CN101709330B

CN101709330B - 一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法

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Publication number: CN101709330B
Application number: CN2009102182501A
Authority: CN
Inventors: 文建成; 黄大军; 谭学林; 谭亚玲; 洪汝科; 张忠林; 金寿林
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: CN101709330A

Abstract

本发明涉及一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法，属于农业生物技术领域或育种领域。本发明的技术方案是提取水稻总DNA，用水稻Rf-1基因引物M49609BstUI进行PCR反应；反应产物加入BstUI酶在4℃酶切48h，加入3μl loading buffer，上样6μl，用1％琼脂糖凝胶，120V电泳50min；经UVP检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。可育株基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；含恢复基因可育株基因型的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp。本发明的用途能快速、经济、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株。

Description

一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法

技术领域

本发明涉及一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于育种领域。

背景技术

细胞质雄性不育系是培育杂交水稻的基础，而不育系纯度高低直接影响杂交种的纯度和杂种优势的表现。我国的粳型与籼型杂交水稻研究同期，但粳型杂交水稻研究进展仍缓慢，其中一个重要原因是用于杂交粳稻育种的主要是滇I型和BT型两个体系，这两个体系的部分不育系育性不稳定，致使生产的杂交种子纯度较低，严重影响了杂交粳稻杂种优势的表现。

粳稻不育系的育性不稳定主要表现在两方面。一是一些BT型和滇I型的粳稻不育系在高温下会发生少量自交结实，该问题我们基于云南立体气候优势，在海拔相差1000米的不同温度条件下筛选败育稳定的不育系得到很好的解决。二是在粳稻不育系中发现存在少量可自交结实的植株——称之为“可育株”。这些可育株表型与保持系完全一致，但在恢复基因位点存在差异。可育株存在两类：一类是细胞核携带隐性恢复基因，对不育系无育性恢复功能，其基因型与保持系一致是来源保持系混杂；另一类是细胞核携带显性恢复基因，能使不育系育性恢复，该基因来源于不育系隐性恢复基因发生自然回复突变产生，这类可育株称为含恢复基因可育株。在所有报道中，鉴别含恢复基因可育株的基因型都采用传统的测交鉴别方法，时间周期在120天以上，工作量大、繁琐，鉴别一个材料需人民币60元以上。目前还没有一种技术经济、快速、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株的方法。

发明内容

本发明首次采用现代分子生物学技术鉴定粳稻不育系中混杂含恢复基因可育株基因型，克服传统的测交鉴别方法的不足，提供一种快速、经济、准确的分子鉴定方法。

本发明的技术方案是取待鉴定可育株叶片提取水稻总DNA；用恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI进行PCR反应；反应产物加入BstUI酶在4℃酶切48h；酶切混合物加入3μl的loading buffer，混匀上样6μl，用1％琼脂糖凝胶、1×TAE buffer、120V电泳50min；紫外透射仪上检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。可育株基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；基因型为含恢复基因的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp，这种基因型为含恢复基因可育株。本发明的效果用途能经济、快速、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH₂O 8.95μl，10×buffer(含NH₄ ⁺)1.25μl，MgCl₂(25mM)0.9μl，dNTP(2.5mM)0.3μl，2个引物(10pmol)各0.2μl，FermentasTaq(5U/μl)0.1μl，模板DNA(20-40ng/μl)0.6μl；

扩增程序：94℃5min；94℃1min、58℃1min、72℃1min，40个循环；72℃5min。

PCR扩增产物的酶切反应液组成为：反应总体积为12.0ul，含ddH₂O 2.5μl，10×buffer(R)1.2μl，PCR扩增产物8.0μl，Fermentas BstUI(10U/μl)0.3μl。

