CN111471783B - 一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方法、分子标记、引物及应用 - Google Patents

一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方法、分子标记、引物及应用 Download PDF

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Abstract

一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方法、分子标记、引物及应用，属于遗传育种技术领域。针对如何在同一生理小种多遗传背景和多生理小种同一遗传背景获得抗大豆胞囊线虫主效抗病位点或抗病基因的问题，本发明提供了一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记，该分子标记位于大豆第16号染色体(J连锁群)，所述分子标记为SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07和SSR_16_08中的一种，各分子标记的引物如SEQ ID NO：1‑12所示。本发明可用于筛选抗胞囊线虫基因或用于大豆抗胞囊线虫病育种。

Description

一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方 法、分子标记、引物及应用
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方法、分子标记、引物及应用。
背景技术
SCN存在着众多多个生理小种抗性的位点，研究发现，Yue采用一个F2代群体，在对每个生理小种拥有抗性的位点进行检验时，分别运用了RFLP标记与SSR标记，结果表明位于Chr.18(LG G)上的一个区间聚集了拥有对多个生理小种抗性的位点，然而，对SCN l、2、5号生理小种具有抗病性的位点聚集在Chr.11 (LG B1)上某一区间。目前在众多抗病位点中，已被定位到LG G上的rgh1位点与LG A2上的Rhg4位点是较为公认的抗性位点。这对研究大豆生产效率、大豆优良品质资源选育以及筛选抗病候选基因具有重要意义。目前Boutin等用PI 209332为抗源得到的4个抗病品系为材料进行RFLP分析，在Chr.11(LGB1) 上邻近于RFLP标记K 69周围找到与SCN抗性相关的位点，Shoemaker等131-138创建的连锁图谱中，RFLP标记K69被定位在Chr.18(LG G)上。其后的研究者采用相关抗源证实了抗SCN3号生理小种的抗病基因位于邻近Chr.18(LG A2)染色体上的i位点周围。Vierling以Hatwig为材料，找到位于连锁群Chr.11 (LGB1)、Chr.13(LGF)上抗SCN位点，而主效抗性位点位于Chr.11(LGB1)染色体上，并发现4个位点同时存在，才拥有完整的抗性。Concibido等以Evans与PI209332为组合，在Chr.18(LG G)染色体上，通过利用已确定的RFLP标记进行含有抗SCN位点区段的饱和，增加了8个RFLP标记，使此区域每2.6cM便有一个RFLP标记。Choi等以一个DNA库，并用192个引物对其实行RAPD分析，成功地筛选出抗3、5、 14号生理小种的标记；Skorupska等对一个近等基因系进行RAPD分析，得到了17个位于Peking上的RAPD 片段，均对SCN 3号生理小种的抗性有关。2003年蒙忻利用群体分离分析，得到抗SCN4号小种的SSR 标记，其中Satt187是王惠于2007年利用一个F2代材料筛选得到的，此标记与SCN抗性基因有关。2000 年，王敬强以一个F2代群体为材料，筛选得到一个位于G连锁群上的标记UBC811。该位点受到技术手段、成本及操作难度的限制难于推广应用，对操作者经验要求较高，在同一生理小种多遗传背景和多生理小种同一遗传背景的情况下工作量较大，且获得的QTL分析较少。
发明内容
针对如何在同一生理小种多遗传背景和多生理小种同一遗传背景获得抗大豆胞囊线虫主效抗病位点或抗病基因的问题，本发明提供了一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记，该分子标记位于大豆第16号染色体J连锁群，所述分子标记为SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07 和SSR_16_08中的一种，上述分子标记的多态性SSR引物如下：
①上游引物SSR_16_01-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物SSR_16_01-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，用于获得SSR_16_01分子标记；
②上游引物SSR_16_02-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物SSR_16_02-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，用于获得SSR_16_02分子标记；
③上游引物SSR_16_03-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物SSR_16_03-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，用于获得SSR_16_03分子标记；
④上游引物SSR_16_06-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物SSR_16_06-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，用于获得SSR_16_06分子标记；
