CN104278028B - 位于簇毛麦6vs dna渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117配制方法和6VS渗入近等基因系DNA片段序列。该近等基因系的获得是以抗白粉病小麦易位系T6VS.6AL为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的栽培小麦京411为轮回亲本，T6VS.6AL与京411杂交后，获得的F1再与京411连续回交7代，自交1代育成近等基因系411/6VS.6AL/京4117。每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。本发明的实验结果表明，EACG/M14‑301是6VS上的专一分子标记，它可以用于小麦抗白粉病种质资源的筛选和Pm21高抗、广谱抗病特性的机理研究以及小麦起源进化、远缘杂交亲本选择等方面的研究。
Description
国家自然科学基金（编号：31071671）和天津市科技支撑重点（11ZCKFNC00700）资助。
技术领域
本发明属于农业生物技术工程，涉及抗白粉病近等基因系配制、簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据以及应用。
背景技术
近等基因系（Near isogenic line, NIL）是通过一个重要农艺性状优良但某一性状不够理想的栽培种作为轮回亲本（Recurrent parent, PR）与一个具目标基因的品种或品系杂交、回交6-8代后再自交一代培育而成， 因此NIL与PR是遗传背景相同仅目标基因有差异的一对品种。由于NIL可以用于目标基因的分离、基因的精细定位与克隆及基因多效性分析，目前，已被广泛应用于遗传学研究以及育种实践中。 但由于NIL的培育时间长，在回交选育过程中，容易受发育、环境条件及人为因素的影响，因此，为保证NIL的培育质量与选择效果，对NIL遗传背景评估与检测十分重要。早期研究者们利用回交世代与外观形态对NIL的遗传背景进行评价，但这种方法多侧重于NIL与PR的遗传相似性分析上，对特定目标基因的跟踪即供体基因在NIL中的检测则报道较少。虽然近10多年来，利用分子标记技术追踪NIL目标基因的工作取得进展，如Kaczorowski 等在黄豆抗Kag1 NIL中筛选到与目标基因相连锁的22个SFPS，Martin等在番茄抗Pro NIL中发现存在抗病基因供体片段，Stan等发现在10个NIL中有目标基因片段的存在，我们在以Brock为供体基因配制的小麦抗白粉病NIL中也筛选到了与供体基因相连锁的P15/M14-160AFLP分子标记。 上述工作为提高NIL的培育质量与筛选效益发挥了积极作用。
簇毛麦（Dasypyrum villosum, 2 N=2X=14, VV）是普通小麦（Triticumaestivum, 2N=6X=42, AABBDD）的野生近缘种。我国学者陈佩度等利用簇毛麦与小麦杂交结合辐射培育了小麦-簇毛麦染色体易位系（T6VS.6AL），细胞与抗性遗传学研究表明，抗小麦白粉病基因Pm21位于6VS上。Pm21被证实对所有的Bgt菌株都是免疫的。近期，他们的研究又发现抗白粉病基因Pm21基因区域中的一个关键基因丝氨酸/苏氨酸激酶基因Stpk-Ⅴ。本发明以T6VS.6AL为抗白粉病基因供体，以生产上已推广种植多年但对白粉病敏感的小麦优良品种京411为轮回亲本，在白粉菌胁迫下，经过连续8年的回交转育，培育了具强抗白粉病特性的NIL，用AFLP分子标记方法，对NIL中供体基因进行跟踪监测，找到了簇毛麦6VS基因组渗入NIL中的分子证据和NIL中来源于簇毛麦6VS上的部分同源分子序列。
发明内容
本发明公开了一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。
本发明公开的位于簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列的制备方法，其特征在于包括如下步骤
1、抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117配制：
供试材料普通栽培小麦京411（Triticum aestivum, 2N=6X=42, AABBDD），农艺性状优良，但易感染白粉病；抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL（T6VS.6AL），易位系中的6VS来源于簇毛麦（Haynaldiavillosa, 2N=2X=14, VV）。以6VS.6AL为抗病供体亲本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS.6AL/京4117（ Near-isogenic Lines,NIL）。其过程为T6VS.6AL×京411杂交，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系411/6VS.6AL/京4117；每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。
