 배양물의 둘 중 하나와 혼합하고, 3시간 동안 55℃에서 진탕시키면서 혼성화시켰다. 혼성화 후, 세포를 500 ㎕의 FLOW 세척 완충액 (FWB)으로 3회 세척하였다. 이어서, 30 ㎕의 세포를 슬라이드에 도포하고, 20분 동안 55℃에서 열 고정시켰다.
형광 현미경법 :
한 방울의 검경용 매질 (MM) 및 커버 슬립을 건조시킨 시료에 도포하고, 슬라이드-침착 세포를 표지된 형광 현미경법 2 (FM2)의 절차에 따라 조사하였다.
PNA 프로브들 및 프로브 농도:
PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 이 실시예 9에서 사용된 PNA 프로브들의 속성을 표 11에 열거하였다.
표 11
Figure pct00011
상기의 표에서 사용된 모든 약어들을 앞서 정의하였다.
표 11에 열거된 10개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 혼합물을 각각 250 nM 프로브의 농도로 사용하였다. 따라서, 합한 프로브의 농도는 2500 nM이었다.
결과:
mecA PNA FISHFLOW를 이용한, 유도되지 않은 및 세폭시틴-유도된 에스. 아우레우스 단리물의 분석을 표 12에 요약하였다. 일부 균주가 mecA 신호를 수득하기 위한 유도를 필요로 하지 않기 때문에, mecA 발현의 유도는 균주 의존적임이 밝혀졌다. 이러한 결과는 상기의 실시예 8 및 표 10에 기재된 슬라이드 기반 검정에서 발견된 결과와 유사하였다. 세폭시틴으로 유도했을 때, 모든 SCCmec 유형 I, II, III 및 IV에서 mecA 신호를 초래하였다. 2개의 SCCmec 유형 I 균주 중, 하나의 균주는 유도되지 않았을 때 mecA 신호를 초래하지 않았으나, 다른 하나는 mecA 신호를 초래하였다. SCCmec 유형 II 및 III 균주는 유도되지 않았을 때 어떠한 mecA 신호도 초래하지 않았다. 2개의 SCCmec 유형 IV 균주 중, 하나의 균주는 유도되지 않았을 때 신호가 없거나 매우 낮은 mecA 신호를 초래하였고, 다른 하나는 유도되지 않았을 때, mecA 신호를 초래하였다. SCCmec 유형 V 균주는 세폭시틴으로 유도했음에도 불구하고, 어떠한 신호도 초래하지 않았다. 그러나, 혈액 배양물로 첨가됐을 때, 동일한 균주가 양성으로 검출되었다. 이러한 균주는 CLSI에 따라 민감성 구분점 (S: 4 ㎍/mL 이하 및 R: 8 ㎍/mL 이상)에 가까운 매우 낮은 세폭시틴 MIC (MIC = 12 ㎍/mL)를 가지고, 다시 낮은 수준의 mecA 발현을 나타낼 수 있다.
이러한 실시예 9 및 표 12와의 비교에 의한 실시예 8 및 표 10을 참조로 하여, mecA PNA FISHFLOW 결과는, PNA FISHFLOW (표 8의 결과를 균주 번호 9와 비교함)에서 시험할 때 유도를 필요로 하는 하나의 균주 (SCCmec 유형 I)를 제외하고, 실시예 8의 슬라이드-기반 결과와 100％ 일치하였다. 이 결과는 일부 MRSA 균주가 유도를 필요로 할 수 있다는 것을 나타내었다.
표 12
Figure pct00012
부록 V
박테리아 균주의 설명: 모든 균주를 부록 IV에 열거하였다.
완충액의 조성:
FLOW 혼성화 완충액 ( FHB ): 25 mM 트리스-HCl pH = 9; 0.1％ (w/v) 나트륨 도데실 술페이트; 100 mM NaCl; 50％ 메탄올; 100％로 조정된 물.
FLOW 세척 완충액 ( FWB ): 5 mM 트리스-HCl pH = 9; 0.1％ (v/v) 트리톤-X 100; 25 mM NaCl; 0.05％ (v/v) 프로클린 (proclin) 300; 100％로 조정된 물.