⑤上游引物SSR_16_07-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物SSR_16_07-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，用于获得SSR_16_07分子标记；
⑥上游引物SSR_16_08-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物SSR_16_08-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，用于获得SSR_16_08分子标记。
进一步地限定，所述大豆抗胞囊线虫病抗性位点为qSCN16位点，位于大豆第16号染色体 31.4697Mb-35.7920Mb区间。
本发明提供了用于获得与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的引物，所述引物为下述中的一种：
①上游引物SSR_16_01-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物SSR_16_01-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
②上游引物SSR_16_02-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物SSR_16_02-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
③上游引物SSR_16_03-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物SSR_16_03-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
④上游引物SSR_16_06-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物SSR_16_06-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
⑤上游引物SSR_16_07-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物SSR_16_07-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
⑥上游引物SSR_16_08-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物SSR_16_08-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明还提供了上述与大豆抗胞囊线虫病基因连锁的分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
1)以大豆品种东农L-10为父本，分别以大豆品种黑农37、大豆品种绥农10号、大豆品种绥农14 号为母本，杂交后培育获得重组自交系F5:11代：黑农37×东农L-10、绥农10号×东农L-10、绥农14号×东农L-10；
2)分别提取东农L-10、黑农37、绥农10号、绥农14号亲本基因组DNA，利用SSR引物进行PCR 扩增，筛选多态性SSR引物；
3)利用多态性SSR引物构建大豆遗传连锁图谱；
4)利用描述统计对群体数据实施正态性检验，对不契合正态分布的表现型数据进行标准化处理，以 LOD>2.0作为QTL存在的阈值对大豆胞囊线虫1号、3号、4号和14号中的一种或多种生理小种抗病性位点进行QTL定位分析，确定与大豆抗胞囊线虫病基因连锁的分子标记。
进一步地限定，步骤3)所述利用SSR引物进行PCR扩增的方法为：每20μL反应体积，反应体系包括50ng/μL模板DNA 2μL，10×PCR缓冲液2μL，10ng/μL SSR引物3μL，10mM dNTP0.3μL，5units/μL Taq 酶0.3μL，ddH2O 12.4μL，液体石蜡覆盖；PCR反应程序：94℃预变性5min，循环：94℃变性30sec；50℃复性30sec；72℃延伸30sec；循环38次，72℃延伸5min。
本发明还提供了上述分子标记在筛选抗胞囊线虫基因或大豆抗胞囊线虫病育种中的应用。
进一步地限定，所述应用包括：提取被测大豆基因组DNA，以东农L-10的基因组DNA为抗病对照样本，以黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的基因组DNA为感病对照样本，与被测大豆种质的DNA 同时利用SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07和SSR_16_08分子标记中的一个或多个，经SSR引物PCR扩增后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测分析，根据银染结果鉴定大豆是否具有大豆胞囊线虫抗性，当被测种质扩增条带与抗病对照东农L-10扩增条带一致时，鉴定该大豆为携带抗病等位基因的种质，其抗大豆胞囊线虫病1，3，4和14号生理小种，当扩增条带与感病对照黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的扩增条带一致时，鉴定该大豆携带感病等位基因的种质，其对大豆胞囊线虫病1，3，4和14号生理小种的抗性较低或不具抗性。
有益效果
