CN101649350A - 一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法 - Google Patents

一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速区分蛹虫草MAT1－1和MAT1－2交配型的分子检测方法，包括两对检测交配型的特异性引物(Cm1－F/Cm1－R和Cm2－F/Cm2－R)和两套相应的PCR扩增体系和扩增程序。引物对Cm1－F/Cm1－R用于蛹虫草MAT1－1交配型的检测，另一引物对Cm2－F/Cm2－R用于MAT1－2交配型的检测，用这两对特异性引物及其相应的PCR扩增体系和PCR扩增程序可以实现对蛹虫草交配型的快速检测。本发明的检测结果特异性强，稳定，可靠，快速，较生物学检测的时间大大缩短。本发明不仅适用于食药用菌生产、菌种选育、植物保护等相关专业领域对蛹虫草交配型的检测和进行交配型基因及系统发育等方面的研究，对研究虫草属其他真菌的有性生殖以及指导生产实践都具有重要的意义。

Description

一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种快速区分蛹虫草(Cordyceps militaris)交配型的分子检测方法。本发明技术适用于食药用菌生产、菌种选育、植物保护等相关专业领域对蛹虫草交配型的检测和进行交配型基因及系统发育等方面的研究。
背景技术
真菌的交配系统主要分为同宗配合(自身可育)和异宗配合(自身不育)，其中异宗配合的菌株必须由不同的交配型个体交配才能完成有性生殖。异宗配合菌株的交配型基因调控着个体间性的亲和性，在有性生殖、子实体分化、发育、遗传进化等方面发挥着决定性作用。因而对自然群体中真菌交配型的研究，将加深人们对菌株遗传背景的了解，为菌种鉴定提供参考、为改良菌种提供指导，具有重要理论和实践价值。
蛹虫草(C.militaris)最早源于我国，由于其药用价值与冬虫夏草(C.sinensis)相似，故药典中又记载为“北冬虫夏草”，同时蛹虫草是虫草属真菌的模式种，因而对蛹虫草的研究具有很高的经济和学术价值。蛹虫草为异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型。研究表明，只有两个不同交配型的菌株混合培养，蛹虫草才能完成有性生殖，产生具有药用价值的子实体。因而，研究快速检测菌株交配型的方法，对于生产和开发蛹虫草具有重要应用价值。
近几年，用PCR方法对子囊菌交配型基因进行研究和检测的报道不断增多，但有关蛹虫草交配型基因的研究屈指可数。Yokoyama等(FEMS Microbiology Letters，2004，237：205-212)于2004年研究麦角菌科真菌交配型时，设计了两对简并引物用于检测蛹虫草交配型，并将获得的两个交配型基因的部分保守序列提交GenBank数据库(序列号分别为AB124614和AB124626)。2005年Yokoyama等又成功获得蛹虫草的MAT1-1和MAT1-2两种交配型基因的全长序列(序列号分别是AB194982和AB084257)。但我们在试验中用Yokoyama等设计的简并引物并不能有效区分国内蛹虫草菌株的交配型。因而，有必要重新设计特异性引物，从而高效、快速测定我国蛹虫草菌株的交配型，为其开发利用提供技术指导。
本发明基于GenBank中登录的蛹虫草的2个交配型基因的全长和部分保守序列，设计了两对特异性引物，分别用于MAT1-1和MAT1-2交配型菌株的检测。通过试验条件的优化，保证了检测结果特异、稳定和可靠。若采用传统的混合培养法，需要培养近两个月才能观察蛹虫草的子实体形成情况，因而本方法大大缩短了检测时间。与传统方法相比，本方法还避免了环境因素对检测结果的影响，保证了交配型检测的准确性和可靠性。
本发明中所涉及的检测引物和检测方法在国内外均未见报道，适用于食药用真菌开发、微生物等相关研究的各科研部门使用。由于对蛹虫草的交配型进行检测是研究其遗传学、进一步克隆交配型基因和研究交配型基因功能的基础，本发明对研究虫草属其他真菌的有性生殖以及指导生产实践都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服传统蛹虫草交配型检测方法存在的缺陷，提供一种快速、准确且易于操作的区分蛹虫草交配型的分子检测方法。本方法可以直接用于生产实践，对提高人工栽培蛹虫草的产量和品质无疑具有重要意义。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，包括分别用于检测交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的两对特异性引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R的寡核苷酸序列、两套相应的PCR扩增体系以及扩增程序。
快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的一对特异性引物Cm1-F/Cm1-R，其特征在于，Cm1-F的寡核苷酸序列为5′-CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3′，Cm1-R的寡核苷酸序列为5′-ATATACCTTCGCGATCATTG-3′。
快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序，其特征在于，PCR扩增体系包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，60℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，58℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
利用特异性引物Cm1-F和Cm1-R及相应的PCR扩增体系和PCR扩增程序检测蛹虫草交配型时，MAT1-1交配型菌株均可得到一条180bp左右的条带，而MAT1-2交配型菌株没有扩增产物。
快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的一对特异性引物Cm2-F/Cm2-R，其特征在于，Cm2-F的寡核苷酸序列为5′-CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3′，Cm2-R的寡核苷酸序列为5′-GGGATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。
快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序，其特征在于，PCR扩增体系包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，66℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，64℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
利用特异性引物Cm2-F/Cm2-R及相应的PCR扩增体系和PCR扩增程序检测蛹虫草交配型时，MAT1-2交配型菌株均可得到一条210bp左右的条带，而MAT1-1交配型菌株没有扩增产物。
本发明的核心在于用于检测蛹虫草交配型的两对特异性引物。所用引物是根据GenBank数据库中蛹虫草两个交配型基因的部分保守序列(序列号分别为AB124614和AB124626)和全长序列(序列号分别是AB194982和AB084257)设计的。随机选取14个蛹虫草单分生孢子菌株，利用引物Cm1-F/Cm1-R对其DNA进行PCR扩增时，MAT1-1交配型菌株可以扩增得到一条180bp左右的条带，MAT1-2交配型菌株没有扩增产物；利用引物Cm2-F/Cm2-R进行PCR扩增时，MAT1-2交配型的菌株可以扩增得到一条210bp左右的条带，MAT1-1交配型菌株没有扩增产物。
