KR20080043164A - 알에이피디 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성유전자 판별방법 - Google Patents

알에이피디 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성유전자 판별방법 Download PDF

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우종규
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Abstract

본 발명은 본 발명은 배추 뿌리혹병 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자에 관한 것으로, 특히 본 발명에 의해 제공된 DNA 표지인자인 RAPD 표지인자를 이용함으로서 포장 내에서 저항성 검정을 수행하지 않고 실험실 내에서 단시간에 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 형태를 확인하여 저항성 개체를 선발할 수 있다.
즉, 본 발명의 RAPD 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법은 배추 뿌리혹병 저항성 유전자형을 RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA) 표지인자로 확인 후 저항성 개체 "CR-새로나"를 선발하게 되며, 특히 저항성 개체 "CR-새로나" 품종의 저항성 유전분석을 위하여 단포자 유래 병원균(Rrace 4, Willinams법)과 F2, BC1P1, BC1P2의 집단을 이용하여 배추 뿌리혹병의 저항성 유전양식을 판별하는 단계, F2 집단 203개체의 저항성과 감수성 개체별 DNA를 추출하여 BSA-RAPD(Bulked Segregant Analysis-Randomly Amplified Polymorphic DNA)방법으로 저항성 유전자와 밀접하게 연관된 1.2kb의 DNA 표지인자를 선개발하는 처리과정으로 구성된 것을 특징으로 한다.
배추, 뿌리혹병, "CR-새로나", RAPD, PCR(Polymerization Chain Reaction)

