CN104531886B - 一种d1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法 - Google Patents

一种d1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻鉴定领域，特别涉及一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，以碱基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定。该鉴定方法是以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，先将D1型水稻细胞质不育系的线粒体提取并测序，然后与其他水稻品种进行基因组学分析，筛选出3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列；以该序列设计引物，然后通过分子检测手段，来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合特异的标记。该鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。

Description

一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法
技术领域
本发明涉及水稻鉴定领域，具体而言，涉及一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法。
背景技术
70年代我国应用三系法培育杂交水稻获得成功，并在生产上大面积推广种植，实现了我国水稻单产的第二次飞跃。1976-2005年，我国杂交水稻累计种植面积52.5亿亩，增收稻谷约6.5亿吨，因此杂交水稻的发展是提高粮食产量、解决粮食安全问题的重要途径(袁隆平，2008)。三系杂交水稻利用的基础是细胞质雄性不育，自从野败型细胞质雄性不育系被发现与大面积推广应用以来，上世纪70年代到80年代中期，育种家培育出多达60多种细胞质源来源于野败型、云南滇型(Dian I和DianⅡ)、红莲型、冈型、K型和马协型等，尽管细胞质源和败育特点有较大差异，可分为孢子体不育和配子体不育两种类型(朱英国，2000)。其中，云南滇型、包台型和红莲型为配子体不育系，野败型、D型、K型和冈型等为孢子体败育类型，大部分的配子体败育恢保关系一致，而大部分孢子体败育类型的恢保关系一致，配子体败育和孢子体败育类型的恢保关系相反。
在配子体细胞质雄性不育系中，已经克隆验证了包台型细胞质雄性不育基因orf79和红莲型细胞质雄性不育基因orfH79，两个不育基因为等位变异,有97％的序列同源性(Wang et al.2006；Peng et al.2010)，滇型不育系也鉴定到orf79等位变异基因。对于孢子体型细胞质雄性不育系，罗荡平等用全线粒体基因组表达分析的方法鉴定出野败型不育基因WA352，该基因由3个线粒体基因组片段和一个来源不明片段组成，其他孢子体细胞质不育类型，如印水型、矮败型、冈型、爪哇型、马协型、K型均含有不育基因WA352(Luo etal.2013)。
目前，国际公认细胞质雄性不育类型主要为野败、红莲、包台三种类型，其中前面两种不育细胞质都来源于普通野生稻。20世纪70年代，国内外育种家还利用普通野生稻为细胞质供体培育了其他13种细胞质类型，如崖城野生稻细胞质、田东野生稻细胞质等(朱英国，2000)，因此，从野生稻中挖掘细胞质是培育新型细胞质雄性不育系的一个重要途径。东乡野生稻为多年生野生稻，是迄今为止发现的世界上分布最北的野生稻，被国内外誉为“野生植物大熊猫”(黄依南等，2012)。
上世纪80年代，江西省农科院水稻所利用东乡野生稻作为细胞质供体培育出雄性不育系国际油粘A，但一直没有找到对该新型不育系育性恢复良好的恢复源，因此，没有得到推广和利用。近年来，江西省超级水稻研究发展中心与宜春农科所合作，以东乡野生稻为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，新型东野不育系D1A的具体培育方法见申请号为201410190251.0所述；新型东野不育系D1A分别与培矮64和天丰B杂交得到新型东野不育系DPA和DTA。D1A、DPA和DTA均为孢子体不育系，分子标记鉴定该类型不育系不含有已克隆的孢子体不育基因WA352。无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，且保持谱广，绝大多数栽培品种可为其保持系，只在同质野生稻中找到恢复系，并实现同质野生稻恢复系恢复基因的栽培稻转育，最高恢复率达到85.1％。因此，它的败育特点、分子机理和恢保关系与目前推广的其他不育系完全不同，为一种新型孢子体不育类型，暂命名为D1型水稻细胞质不育系。该不育系的研究及应用推广对于丰富杂交水稻类型，促进杂交水稻的可持续发展具有重要价值。