本发明适用于蛹虫草两种交配型的快速检测。蛹虫草是一种重要的药用兼食用真菌，具有很高的经济价值，有性生殖产生的子实体正是蛹虫草的药用和食用部位。蛹虫草为异宗配合真菌，所以利用不同交配型的菌株混合培养可以大大增加子实体产生的几率。传统的交配型检测方法费时、费力，本发明可实现蛹虫草交配型的快速检测且检测结果十分可靠。本发明可直接用于指导生产，可以大大了增加蛹虫草出草的概率，提高子实体的产量和品质，对于蛹虫草的生产和开发具有十分重要的经济意义。
附图说明
图1特异性引物Cm1-F/Cm1-R对蛹虫草单分生孢子菌株DNA的PCR扩增电泳图：M代表Marker-DL2000；泳道1和泳道2分别为MAT1-1交配型和MAT1-2交配型标准菌株；泳道3为空白对照，泳道4-17为蛹虫草单分生孢子菌株。
图2特异性引物Cm2-F/Cm2-R对蛹虫草单分生孢子菌株DNA的PCR扩增电泳图：各泳道的菌株编号同图1。
具体实施方式
本发明的技术内容是一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，包括MAT1-1交配型的特异性引物对Cm1-F/Cm1-R和MAT1-2交配型特异性引物对Cm2-F/Cm2-R，及其相应的PCR扩增体系和PCR扩增程序。
引物Cm1-F的寡核苷酸序列为：5′-CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3′；引物Cm1-R的寡核苷酸序列为：5′-ATATACCTTCGCGATCATTG-3′。
引物Cm2-F的寡核苷酸序列为：5′-CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3′；引物Cm2-R的寡核苷酸序列为：5′-GGGATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。
用引物对Cm1-F/Cm1-R在蛹虫草MAT1-1交配型菌株中可以特异性地扩增得到一条180bp左右的条带；用引物对Cm2-F/Cm2-R在MAT1-2交配型的菌株中可以特异性地扩增得到一条210bp左右的条带。
蛹虫草交配型的快速检测方法如下：
1.收集所需检测样本的菌丝或组织，单子囊孢子菌株、单分生孢子菌株的菌丝和子实体组织均可。
2.采用CTAB/NaCl法提取所需检测样本的DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对所提取DNA进行定量分析。
3.利用由生物公司合成的特异性引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R对上述提取的样本DNA进行PCR扩增。
4.引物Cm1-F/Cm1-R的扩增体系和扩增程序如下：
PCR扩增体系25μL，包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，60℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，58℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
5.引物Cm2-F/Cm2-R的扩增体系和扩增程序如下：
PCR扩增体系25μL，包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，66℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，64℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
6.取8μL扩增产物用1.4％的琼脂糖凝胶进行电泳。100V稳定电压电泳40min后，将凝胶置于溴化乙锭溶液中浸泡5-10min，移至清水中漂洗，经Alpha凝胶成像仪系统记录电泳结果，利用Marker对扩增条带大小进行标记。
实施例1：引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R检测蛹虫草单分生孢子菌株的交配型
利用引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R对14个蛹虫草单分生孢子菌株进行交配型快速检测。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增体系包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。引物对Cm1-F/Cm1-R的PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，60℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，58℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。引物对Cm2-F/Cm2-R的PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，66℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，64℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。用1.4％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。引物对Cm1-F/Cm1-R在MAT1-1交配型的单分生孢子菌株中可以特异性地扩增得到一条180bp左右的条带，检测结果见图1；引物对Cm2-F/Cm2-R在MAT1-2交配型的单分生孢子菌株中可以特异性地扩增得到一条210b p左右的条带，检测结果见图2。
实施例2：引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R检测蛹虫草单子囊孢子菌株的交配型。
利用引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R对13个蛹虫草单子囊孢子菌株进行交配型检测。PCR扩增体系和扩增程序均同实例1的蛹虫草单分生孢子菌株交配型检测的步骤。引物对Cm1-F/Cm1-R在MAT1-1交配型的单子囊孢子菌株中可以特异性地扩增得到一条180bp左右的条带，检测结果见图3；引物对Cm2-F/Cm2-R在MAT1-2交配型的单子囊孢子菌株中可以特异性地扩增得到一条210b p左右的条带，检测结果见图4。
附图说明
图3特异性引物Cm1-F/Cm1-R对蛹虫草单子囊孢子菌株DNA的PCR扩增电泳图：M代表Marker-DL2000；泳道1和2分别为MAT1-1交配型和MAT1-2交配型标准；泳道3-15为蛹虫草单子囊孢子菌株；泳道16为空白对照。
图4特异性引物Cm2-F/Cm2-R对蛹虫草单子囊孢子菌株DNA的PCR扩增电泳图：各泳道的菌株编号同图3。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>蛹虫草(Cordyceps militaris)
<400>1
cgcattcaga agtgagtgca
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>蛹虫草(Cordyceps militaris)
<400>2
atataccttc gcgatcattg
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>蛹虫草(Cordyceps militaris)
<400>3
cgacatacgc ttgtcaagaa aagc
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>蛹虫草(Cordyceps militaris)
<400>4
gggatgccgt tcgaggagag

