CN106244714B - 一种巨大芽孢杆菌特异性检测的基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌特异性检测的基因芯片，属于微生物基因检测技术。本发明根据报道的巨大芽孢杆菌16SDNA序列和rpoB基因序列，选择了巨大芽孢杆菌rpoB和16S特异基因片段作为检测的靶序列。并设计了相应的多重PCR扩增引物对、探针以及检测芯片。本发明可通过该基因检测芯片能够在短时间内对巨大芽孢杆菌进行定性定量检测，实现了在“种”的水平上对巨大芽孢杆菌的分类鉴定。本发明为跟踪巨大芽孢杆菌在肥料或土壤中的定殖、繁殖等提供了有力工具。

Description

一种巨大芽孢杆菌特异性检测的基因芯片

技术领域：

本发明涉及微生物DNA检测技术，具体属于巨大芽孢杆菌DNA检测芯片及其制备，以及在微生物肥料及土壤微生物检测中的应用。

技术背景：

巨大芽孢杆菌这种功能微生物经常被用来制作生物有机肥以及被用于土壤中来调控微生物区系结构，实现作物的抗病、促生长、提高品质等。但如何定性定量跟踪这种菌在肥料、土壤中的定殖和繁殖行为一直困扰着相关工作者，常规的有效活菌数的检测已经无法满足科研需求和生产需求。通过基因芯片技术对常见的功能菌进行定性定量具有很强的应用价值。目前，传统的微生物检测方法主要为培养法，这种方法检测周期长且不能对亲缘关系近的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌进行分类鉴定。近些年类似16SDNA的条形码序列也被经常用于微生物的鉴定上，但是16S DNA在种间的差异性非常小，因此仅靠16S DNA进行分类鉴定难免出现特异性差的问题。

基因芯片是一种新型DNA识别技术，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多个物种的多个DNA条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还可以区分微生物种与种之间的微小DNA差异，即基因芯片可以在“种”的水平上对同属不同种的微生物进行准确鉴定。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌特异性检测的基因芯片及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

一种巨大芽孢杆菌16S特异基因片段，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：2。

一种巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的多重PCR扩增引物对，其核苷酸序列为：

引物1:5’FAM—GTGTAATTTCACGTATTTTACCG—3’(SEQ ID NO：3)；

引物2：5’—GCTCATGGTCCTCTTCTGAGTCC—3’(SEQ ID NO：4)。

一种巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的多重PCR扩增引物对，其核苷酸序列为：

引物1:5’FAM—GATGAACGCTGGCGGCGTGCC—3’(SEQ ID NO：5)；

引物2：5’—TAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG—3’(SEQ ID NO：6)。

一种巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的检测探针，其核苷酸序列为：5’NH₃—TTTTTTTTTTTAGCTTGGCATTCACGTTGCGTCTCCAG—3’(SEQ ID NO：7)。

一种巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的检测探针，其核苷酸序列为：5’NH₃—TTTTTTTTTTAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTG—3’(SEQ ID NO：8)。

一种巨大芽孢杆菌DNA检测芯片，含有如上所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的检测探针和巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的检测探针。

一种巨大芽孢杆菌DNA检测试剂盒，包括如前所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的多重PCR扩增引物对，巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的多重PCR扩增引物对，以及巨大芽孢杆菌DNA检测芯片。

与现有技术相比本发明的有益效果和特点：

本发明通过该基因芯片能够在短时间内对巨大芽孢杆菌进行定性定量检测，实现了在“种”的水平上对巨大芽孢杆菌的分类鉴定。具体体现在：准确性：基于DNA差异的检测，结果更可靠；时效性：相比于传统培养法鉴定耗时3-4天，本发明只需要8小时即可完成巨大芽孢杆菌的鉴定。可靠性：每种微生物设计两个检测靶点，提供了检测的特异性。