本研究在前期定位到Chr.16号染色体上检测到一个控制多个大豆胞囊线虫小种抗性，命名为qSCN16 (q代表QTL，SCN代表大豆胞囊线虫，16代表染色体编号Chr16q)，该位点位于Chr16：31.46Mb-35.79Mb 区间，在此基础上，在同一生理小种多遗传背景和多生理小种同一遗传背景的两种情况下，通过对有/无主效抗病位点情况下均确认了该抗性QTL的存在检测，结果表明qSCN16位点与标记SSR_16_01， SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07和SSR_16_08(31.4697Mb-35.7920Mb)紧密连锁，在去除主效抗病位点rhg1和Rhg4的情况下，同样可以在该群体中定位到与1、3、4和14号生理小种相关的QTL且遗传贡献率均在15％以上，由此得出，qSCN16位点是一个兼抗多个大豆胞囊线虫生理小种的主效抗病位点。
本发明通过群体抗、感表性鉴定结合遗传图谱以及QTL分析选出的qSCN16位点，具有较好抗胞囊线虫病的特点，利用遗传连锁图谱SNP标记、SSR标记和QTL分析重新定义qSCN16所在基因组区段，并挖掘与之紧密连锁的分子标记；结合亲本基因组深度重测序数据进一步对qSCN16所在的基因组区段进行变异位点分析、基因拷贝数变异分析及荧光定量PCR分析以筛选抗病候选基因。为简化抗性位点操作，进一步对qSCN16所在的基因组区段进行变异位点分析、基因拷贝数变异分析及荧光定量PCR分析可用于筛选抗病候选基因。
本发明能够有效改善大豆胞囊线虫病对大豆的抗性影响，且只能在收获后进行评价的缺点，该位点克服了传统抗性品种的选年限长、耗费大量人力物力的缺点；通过该位点分析进一步筛选抗病候选基因，提高育种效率。
综上所述，本发明获得的有益效果如下：
1可以利用QTL位点选育出新的抗病性基因，对现有品种进行改进；
2与现有技术相比，无需盲目选择基因进行抗病性鉴定，方向更加明确；
3抗胞囊线虫病效果显著，有效减少胞囊数量。
4理论上通过抗病性位点，更加容易选育出抗病品种。
5通过位点可以选出更多有效抗胞囊线虫病基因。
附图说明
图1重组自交系群体雌虫指数分布，其中a、b、c分别代表黑农37×东农L-10群体、绥农10号×东农 L-10群体、绥农14号×东农L-10群体在3号小种上频率分布，横坐标为雌虫指数(％)；纵坐标为频率(％)。
图2重组自交系雌虫指数分布，其中，a、b、c分别代表1号生理小种、4号生理小种、14号生理小 种在黑农37×东农L-10群体上的频率分布，横坐标为雌虫指数(％)；纵坐标为频率(％)。
图3部分SSR引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳，1-4分别为东农L-10，黑农37、绥农10号、绥农14号的扩增产物。
图4qSCN16位点的局部遗传连锁图谱，图中左侧数据为遗传距离，单位为厘摩尔根，右侧为SSR标记，1表示黑农37×东农L-10组合的遗传连锁图谱，2表示绥农10号×东农L-10组合的遗传连锁图谱，3 表示绥农14号×东农L-10组合的遗传连锁图谱。
图5rhg1PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，1:50℃，2：51℃，3：52℃，4：53℃，5：54℃，6：55℃， 7：56℃；A：东农L-10，B：黑农37，C：绥农10号，D：绥农14号；M：2000marker，从上到下：2000bp， 1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图6Rhg4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，1:50℃，2：51℃，3：52℃，4：53℃，5：54℃，6： 55℃，7：56℃；A：东农L-10，B：黑农37，C：绥农10号，D：绥农14号；M：2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图7rhg1测序结果比较，14，13，12，11，10，9分别为rhg1，Forrest，黑农37，东农L-10，绥农 10号，绥农14号；1-4,7-7-8为东农L-10×黑农37重组自交系的抗病株系，5-6为东农L-10×黑农37重组自交系的感病株系。
图8Rhg4测序结果比较，14，13，12，11，9，8分别为Rhg4，黑农37，绥农10号，绥农14号，Forrest，东农L-10；6-7为东农L-10×黑农37重组自交系的抗病株系，1-5和10为东农L-10×黑农37重组自交系的感病株系。
具体实施方式
本发明所述黑农37，记载在：常玮,韩英鹏,胡海波,et al.基于元分析与结构域注释的大豆胞囊线虫抗性基因挖掘[J].中国农业科学,2010,43(23):4787-4795.。
绥农10号，记载在：付春旭,景玉良,王金星,et al.优良大豆种质绥农10号的利用及效果分析[J].黑龙江农业科学,2017(09):6-11.。
绥农14号，记载在王贵江.大豆品种绥农14号快速推广的原因分析[J].大豆科学,2002, 21(3):238-240.。
东农L-10，记载在：胡海波.重组自交系群体对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性与主要农艺性状的相关分析.大豆科学,2012,31(5):000793-795.。
生理小种1号、生理小种3号、生理小种4号、生理小种14号均记载在董丽民,许艳丽,李春杰,et al. 黑龙江省大豆胞囊线虫胞囊密度和生理小种鉴定[J].中国油料作物学报,2008,30(1):108-111.。
抗病对照Forrest，记载在Cook D E,Lee T G,Guo X,et al.Copy NumberVariation of Multiple Genes at Rhg1 Mediates Nematode Resistance in Soybean[J].Science,2012,338(6111):1206-1209.
