CN109234447B

CN109234447B - 一种鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的方法及专用ssr引物

Info

Publication number: CN109234447B
Application number: CN201811417103.2A
Authority: CN
Inventors: 张海平; 陈妍
Original assignee: INSTITUTE OF CROP GERMPLASM RESOURCES SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF CROP GERMPLASM RESOURCES SHANXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2038-11-26
Also published as: CN109234447A

Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的方法及专用SSR引物。本发明提供的抗大豆胞囊线虫4号小种鉴定的SSR标记由Satt533、Satt504组成。本发明通过对来自国内外抗、感大豆资源进行实验验证，本发明的鉴定方法操作简单、经济高效，结果稳定可靠。相比病土鉴定法具有省时省力、不受季节限制的优点，具有较好的应用前景，更好地服务于生产实践中大豆抗胞囊线虫4号小种的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合及抗大豆胞囊线虫4号小种鉴定方法在大豆抗胞囊线虫4号小种资源筛选和品种选育等方面将有广阔的应用前景。

Description

一种鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的方法及专用SSR 引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的方法及专用SSR引物。

背景技术

大豆胞囊线虫病（Soybean Cyst Nematode，SCN）是大豆生产上毁灭性病害之一，病原物为大豆胞囊线虫（Heterodera glycines Ichinohe）。我国大豆胞囊线虫有1、2、3、4、5、6、7、14 号等8个生理小种，其中4号小种致病力最强，主要分布在黄淮大豆产区。该病一般会造成产量损失为5-10%，严重发生地块减产可达30%以上，甚至颗粒无收，经济损失严重。据估计全世界每年由于大豆胞囊线虫病危害而造成的经济损失在16.2亿美元以上。目前我国的受害面积在2000万亩以上，估计减产数百万吨，经济损失达几十亿元左右。

选育抗病品种是解决大豆胞囊线虫病最经济有效的措施。但目前生产上尚无抗胞囊线虫4号小种大豆品种，主要原因是大豆胞囊线虫4号小种是所有胞囊线虫小种中致病性最强的小种，而且其抗性是受多基因控制的数量性状，推广良种与抗病资源的杂交后代中只有少数资源抗病。另外，大豆胞囊线虫鉴定是在根系上进行，需要挖出根系根据根系上线虫胞囊的多少来确定该单株是否抗病，鉴定过程繁琐，工作量大，即使发现抗病单株，也可能会因为移栽不当而将抗病资源丢失。因此，急需开发可有效检测抗病单株的抗病分子标记用于大豆抗胞囊线虫4号小种鉴定，辅助选育抗病品种。

SSR（Simple Sequence Repeats）标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA，是一类由1~6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。微卫星中重复单位的数目存在高度变异，造成多个位点的多态性。因此，SSR标记在不同的种甚至不同个体间的多态性。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性。

目前，大豆分子标记开发技术已经成熟，已有研究人员开发出针对大豆胞囊线虫1、3号生理小种的SSR分子标记。本课题组自李莹研究员开始，四十余年来一直从事大豆抗胞囊线虫4号生理小种研究。现已筛选并保存有灰皮支黑豆等20份抗病资源，以及典型的感病资源。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的SSR引物组合。

本发明所提供的用于鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的SSR引物组合为Satt533 和Satt504。

所述Satt533的一条引物序列如SEQ ID NO. 1所示，另一条引物序列如SEQ IDNO. 2所示；所述Satt504的一条引物序列如SEQ ID NO. 3所示，另一条引物序列如SEQ IDNO. 4所示。

上述引物组合在辅助鉴定抗胞囊线虫4号小种大豆资源、在辅助鉴定大豆胞囊线虫4号小种抗源中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明另一个目的是提供一种辅助鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种抗病资源中的应用。

本发明所提供的辅助鉴定大豆胞囊线虫4号小种抗病资源的方法，包括如下步骤：

分别用上述引物组合中的每对引物对待测大豆单株基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测大豆单株为大豆胞囊线虫4号小种抗病资源还是感病资源：

A、若所述引物组合中的每对引物所对应的PCR扩增产物均含有抗病特征带，则认为所述待测大豆单株为抗病单株；

B、若所述引物组合中只要有其中一个或一个以上引物所对应的PCR扩增产物不含有抗病特征带，则认为所述待测大豆单株为感病单株。

所述抗病特征带为Satt533为269 bp的DNA；Satt504为159 bp的DNA片段。

上述鉴定方法中，所述PCR扩增体系为10×PCR buffer（含Mg²⁺）0.1µl/µl，dNTPmixture 0.2mmol/L，Taq酶 0.05 U/µl，SSR标记两条引物的浓度分别为0.5µmol/L，基因组DNA的浓度为5 ng/µl。

上述的方法中PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性30s，合适的退火温度退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

上述方法中引物Satt533进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物Satt504进行PCR扩增的退火温度为58℃。