2、簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据的获得：
提取栽培小麦京411、T6VS.6AL、簇毛麦和NIL基因组DNA，用AFLP分析技术，寻找在普通小麦中不存在，但同时存在于NIL、簇毛麦和T6VS.6AL的差异谱带，克隆并测序这些差异带，通过BLAST比对确定同时存在于NIL、簇毛麦和T6VS.6AL的差异片段的DNA碱基序列，同源性高达100%的片段即为簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据。
3、簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列证据
一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列为：
GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCATTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCCTGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTTGTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
本发明更进一步公开了通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在制备抗白粉病育种中的应用。我们用EACG/M14 为引物，在轮回亲本京411、簇毛麦、抗白粉病小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL、近等基因系（京411/6VS.6AL/京4117）120个单株中进行PCR扩增，片段EACG/M14-301与6VS紧密连锁。
本发明更加详细的制备方法如下：
1 材料
供试材料普通栽培小麦京411（Triticum aestivum, 2N=6X=42, AABBDD），农艺性状优良，但易感染白粉病；抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL（T6VS.6AL）；以6VS.6AL为抗病供体亲本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS.6AL/京4117（Near-isogenic Lines, NIL）。簇毛麦（Dasypyrum villosum, 2N=2X=14, VV）
2材料培养及抗病性鉴定
将小麦种子放置于铺有湿润滤纸的培养皿中，20℃下于人工气候箱中催芽，待根长1cm时转移到培养土中，置于人工气候箱中培养，培养条件：白天温度25℃，湿度60%，光照强度80，16h；夜间温度22℃，湿度60%，黑暗，8h。小麦长至一叶一心期时，用毛笔蘸取新鲜的白粉菌孢子均匀刷在叶片表面，培养7-10天后，调查小麦感病情况。抗病等级按照盛宝钦（1988）提出的0～4级分级法（0型为免疫，1～4型分别表示高抗、抗、敏感、高度感病）方法进行。
3不同抗性材料接种白粉菌后的显微观察
分别剪取不同染菌时间（2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、60h、72h）小麦叶片，各取中间2cm左右叶段4段，置于固定透明液（无水乙醇׃冰乙酸3׃1，0.15%三氯乙酸）中固定72h，再用染色液（0.6%考马斯亮蓝R-250甲醇溶液׃15%三氯乙酸=׃11）染色24h，冲洗叶片表面的染色液后于保存液（冰乙酸׃甘油׃水=1׃4׃15）中保存待用。取叶段于载玻片上，用保存液作浮载液制成临时装片，于显微镜下（Nikon AI）观察附着胞形态及宿主抗性反应等互作情况，统计白粉菌孢子数、孢子萌发芽管数、正常附着胞数、畸形附着胞数以及寄主细胞的结构特征变化等。
4 NIL的AFLP分析