附图说明：

图1为巨大芽孢杆菌的双重靶点检测结果图。

具体实施方式：

本发明的具体实施步骤如下：

引物、探针均为本实验室设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

(1)靶序列的确定：根据报道的巨大芽孢杆菌16SDNA序列和rpoB基因序列，选择核苷酸序列为SEQ ID NO：1的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段，核苷酸序列为SEQ ID NO：2的巨大芽孢杆菌16S特异基因片段，其作为检测的靶序列。

(2)引物与探针的设计：靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：

巨大芽孢杆菌rpoB：

引物1:5’FAM—GTGTAATTTCACGTATTTTACCG—3’

引物2：5’—GCTCATGGTCCTCTTCTGAGTCC—3’

检测探针：5’NH₃—TTTTTTTTTTTAGCTTGGCATTCACGTTGCGTCTCCAG—3’

巨大芽孢杆菌16S：

引物1:5’FAM—GATGAACGCTGGCGGCGTGCC—3’

引物2：5’—TAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG—3’

检测探针：5’NH₃—TTTTTTTTTTAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTG—3’

(3)模板提取：为了验证所设计引物的特异性，用所设计的多重PCR引物，将巨大芽孢杆菌同属的其他两种芽孢杆菌的基因组DNA引入扩增体系中。用天根生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(阴性对照)、苏云金芽孢杆菌(阴性对照)混合样品中的总DNA提取方法及步骤详见说明书。

(4)PCR扩增及荧光标记：用上述两对引物对所提取的微生物的总DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：

成分	用量
		引物(FAM标记5’端)	10pM 0.2μl
10×PCR buffer	2.5μl
		模板DNA	3μl
DNA聚合酶	0.5μl
		dNTP	10mM 2μl
ddH<sub>2</sub>O	补充至25μl

(5)芯片制备：将氨基化的探针按一定浓度点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液I(5×SSC,1％SDS)、洗脱液II(0.25×SSC,1％SDS)各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用。为了验证所设计探针的特异性，将巨大芽孢杆菌同属的其他两种芽孢杆菌的检测探针作为阴性对照，也固定到芯片片基上。

(6)分子杂交：将步骤(4)的PCR产物与步骤(5)制备好的芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液I(5×SSC,1％SDS)、洗脱液II(0.25×SSC，1％SDS)各洗脱5min。

(7)结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果，巨大芽孢杆菌检测探针与PCR扩增产物杂交结果呈现亮绿色，而枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌两个阴性对照并无荧光显色，结果见图1。

图1中Bt-rpoB为苏云金芽孢杆菌的rpoB基因检测位点，Bt-16S为苏云金芽孢杆菌的16S DNA检测位点；图中Bm-rpoB为巨大芽孢杆菌的rpoB基因检测位点，Bm-16S为巨大芽孢杆菌的16S DNA检测位点；图中Bs-rpoB为枯草芽孢杆菌的rpoB基因检测位点，Bs-16S为枯草芽孢杆菌的16S DNA检测位点。

Claims (5)

1.一种巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的多重PCR扩增引物对，其核苷酸序列为：

引物1:5’FAM—GTGTAATTTCACGTATTTTACCG—3’

引物2：5’—GCTCATGGTCCTCTTCTGAGTCC—3’。

3.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的检测探针，其核苷酸序列为：5’NH₃—TTTTTTTTTTTAGCTTGGCATTCACGTTGCGTCTCCAG—3’。

4.一种巨大芽孢杆菌DNA检测芯片，含有如权利要求3所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的检测探针和巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的检测探针；

所述巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的检测探针，其核苷酸序列为：5’NH₃—TTTTTTTTTTAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTG—3’。

5.一种巨大芽孢杆菌DNA检测试剂盒，包括如权利要求2所述的巨大芽孢杆菌rpoB特异基因片段的多重PCR扩增引物对，巨大芽孢杆菌16S特异基因片段的多重PCR扩增引物对，以及权利要求4所述的DNA检测芯片；

所述的巨大芽孢杆菌16S特异基因片段，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：2；所述的多重PCR扩增引物对，其核苷酸序列为：引物1:5’FAM—GTGTAATTTCACGTATTTTACCG—3’，引物2：5’—GCTCATGGTCCTCTTCTGAGTCC—3’。