上述方法中，所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

上述方法在抗大豆胞囊线虫4号小种资源筛选或抗大豆胞囊线虫4号小种品种选育中应用也属于本发明的保护范围。

本发明利用8个抗病资源和8个感病资源为模板DNA，扩增了已合成的1000对SSR标记，发现有2对标记可将抗、感资源区分开。经过对200份资源扩增验证，这2个标记单独鉴定的准确率达不到100%，但组合起来，准确率可达到100%。

本发明通过对来自国内外抗、感大豆资源进行实验验证，本发明的鉴定方法操作简单、经济高效，结果稳定可靠。相比病土鉴定法具有省时省力、不受季节限制的优点，具有较好的应用前景，更好地服务于生产实践中大豆抗胞囊线虫4号小种的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合及抗大豆胞囊线虫4号小种鉴定方法在大豆抗胞囊线虫4号小种资源筛选和品种选育等方面将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为16个资源即8个高抗资源和8个高感资源进行SSR引物筛选电泳图；图2为Satt533标记对75份资源的扩增图谱；图3为Satt 504标记对75份资源的扩增图谱；图4为Satt533标记对99份资源的的扩增图谱；图5为Satt 504标记对99份资源的扩增图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的耗材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如下各个实例中，用标记进行PCR扩增和检测的步骤如下：

大豆育苗。随机选10粒待鉴定资源的种子，要求种子饱满、无破损粒。播种于装有沙土的发芽盒中，播种深度2厘米。然后置于30℃左右的培养箱中，黑暗培养。大约1周后取单株幼嫩叶片。

大豆基因组DNA提取。将取得的叶片约0.5 g装入预先装有1粒钢珠的2ml离心管。用高速匀浆机快速磨样，采用基因组DNA提取试剂盒（天根）提取每个样品的基因组DNA。

PCR扩增和产物检测。PCR扩增体系见表1。所有试剂均购自于TaKaRa公司。

表1.：PCR反应体系

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，合适的退火温度退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

由于每对引物有其最适的退火温度，因此，在扩增程序中退火温度是根据不同引物的最适退火温度而定，其余程序不变。

PCR扩增产物的检测：采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。

如下各个实例中，大豆抗胞囊线虫4号小种鉴定方法的步骤如下：采用人工接种鉴定法（DB 14/ T1613-2018）鉴定供试资源的抗病性。目前已利用该方法对我国大豆种质资源8000余份资源进行了抗大豆胞囊线虫4号小种鉴定，是行业内通用的方法。具体操作流程如下：

试验在温室中进行。温室温度保持在25℃～30℃，含水量控制在50%～60%。

A、将待鉴定的种质在育苗盘中育苗。

B、将出苗后子叶展开、根系发达、健壮一致的植株移栽到装有灭菌沙土的塑钵中，每钵2株，三次重复。每30个资源设1个感病对照。

C、提前在病土中种植感病品种，在胞囊显盛期，将根系上的胞囊冲洗下来，制备成浓度为400个/ml的卵悬浮液。待鉴定资源在移栽后3天接种卵悬浮液5mL。

D、待感病对照白色胞囊突破根系表皮时即可调查。将待调查植株根系上的土轻轻抖掉或用水冲洗干净、晾干，统计其根上的胞囊数。

E、根据大豆对胞囊线虫4号小种抗性级别划分标准（见表2），对大豆资源抗、感进行评价。

表2：大豆对胞囊线虫4号小种抗性级别划分标准

实施例1：抗大豆胞囊线虫4号小种SSR标记筛选

一、单个标记的筛选

首先用16个资源（8个高抗资源和8个高感资源）进行SSR引物筛选（图1）。从1000对SSR引物中筛选出抗、感资源间差异明显易于辨认的有多态性的引物13对。用这13对引物作为候选引物。

用75份资源（10份抗病资源和66份感病资源）对这13对引物进行PCR扩增进一步复筛。通过分析电泳条带，发现有2个标记可有效区分抗、感资源。每个标记在抗病资源间带型一致，但在感病资源中有少数资源的带型与抗病资源一致。将R记为抗病带型，其余条带记为S，为感病带型。图2-图3为2个标记对75份资源的扩增图谱。

Satt533进行扩增得到的抗病特征条带大小为R1（269 bp），其余不同条带记为S1。

Satt504进行扩增得到的抗病特征条带大小为R2（159 bp），其余不同条带记为S2。

各个标记的引物序列如下：

Satt533 ：GAACAGGTAGCAGTAAGTAATG（SEQ ID NO. 1）；TCGTTTTGCTTTGTAGAACA（SEQ ID NO. 2）。

Satt504：GCGCATGTGCAACTTGAAAAACA（SEQ ID NO. 3）；TCGTTGGTTGACCCAATGTCATC（SEQ ID NO. 4）。

将分子标记鉴定结果与人工接种抗病鉴定结果相比对，若人工接种鉴定结果为抗性的资源扩增出的特征带R，人工接种鉴定结果为感病的资源扩增出的特征带S，则认为两种鉴定结果相符，表3为人工接种抗病鉴定结果与分子标记鉴定结果的比对。2个标记的鉴定结果与人工接种鉴定相符程度在96.000%—93.333%之间。由于标记Satt533引物特异性较差，个别资源未能扩增出条带而无法判断抗感，因此，相符率为96.000%；引物satt504在感病资源中扩增出抗病特征条带，相符率为93.333%。这两个引物的分子鉴定结果与人工接种鉴定结果相符率均未达到100%。表3中所记载的76份资源均来自于山西省种质库。