本发明的有益效果是由于利用了分子遗传学及分子生物学技术，结合我们对滇I型恢复基因精确标记及分子定位的结果，在粳稻不育系繁殖过程中快速鉴定出含恢复基因可育株基因型，有利于繁殖高纯度不育系，为解决杂交粳稻不育系纯度面临的问题提供有力的工具。具体表现为：(1)用恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株基因型，鉴别准确率为100％，而且用时不超过5天，鉴别材料提取DNA，PCR反应、酶切、电泳即可；(2)由于鉴别方法简单易行，鉴别不受季节及材料数量的限制，而避免了测交和田间种植的繁琐程序，鉴别方法简单经济，鉴定一个材料仅需人民币5元。

附图说明

图1是用M49609BstUI作引物，PCR扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱，其中泳道1、2、4、6、8、10、11、12、13、14为无育性恢复基因可育株基因型，泳道3、5、7、9为含恢复基因可育株基因型。

具体实施案例

具体实施方式对滇I型不育系群体中混杂含恢复基因可育株分别用测交鉴别和分子鉴别法鉴定材料基因型，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的快速、经济和准确性。

实施例一

来自滇I型粳稻不育系黎榆A群体的10个可育株，对10株分别用测交鉴别及分子鉴定法鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的快速、经济和准确性。

测交鉴别时，不育系黎榆A与10个可育株分别测交，下一季种植10个测交F₁代，调查套袋结实率。

分子鉴别时，取10个可育株叶片，提取水稻总DNA；用恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI进行PCR反应；反应产物加入BstUI酶在4℃酶切48h；酶切混合物加入3μl的loading buffer，混匀上样6μl，用1％琼脂糖凝胶、1×TAE buffer、120V电泳50min；紫外透射仪上检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；基因型为含恢复基因的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp，这种基因型为含恢复基因可育株。本发明的效果用途能经济、快速、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：

反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH₂O 8.95μl，10×buffer(含NH₄ ⁺)1.25μl，MgCl₂(25mM)0.9μl，dNTP(2.5mM)0.3μl，2个引物(10pmol)各0.2μl，FermentasTaq(5U/μl)0.1μl，模板DNA(20-40ng/μl)0.6μl；

结果见表1，来自不育系黎榆A群体的10个可育株，测交鉴别有1个测交F₁代套袋结实为86.5％，说明这个F₁对应的可育株对不育系有育性恢复功能，分子鉴别这株可育株基因型为含恢复基因可育株；另9个测交个F₁代套袋结实为0％，它们对应可育株对不育系无育性恢复功能，这9株可育株基因型为无育性恢复基因可育株，分子鉴别的基因型为无育性恢复基因。表明分子鉴别与测交鉴别完全一致，分子鉴别准确率为100％，且分子鉴别经济、快速。

表1不育系黎榆A群体混杂含恢复基因可育株的测交鉴别与分子鉴别法鉴定比较

实施例二

来自滇I型粳稻不育系榆密15A群体共19个可育株，对19株分别用测交鉴别及分子鉴别法鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的快速、经济和准确性。

测交鉴别时，不育系榆密15A与19个可育株分别测交，下一季种植19个测交F₁代，调查套袋结实率。

分子鉴别时，取19个可育株叶片，提取水稻总DNA；用恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI进行PCR反应；反应产物加入BstUI酶在4℃酶切48h；酶切混合物加入3μl的loading buffer，混匀上样6μl，用1％琼脂糖凝胶、1×TAE buffer、120V电泳50min；紫外透射仪上检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；基因型为含恢复基因的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp，这种基因型为含恢复基因可育株。本发明的效果用途能经济、快速、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：

反应液组成：反应总体积为12.5ul，含ddH₂O 8.95μl，10×buffer(含NH₄ ⁺)1.25μl，MgCl ₂(25mM)0.9μl，dNTP(2.5mM)0.3μl，2个引物(10pmol)各0.2μl，FermentasTaq(5U/μl)0.1μl，模板DNA(20-40ng/μl)0.6μl；

