CN102643895B - 一种蝉拟青霉菌株的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本专利涉及分子生物学技术领域，公开了一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的方法，包括下列步骤：提取待检菌株的DNA；对待检菌株DNA分别采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06进行PCR扩增：获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAPD条带图谱；将获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定结果。采用本发明的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453，并且不受环境影响。
Description
技术领域
本专利涉及分子生物学技术领域，具体涉及保藏号为CGMCC No.3453的蝉拟青霉菌株的鉴定方法。
背景技术
蝉花，别名虫花，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝉草Cordyceps cicadae，基生棒束孢Isaria basili，辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii，丛生虫壳菌Torrubia caespitosa，辛克莱虫草Cordyceps sinclairii，哈里棒束孢Isaria hariottii，小蝉茸Cordyceps sobolifera，辛克莱棒束孢Isaria sinclairii，蒙克苏棒束孢Isaria mokanshawii和多枝棒束孢Isaria arbuscula等等。
蝉拟青霉的有性阶段被认为是大蝉草Cordyceps cicadae，在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。常采到的是蝉拟青霉及其寄主山蝉若虫寄生后的复合体。根据历史产区浙江的1467份样品的调查，药材蝉花主要是蝉拟青霉寄生后的虫菌复合体。蝉拟青霉属半知菌类真菌，其孢梗束自虫体头部长出，单生或丛聚成束，浅黄色，长1.5～8.0厘米，前端膨大，呈纺锤形或呈鸡冠花状。
本发明所涉及的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。
该蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]采用如下方法进行分离：
从云南三江源头采集纯净无污染野生蝉花标本，在净化工作台上用火焰灭菌过的移植镊从样本上取少量分生孢子于加入孟加拉红的PSA平板上置22℃-25℃下培养120h后再挑取单菌落接入斜面培养基，在22℃-25℃下培养并经反复纯化即可得本发明所述的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。
蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453属于半知菌亚门Deuteromycotina，丝孢纲Hyphomycetes，束梗孢目Stilbellales，束梗孢科Stilbellaceae，拟青霉属Paecilomyces。其主要形态特征为：
在PDA培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平展，初絮状，后粉状，白色至浅黄色，背面浅黄色，直径5～6厘米。菌丝无色，分枝，具隔膜，宽1.2～2.5μm。分生孢子梗多分枝，宽3.0～5.5μm，由每轮2～5个产孢细胞组成轮状分枝。产孢细胞瓶形，基部球状膨大，向上变细窄，4.5～6.5×2.5～3.5μm。分生孢子圆柱形，单细胞，无色，平滑，链生，直或弯曲，6.5～8.8(～11.0)×2.5～3.5μm。
蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453经试验证实其培养物具有易于培养、产量高的特点，其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，因此具有广泛的工业化应用价值。
由于地理来源不同、寄主不同的蝉拟青霉菌株，其次生代谢产物方面具有较大的变异性。但是现有的蝉拟青霉鉴定方法是通过菌体形态，生长特性及生理反应的特征进行鉴定的，这些形态学鉴定的方法受环境因素影响，难以对形态差异较小的种间和种内菌株加以鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用RAPD(random amplified polymorphic DNA随机扩增多态性DNA标记)技术鉴定蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453的方法，以及特定引物和反应条件下蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的RAPD条带图谱。
本发明公开了一种鉴定蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCCNo.3453的方法，包括下列步骤：
1)提取待检菌株的DNA；
2)对步骤1)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增：
S6：TGCTCTGCCC；
S10：CTGCTGGGAC；
S31：CAATCGCCTG；
OPV-14：AGATCCCGCC；
OPW-06：AGGCCCGATG；
3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAPD条带图谱；
4)将步骤3)获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定结果。
进一步的，步骤2)的引物还包括以下引物中的一种或多种：
S7：GGTGACGCAG；
S33：CAGCACCCAC；
S69：CTCACCGTCC；
OPC-10：TGTCTGGGTG；
OPF-06：GGGAATTCGG；
OPG-03：GAGCCCTCCA；
OPH-18：GAATCGGCCA；
OPH-20：GGGAGACATC。
进一步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应体系如下：总体积25ul，DNA样本：20-50ng，Mg2+：50n mol，dNTP：5n mol，引物：10p mol，Taq酶：1.5U(如TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液：2.5ul(如TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul。