植物线粒体基因组由于线粒体基因组高频率的基因重组导致植物线粒体基因组序列差异很大，存在各自特异的序列，比较分析任何两个物种的线粒体基因组的基因间区，发现大部分基因间区都不是保守的，甚至是同源物种的比较(Kubo and Mikami,2007)。如，将小麦Ks3和Km3的线粒体基因组进行比较，只有85.2％的序列为保守序列，与NCBI数据库比较，7.3％Ks3序列为新序列，且大部分特异序列位于进化速率快的基因间区(Liu etal.,2011)；目前，水稻已完成了7个线粒体基因组的测序，分别是水稻品种Nipponbare、N、9311、CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、RT98C。其中，Nipponbare是一个典型的粳稻品种，9311为典型的籼稻品种，WA-CMS和CW-CMS细胞质来源于中国普通野生稻(Oryza rufipogon)，LD-CMS细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻。水稻线粒体基因组最大的为CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，通过比较水稻CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、N和Nipponbare线粒体基因组获得57个大小在102-5745bp的线粒体基因组特异序列，这些特异序列占到水稻线粒体基因组14.5％，通过比较分析获得了3个在所分析的14个不育系中均能扩出条带的分子标记，3个在所分析的7个配子体不育系均能扩出条带的分子标记，9个在所分析的7个孢子体不育系均能扩出条带的分子标记，没有鉴定到单个不育系所特异的分子标记(xie et al.,2014)。
D1型水稻细胞质不育系为一种以东乡野生稻为细胞质来源的孢子体不育系，与推广应用的其他孢子体不育系类型完全不一样，目前，还没有开发出相应的特异分子标记能够快速鉴定该不育类型。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，以碱基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定。
本发明提供的D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，是以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，先将D1型水稻细胞质不育系的线粒体提取并测序，然后与其他水稻品种进行基因组学分析，筛选出3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列，即为序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的序列；以该序列设计引物，然后通过分子检测手段，来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合特异的标记。该鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
进一步地，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种；
其中，所述引物DM-1为：
F：5’-GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3’
R：5’-CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3’；
所述引物DM-2为：
F：5’-CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3’
R：5’-CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3’；
所述引物DM-3为：
F：5’-ACTTCTACGGCCTTACGA-3’
R：5’-GTGGACCTGGGATGACTA-3’。
其中，引物DM-1是依据SEQ ID NO：1设计的引物；引物DM-2是依据SEQ ID NO：2设计的引物；引物DM-3是依据SEQ ID NO：3设计的引物。采用这三个引物进行基因扩增，特异性强，得到的产物条带清晰，能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
为了便于检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合，进一步地，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种。
为了便于检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合，并同时增加准确性，进一步地，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任两种。
为了进一步增加鉴定的准确度，进一步地，所述引物为引物DM-1、引物DM-2和引物DM-3。
优选地，所述基因扩增的模板为所述D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的总基因组。本发明提供的各引物扩增的基因序列均为线粒体特异性的基因序列，但是，提取线粒体基因组需要的原料多，提取过程复杂。而本发明选用的这三对引物的特异性强，以提取D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的总基因组为模板进行PCR即可得到清晰条带，很好的满足鉴定的要求，简便易行。