Description

알에이피디 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법{Identification of clubroot resistance gene using RAPD marker in Chines cabbage}
본 발명은 배추 뿌리혹병 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자에 관한 것으로, 특히 본 발명에 의해 제공된 DNA 표지인자를 이용함으로서 포장 내에서 저항성 검정을 수행하지 않고 실험실 내에서 단시간에 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 형태를 확인하여 저항성 개체를 선발할 수 있는 알에이피디(RAPD) 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법에 관한 것이다.
배추는 김치의 주재료로 국내에서 중요한 채소 작물중의 하나이다. 최근 전국적으로 발생(예컨대, 2005년 강원도에서 692ha 발생)하는 배추 뿌리혹병의 피해가 심각하여 병저항성 품종 육성이 시급한 실정이다.
무사마귀병으로 알려진 배추의 뿌리혹병은 Plasmodiophora Brassicae에 의해 발생하는 토양전염병으로, 병원균은 뿌리혹균문, 뿌리혹균목의 뿌리혹균속(Plasmodiophorid)에 속하고 배추과 식물의 뿌리에 절대기생하는 균이며, 휴면포자, 유주자, 변형체 등의 형태로 토양 내에 존재한다.
배추 뿌리혹병의 방제는 주로 농약을 사용하는 화학적 방제법인 유묘검정법이 이용되고 있으나, 방제율이 낮고 농약의 과도한 사용으로 인한 환경오염에 직접적인 영향을 미칠 가능성이 있어 저항성 품종 육성이 무엇보다 시급한 실정이다. 따라서 저항성 품종의 육성을 위해서는 병원균의 분리, 휴면포자 농도 측정, 인공접종, 평가 등 많은 시간이 소요되고 비용이 많이 소용되며 환경에 대한 변이가 발생하여 정확한 병저항성 개체를 선발하는데 어려움이 있다.
한편, 배추 뿌리혹병 저항성 유전양식은 배추과 작물과 연구자에 따라 다양하게 보고되고 있는데, James & Williams (1980)는 배추의 저항성을 단인자 우성으로 보고 있으며, 또한 Voorrips & Kanne (1997)은 양배추의 저항성이 2개의 보족유전자로 보고되고, 또한 Zhong 등은 (2002)은 배추의 저항성 유전자는 한 개의 우성유전자가 지배한다고 보고하였다.
그러나 뿌리혹병원균은 같은 지역 및 포장 심지어 같은 뿌리혹 내에서도 생리형의 분화가 이루어지므로, Voorips (1995)는 정확한 유전양식 분석을 위해서는 유전적으로 균일한 단포자 유래 병원균을 이용한 저항성 검정이 필요하다고 보고하였다.
배추 뿌리혹병 저항성 품종은 CR Turnip으로부터 저항성 유전자를 도입하여 육성된 것으로 알려져 있으나, 국내 품종을 수집하여 저항성과 병원균 Race와의 상호작용을 통한 저항성 유전자 게놈(Genotype) 판정 결과 세 가지 형태로 구분되는 것으로 보고하였으며, 특히 "CR-새로나"의 경우는 기존의 다른 저항성 Genotype과는 차이가 있다고 하였다. 또한 Cho Et Al (2003)은 현재 육성된 저항성 품종 을이 연작할 경우 이병성으로 변화한다고 보고하여 새로운 저항성 Source가 필요하다고 보고하였다.
최근 배추 뿌리혹병의 저항성 유전자가 단일 우성유전자로 이와 연관된 분자표지가 개발되어 육종 초기에 선발효율을 높일 수 있을 것으로 보고하였다. 그러나 일부 연구자는 배추 뿌리혹병의 저항성 유전을 양적 형질로 분석하여 이에 대한 QTL 연관 분자표지인자를 보고하였다.
이에 본 발명은 유전적으로 균일한 단포자 유래병원균을 이용하여 새로운 저항성원으로 알려진 "CR-새로나"의 저항성 유전 양식을 분석하였으며, 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자를 개발하여 인공접종 또는 포장 저항성 검정을 않고 실험실 수준에서 배추 뿌리혹병 저항성 개체를 선발 하고자 수행하였다.
즉, 본 발명은 방제율이 낮고 농약의 과도한 사용으로 인한 환경오염에 직접적인 영향을 미칠 가능성이 있는 화학적 방제법인 유모검정법을 생략할 수 있을 뿐만 아니라, 판별시간도 파종 후 일주일 내에 판별할 수 있어 뿌리혹병의 저항성 육종 효율을 높일 수 있는 새로운 배추 뿌리혹병의 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자인바, 유전적으로 균일한 단포자 유래병원균을 이용하여 새로운 저항성 Source로 알려진 "CR-새로나"의 저항성 유전 양식의 분석으로서 저항성 유전자와 이에 연관된 DNA 표지인자를 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명의 알에이피디(RAPD) 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전 자 판별방법은 배추 뿌리혹병 저항성 유전자형을 RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA) 표지인자로 확인 후 저항성 개체 "CR-새로나"를 선발한다.
또한 저항성 개체 "CR-새로나" 품종의 저항성 유전분석을 위하여 단포자 유래 병원균(Rrace 4, Willinams법)과 F2, BC1P1, BC1P2의 집단을 이용하여 배추 뿌리혹병의 저항성 유전양식을 판별하는 단계, F2 집단 203개체의 저항성과 감수성 개체별 DNA를 추출하여 BSA-RAPD(Bulked Segregant Analysis-Randomly Amplified Polymorphic DNA)방법으로 저항성 유전자와 밀접하게 연관된 1.2kb의 DNA 표지인자를 선개발하는 처리과정으로 구성된다.