进一步的，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃3分钟；而后依次95℃40秒，56℃1分钟，72℃2分钟，共循环40次；然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
进一步的，所述步骤4)中，将步骤3)获得的待检菌株RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较，如两者相似度为95％以上，则鉴定待检菌株为蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson CGMCC No.3453。
所述相似度的计算方法为：F＝2NXY/(NX+NY)*100％(其中F为相似度，NXY为待检菌株RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较后二者相同的条带数，NX为待检菌株RAPD条带图谱拥有的条带数，NY为标准样本的RAPD条带图谱拥有的条带数)。
采用本发明的鉴定方法，可快速、准确地鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453，并且不受环境影响。
附图说明
图1：各引物对应的标准样本的RAPD条带图谱
1：S6为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为6500～6000bp之间，5500～4700bp之间，2600～2300bp之间，2000～1800bp之间，1700～1600bp之间，1450～1350bp之间，1300～1200bp之间。
2：S7为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为4700～3700bp之间，2000～1800bp之间，1550～1400bp之间，1350～1200bp之间，790～720bp之间。
3：S10为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为5700～5200bp之间，4800～4300bp之间，2300～2050bp之间，2000～1900bp之间，1850～1700bp之间，1350～1200bp之间，920～880bp之间，830～790bp之间，740～700bp之间，450～410bp之间。
4：S31为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为8100～6900bp之间，4700～3300bp之间，2200～1800bp之间，1650～1300bp之间，1200～1100bp之间，870～830bp之间，690～650bp之间。
5：S33为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为5000～4000bp之间，2800～2300bp之间，2150～200bp之间，1750～1550bp之间，1500～1380bp之间，1200～1050bp之间，900～850bp之间。
6：S69为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为45000～35000bp之间，6000～4300bp之间，2900～2300bp之间，2130～1900bp之间，1500～1270bp之间，400～380bp之间。
7：OPC-10为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为5000～4300bp之间，3800～3300bp之间，2000～1750bp之间，900～850bp之间，750～800bp之间。
8：OPF-06为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为65000～50000bp之间，6500～4800bp之间，4300～3800bp之间，2500～2300bp之间，1850～1600bp之间，1250～1050bp之间。
9：OPG-03为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为4700～4300bp之间，4000～2800bp之间，2400～2050bp之间，1900～1700bp之间，1080～1000bp之间。
10：OPH-18为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为4300～3600bp之间，2600～2300bp之间，1950～1750bp之间，1650～1350bp之间，1020～970bp之间，750～720bp之间，560～540bp之间。
11：OPH-20为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为5500～4300bp之间，3500～3100bp之间，2700～2400bp之间，2350～2280bp之间，1830～1600bp之间，1050～980bp之间，650～620bp之间，440～420bp之间。
12：OPV-14为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为6400～4700bp之间，4300～3700bp之间，2100～2000bp之间，1950～1800bp之间，1620～1500bp之间，1350～1250bp之间，1220～1180bp之间，830～860bp之间。
13：OPW-06为引物RAPD条带图谱，泳道1为BA001的PCR结果，泳道M为Maker，条带按照分子量大小顺序依次是：23130bp，9416bp，6557bp，2322bp，2027bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp。BA001的RAPD条带大小估算为6000～5200bp之间，4700～4100bp之间，3700～3000bp之间，2200～2070bp之间，1700～1550bp之间，1500～1300bp之间，1050～1000bp之间。
图2：RAPD指纹图谱的稳定性试验获得的电泳图谱
1：S6为引物的RAPD条带图谱
2：S10为引物的RAPD条带图谱
3：S31为引物的RAPD条带图谱
4：OPV-14为引物的RAPD条带图谱