进一步地，所述总基因组采用CTAB法提取。CTAB法为常用的提取基因组的方法，具体方法可参考冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、NinaIrwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
为了减少杂质基因序列的影响，得到的条带更单一和清晰，并且易于提取得到D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的总基因组，优选地，所述总基因组的提取材料为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合生长至两叶一心的幼苗。
为了使得到的PCR扩增产物条带更清晰，优选地，基因扩增时所用的体系中，所述水稻的总基因组的终浓度为8-15ng/μl。
进一步地，所述基因扩增的反应体系为20μl；
所述基因扩增的程序为：94℃预变性5分钟；32个循环：94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟；产物4℃保存。
本发明提供的三对引物均可采用该基因扩增的程序，统一了程序，节约了工作量，并且扩增后得到的产物清晰可辩，很好的满足了鉴定的要求。
此外，所述基因扩增的反应体系具体为：
10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl2 1.6μl，25μM dNTP 1μl，1U/μl Taq酶0.8μl，10pM的引物F 1μl，10pM的引物R 1μl，160-300ng/μl总DNA 1μl，补去离子无菌水至20μl，加矿物油覆盖。
添加矿物油防止样品蒸发，保持了PCR反应体系的稳定。
本发明还提供了所述的引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种在D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合种子纯度鉴定的应用。该纯度鉴定方法简单易行，结果稳定，极大的方便了种子纯度的鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列，即为序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的序列；以该序列设计引物，然后通过分子检测手段，来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合，鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠；
(2)本发明特定选用了引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任意一种或多种进行基因扩增，特异性强，得到的产物条带清晰，能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合，鉴定方法操作简便、稳定可靠；
(3)本发明提供的引物序列虽然为线粒体特异性的序列，但提取总基因组即可达到很好的鉴定的效果，简化了操作步骤；
(4)本发明通过选用两叶一心的幼苗为材料提取基因组，并选用特定的浓度，扩增后得到的PCR产物，条带清晰，非常好的实现了鉴定的要求，使得整个检测方法简便易行。
(5)本发明还提供了以引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种在D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合种子纯度鉴定的应用，该纯度鉴定方法简单易行，结果稳定，极大的方便了种子纯度的鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中不同水稻不育系及其保持系的PCR扩增产物电泳图；
图2为本发明实施例2中不同水稻不育系的PCR扩增产物电泳图；
图3为本发明实施例2中对种子纯度鉴定的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
A、新型东野D1型水稻细胞质不育系D1A线粒体特异序列的鉴定
提取新型东野D1型水稻细胞质不育系D1A线粒体DNA，完成D1A线粒体全基因组的测序，分别以D1A线粒体基因组与已测序的水稻线粒体基因组WA-CMS、LD-CMS、CW-CMS、N、Nipponbare、RT98C比对分析，获得大于300bp新型东野不育系特异序列13条，其中，完全为D1A线粒体特异的5条，序列大小分别为：如序列表SEQ ID NO：1所示的基因序列，其长度为5797bp；如序列表SEQ ID NO：2所示的基因序列，其长度为3858bp；如序列表SEQ ID NO：3所示的基因序列，其长度为532bp；如序列表SEQ ID NO：4所示的基因序列，其长度为333bp；如序列表SEQ ID NO：5所示的基因序列，其长度为1623bp。
B、新型东野D1型水稻细胞质不育系线粒体特异分子标记筛选
(1)代表性水稻细胞质雄性不育系和保持系材料：分别是红莲型不育系粤泰A、保持系粤泰B；包台型不育系包源A及保持系包源B；滇型不育系楚粳23A及保持系楚粳23B；野败型不育系珍汕97A及保持系珍汕97B；马协型不育系马协A及保持系马协B；矮败型不育系协青早A及保持系协青早B；K型不育系K17A及保持系K17B；印水型不育系Ⅱ-32A及保持系Ⅱ-32B；冈型不育系G46A及保持系G46B，以及本研究组已培育出的D1型不育系D1A、DPA、DTA及其保持系D1B、培矮64、天丰B，其中红莲型、包台型、滇型为配子体不育系，野败型、马协型、印水型、K型、冈型、矮败型、新东野型为孢子体不育。每个材料取生长至两叶一心幼苗0.5克装入EP管中，在震荡打样机打碎，CTAB法提取总DNA，参照冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