4.1 小麦DNA的提取采用CTAB法，略有改动：称取0.2g幼嫩叶片剪碎于研钵中，加液氮迅速研磨成粉状转入5ml离心管，加1mlDNA提取缓冲液（0.1M Tris·Cl，pH8.0；0.02mMEDTA，pH8.0；1.4M NaCl；4%CTAB；1%PVP），65℃水浴90min，期间每10min振摇一次；10000rpm，4℃离心10min，取上清液于新的5ml离心管，加等体积的酚-氯仿-异戊醇（25 ׃24׃1）轻轻上下颠倒充分混匀，10000rpm离心10min，吸取上清液于新的5ml离心管，再次加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提，10000rpm离心10min，吸取上层水相于2ml离心管；加等体积冷异丙醇，于－20℃放置20min以上。待DNA沉淀后于12000rpm离心10min，收集沉淀；加720µl75%乙醇，80µlNaAc（3M，pH5.2）洗涤沉淀，静置20min，12000rpm离心10min；加800µl75%乙醇，洗涤沉淀，静置10min，12000rpm离心10min，收集沉淀；加100µlTE（Tris·Cl，1M，EDTA，0.5M，pH8.0）溶解DNA，加2µlRNAse，于37℃孵育1h降解RNA；加等体积氯仿-异戊醇（24 ׃1）去除RNAse，10000rpm离心10min，取上清；重复一次；取上清，加2倍体积冷无水乙醇，1/10体积NaAc，混匀后于－20℃放置20min，12000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用75%乙醇洗2次，稍离心，去掉洗涤液，晾干后溶于40µlTE。取5µlDNA样品在0.7%的琼脂糖凝胶上检测DNA的完整性。取2µl样品用Nanodrop 2000C测定DNA的浓度。
4.2 AFLP扩增及产物检测
AFLP分析参照Vos等的方法。所用接头和引物见表1。基因组DNA双酶切及接头连接、预扩增、选择性扩增以及扩增产物的检测参照张荣等[ 7 ]的方法。
表1 AFLP分析所用接头和引物
注：下画线部分为选择碱基, N为任意碱基A、G、T、C（例如：5’-gACTgCgTACATgCAgACG -3’或5’-gACTgCgTACATgCAgAGA -3’或5’-gACTgCgTACATgCAgATA -3’等）
4.3 AFLP谱型统计及分析
根据电泳图片展示扩增产物，将在四种材料中可能出现的谱带类型划分为15种，各种类型谱带表示方法见表2。本研究中克隆和测序的主要是第Ⅷ型，即只有京411中无，而其它三种材料中均有的条带类型。
表2. 在不同抗性材料中AFLP谱带类型
“+”表示有；“-：表示无
4.4 目标片段的回收、克隆和测序
在紫外灯下，用灭菌手术刀切下目标带，放入离心管中，加50μl ddH2O 95℃煮30min，3000×g离心2min，取上清液2μl作为模板进行二次PCR扩增，体系和AFLP预扩条件相同。扩增产物用1.2％的低熔点琼脂糖凝胶检测并纯化。克隆载体为pGEM®-T Easy Vector(Promega，USA)，阳性克隆子送上海生工生物技术公司进行测序。
4.5 将阳性克隆子的序列通过NCBI 进行BLAST比对，每组序列用Bioedit软件进行序列间相似性比对分析。
所得结果
1、 NIL对白粉菌的抗性反应
小麦白粉菌15号生理小种（E, graminis f. sp. Tritici race No.15 ）是华北地区流行的优势小种，当轮回亲本京411、抗病基因供体小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL和NIL接种白粉菌10天后观察，轮回亲本京411发病快，叶片上有连接成片的病斑，具有大量孢子堆，为高度敏感型。簇毛麦、易位系叶片上无病斑，无坏死现象，对白粉病呈免疫。NIL是经轮回亲本连续7代以上回交再经白粉菌的胁迫下选择而得到的，外部形态上与轮回亲本京411十分相似，而抗白粉病特性则与抗病供体亲本一样，表现出强抗白粉病（图1，表3）。因此，培育的NIL从形态和抗病特性上已兼具了双亲的特性。
表3 不同小麦材料的白粉病抗性鉴定结果
*注：0代表免疫，植株无病斑。0;代表坏死反应，叶片有枯死斑。1代表高抗，病斑直径﹤1mm，菌丝层稀薄。2代表中抗，菌丝层较厚。3代表中感，病斑多且直径﹥1mm 。4代表高感，菌丝层厚，产孢量多，病斑连片。
2、 白粉菌侵染京411和NIL后病原菌的发育
白粉菌15号生理小种侵染轮回亲本京411时，接种后0.5h内仅有极少数孢子萌发，0.5-4h为萌发阶段，分生孢子侧面长出初生芽管，每个初生孢子可产生2-4个芽管，但此时芽管并未立即侵入寄主细胞，而是先在寄主表面生长扩展，这与一些学者观察到的3h后，初生芽管顶端形成入侵栓，穿透寄主角质层和细胞壁，侵入寄主细胞的实验结果有一定差异。我们是在白粉菌侵染寄主8-12h后，才观察到芽管末端膨大形成附着胞，然后附着胞长出入侵栓侵入到寄主细胞，16h后吸器产生，20h后初级菌丝产生（图2）。
白粉菌感染抗病供体T6VS.6AL以及簇毛麦、NIL后，与感染对白粉菌敏感的轮回亲本京411相比，白粉菌的发育有明显不同，首先可以观察到是附着胞和芽管的发育畸形如扭曲型芽管和分瓣型附着胞（图3）。