表3：76份大豆种质资源抗大豆胞囊线虫4号小种鉴定结果

二、标记组合法鉴定大豆对胞囊线虫4号小种的抗性

由于单标记鉴定结果的相符率达不到100%，因此采用标记组合法鉴定大豆对胞囊线虫4号小种的抗性。标记组合包含两种方式，一是多重PCR，将两对以上引物放在同一反应体系中进行PCR扩增；另一种是每个引物单独进行PCR扩增，然后将两对引物的扩增产物混合电泳检测，或每个引物单独PCR扩增后单独进行电泳检测。本实验中由于这2个引物扩增片段大小接近，故采用每个引物单独扩增，单独电泳检测，统计带型后，组合结果进行评价大豆对胞囊线虫4号小种的抗性。

资源：表3中75份资源。标记组合：Satt533和Satt504。

方法：以上述表3资源的DNA为模板进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。按照标记组合判断标准，确认每个资源的抗病性。

标记组合及判断标准如下：

Satt533和Satt504：扩增产物经检测同时有R1和R2特征带而无S1和S2带，判断为抗病资源；有S1或S2或同时有S1和S2，判断为感病资源。

结果：标记组合与人工接种鉴定的比对结果见表4。

表4：各标记组合法鉴定大豆对胞囊线虫4号小种抗性的结果

实施例2：用标记组合进行大豆抗胞囊线虫4号小种鉴定：本实施例中使用106份资源，由山西种质库提供。两标记组合：Satt533、Satt504。

方法：以资源基因组DNA为模板进行PCR扩增和扩增产物检测。按Satt533、Satt504两标记组合的单株判断标准，确认该资源为抗病还是感病资源。

判断标准为：扩增产物经检测同时有R1和R2特征带而无S1和S2带，判断为抗病资源；有S1或S2或同时有S1和S2，判断为感病资源。

结果：检测图谱如图4-图5所示。106份资源的标记组合鉴定结果及人工接种鉴定结果见表5，结果表明，106份资源的分子鉴定结果和人工接种鉴定结果符合率达100%。

表5：标记组合鉴定法和人工接种鉴定法的比较结果

序列表

<110> 山西省农业科学院农作物品种资源研究所

<120> 一种鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的方法及专用SSR引物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaacaggtag cagtaagtaa tg 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgttttgct tgtagaaca 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgcatgtgc aacttgaaaa aca 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgttggttg acccaatgtc atc 23

Claims

1.一种用于鉴定抗大豆胞囊线虫4号小种大豆资源的SSR引物组合，其特征在于：该SSR引物组合为Satt533 和Satt504；所述Satt533的一条引物序列如SEQ ID NO. 1所示，另一条引物序列如SEQ ID NO. 2所示；所述Satt504的一条引物序列如SEQ ID NO. 3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO. 4所示。

2.权利要求1所述引物组合在辅助鉴定抗胞囊线虫4号小种大豆资源中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：辅助鉴定抗胞囊线虫4号小种大豆资源的方法，具体包括如下步骤：

用所述的引物组合中的每对引物对待测大豆单株基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测大豆单株对抗大豆胞囊线虫4号小种是抗病资源还是感病资源：

A、若所述引物组合中的每对引物所对应的PCR产物均含有抗病特征带，则认为所述待测大豆单株为抗病单株；

B、若所述引物组合中有其中一个引物或一个以上引物所对应的PCR产物不含有抗病特征带，则认为所述待测大豆单株为感病单株；

所述抗病特征带为：Satt533为269 bp的DNA；Satt504为159 bp的DNA。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增体系为：PCR总体积为10µl，含Mg²⁺的10×PCR buffer为1µl；2.5mmol/ml 的dNTP mixture为0.5µl；10 ng/µl 的引物-F为1µl；10 ng/µl的引物-R为1µl；10ng/µl的基因组DNA为3µl；5U/µl 的Taq酶为0.1 µl；ddH₂O为3.4µl；SSR标记两条引物的浓度分别为0.5µmol/L，基因组DNA的浓度为5 ng/µl；PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性30s，退火温度退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述引物Satt533进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物Satt504进行PCR扩增的退火温度为58℃。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述辅助鉴定抗胞囊线虫4号小种大豆资源的方法在抗大豆胞囊线虫4号小种资源筛选或抗大豆胞囊线虫4号小种品种选育中应用。