5：OPW-06为引物的RAPD条带图谱
6：OPC-10为引物的RAPD条带图谱
图3：内不同批次抽提的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的DNA的RAPD多态性相似度试验获得的电泳图谱
1：S6为引物的RAPD条带图谱
2：S10为引物的RAPD条带图谱
3：S31为引物的RAPD条带图谱
4：S33为引物的RAPD条带图谱
5：OPV-14为引物的RAPD条带图谱
6：OPW-06为引物的RAPD条带图谱
7：OPC-10为引物的RAPD条带图谱
图4：同一菌株不同传代数的样本DNA的RAPD相似度试验获得的电泳图谱
1：S6为引物的RAPD条带图谱
2：S10为引物的RAPD条带图谱
3：S31为引物的RAPD条带图谱
4：S33为引物的RAPD条带图谱
5：OPV-14为引物的RAPD条带图谱
6：OPW-06为引物的RAPD条带图谱
条带A：第11代的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453对应的RAPD条带图谱
条带B：第10代的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453对应的RAPD条带图谱
条带C：第5代的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453对应的RAPD条带图谱
条带D：第1代的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453对应的RAPD条带图谱
图5(包括图5-1和图5-2)：不同菌株RAPD多态性指纹图谱检测试验获得的电泳图谱
1：S6为引物的RAPD条带图谱
2：S7为引物的RAPD条带图谱
3：S10为引物的RAPD条带图谱
4：S31为引物的RAPD条带图谱
5：S33为引物的RAPD条带图谱
6：S69为引物的RAPD条带图谱
7：OPC-10为引物的RAPD条带图谱
8：OPF-06为引物的RAPD条带图谱
9：OPG-03为引物的RAPD条带图谱
10：OPH-18为引物的RAPD条带图谱
11：OPH-20为引物的RAPD条带图谱
12：OPV-14为引物的RAPD条带图谱
13：OPW-06为引物的RAPD条带图谱
条带E：蛹虫草菌株对应的RAPD条带图谱
条带F：细脚拟青霉菌株对应的RAPD条带图谱
条带G：蝉拟青霉菌株B-5对应的RAPD条带图谱
条带H：蝉拟青霉菌株f12对应的RAPD条带图谱
条带I：蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453对应的RAPD条带图谱
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中菌种培养及DNA的提取均采用常规方法进行。
本发明基于RAPD技术，先人工合成多个随机多态核苷酸序列作为引物，从中筛选出重复性好，扩增条带种间及种内差异明显的随机多态核苷酸序列S6，S7，S10，S31，S33，S69，OPV-14，OPW-06、OPC-10、OPF-06、OPG-03、OPH-18和OPH-20，并进一步优化反应条件，从而获得建立了对蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的鉴定方法。
实施例1RAPD指纹图谱的稳定性试验：
试验操作：
1.常规方法提取蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的DNA，采用引物S6，S10，S31，S80，OPV-14，OPW-06，OPC-10进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。
2.PCR反应条件如下：
反应体系：体积25ul，DNA：20-50ng，Mg2+：50n mol，dNTP：5n mol，引物：10p mol，Taq酶：1.5U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液：2.5ul(TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。
PCR反应条件95℃3分钟，接下来是95℃40秒，56℃1分钟，72℃2分钟，循环40次，然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
1.琼脂糖凝胶电泳，胶：1.5％的琼脂糖胶；缓冲液：1X TBE缓冲液(90m M Tris-H3BO3，2m M EDTA)，电压：160v，时间：45分钟。
2.图像拍摄，拍摄仪器：Tanon 2500。
实验结果：
分别以S6，S10，S31，S80，OPV-14，OPW-06和OPC-10为引物，以同一次提取的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的DNA为模板的PCR获得电泳图谱(如图2所示)
从电泳图谱上看，以同一次抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，按照公式：F＝2NXY/(NX+NY)*100％(其中F为相似度，NXY为二者相同的条带数，NX为X拥有的条带数，NY为Y拥有的条代数)，计算二者的相似度为100％。
从以上试验结果可以得出，RAPD检测DNA的多态性是一种稳定的方法。
实施例2，内不同批次抽提的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的DNA的RAPD多态性相似度：
试验操作：
1.取不同批次提取的蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的DNA，分别以引物S6，S10，S31，S33，OPV-14，OPW-06，OPC-10进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。
2.PCR反应条件如下：
反应体系：体积25ul，DNA：20-50ng，Mg2+：50n mol，dNTP：5n mol，引物：10p mol，Taq酶：1U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液：2.5ul(TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。
PCR反应条件95℃3分钟，接下来是95℃40秒，56℃1分钟，72℃2分钟，循环40次，然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