虽然孢子在抗性材料也能萌发，但萌发缓慢，附着胞形成后白粉菌停止发育，不能形成正常的菌丝。在对白粉菌的防御反应上，白粉菌感染后，白粉菌感染后NIL和抗病供体T6VS.6AL及簇毛麦中，可以明显观察到细胞质凝集、晕环出现和乳突的形成三种细胞结构的变化。细胞质凝集即在白粉菌初生芽管和附着胞芽管顶端下方，寄主表皮细胞壁上形成具有荧光的环状区域。晕环是白粉菌入侵栓形成前在侵染点处寄主细胞壁上出现的环状结构，被认为具有阻止入侵栓穿透寄主细胞壁的能力。白粉菌侵染后乳突的快速形成即在寄主细胞膜和细胞壁间分泌的类似乳头状的胞壁沉积物（图4），也是抗白粉病寄主细胞结构变化。虽然在感病轮回亲本京411上也可以形成乳突，但在形成时间、大小、性状、致密度以及形成速率上存在明显差异，在抗病品种寄主细胞中形成的乳突大而致密度高。乳突被认为是抗白粉菌入侵的。
3 、NIL中来源于6VS抗白粉病基因的AFLP检测
NIL是对白粉菌敏感的普通小麦优良品种京411和具簇毛麦6VS的染色体易位系杂交和回交后培育而成的。NIL具有对白粉菌15号生理小种强抗性，显然是来源于6VS上的抗病基因，对于NIL的分子检测，追踪抗病基因的来源，对于缩短NIL的培育时间、提高选择效率有重要意义。为此，我们利用AFLP方法，在簇毛麦（VV）、易位系T6VS.6AL、NIL和轮回亲本普通小麦京411中进行分子标记筛选，本实验中列出15种被筛选到的AFLP谱型（图5），其中Ⅰ型，在簇毛麦、T6VS.6AL、NIL和轮回亲本中均存在的AFLP谱型，这种AFLP谱型出现频率为3.8%。簇毛麦为普通小麦的近缘野生种，证明它们在Ⅰ型AFLP基因组有一定的同源性,但与抗白粉病特性无相关性；Ⅱ型：簇毛麦中不存在，在T6VS.6AL、NIL和普通小麦种存在的AFLP谱型，由于T6VS.6AL、NIL与普通小麦相比，均具有来源于簇毛麦的6VS染色体，显然这类AFLP谱型与6VS无关，而是来源于普通小麦基因组；Ⅲ型：仅存在于簇毛麦，在T6VS.6AL、NIL和普通小麦中均不存在.由于在具有簇毛麦6VS的易位系T6VS.6AL和NIL不存在，因此该类AFLP谱带也与6VS无关。Ⅷ型：在簇毛麦、T6VS.6AL、NIL中存在但在普通小麦中不存在的AFLP谱型。本研究中这类AFLP谱型仅占2.3%，由于T6VS.6AL和NIL中仅具簇毛麦VV染色体组的6VS，故这一实验结果说明2个问题，（1）这类AFLP谱带位于6VS上；（2）证明存在于供体亲本簇毛麦的部分外源基因组6VS通过杂交已渗入到NIL中，NIL的抗白粉病特性来源于簇毛麦6VS上，并且经过与PR的多代回仍存在于NIL中，这与细胞遗传分析时发现的减数分裂时，6VS染色体与小麦的6AS不配对，不会产生交换现象相吻合。在我们的实验中，上述4种类型的AFLP谱型出现频率为71.9%，而可以定位于簇毛麦6VS上的只有Ⅷ 一种类型（图5）。应该指出的是在我们的实验中还检测几类型的AFLP谱型，它们与NIL的关系较难确立，如在NIL中存在但在簇毛麦、T6VS.6AL不存在（ⅩⅤ型），在簇毛麦和T6VS.6AL中存在，但在NIL中不存在（Ⅵ型）等AFLP谱型。由于这种谱型可以被实验重复，唯一的可能是NIL或簇毛麦、T6VS.6AL某些位点上的碱基产生了突变，因此我们将这几类AFLP谱型归为突变型谱型，但这一情况需进一步研究。
NIL中的抗白粉病特性来源于供体6VS，为了追踪抗病供体6VS渗入NIL的分子证据，我们对在普通小麦中不存在，但同时存在于簇毛麦、易位系T6VS.6AL和NIL的7组（D5、D6、F2、F4、F6、F8、F13）共21条AFLP谱带(表4)进行了克隆与测序分析，结果表明在7组材料中，多数组合在簇毛麦、T6VS.6AL和NIL序列的同源性较低，但在D6和F8 两个组合中，其在NIL与簇毛麦、易位系T6VS.6AL间有较高或很高的同源性，如F8组合中，NIL与抗病供体易位系T6VS.6AL间，344bp中仅2个bp之差，但与簇毛麦间同源性较低，故这一结果尚需进一步研究，值得指出的是D6组，在NIL（D6N）、抗病供体T6VS.6AL（D66）和簇毛麦（D6H）均扩增到一个301bp片段，且它们具100%同源性（图6）。由于在普通小麦京411中不存在，故NIL中该301bp来源于簇毛麦6VS，是簇毛麦易位系T6VS.6AL DNA片段渗入到NIL中的的一个序列证据。将该片段命名为EACG/M14-301，其序列为：
GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCATTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCCTGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTTGTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA
表4存在于簇毛麦、T6VS.6AL和NIL中的21条AFLP 片段测序结果
本发明与已有标记相比的优点和有益效果在于：
1、本发明为簇毛麦6VS供体基因渗入NIL提供序列证据
我们在以6VS为供体基因培育的NIL中，分别筛选到包括双亲在内的21条AFLP谱带，经克隆测序后的序列比对发现，在簇毛麦，T6VS.6AL和NIL中，筛选到一个EACG/M14-301AFLP谱带，并且呈现出100%的同源性，这一实验结果为我们确证位于簇毛麦6VS上的DNA渗入NIL中提供了一个直接证据，而这在以往的NIL遗传背景的分子检测工作学术界还没有报道。
2、 EACG/M14-301在小麦抗病育种中的具有重要价值
小麦对白粉病的抗性由于遗传资源的长期重复使用和白粉病菌生理小种的不断出现，已高度退化，异源遗传物质的引入，尤其是带有抗白粉病基因染色体或染色体片段的导入对改良小麦抗白粉病特性具有十分重要的作用。我国学者陈佩度等将簇毛麦的6VS染色体片段导入栽培小麦，育成簇毛麦-小麦染色体易位系T6VS.6AL, T6VS.6DL。细胞遗传与抗病育种实践表明，具有广谱抗病特性（BSR）的Pm21基因位于6VS上，减数分裂时6VS与小麦的6AS极少配对，抑制了交换的产生，因此Pm21基因一直会伴随6VS.6AL染色体传递。迄今为止，Pm21是唯一被证明能够抵抗所有新产生的白粉病小种，因此，T6VS.6AL已广泛的用作为小麦抗白粉病育种亲本。在近10年中，利用T6VS.6AL为种质，已有10多个抗白粉病小麦新品种被培育和生产上应用，栽培面积已达到340万公顷。由于Pm21在小麦抗白粉病育种上的重要性，许多研究者开展了与Pm21相连锁分子标记的筛选，并取得很多进展，但到目前为止，我们还没有见到直接利用分子标记进行小麦抗白粉病辅助选择育种的报道。本工作证明EACG-M14-301是6VS上专一性分子标记，因此也可以认为是Pm21的分子标记，与以往筛选到的分子标记不同的是，EACG-M14-301同时存在于簇毛麦、T6VS.6AL和以T6VS.6AL为供体配体的抗白粉病近NIL中，且具100%的序列同源性，因此，它不仅可以在小麦育种上作为筛选抗白粉病种质的预选指标，这对于缩短抗病育种年限，提高育种效率有重要应用价值，而且对于进一步了解Pm21的高抗和广谱抗病性质与机理以及小麦种质资源创新、起源进化研究及小麦远缘杂交亲本选择都有重要意义。
附图说明：
图1为簇毛麦（VV）、易位系T6VS.6AL、NIL（京411×6VS.6AL//京4117）、京411对白粉病的抗性反应图；
图2为 白粉菌侵染轮回亲本京411后的发育过程图，其中C: conidiospore,分生孢子; RA: rostriform appresorium,喙形附着胞; PGT: primary germ tube,初生芽管;AGT: appresorium germ tube,附着胞芽管; PP: penetration peg,入侵栓; PH:primary hypha,初级菌丝; SM: secondary mycelium,二级菌丝; TM: triple mycelium,三级菌丝；a为接种后4h，示分生孢子萌发出初生芽管；b为8h，示附着胞芽管；c为12h，芽管末端膨大形成喙形附着胞；d为16h，附着胞形成吸器；e为20h，形成初级菌丝；f为24h，示次级菌丝；g为36h的三级菌丝；h为48h的菌丝；i、j、k分别为菌丝生长扩大；l为菌丝成熟，形成串珠状分生孢子；
图3为白粉菌在抗性材料上的发育畸形图；其中C: conidiospore,分生孢子; VA:valving appresorium,分瓣附着胞; S: slender,纤细型; CG: contorted germ tube,扭曲型芽管; IE: intumescence end,末端膨大；a和b是NIL上的分瓣型附着胞畸形；c和d所示为簇毛麦上的芽管纤细型畸形；e和f为T6VS.6AL上的芽管扭曲型畸形；
图4抗性材料对白粉菌的防御反应图；其中C: conidiospore,分生孢子; P:papillae,乳突; CA: cytoplasm agglomeration,细胞质凝聚; H: halo,晕环; HR:hypersensitive reaction,过敏性坏死反应； 图a, b, c, d均为抗性寄主对白粉菌的防御反应，a示乳突，b示细胞质凝聚，c示晕环，d示过敏性坏死；
图5为在簇毛麦、易位系、NIL和京411中检测到的AFLP图谱；
图6 片段D6C、D66、D6N序列间相似性比对结果图；
图7 为引物 EACG-M14在京411、簇毛麦、T6VS/6AL和 NIL单株中扩增图；其中 M，DL2000 Maker，1，京411；2，簇毛麦；3，T6VS/6AL；4-22，NIL单株。