실시예 10: 혈액 배양물 중 첨가된 단리물의 분석
MSSA (mecA 유전자에 대한 음성) 및 메티실린-내성 CNS (MR-CNS; 에스. 아우레우스에 대해서는 음성이나, mecA 유전자에 대해서는 양성임)의 혼합물을 함유하는 혈액 배양물 중의 에스. 아우레우스 및 mecA의 결정을 위한 일부 상업적 분자 진단학적 시험은 MRSA와 같이 샘플의 부정확한 증명을 초래할 수 있다. 이 실시예 10에서의 연구는 PNA FISH 검정을 사용함으로써, 혼합되고, 첨가된 혈액 배양물 (MSSA + MRSA, MSSA + MR-CNS, MRSA + MR-CNS 및 MSSA + MR-CNS + MRSA)에 대한 에스. 아우레우스 (에스. 아우레우스 rRNA-지정된 프로브 (서열 8)) 및 mecA 발현 (mRNA-지정된 PNA 프로브 (즉, 서열 16 내지 22, 24 내지 26))의 동시적인 결정을 포함한다.
또한, 제조사의 설명에 따라, 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH® (어드밴딕스, 파트 번호: KT005) 및 에스. 아우레우스 에비진® (어드밴딕스, 파트 번호: KT106-96)으로 에스. 아우레우스 (16S rRNA)의 존재에 대해 모든 배양물을 시험하였다. 제조사의 설명에 따라, mecA 유전자의 존재는 mecA 에비진® (어드밴딕스, 파트 번호: KT102-96)으로 독립적으로 확인되었다. 달리 언급되지 않으면, 모든 절차를 실온 (RT)에서 수행하였다. 이 실시예 10에서 사용된 다양한 박테리아 균주, PNA 프로브 및 형광 현미경법 (FM)의 설명 이외에도 고정화 용액 (FS), 혼성화 완충액 (HB2) 및 세척 완충액 (WB), 검경용 매질 (MM)의 조성을 부록 I, 부록 II 또는 부록 VI에 제공하였다.
세포 성장 및 고정화:
MSSA, MRSA, MR-CNS (에스. 에피데르미디스) 및 MS-CNS (에스. 에피데르미디스) 박테리아 (참조: 부록 Vl)를 음성 혈액 배양물로 접종하고, 밤새 (16 내지 18시간) 35℃ 내지 37℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 모든 균주를 1:1 (150 ㎕ + 150 ㎕) 또는 1:2 (150 ㎕ + 300 ㎕)로 혼합하였다. 혼합 후, 배양물을 미리 가온시킨 TSB에서 1:9로 희석시키고, 또다른 1.5시간 동안 성장시켰다. 이 전배양물을 3 ㎍/mL 세폭시틴과 함께 또다른 40분 동안 35±2℃에서 진탕시키면서 유도하였다. 세폭시틴-유도된 세포를 유리 슬라이드에 첨가 (20 ㎕)하고, 2분 동안 80℃에서 고정화 용액 (FS)으로 열 고정시켰다. 열 고정 후, 슬라이드를 5분 동안 100％ 메탄올에서 침지시키고, 대략 5분 동안 공기-건조시키도록 두었다.
형광 계내 혼성화 및 형광 현미경법 :
상업 제품으로 처리하지 않은 샘플의 경우, PNA 프로브 (하기의 프로브 농도 참조)를 함유하는 25 ㎕의 혼성화 완충액 (HB2)을 혼성화 챔버에서 슬라이드 위에 도포하고, 커버 슬립으로 덮었다. 세포를 0.5시간 동안 55℃에서 혼성화시켰다. 혼성화 후, 슬라이드를 세척 완충액 (WB)으로 30분 동안 55℃에서 세척하였다. 한 방울의 검경용 매질 (MM) 및 커버 슬립을 건조시킨 시료에 도포하고, 슬라이드-침착 세포를 표지된 형광 현미경법 2 (FM2)의 절차에 따라 조사하였다.
PNA 프로브들 및 프로브 농도:
PNA 프로브를 파나진 (한국 대전 소재) 사로부터 수득하였다. 이 실시예 10에서 사용된 PNA 프로브의 속성을 표 13에 열거하였다.
표 13
Figure pct00013
상기 표에서 사용된 모든 약어들을 앞서 정의하였다.
표 13에서 서열 16 내지 22 및 24 내지 26으로서 열거된 10개의 플루오레세인-표지된 mecA mRNA-지정된 PNA 프로브의 혼합물을 각각 500 nM 프로브의 농도로 사용하였다. mRNA-지정된 PNA 프로브의 총 농도는 5000 nM이었다. 또한, 하나의 rRNA-지정된 에스. 아우레우스 PNA 프로브 (서열 8)를 12 nM의 농도로 HB2에 첨가하였다.