3.琼脂糖凝胶电泳，胶：1.2％的琼脂糖胶；缓冲液：1X TBE缓冲液(90m M Tris-H3BO3，2m M EDTA)，电压：160v，时间：45分钟。
4.图像拍摄，拍摄仪器：Tanon 2500。
实验结果：
电泳图谱(如图3所示)是S6，S10，S31，OPV-14，OPW-06和OPC-10为引物，以两次提取的BA001的DNA为模板的PCR反应结果。
从电泳图谱上看，以两次不同抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，并且次要扩增片段也存在很高的相似性，按照公式：F＝2NXY/NX+NY*100％(其中F为相似度，NXY为二者相同的条带数，NX为X拥有的条带数，NY为Y拥有的条代数)，计算二者的相似度为98.8％。
从以上结果可以得出，本发明的RAPD检测不同样本的DNA多态性是一种稳定的，可操作的方法。
实施例3，同一菌株不同传代数的样本DNA的RAPD相似度试验：
试验操作：
1.提取同一蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的四个不同传代数的样本的DNA，做RAPD引物S6，S10，S31，OPV-14，OPW-06进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。
2.PCR反应条件如下：
反应体系：体积25ul，DNA：20-50ng，Mg2+：50n mol，dNTP：5n mol，引物：10p mol，Taq酶：1.5U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液：2.5ul(TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。
PCR反应条件95℃3分钟，接下来是95℃40秒，56℃1分钟，72℃2分钟，循环40次，然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
5.琼脂糖凝胶电泳，胶：1.5％的琼脂糖胶；缓冲液：1X TBE缓冲液(90m M Tris-H3BO3，2m M EDTA)，电压：160v，时间：45分钟。
6.图像拍摄，拍摄仪器：Tanon 2500。
实验结果：
电泳图谱(如图4所示)分别是S6，S10，S31，OPV-14和OPW-06为引物，以一个菌株的四个不同传代数的样本的DNA为模板的PCR反应结果。
从电泳图谱上看，以两次不同抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，并且次要扩增片段也存在很高的相似性，按照公式：F＝2NXY/NX+NY*100％(其中F为相似度，NXY为二者相同的条带数，NX为X拥有的条带数，NY为Y拥有的条代数)，计算第1代样本与第5代样本的相似度为98.2％，计算第1带样本与第10代样本的相似度为98.2％，计算第1带样本与第11代样本的相似度为96.3％，计算第5代样本与第10代样本的相似度为100％，计算第5代样本与第11代样本的相似度为98.2％，计算第10代样本与第11代样本的相似度为98.2％。
由以上实验结果可以得出，RAPD鉴定菌株是一种稳定的、可操作的方法。
实施例4蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453及其它两种蝉拟青霉菌株、细脚拟青霉菌株和蛹虫草菌株RAPD多态性指纹图谱检测
实验操作：
1.取蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453，蝉拟青霉菌株f12(分离自安徽繁昌采集的竹蝉蛹)，蝉拟青霉菌株B-5(分离自上海采集的鳞翅目蛹体)，细脚拟青霉菌株(分离自上海采集的鳞翅目蛹体)，及蛹虫草菌株(分离自黑龙江黑河采集的蚱蝉蛹体)分别培养后提取DNA，分别采用引物S6、S7、S10、S31、S33、S69、OPC-10、OPF-06、OPG-03、OPH-18、OPH-20、OPV-14、OPW-06进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测RAPD条带图谱。
引物编号序列对照表：
| 引物编号 | 引物序列 | 引物编号 |
| S6 | TGCTCTGCCC | SEQ ID NO：1 |
| S7 | GGTGACGCAG | SEQ ID NO：2 |
| S10 | CTGCTGGGAC | SEQ ID NO：3 |
| S31 | CAATCGCCTG | SEQ ID NO：4 |
| S33 | CAGCACCCAC | SEQ ID NO：5 |
| S69 | CTCACCGTCC | SEQ ID NO：6 |
| OPC-10 | TGTCTGGGTG | SEQ ID NO：7 |
| OPF-06 | GGGAATTCGG | SEQ ID NO：8 |
| OPG-03 | GAGCCCTCCA | SEQ ID NO：9 |
| OPH-18 | GAATCGGCCA | SEQ ID NO：10 |
| OPH-20 | GGGAGACATC | SEQ ID NO：11 |
| OPV-14 | AGATCCCGCC | SEQ ID NO：12 |
| OPW-06 | AGGCCCGATG | SEQ ID NO：13 |
2.PCR反应条件如下：
反应体系：体积25ul，DNA：20-50ng，Mg2+：50n mol，dNTP：5n mol，引物：10p mol，Taq酶：1U(TAKARA Ex Taq)，酶反应缓冲液：2.5ul(TAKARA Ex Taq Buffer)，加双蒸水至25ul，用移液器吹打均匀。
PCR反应条件95℃3分钟，接下来是95℃40秒，56℃1分钟，72℃2分钟，循环40次，然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
7.琼脂糖凝胶电泳，胶：1.2％的琼脂糖胶；缓冲液：1X TBE缓冲液(90m M Tris-H3BO3，2m M EDTA)，电压：160v，时间：45分钟。
8.图像拍摄，拍摄仪器：Tanon 2500。
实验结果：
5个菌株，13条引物的RAPD指纹图谱如图5所示；
从电泳图谱上看，以两次不同抽提的DNA作为模板的PCR反应，得到的主要的随机扩增片段是一致的，并且次要扩增片段也存在很高的相似性，按照公式：F＝2NXY/NX+NY*100％(其中F为相似度，NXY为二者相同的条带数，NX为X拥有的条带数，NY为Y拥有的条代数)，计算五个菌株两两之间的相似度。