以上资源公众可通过东北农业大学获得。
本发明所涉及的分子生物学方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，所使用的实验试剂，酶制剂等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。
实施例1.大豆胞囊线虫病土扩繁及抗性鉴定。
本研究评价以黑农37×东农L-10、绥农10号×东农L-10、绥农14号×东农L-10三个组合构建的重组自交系群体对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性鉴定，所述重组自交系群体获得过程如下：通过上述亲本组合杂交衍生的F1代单粒自交繁殖获得F2代单粒，自F2代起连续自交，结合单粒传法保留后代至F6代，自F6代进行株行繁殖，至F11代，对F11代进行图谱的构建和抗病性鉴定，并对群体雌虫指数进行统计分析(表1)。
表1三个组合后代群体在3号生理小种上统计分析
Figure BDA0001955000600000051
Figure BDA0001955000600000061
同时，以黑农37×东农L-10组合构建的重组自交系，利用大豆胞囊线虫生理小种1号、4号和14号对其进行抗性鉴定，得到其雌虫指数，并进行了统计分析(表2)。
表2群体在各小种上的雌虫指数统计分析
Figure BDA0001955000600000062
次数分布描述统计结果显示，在不同遗传背景下，群体对SCN(大豆胞囊线虫)3号生理小种的抗性均呈现连续单峰分布，符合数量性状特征(图1)。
统计结果显示，黑农37×东农L-10杂交组合衍生的RIL(重组自交系)群体对SCN 1号、4号和14 号生理小种的抗性均呈现连续单峰分布，符合数量性状特征(图2)。
实施例2.分子标记的筛选方法。
亲本及后代分子标记分析：
(1)以大豆品种东农L-10为父本，分别以大豆品种黑农37、绥农10号、绥农14号为母本，杂交后培育获得重组自交系F5:11代：黑农37×东农L-10、绥农10号×东农L-10、绥农14号×东农L-10；所述重组自交系的培育方法参见实施例1所述。
(2)分别提取东农L-10、黑农37、绥农10号、绥农14号亲本基因组DNA，利用SSR引物进行PCR 扩增，筛选多态性SSR引物；方法如下：
依据本研究前期对大豆胞囊线虫抗性位点的报道，选取大豆第16号染色体Chr.16(LGJ)连锁群上目标 QTL(qSCN16)区段内(31.46Mb-35.79Mb)的SSR标记位点，并对其进行PCR分析，采取SDS小量法提取大豆基因组DNA，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测和SSR PCR扩增及银染检测分析。将来源于母本黑农37、绥农10号、绥农14号带型记录为0，来源于父本L-10带型记录为2，双亲杂合带型记录为1，缺失记录为“-1”。通过查询大豆公共遗传连锁图谱，确定存在差异的SSR标记所属染色体，并将分子标记锚定于所属的染色体上。
结果发现在抗病品种东农L-10，感病亲本黑农37、绥农10号、绥农14号上存在多态性的引物为8 个，图3示例其中一个标记SSR_16_01在三个作图群体亲本及部分后代的分型结果(1-4分别为东农L-10，黑农37、绥农10号、绥农14号的扩增产物)。
所述8个SSR引物组合分别为：
①上游引物为SSR_16_01-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物为SSR_16_01-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
②上游引物为SSR_16_02-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物为SSR_16_02-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
③上游引物为SSR_16_03-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物为SSR_16_03-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
④上游引物为SSR_16_06-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物为SSR_16_06-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
⑤上游引物为SSR_16_07-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物为SSR_16_07-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
⑥上游引物为SSR_16_08-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物为SSR_16_08-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
⑦上游引物为SSR_16_04-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物为SSR_16_04-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
⑧上游引物为SSR_16_05-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物为SSR_16_05-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
(3)利用多态性SSR引物构建大豆遗传连锁图谱；
利用筛选出的8对具有多态性的SSR引物，在3个重组自交系群体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用 Icimapping(v3.1)构建qSCN16位点的局部遗传连锁图谱(图4)。