결과:
MSSA, MRSA, MR-CNS (에스. 에피데르미디스) 및 MS-CNS (에스. 에피데르미디스) 박테리아를 혈액 배양물로 첨가했을 때 이것들을 검출하였다. 박테리아는 MSSA에 대한 적색 형광 신호, 프로브 16 내지 22 및 24 내지 26 (Flu와 함께 표지됨)의 녹색 형광 및 프로브 8 (TAMRA와 함께 표지된 rRNA-지정된 에스. 아우레우스-특이적 프로브)의 적색 형광의 배합으로 인한 MRSA에 대한 황색 신호, MR-CNS에 대한 녹색 신호 (이 박테리아는 에스. 아우레우스가 아니기 때문에 이러한 박테리아는 오직 녹색이었음 (즉, TAMRA 신호가 없음)), 및 검정에서는 이 박테리아에 대해 지정된 프로브가 없기 때문에 MS-CNS에 대한 신호가 없는 것을 특징으로 하였다. 모든 결과를 표 14에 요약하였다. 혈액 배양물 중의 혼합된 집단에서의 에스. 아우레우스 및 mecA 발현의 확인은 MSSA + MRSA, MSSA + MR-CNS, MRSA + MR-CNS 및 MSSA + MR-CNS + MRSA에 대해 가능하였다.
에비진® 제품 중의 동일한 혼합된 집단을 시험할 때, MSSA + MR-CNS 혼합된 샘플에 대한 결과는 MRSA이었다. MSSA + MR-CNS 혼합된 샘플이 mecA 유전자에 대해 양성인 에스. 아우레우스 또는 CNS이면, 에비진®과 함께 에스. 아우레우스/CNS PNA FISH 제품을 사용하여, 혼합된 것으로 나타난 MSSA + MR-CNS 혼합된 샘플을 확인할 수 없었다. 표 13에 열거된 프로브와 함께 수행된 PNA FISH 검정은, 개별 박테리아 세포 중의 에스. 아우레우스 확인 및 mecA 발현의 독립적인 결정 둘 모두를 제공함으로써, MRSA, MSSA 및 MR-CNS의 명백한 확인을 제공하였다. 그 결과, 이러한 전세포 검정은 혼합된 집단을 함유하는 복합체 샘플의 정확한 결정을 할 수 있었다.
표 14
Figure pct00014
부록 VI
박테리아 균주의 설명:
#155, 에스. 아우레우스 ATCC 25923 (MSSA 25923); 메티실린-민감성 균주
#320, 에스. 아우레우스 DK (MRSA, 임상 DK); SCCmec IV; 메티실린-내성 균주
#350, 에스. 에피데르미디스 (MR-CNS, 임상); 메티실린-내성 균주
#629, 에스. 에피데르미디스 ATCC 14990 (MS-CNS); 메티실린-민감성 균주
표 15
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
본 교시사항이 다양한 실시양태와 함께 기재되어 있지만, 본 교시사항이 그러한 실시양태에 제한되고자 하는 것은 아니다. 이와는 반대로, 본 기술은 당업자에 의해 알려진 바와 같이 다양한 대안, 변형 및 등가의 것을 포함한다.
8. 참고문헌
미국 특허 및 공개된 특허 출원:
1. 1993년 7월 6일에 허여된 브레써 (Bresser) 등의 미국 특허 제5,225,326호.
2. 1997년 3월 18일에 허여된 힐디그-닐슨 (Hyldig-Nielsen)의 미국 특허 제5,612,458호.
3. 1997년 12월 30일에 허여된 마쯔나가 (Matsunaga)의 미국 특허 제5,702,895호.
4. 2000년 12월 5일에 허여된 히라마쯔 (Hiramatsu) 등의 미국 특허 제6,156,507호.
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6. 2003년 2월 25일에 허여된 골드바드 (Goldbard) 등의 미국 특허 제6,524,798호.
7. 2003년 12월 2일에 허여된 힐디그-닐슨, 제이.제이. (Hyldig-Nielsen, J.J.)의 미국 특허 제6,656,687호.
8. 2003년 12월 16일에 허여된 힐디그-닐슨 등의 미국 특허 제6,664,045호.
9. 2005년 1월 11일에 허여된 포스터 (Foster) 등의 미국 특허 제6,841,154호.
10. 2005년 6월 14일에 허여된 릭비 (Rigby) 등의 미국 특허 제6,905,824호.
11. 2006년 7월 11일에 허여된 울 (Uhl) 등의 미국 특허 제7,074,599호.
12. 2008년 11월 25일에 허여된 스튜어트 (Stuart) 등의 미국 특허 제7,455,985호.
13. 2002년 10월 3일에 공개된 코울 (Coull) 등의 미국 특허 제2002/0142326호.
14. 2005년 6월 9일에 공개된 윌리암스 (Williams) 등의 미국 특허 제2005/0123959호.