当选取引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06的RAPD指纹图谱时，计算蝉拟青霉BA001与蝉拟青霉F12之间的相似度为42.1％；蝉拟青霉BA001与蝉拟青霉B5之间的相似度为45.1％；蝉拟青霉BA001与细脚拟青霉之间的相似度为29.4％；蝉拟青霉BA001与蛹拟青霉之间的相似度为8.8％；蝉拟青霉F12与蝉拟青霉B5之间的相似度为48.3％；蝉拟青霉F12与细脚拟青霉之间的相似度为35.9％；蝉拟青霉F12与蛹拟青霉之间的相似度为13.0％；蝉拟青霉B5与细脚拟青霉之间的相似度为55.2％；蝉拟青霉B5与蛹拟青霉之间的相似度为14.9％；细脚拟青霉与蛹拟青霉之间的相似度为15.4％。
当选取所有13条引物的RAPD指纹图谱时，计算蝉拟青霉BA001与蝉拟青霉F12之间的相似度为46.7％；蝉拟青霉BA001与蝉拟青霉B5之间的相似度为46.5％；蝉拟青霉BA001与细脚拟青霉之间的相似度为25.9％；蝉拟青霉BA001与蛹拟青霉之间的相似度为4.4％；蝉拟青霉F12与蝉拟青霉B5之间的相似度为51.1％；蝉拟青霉F12与细脚拟青霉之间的相似度为40％；蝉拟青霉F12与蛹拟青霉之间的相似度为11.2％；蝉拟青霉B5与细脚拟青霉之间的相似度为48.6％；蝉拟青霉B5与蛹拟青霉之间的相似度为12.6％；细脚拟青霉与蛹拟青霉之间的相似度为11.4％。
从上述结果可见采用引物S6、S10、S31、OPV-14和OPW-06的RAPD多态性检测已足以区分出不同种的菌种，而且可以区分出地理来源不同、寄主不同的蝉拟青霉菌株，适合作为鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的方法。而引物S7、S33、S69、OPC-10、OPF-06、OPG-03、OPH-18和OPH-20也可作为备选用于蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的RAPD多态性检测。
Claims (3)
1.一种鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的方法，包括下列步骤：
1)提取待检菌株的DNA；
2)对步骤1)获得的待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增：
S6：TGCTCTGCCC；
S10：CTGCTGGGAC；
S31：CAATCGCCTG；
OPV-14：AGATCCCGCC；
OPW-06：AGGCCCGATG；
3)将步骤2)获得的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳后获得待检菌株的RAPD条带图谱；
4)将步骤3)获得的待检菌株的RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较判定获得鉴定结果，两者相似度为95％以上，则鉴定待检菌株为蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453，
所述步骤2)所采用的PCR扩增反应体系如下：总体积25ul，DNA样本：20-50ng，Mg2+：50nmol，dNTP：5nmol，引物：10pmol，Taq酶：1.5U，酶反应缓冲液：2.5ul，加双蒸水至25ul。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)所采用的PCR扩增反应条件如下：先95℃ 3分钟；而后依次95℃ 40秒，56℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共循环40次；然后72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。
3.如权利要求1所述鉴定蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453的方法，其特征在于，所述相似度的计算方法为：F＝2NXY/(NX+NY)*100％；其中F为相 似度，NXY为待检菌株RAPD条带图谱与标准样本的RAPD条带图谱比较后二者相同的条带数，NX为待检菌株RAPD条带图谱拥有的条带数，NY为标准样本的RAPD条带图谱拥有的条带数。
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| 淡紫拟青霉种内RAPD多态性分析;王艳娜等;《中国农学通报》;20060228;第22卷(第2期);25-28 * |
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Effective date of registration: 20130513 Address after: 314200 Pinghu City, Zhejiang Province Economic Development Zone, new road, No. 1938, No. Applicant after: ZHEJIANG BIOASIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 200433, room 16, building 128, No. 102 Xiang Yin Road, Shanghai, Yangpu District Applicant before: SHANGHAI BIOASIA LIFE TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.1938, xinqun Road, Pinghu Economic Development Zone, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314200 Patentee after: Pan Asia Biopharmaceutical Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No.1938, xinqun Road, Pinghu Economic Development Zone, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314200 Patentee before: ZHEJIANG BIOASIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Country or region before: China |
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| CP03 | Change of name, title or address |