其中SSR_16_01-F和SSR_16_01-R引物对获得的分子标记为SSR_16_01；
SSR_16_02-F和SSR_16_02-R引物对获得的分子标记为SSR_16_02；
SSR_16_03-F和SSR_16_03-R引物对获得的分子标记为SSR_16_03；
SSR_16_04-F和SSR_16_04-R引物对获得的分子标记为SSR_16_04；
SSR_16_05-F和SSR_16_05-R引物对获得的分子标记为SSR_16_05；
SSR_16_06-F和SSR_16_06-R引物对获得的分子标记为SSR_16_06；
SSR_16_07-F和SSR_16_07-R引物对获得的分子标记为SSR_16_07；
SSR_16_08-F和SSR_16_08-R引物对获得的分子标记为SSR_16_08分子标记。
表3 SSR引物序列及物理位置信息
Figure BDA0001955000600000081
黑农37×东农L-10群体图谱长度117.4cM；绥农10号×东农L-10群体图谱长度81.9cM；绥农14号×东农L-10群体图谱长度75.6cM。
rhg1和Rhg4位点SNP分析：
本研究对rhg1和Rhg4位点的关键基因及抗感病相关变异位点进行引物设计和PCR分析，以东农L-10 为模板，通过设定7个温度梯度PCR来确定最适退火温度，其中53℃(rhg1)和56℃(Rhg4)，引物和模板结合较好，产物特异性较好，确定为最适退火温度；设置退火温度为53℃和56℃，对2个位点特异性引物进行4个亲本模板DNA的PCR分析，经琼脂糖凝胶电泳检测，均得到较好的产物(图5、图6)。
通过对抗病亲本东农L-10，感病亲本黑农37、绥农10号、绥农14号及相应的重组自交系后代群体的主效抗病基因rhg1和Rhg4变异位点PCR产物进行序列分析，获得亲本及后代在rhg1和Rhg4位点的基因型。
rhg1位点引物如下，上游引物rhg1-F：TTGTCAGGCTATGGAATCAT；下游引物rhg1-R：GTCTTCAATAGCCATCCAAC；PCR产物长度311bp。
结果发现在rhg 1PCR扩增产物上127bp处存在胸腺嘧啶和鸟嘌呤(T/G)的突变(图7)，其中抗病品种东农L-10及30个群体后代为胸腺嘧啶(T)，与抗病对照Forrest一致，感病亲本黑农37、绥农10号、绥农14号及大部分群体后代为鸟嘌呤(G)。
Rhg4位点引物如下，上游引物Rhg4-F：CTACACCGCCGTCCTCAAC；下游引物Rhg4-R：CGGTGGTGGAGTTTACCTTGT；PCR产物长度158bp。
在Rhg4PCR扩增产物上108bp处存在胞嘧啶和鸟嘌呤(C/G)的突变(图8)，其中抗病品种东农L-10 及23个群体后代为胞嘧啶(C)，与抗病对照Forrest一致，感病亲本黑农37、绥农10号、绥农14号及大部分群体后代为鸟嘌呤(G)。
4)利用描述统计对群体数据实施正态性检验，对不契合正态分布的表现型数据进行标准化处理，以 LOD>2.0作为QTL存在的阈值对大豆胞囊线虫1号、3号、4号和14号中的一种或多种生理小种抗病性位点进行QTL定位分析，确定与大豆抗胞囊线虫病基因连锁的分子标记。方法如下：
a.多遗传背景下胞囊线虫3号生理小种QTL分析。
采用Icimapping(v3.1)软件对群体基因型和表型数据进行QTL分析，利用符合区间作图法在三个群体中均检测到与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关位点，且存在公共的连锁分子标记SSR_16_01(表4)。
表4大豆胞囊线虫3号生理小种抗性QTL定位结果
Figure BDA0001955000600000091
利用3个重组自交系群体主效位点rhg1和Rhg4的SNP基因型，筛选出携带rhg1和Rhg4抗病等位的株系，将这部分株系剔除，利用剩余的262个株系进行QTL分析(表5)，结果表明，通过去除抗大豆胞囊线虫主效位点rhg1和Rhg4定位到的QTL，与含有这两个主效位点定位到的QTL相比，QTL与标记SSR_16_01的遗传距离缩短，且对表型的贡献率显著增加，这都说明了qSCN16-3-1、qSCN16-3-2和 qSCN16-3-3三个QTL与标记SSR_16_01紧密连锁，且为抗大豆胞囊线虫3号生理小种的主效QTL，同时，本研究结果表明多个主效位点同时存在的情况下，单个主效QTL的检出效率被削弱，通过剔除携带已知位点优异等位的方式进行QTL挖掘对于新QTL的检出有重要意义。
表5大豆胞囊线虫3号生理小种无主效抗病位点抗性QTL定位结果
Figure BDA0001955000600000092
b.大豆胞囊线虫多生理小种QTL分析
利用qSCN16位点的局部遗传连锁图谱，结合黑农37×东农L-10群体对大豆胞囊线虫1号、4号和14 号生理小种的抗感性表型数据进行QTL分析，分别定位到控制在3个大豆胞囊线虫生理小种抗性的QTL，且公共连锁标记为SSR_16_01(表6)。
表6大豆胞囊线虫1、4和14号生理小种抗病QTL定位结果
Figure BDA0001955000600000101
去除该群体中含有主效位点rhg1和Rhg4的样本，并进行定位(表7)。
表7大豆胞囊线虫1、4和14号生理小种无主效位点抗病QTL定位结果
Figure BDA0001955000600000102