具体实施方式
以下结合实施例（附图、表具体说明）用来帮助理解本发明，并且不用于也不应被解释为以任何方式对所列出的权利要求中发明的限制。特别加以说明的是，本发明所用到的各种试剂均有市售。
实施例1
近等基因系的配制及抗病性鉴定：
本发明近等基因系的配制： 供试材料普通栽培小麦京411（Triticum aestivum,2N=6X=42, AABBDD），农艺性状优良，但易感染白粉病；抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL（T6VS.6AL），易位系中的6VS来源于簇毛麦（Haynaldiavillosa, 2N=2X=14, VV）。以6VS.6AL为抗病供体亲本，京411为轮回亲本配制的近等基因系京411/6VS.6AL/京4117（Near-isogenic Lines, NIL）。其过程为T6VS.6AL×京411杂交，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系411/6VS.6AL/京4117；每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。小麦白粉菌15号生理小种（E, graminis f. sp.Tritici race No.15 ）是华北地区流行的优势小种，当轮回亲本京411、抗病基因供体小麦-簇毛麦染色体易位系6VS.6AL和NIL接种白粉菌10天后观察，轮回亲本京411发病快，叶片上有连接成片的病斑，具有大量孢子堆，为高度敏感型。簇毛麦、易位系叶片上无病斑，无坏死现象，对白粉病呈免疫。NIL是经轮回亲本连续7代以上回交再经白粉菌的胁迫下选择而得到的，外部形态上与轮回亲本京411十分相似，而抗白粉病特性则与抗病供体亲本一样，表现出强抗白粉病（图1，表3）。因此，培育的NIL从形态和抗病特性上已兼具了双亲的特性。
实施例2
NIL中来源于6VS抗白粉病基因的AFLP检测
小麦DNA的提取采用CTAB法，略有改动：称取0.2g幼嫩叶片剪碎于研钵中，加液氮迅速研磨成粉状转入5ml离心管，加1mlDNA提取缓冲液（ 0.1M Tris·Cl，pH8.0；0.02mMEDTA，pH8.0；1.4M NaCl；4%CTAB；1%PVP），65℃水浴90min，期间每10min振摇一次；10000rpm，4℃离心10min，取上清液于新的5ml离心管，加等体积的酚-氯仿-异戊醇（25 ׃24׃1）轻轻上下颠倒充分混匀，10000rpm离心10min，吸取上清液于新的5ml离心管，再次加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提，10000rpm离心10min，吸取上层水相于2ml离心管；加等体积冷异丙醇，于－20℃放置20min以上。待DNA沉淀后于12000rpm离心10min，收集沉淀；加720µl75%乙醇，80µlNaAc（3M，pH5.2）洗涤沉淀，静置20min，12000rpm离心10min；加800µl75%乙醇，洗涤沉淀，静置10min，12000rpm离心10min，收集沉淀；加100µlTE（Tris·Cl，1M，EDTA，0.5M，pH8.0）溶解DNA，加2µlRNAse，于37℃孵育1h降解RNA；加等体积氯仿-异戊醇（24 ׃1）去除RNAse，10000rpm离心10min，取上清；重复一次；取上清，加2倍体积冷无水乙醇，1/10体积NaAc，混匀后于－20℃放置20min，12000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用75%乙醇洗2次，稍离心，去掉洗涤液，晾干后溶于40µlTE。取5µlDNA样品在0.7%的琼脂糖凝胶上检测DNA的完整性。取2µl样品用Nanodrop 2000C测定DNA的浓度。
AFLP扩增参照Vos等（Vos, P.，R.Hogers，M.Bleeker，M.Reijans，T.van de Lee，M.Hornes，A.Frijters，J.Pot, J.Peleman，M.Kuiper，M.Zabeau．AFLP：A new techniquefor DNA fingerprinting．Nucleic Acids Res，1995，21：4407-4414）的方法，所用接头和引物见表1。基因组DNA双酶切及接头连接、预扩增、选择性扩增以及扩增产物的检测参照张荣等（张荣，王轶，刘晓颖，王振英，彭永康，解超杰，杨作民. 小麦Brock抗白粉病基因近等基因系的培育与分子检测,中国农业科学, 2010,43(15):3059-3066）的方法。AFLP扩增产物用变性的聚丙烯酰胺凝胶结合硝酸银染色方法进行检测，根据电泳图片展示扩增产物，将在四种材料中可能出现的谱带类型划分为15种，各种类型谱带表示方法见表2。本发明中克隆和测序的主要是第Ⅷ型，即只有京411中无，而其它三种材料中均有的条带类型。