Claims (7)

1.一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，包括分别用于检测交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的两对特异性引物Cm1-F/Cm1-R和Cm2-F/Cm2-R的寡核苷酸序列、两套相应的PCR扩增体系以及扩增程序。
2.如权利要求1所述一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的一对特异性引物Cm1-F/Cm1-R，其特征在于，Cm1-F的寡核苷酸序列为5′-CGCATTCAGAAGTGAGTGCA-3′，Cm1-R的寡核苷酸序列为5′-ATATACCTTCGCGATCATTG-3′。
3.如权利要求1所述一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序，其特征在于，PCR扩增体系包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，60℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，58℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
4.利用权利要求2所述快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的一对特异性引物Cm1-F/Cm1-R和权利要求3所述快速检测蛹虫草MAT1-1交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序检测蛹虫草交配型时，MAT1-1交配型菌株均可得到一条180bp左右的条带，而MAT1-2交配型菌株没有扩增产物。
5.如权利要求1所述一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的一对特异性引物Cm2-F/Cm2-R，其特征在于，Cm2-F的寡核苷酸序列为5′-CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC-3′，Cm2-R的寡核苷酸序列为5′-GGGATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。
6.如权利要求1所述一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法，快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序，其特征在于，PCR扩增体系包括10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10mM正向和反向引物各0.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：预变性95℃5min；95℃40s，66℃30s，72℃30s先扩增6个循环；随后95℃40s，64℃30s，72℃30s扩增24个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。
7.利用权利要求5所述快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的一对特异性引物Cm2-F/Cm2-R和权利要求6所述快速检测蛹虫草MAT1-2交配型的PCR扩增体系和PCR扩增程序检测蛹虫草交配型时，MAT1-2交配型菌株均可得到一条210bp左右的条带，而MAT1-1交配型菌株没有扩增产物。
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