结果表明，在去除主效抗病位点rhg1和Rhg4的情况下，同样可以在该群体中定位到与1号、4号、 14号生理小种相关的QTL，且遗传贡献率均在15％以上，由此得出，qSCN16位点是一个兼抗多个大豆胞囊线虫生理小种的主效抗病位点，确定了与该位点连锁的分子标记SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07或SSR_16_08，所述分子标记以及获得该分子标记的引物可用于大豆抗胞囊线虫病品种鉴定。具体应用方法为：提取被测大豆基因组DNA，以东农L-10的基因组DNA为抗病对照样本，以黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的基因组DNA为感病对照样本，与被测大豆种质的DNA一同利用SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07和SSR_16_08分子标记中的一个或多个，进行PCR，PCR反应体系及程序为：反应总体积为20μL，反应体系包括2μL模板DNA(50ng/μL)， 10×PCR缓冲液2μL，3μLSSR引物(10ng/μL)，0.3μL dNTP(10mM)，0.3μL Taq酶(5units/μL)， 12.4μLddH2O，液体石蜡覆盖。PCR反应程序：94℃预变性5min，循环：94℃变性30sec；50℃复性30sec； 72℃延伸30sec；循环38次，72℃延伸5min。
将PCR产物中加上8μL甲酰胺双色缓冲液，置于PCR仪中94℃变性10min，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测分析，根据银染结果鉴定大豆是否具有大豆胞囊线虫抗性，当被测种质扩增条带与抗病对照东农L-10扩增条带一致时，鉴定该大豆为携带抗病等位基因的种质，判断其抗大豆胞囊线虫病1，3，4 和14号生理小种，当扩增条带与感病对照黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的扩增条带一致时，鉴定该大豆携带感病等位基因的种质，判断其对大豆胞囊线虫病1，3，4和14号生理小种的抗性较低或不具抗性。
核苷酸序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的筛选方法、分子标记、
引物及应用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> SSR_16_01-F
<400> 1
ttgcaatagc tcatctggac a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_01-R
<400> 2
cttcttggcc agtctcaagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_02-F
<400> 3
ggatgaagca gctatcccaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_02-R
<400> 4
ggcaacaatg aaaaggagga 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> SSR_16_03-F
<400> 5
ttctgtcgac ttattttgtt cattt 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_03-R
<400> 6
taaagatggc acacggatca 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> SSR_16_06-F
<400> 7
gggacattct tttattagaa tttgatg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> SSR_16_06-R
<400> 8
gagaataatg gtcgtaaaat aacattg 27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_07-F
<400> 9
gagaagcatg gcattcactg 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> SSR_16_07-R
<400> 10
gcaaagtcaa aaggtagtta tgga 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> SSR_16_08-F
<400> 11
tcccattatt agtttcctcc aaaa 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> SSR_16_08-R
<400> 12
cccaaaagtt ttctctcaac g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_04-F
<400> 13
cgtggttcta cgcttgattg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_04-R
<400> 14
gaatccattt gcttcccttt 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> SSR_16_05-F
<400> 15
tccaatttat gtcacacgca a 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR_16_05-R
<400> 16
ccgcacgaga tgtatgagac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> rhg1-F
<400> 17
ttgtcaggct atggaatcat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> rhg1-R
<400> 18
gtcttcaata gccatccaac 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Rhg4-F
<400> 19
ctacaccgcc gtcctcaac 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Rhg4-R