实施例3
NIL中来源于6VS分子证据获得
利用AFLP方法，在簇毛麦（VV）、易位系T6VS.6AL、NIL和轮回亲本普通小麦京411中进行分子标记筛选，本实验中列出15种被筛选到的AFLP谱型（图5），其中Ⅰ型，在簇毛麦、T6VS.6AL、NIL和轮回亲本中均存在的AFLP谱型，这种AFLP谱型出现频率为3.8%。簇毛麦为普通小麦的近缘野生种，证明它们在Ⅰ型AFLP基因组有一定的同源性,但与抗白粉病特性无相关性；Ⅱ型：簇毛麦中不存在，在T6VS.6AL、NIL和普通小麦种存在的AFLP谱型，由于T6VS.6AL、NIL与普通小麦相比，均具有来源于簇毛麦的6VS染色体，显然这类AFLP谱型与6VS无关，而是来源于普通小麦基因组；Ⅲ型：仅存在于簇毛麦，在T6VS.6AL、NIL和普通小麦中均不存在.由于在具有簇毛麦6VS的易位系T6VS.6AL和NIL不存在，因此该类AFLP谱带也与6VS无关。Ⅷ型：在簇毛麦、T6VS.6AL、NIL中存在但在普通小麦中不存在的AFLP谱型。本研究中这类AFLP谱型仅占2.3%，由于T6VS.6AL和NIL中仅具簇毛麦VV染色体组的6VS，故这一实验结果说明2个问题，（1）这类AFLP谱带位于6VS上；（2）证明存在于供体亲本簇毛麦的部分外源基因组6VS通过杂交已渗入到NIL中，NIL的抗白粉病特性来源于簇毛麦6VS上，并且经过与PR的多代回仍存在于NIL中，这与细胞遗传分析时发现的减数分裂时，6VS染色体与小麦的6AS不配对，不会产生交换现象相吻合。在我们的实验中，上述4种类型的AFLP谱型出现频率为71.9%，而可以定位于簇毛麦6VS上的只有Ⅷ 一种类型（图5）。
NIL中的抗白粉病特性来源于供体6VS，为了追踪抗病供体6VS渗入NIL的分子证据，我们对在普通小麦中不存在，但同时存在于簇毛麦、易位系T6VS.6AL和NIL的7组（D5、D6、F2、F4、F6、F8、F13）共21条AFLP谱带(表4)进行了克隆与测序分析，结果表明在7组材料中，多数组合在簇毛麦、T6VS.6AL和NIL序列的同源性较低，但在D6和F8 两个组合中，其在NIL与簇毛麦、易位系T6VS.6AL间有较高或很高的同源性，如F8组合中，NIL与抗病供体易位系T6VS.6AL间，344bp中仅2个bp之差，但与簇毛麦间同源性较低，故这一结果尚需进一步研究，值得指出的是D6组，在NIL（D6N）、抗病供体T6VS.6AL（D66）和簇毛麦（D6H）均扩增到一个301bp片段，且它们具100%同源性（图6）。由于在普通小麦京411中不存在，故NIL中该301bp来源于簇毛麦6VS，是簇毛麦易位系T6VS.6AL DNA片段渗入到NIL中的的一个序列证据。将该片段命名为EACG/M14-301，其序列为图6。
实施例4
EACG/M14-301在抗白粉病育种中的应用：
为了进一步验证 EACG/M14-301 的可靠性，我们用引物 EACG/M14，在轮回亲本京411、簇毛麦、抗白粉病小麦-簇毛麦易位系T6VS.6AL、近等基因系（京411/6VS.6AL/京4117）120个单株中进行PCR扩增，结果发现片段EACG/M14-301在含有6VS染色体的材料中均稳定出现，而没有6VS的京411中则扩增不到该片段（图7），说明片段EACG/M14-301已经渗入到抗白粉病近等基因系411/6VS.6AL/京4117中，进一步说明NIL中EACG/M14-301 来源于6VS。
由此得出结论：EACG/M14-301可以作为一个追踪6VS染色体的一个分子标记，即小麦单株中用引物EACG/M14能扩增出片段EACG/M14-301的即含有6VS，抗白粉病；不能扩增出EACG/M14-301片段的，不含有6VS，不抗白粉病。x
小麦对白粉病的抗性由于遗传资源的长期重复使用和白粉病菌生理小种的不断出现，已高度退化，异源遗传物质的引入，尤其是带有抗白粉病基因染色体或染色体片段的导入对改良小麦抗白粉病特性具有十分重要的作用。我国学者陈佩度等将簇毛麦的6VS染色体片段导入栽培小麦，育成簇毛麦-小麦染色体易位系T6VS.6AL, T6VS.6DL。细胞遗传与抗病育种实践表明，具有广谱抗病特性（BSR）的Pm21基因位于6VS上，减数分裂时6VS与小麦的6AS极少配对，抑制了交换的产生，因此Pm21基因一直会伴随6VS.6AL染色体传递。迄今为止，Pm21是唯一被证明能够抵抗所有新产生的白粉病小种，因此，T6VS.6AL已广泛的用作为小麦抗白粉病育种亲本。在近10年中，利用T6VS.6AL为种质，已有10多个抗白粉病小麦新品种被培育和生产上应用，栽培面积已达到340万公顷。