(2)线粒体特异标记PCR扩增体系：
标准的PCR扩增反应体系为20μl，组成如下：
10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl2 1.6μl，25μM dNTP 1μl，1U/μl Taq酶0.8μl，10pM的引物F 1μl，10pM的引物R 1μl，300ng/μl总DNA 1μl，补去离子无菌水至20μl，加矿物油覆盖。PCR程序如下：94℃预变性5min；32循环:94℃30sec,52℃30sec,72℃1min；72℃10min；4℃保藏；
其中，根据获得的D1A线粒体特异的5条基因序列，设计PCR引物，每个特异序列设计一对引物。PCR引物及其参数如表1所示。
表1 D1型水稻细胞质不育系线粒体特异标记引物序列
以5对D1型水稻细胞质不育系线粒体特异标记引物序列为扩增引物对18个代表性水稻不育系以及本研究组培育的D1型水稻细胞质不育系D1A、DPA、DTA和保持系D1B、培矮64、天丰B进行PCR扩增；同时，以actin引物扩增为阳性对照。将PCR产物进行电泳，结果如图1所示。
从图1可以看出，以actin引物扩增为阳性对照均扩增出对应条带，说明提取的DNA质量没有问题。PCR结果表明，分子标记引物DM-1、DM-2、DM-3只在D1型水稻细胞质不育系、D1型水稻细胞质不育系的杂交组合DPA、D1型水稻细胞质不育系的杂交组合DTA均能扩增出对应条带，而其保持系和其他水稻不育系及相应的保持系均未扩增出条带；由于D1A、DPA和DTA的细胞质都是一样的，均来自东野，即它们的线粒体组型都一样，但是细胞核核不一样，因此，该标记序列为不育系线粒体基因组所特异，核基因组没有该序列，说明这3个标记为D1型水稻不育系及其杂交组合所特异的分子标记。
另外，分子标记引物DM-4和DM-5在D1A、DPA、DTA和红莲型不育系粤泰A均能扩增出条带，其他材料均无扩增带，说明这两个分子标记引物为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合和红莲型不育系所共有的线粒体特异分子标记，利用这两个标记和前面3个完全为D1型不育系所特异的标记可用于红莲型不育系的鉴定。
此外，为了进一步验证筛选出的D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合得到的系线粒体特异序列及标记的特异性，随机选取120个水稻品种，包括80个亚洲栽培稻品种、40个普通野生稻，提取DNA，分别用DM-1、DM-2和DM-3进行PCR扩增，电泳结果表明，3对引物都没有在任何材料扩增出对应条带。进一步证明了获得的3个D1型不育系线粒体特异序列及标记的具有D1型不育系特异性。
实施例2
利用D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的特异分子标记在鉴定新培育的D1型不育系及种子纯度中的应用
(1)水稻细胞质雄性不育系DNA准备：分别是红莲型不育系珞红3A；野败型不育系天丰A、江农早4A、金23A、新露A、泰丰A、五丰A、欣荣A；印水型不育系中9A；爪哇型不育系岳4A；与D1型不育系D1A杂交得到的D2454A和DYA，D2454A和DYA的保持系分别为2454B、岳4B。每个材料取生长至两叶一心幼苗0.5克装入EP管中，在震荡打样机打碎，CTAB法提取总DNA，参照冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
(2)线粒体特异标记PCR扩增体系：
标准的PCR扩增反应体系为20μl，组成如下：
10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl2 1.6μl，25μM dNTP 1μl，1U/μl Taq酶0.8μl，10pM的引物F 1μl，10pM的引物R 1μl，200ng/μl总DNA 1μl，补去离子无菌水至20μl，加矿物油覆盖。PCR程序：94℃预变性5min；32循环:94℃30sec,52℃30sec,72℃1min；72℃10min；4℃保藏；
分别以引物DM-1、DM-2、DM-3对12个水稻雄性不育系PCR扩增，得到的PCR产物进行电泳，得到的结果如图2所示。
从图2可以看出，转育成功的不育系为D2454A和DYA这两个不育系为D1型不育系，另外10个不育系非新东野型不育系(图2)。
(3)利用特异分子标记鉴定新型东野不育系DXA的种子纯度，其中，DXA是D1A与保持系协青早B回交获得的D1型不育系。
随机挑选200粒DXA种子，生长至两叶一心时，提取幼苗总DNA，以DM-1、DM-2和DM-3为引物，PCR扩增鉴定100棵不育系DNA，扩增发现有1株苗在3对引物PCR中都未扩增出对应条带，如图3编号2所示，说明该粒种子为混杂种子，可知，DXA不育系的种子纯度为99.5％。
实施例3
利用线粒体特异分子标记鉴定D1型水稻细胞质不育系杂交水稻组合，具体操作如下：
(1)、特异分子标记