15. 2008년 1월 10일에 공개된 스텐더 (Stender) 등의 미국 특허 제2008/0008994호.
과학 출판물:
Figure pct00020
Figure pct00021
SEQUENCE LISTING <110> AdvanDx, Inc. Stender, Henrik Trnovsky, Jan Klimas, Lisa L Rasmussen, Anne K <120> Methods For Whole-Cell Analysis Of Gram-Positive Bacteria <130> ADXP001-PCT <150> US 61/179,900 <151> 2009-05-20 <150> US 61/293,674 <151> 2010-01-10 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 gtatttctga agacta 16 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 2 gctatcgtgt cacaa 15 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 3 gctccaacat gaagat 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 4 gatgatgcag ttattg 16 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 5 gatgatacct tcgtt 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 tcaatgagca aaggt 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 7 gctatcgtgt cacaa 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 8 gcttctcgtc cgttc 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 9 tcctcgtctg ttcgc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 10 agagagcagc atcca 15 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 11 gtatttctga agacta 16 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 12 gctatcgtgt cacaa 15 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 13 gctccaacat gaagat 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 14 gatgatgcag ttattg 16 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 15 gatgatacct tcgtt 15 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 16 cacattgttt cggtct 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 17 cattagttgt aagatg 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 18 tcttcagagt taatgg 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 19 gctattatcg tcaacg 16 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 20 agcatcaata gttag 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 21 tgtgcttaca agtgc 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 22 tacctgagcc ataat 15 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 23 cttcgttact catgcca 17 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 24 tagtcttcag aaatac 16 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 25 aacgaaggta tcatc 15 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 26 caataactgc atcatc 16 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 27 atcttcatgt tggagc 16 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 28 atcttcatgt tggagc 16 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 29 acgatgccta tctcat 16 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 30 gatagttacg actttc 16 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 atgtatgtgc gattgt 16 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 32 gatcaatgtt accgta 16 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 33 cgctatgatc ccaatc 16

Claims (58)

  1. a) 박테리아를 포함하는 샘플을, 상기 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 선택적 형질을 갖는 샘플의 박테리아를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법이며, 여기서
    i) 상기 방법은 전세포에 대해 수행되며; ii) 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플을, 상기 샘플내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)가 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들만을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, mRNA-지정된 표지된 프로브들의 혼합물을 사용하여 수행되는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지의 신호 증폭 없이 수행되는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 rRNA-지정된 것인 방법.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 항체-기반인 방법.
  8. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 mRNA-지정된 것인 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 표지 또는 표지들로 표지된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 박테리아-지정된 프로브가 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지된 것인 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 상기 선택적 형질을 갖는 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전에 상기 샘플을 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 표지들이 형광 표지들이고, 상기 방법이 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전-혼성화 단계를 수행하지 않는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전에 상기 샘플을 RNase 억제제로 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 형질이 1) 항생제 내성; 2) 독소 생성; 및/또는 3) 병독성 (virulence)과 관련된 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 선택적 형질이 각각 1) mecA 유전자, 또는 vanA 또는 vanB 유전자; 2) tcdB 유전자; 및/또는 3) lukF 또는 lukS 유전자를 갖는 박테리아를 결정하는 것에 의해 결정되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시키지 않으면서 수행되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 1) 샘플 내 제2 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및/또는 2) 샘플의 임의의 박테리아에 존재할 수 있는 제2 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 제2 염색체 DNA-, mRNA-지정된 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항에 있어서, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들이 직접 결정되는 것인 방법.
  21. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 PNA인 방법.
  22. 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 10 내지 20개의 핵염기 소단위 길이인 방법.
  23. a) 샘플을
    i) 상기 샘플 내 에스. 아우레우스 (S. aureus) 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및
    ii) 상기 샘플의 박테리아 내 메티실린-내성을 결정할 수 있는 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들
    과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 샘플 내 하나 이상의 에스. 아우레우스 박테리아를 결정하는 단계; 및
    c) 메티실린-내성을 갖는 상기 샘플의 하나 이상의 박테리아를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법이며, 여기서
    i) 상기 방법은 전세포에 대해 수행되고; ii) 단계 (b) 및 (c)는 임의 순서로 또는 동시에 수행되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (a-ii)가 메티실린-내성과 관련된 mRNA를 결정할 수 있는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들만을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, mRNA-지정된 표지된 프로브들의 혼합물을 사용하여 수행되는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지되는 것인 방법.
  27. 제23항 또는 제26항에 있어서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 임의의 표지의 신호 증폭 없이 수행되는 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 rRNA-지정된 것인 방법.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 항체-기반인 방법.