由于Pm21在小麦抗白粉病育种上的重要性，许多研究者开展了与Pm21相连锁分子标记的筛选，并取得很多进展，但到目前为止，我们还没有见到直接利用分子标记进行小麦抗白粉病辅助选择育种的报道。本工作证明EACG-M14-301是6VS上专一性分子标记，因此也可以认为是Pm21的分子标记，与以往筛选到的分子标记不同的是，EACG/M14-301同时存在于簇毛麦、T6VS.6AL和以T6VS.6AL为供体配制的抗白粉病近NIL中，且具100%的序列同源性，因此，它不仅可以在小麦育种上作为筛选抗白粉病种质的预选指标，这对于缩短抗病育种年限，提高育种效率有重要应用价值，而且对于进一步了解Pm21的高抗和广谱抗病性质与机理以及小麦种质资源创新、起源进化研究及小麦远缘杂交亲本选择都有重要意义。
EQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 位于簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系序列及应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gactgcgtac caattcacga cgcagcagcc tgtgaagcag aaaagctacg acgagtatcc 60
aggtggtctc cattacgagc attatacctg ttttatacac catttcgcag cctacccctg 120
tagggagaca tgttactcag gactcatcct gagtcctgag taacatgggg gactctgctc 180
ttttctggac tgatgcctgg ttcattggtg gttcctcacg acccttgtgt tgaaggttgc 240
ctagattatt ctcctttgtc aacgatgata aggtatcagt gcgtgaattg gtacgcagtc 300
a 301
Claims (3)
1.一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于所述的基因序列为SEQ ID NO：1。
2.权利要求1所述通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117制备：
以抗白粉病小麦-簇毛麦染色体易位系T6VS.6AL为抗病供体亲本，普通栽培小麦京411为轮回亲本制备近等基因系京411/6VS.6AL/京4117，其过程为T6VS.6AL与京411杂交，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117；每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株；
（2）簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列的获得：
提取栽培小麦京411、T6VS.6AL、簇毛麦和近等基因系京411/6VS.6AL/京4117的基因组DNA，用AFLP分析技术，寻找在普通小麦中不存在，但同时存在于近等基因系京411/6VS.6AL/京4117、簇毛麦和T6VS.6AL的差异谱带，克隆并测序这些差异带，通过BLAST比对确定同时存在于近等基因系京411/6VS.6AL/京4117、簇毛麦和T6VS.6AL的差异片段的DNA碱基序列，同源性高达100%的片段即为簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列；
（3）簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的序列
一种通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列为：
GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCATTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCCTGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTTGTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
3.权利要求1所述通过近等基因系和AFLP方法获得的簇毛麦6VS DNA渗入到小麦抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在抗白粉病小麦育种中的应用。
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