选取已鉴定为完全为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合所特有的分子标记DM-1、DM-2和DM-3组合鉴定。
(2)、选取三系杂交组合10个：分别为汕优63、协优1429、荣优225、D1A/DR3、D1A/DR5、珞优8号、马协63、岳优华占、陆两优98、滇杂41，其中包括野败型杂交组合2个，滇型杂交组合1个，红莲型杂交组合1个，矮败型杂交组合1个，马协型杂交组合1个，两系杂交组合1个，其中D1A/DR3和DPA/DR5为D1型水稻细胞质不育系分别与DR3和DR5(这两种株系详见申请号为201410190251.0记载)杂交得到的杂交组合。每个材料取幼苗0.5克装入EP管中，在震荡打样机打碎，CTAB法提取总DNA，参照冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A.Janssen编著的《分子克隆》。
(3)、PCR扩增体系
标准的PCR扩增反应体系为20μl，组成如下：
10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl2 1.6μl，25μM dNTPs 1μl，1U/μl Taq酶0.8μl，10pM的引物F 1μl，10pM的引物R 1μl，160ng/μl总DNA 1μl，补去离子无菌水至20μl，加矿物油覆盖。
PCR程序：94℃预变性5min；32循环:94℃30sec,52℃30sec,72℃1min；72℃10min；4℃保藏。
(4)、杂交组合的鉴定
扩增均以ddH2O为扩增模板的PCR为阴性对照，只有当阴性对照扩增无任何带型，则说明PCR结果可靠，无污染；根据PCR扩增结果，统计被检测材料的扩增带，未扩增出带计为0，扩增出相应大小的条带则计为1，结果如表2所示。
表2 PCR扩增条带结果
当某个材料的3个PCR扩增都能扩增出对应条带则为D1型不育杂交组合，否则，就为其他类型的杂交组合。从表1的扩增结果分析显示，D1A/DR5和DPA/DR3以DM-1、DM-2和DM-3为引物均扩增出对应条带，而其他杂交组合均未扩增出条带。因此，D1A/DR5和DPA/DR3为D1型水稻细胞质不育系的杂交组合。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，其特征在于，以碱基序列SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定；所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种；分子标记引物DM-1、DM-2、DM-3只在D1型水稻细胞质不育系、D1型水稻细胞质不育系的杂交组合DPA、D1型水稻细胞质不育系的杂交组合DTA中能扩增出对应条带，而在其保持系和其他水稻不育系及相应的保持系均不能扩增出条带；
其中，所述引物DM-1为：
F：5’-GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3’
R：5’-CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3’；
所述引物DM-2为：
F：5’-CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3’
R：5’-CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3’；
所述引物DM-3为：
F：5’-ACTTCTACGGCCTTACGA-3’
R：5’-GTGGACCTGGGATGACTA-3’；
引物DM-1是依据SEQ ID NO：1设计的引物；引物DM-2是依据SEQ ID NO：2设计的引物；引物DM-3是依据SEQ ID NO：3设计的引物。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任两种。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2和引物DM-3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述基因扩增的模板为所述D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的总基因组。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述总基因组采用CTAB法提取。
7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述总基因组的提取材料为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合生长至两叶一心的幼苗。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，基因扩增时所用的体系中，所述总基因组的终浓度为8-15ng/μl。
9.权利要求1所述的引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种在D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合种子纯度鉴定的应用。
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