结果见表2，来自不育系榆密15A群体的19个可育株，测交鉴别有7个测交F₁代套袋结实在63％以上，说明这7个F₁对应的可育株对不育系有育性恢复功能，分子鉴别这7株可育株基因型为含恢复基因可育株；另12个测交个F₁代套袋结实为0％，它们对应可育株对不育系无育性恢复功能，这12株可育株基因型为无育性恢复基因可育株，分子鉴别的基因型为无育性恢复基因。表明分子鉴别与测交鉴别完全一致，分子鉴别准确率为100％，且分子鉴别经济、快速。

表2不育系榆密15A群体混杂含恢复基因可育株的测交鉴别与分子鉴别法鉴定比较

实施例三

来滇I型粳稻不育系楚粳23A群体共14个可育株，对14株分别用测交鉴别及分子鉴别法鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察分子鉴别法的快速、经济和准确性。

测交鉴别时，不育系楚粳23A与14个可育株分别测交，下一季种植14个测交F₁代，调查套袋结实率。

分子鉴别时，取14个可育株叶片，提取水稻总DNA；用恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI进行PCR反应；反应产物加入BstUI酶在4℃酶切48h；酶切混合物加入3μl的loading buffer，混匀上样6μl，用1％琼脂糖凝胶、1×TAE buffer、120V电泳50min；紫外透射仪上检测，依据电泳结果鉴定材料基因型。基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；基因型为含恢复基因的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp，这种基因型为含恢复基因可育株。本发明的效果用途能经济、快速、准确鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株。PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：

结果见表3，来自不育系楚粳23A群体共14个可育株，测交鉴别有3个测交F₁代套袋结实在69％以上，说明这3个F₁对应的可育株对不育系有育性恢复功能，分子鉴定这3株可育株基因型为含恢复基因可育株；另11个测交个F₁代套袋结实为0％，它们对应可育株对不育系无育性恢复功能，这11株可育株基因型为无育性恢复基因可育株，分子鉴别的基因型为无育性恢复基因。表明分子鉴别与测交鉴别完全一致，分子鉴别准确率为100％，且分子鉴别经济、快速。

表3不育系楚粳23A群体混杂含恢复基因可育株的测交鉴别与分子鉴别法鉴定比较

由表1～表3看出，用M49609 BstUI为引物鉴别粳稻不育系混杂含恢复基因可育株时，准确率为100％，且分子技术鉴定成本低，所需时间短。

Claims

1.一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法，其步骤是：

1)将待鉴别水稻材料叶片提取总DNA；

2)用水稻育性恢复基因Rf-1的特异性引物M49609BstUI进行PCR反应；

3)PCR反应产物加入BstUI酶，在4℃酶切48h；

4)酶切混合物加入3μl的loading buffer，混匀上样6μl，用含0.1μg/ml EtBr的1％琼脂糖凝胶，1×TAE buffer，120V电泳50min；

4)在紫外透射仪上检测PCR扩增产物的酶切混合物及电泳结果；

5)可育株基因型为无育性恢复基因的PCR产物酶切分子量为611bp和199bp；基因型为含恢复基因的PCR产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp；

6)PCR扩增产物酶切分子量为810bp、611bp及199bp的可育株基因型为含恢复基因可育株。

2.根据权利要求1所述的一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法，其特征是所述PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：

反应液组成：反应总体积为12.5μl，含ddH₂O 8.95μl，10×buffer含NH₄ ⁺ 1.25μl，MgCl₂ 25mM 0.9μl，dNTP 2.5mM 0.3μl，2个引物10pmol各0.2μl，Fermentas Taq 5U/μl 0.1μl，模板DNA 20-40ng/μl 0.6μl；

扩增程序：94℃ 5min；

94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min，40个循环；

72℃ 5min。

3.根据权利要求1所述的一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法，其特征是所述PCR扩增产物的酶切反应液组成为：反应总体积为12.0ul，含ddH₂O 2.5μl，10×buffer R 1.2μl，PCR扩增产物8.0μl，Fermentas BstUI 10U/μl 0.3μl。