<400> 20
cggtggtgga gtttaccttg t 21

Claims (5)

1.一种与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记位于大豆第16号染色体J连锁群，所述分子标记为SSR_16_01、SSR_16_02、SSR_16_03、SSR_16_06、SSR_16_07和SSR_16_08中的一种，上述分子标记的多态性SSR引物如下：
①上游引物SSR_16_01-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物SSR_16_01-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，用于获得SSR_16_01分子标记；
②上游引物SSR_16_02-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物SSR_16_02-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，用于获得SSR_16_02分子标记；
③上游引物SSR_16_03-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物SSR_16_03-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，用于获得SSR_16_03分子标记；
④上游引物SSR_16_06-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物SSR_16_06-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，用于获得SSR_16_06分子标记；
⑤上游引物SSR_16_07-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物SSR_16_07-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，用于获得SSR_16_07分子标记；
⑥上游引物SSR_16_08-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物SSR_16_08-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，用于获得SSR_16_08分子标记。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述大豆抗胞囊线虫病抗性位点为qSCN16位点，位于大豆第16号染色体31.4697Mb-35.7920Mb区间。
3.一种用于获得与大豆抗胞囊线虫病抗性位点连锁的分子标记的引物，其特征在于，所述引物为下述中的一种：
①上游引物SSR_16_01-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物SSR_16_01-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
②上游引物SSR_16_02-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物SSR_16_02-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
③上游引物SSR_16_03-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物SSR_16_03-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
④上游引物SSR_16_06-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物SSR_16_06-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
⑤上游引物SSR_16_07-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物SSR_16_07-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
⑥上游引物SSR_16_08-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物SSR_16_08-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
4.权利要求1或2所述的分子标记在筛选大豆抗胞囊线虫基因或大豆抗胞囊线虫病育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体应用方法包括：提取被测大豆基因组DNA，以东农L-10的基因组DNA为抗病对照样本，以黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的基因组DNA为感病对照样本，与被测大豆种质的DNA同时利用权利要求1所述的分子标记中的一个或多个，经SSR引物PCR扩增后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测分析，根据银染结果鉴定大豆是否具有大豆胞囊线虫抗性，当被测种质扩增条带与抗病对照东农L-10扩增条带一致时，鉴定该大豆为携带抗病等位基因的种质，其抗大豆胞囊线虫病1，3，4和14号生理小种；当扩增条带与感病对照黑农37、绥农10号或绥农14号其中之一的扩增条带一致时，鉴定该大豆携带感病等位基因的种质，其对大豆胞囊线虫病1，3，4和14号生理小种的抗性较低或不具抗性。
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