  30. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 mRNA-지정된 것인 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들이 표지 또는 표지들로 표지된 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 각각의 박테리아-지정된 프로브가 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지된 것인 방법.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)에서의 결정에 기초하여 상기 샘플 내 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들과 접촉시키지 않으면서 수행되는 방법.
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    α) 상기 샘플을 샘플 내 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (CNS) 박테리아를 결정할 수 있는 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계 (여기서, 상기 제2 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들은 샘플 내 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아를 확인할 수 있는 박테리아-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들로부터 독립적으로 검출가능함);
    β) 상기 샘플 내 하나 이상의 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (CNS) 박테리아를 결정하는 단계; 및
    χ) 임의로, 단계 (β) 및 (c) 및 임의로 단계 (b)에서의 결정에 기초하여, 존재하는 경우 상기 샘플 내 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 샘플의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 및 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아 둘 다를 결정하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 샘플의 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 및 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 박테리아 둘 다를 동시에 결정하는 방법.
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 메티실린-내성 코아굴라제-음성 스타필로코쿠스 (MR-CNS) 및/또는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MSSA) 박테리아의 혼합 집단을 포함하는 것으로서 상기 샘플을 특성화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  39. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전에 상기 샘플을 mRNA 유도 시약 또는 시약들과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  40. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 표지들이 형광 표지들이고, 상기 방법이 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정인 방법.
  41. 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 전-혼성화 단계를 수행하지 않는 방법.
  42. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a-ii) 전에 상기 샘플을 RNase 억제제로 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  43. 제23항 및 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들이 직접 결정되는 것인 방법.
  44. 제23항 및 제26항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 PNA인 방법.
  45. 제23항 및 제26항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 10 내지 20개의 핵염기 소단위 길이인 방법.
  46. 제23항 및 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 증폭을 이용하여 상기 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들의 표지 또는 표지들의 신호를 직접 또는 간접적으로 증폭시키는 것인 방법.
  47. a) 박테리아를 포함하는 샘플을, 상기 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 선택적 형질을 갖는 상기 샘플의 박테리아를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법이며, 여기서
    상기 방법은 i) 전세포에 대해 수행되며; ii) 샘플을 세포 투과화 시약 또는 시약들로 처리하지 않으면서 수행되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 샘플을, 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 어떠한 신호 증폭도 수행하지 않으면서 수행되는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들, 및 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들이 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들로 표지되고, 상기 결정이 상기 표지의 직접 검출에 의한 것인 방법.
  51. 박테리아에 존재하는 것으로 공지된 선택적 형질을 결정할 수 있는 mRNA-지정된 프로브를 포함하는 혼합물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 혼합물의 mRNA-지정된 프로브들 중 하나 이상이 PNA 프로브인 혼합물.
  53. 제51항에 있어서, 상기 mRNA-지정된 프로브들이 각각, 상기 박테리아의 mRNA의 분자 또는 분자들 내에서 선택적 형질과 관련된 표적과 특이적으로 결합하는 것인 혼합물.
  54. 제51항에 있어서, 상기 혼합물의 mRNA-지정된 프로브가 각각 단일 표지된 프로브 또는 이중 표지된 프로브인 혼합물.
  55. a) 샘플을 상기 샘플의 박테리아 내 메티실린-내성을 결정할 수 있는 염색체 DNA- 및/또는 mRNA-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계; 및
    b) 메티실린-내성을 갖는 상기 샘플의 하나 이상의 박테리아를 결정하는 단계
    를 포함하는, 전세포에 대해 수행되는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 박테리아가 그람-양성 박테리아인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 샘플을, 상기 샘플 내 에스. 아우레우스 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들과 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 내 하나 이상의 에스. 아우레우스 박테리아를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  58. a) 샘플을
    i) 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아를 결정할 수 있는 박테리아-지정된 프로브 또는 프로브들; 및
    ii) 상기 샘플의 선택적 그람-양성 박테리아 및/또는 다른 박테리아가 가질 수 있는 선택적 형질과 관련된 염색체 DNA, mRNA 및/또는 플라스미드 핵산을 결정할 수 있는 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들
    과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 샘플 내 선택적 그람-양성 박테리아 중 하나 이상을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 선택적 형질을 갖는 샘플의 박테리아를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법이며, 여기서
    i) 상기 방법은 전세포에 대해 수행되고; ii) 단계 (b) 및 (c)는 임의 순서로 또는 동시에 수행되고; iii) 상기 염색체 DNA-, mRNA- 및/또는 천연 플라스미드-지정된 표지된 프로브 또는 프로브들은 각각 단일 표지 또는 2개의 표지들을 포함하는 것인 방법.
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