또한 RAPD 표지인자는 RAPD 프라이머(OPJ05)를 이용하여 배추의 Genome 중 PCR(Polymerization Chain Reaction) 반응으로 특이적으로 증폭된 약 1.2kb의 DNA 단편인 것을 특징으로 한다.
이하에서 본 발명의 RAPD 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법에 대한 원리가 쉽게 이해될 수 있도록 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명한다.
최근 분자생물학의 발달로 특정 유전자만을 증폭시킬 수 있는 방법이 개발되어 특정 유전자와 연관된 유용한 표지인자로 이용되고 있다. 이러한 방법중 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 방법은 10-20mer로 구성된 DNA 단편(Primer)를 이용하여 PCR(Polymerization Chain Reaction)을 수행 후 전기영동 과정을 통해 특정 유전자와 연관된 표지인자를 개발하는 방법이다.
이 방법은 기존의 여러 가지 DNA 표지인자 RFLP, SSR, AFLP 등에 비해 신속하고 간편하게 개발이 가능하다. 본 발명은 기존의 유묘검정을 통한 저항성 개체를 선발하는 방법 대신 RAPD 표지인자를 이용하여 보다 간편하고 신속하게 저항성 개체를 판별할 수 있다.
본 발명은 배추 "CR-새로나" 품종의 저항성 유전분석을 위하여 단포자 유래 병원균 (race 4, Willinams법)과 F2, BC1P1, BC1P2의 집단을 이용하여 배추 뿌리혹병의 저항성 유전양식을 판별하는 단계, F2 집단 203개체의 저항성과 감수성 개체별 DNA를 추출하여 BSA-RAPD (Bulked segregant analysis - Randomly amplified polymorphic DNA) 방법으로 저항성 유전자와 밀접하게 연관된 1.2kb의 DNA 표지인자를 개발하는 과정으로 구성되어 있으며, 구체적인 실시예는 다음과 같다.
<실시예 1> 배추 "CR 새로나"의 뿌리혹병 저항성에 대한 유전양식 판단
식물재료
식물재료는 CR-새로나의 양친, F1, 및 F2 집단을 이용하였다. 또한 저항성 유전양식 분석을 위해 2개의 Backcross 세대 (BC1P1, BC1P2)를 제작하여 저항성 검정을 수행하였다. 배추 뿌리혹병의 저항성 검정을 위해서 병토삽입법을 이용하여 유묘검정을 실시하였다.
병원균은 원예연구소로부터 분양받은 단포자유래 병원균(Single Spore Isolate, Race 4)을 이용하여 감수성 품종(칠성배추)에서 증식하여 이용하였다. 병원균 분리는 감염된 뿌리를 물로 잘 세척하고 멸균수와 이병조직의 비율을 5:1로 하여 믹서를 통해 잘게 부순 후, 8겹의 cheese cloth를 불순물을 제거하였다.
3,000rpm으로 5분간 원심분리 후에 상징액을 버리고 침전물만 회수하고 증류수를 추가하여 3회 원심분리를 반복하였다. 최종적으로 얻어진 휴면포자액은 헤모사이토미터를 이용하여 Spore의 농도를 5ㅧ106개/㎖로 적정 후 이용하였다.
병저항성 검정은 병토삽입법을 이용하였는데, 병토는 병원균액 1.5L, 상토 3L, 곱게 친 흙 4L와 질석 2L를 잘 섞어 제작하였다. 만들어진 병토에 종자를 각 3립씩 파종 후 35일에 저항성 정도를 판별하였다. 이때 저항성 검정은 0 (무발생), 1 (측근에서 발생), 2 (주근에서 발생), 3(측근 및 주근에서 발생)으로 Grading하여 조사하였으며, 1 이상은 감수성으로 간주하여 유전분석을 수행하였다.
<사진 1>
Figure 112006082951049-PAT00001
발병등급 0 1 2 3
상기의 <사진 1>을 보면, 병토삽입법을 이용하여 배추 뿌리혹병의 저항성 검정 후 배추 뿌리의 병 발병등급을 볼때, 0의 경우에는 발생하지 않았으며, 1의 경우에는 세근에만 일부 발생한 것을 알 수 있고, 2의 경우 주근과 세근에 발생하였고, 3의 경우에는 주근과 세근모두에 크게 발생할 것을 확인할 수 있다.
<사진 2>
Figure 112006082951049-PAT00002
Figure 112006082951049-PAT00003
(A) (B)
상기 <사진 2>는 배추 뿌리혹병의 단포자 유래 병원균(레이스 4)에 대해 접종 35일 후 CR-새로나 F2 집단의 저항성 평가에 대한 결과로서, A는 감수성 개체이고, B는 저항성 개체를 나타낸다.
그리고 "CR-새로나"의 배추 뿌리혹병 저항성 유전분석을 위하여 F2 및 두개의 Backcross 세대(BC1P1, BC1P2)를 제작하여 단포자 유래병원균(Race 4)에 대한 저항성 검정을 수행하였다.
감수성친과 검정교배 집단 53개체의 검정결과 저항성과 감수성이 1:1로, 저항성친과 검정교배 집단 54개는 1:0으로 분리되었으며, F1인 "CR-새로나"는 모두 저항성으로 나타났다. F2 집단 203개체는 154개체가 저항성으로 49개체가 감수성으로 나타나 3:1로 분리되어 "CR 새로나"의 저항성 유전은 하기의 <표 1>에서 보는 것처럼 단인자 우성으로 나타났다.
배추과 작물의 뿌리혹병 저항성 유전은 작물별로 많은 차이를 나타내고 있으 며, 배추의 병저항성은 3가지 형태로 보고되고 있다. Yoshigawa(1983)는 European Fodder Turnip의 저항성에 대해 하나의 Major Gene과 몇 개의 Minor Genes이 지배한다고 하였으며, Williams(1978)는 각기 다른 3개의 유전자가 병원균 Rrace 6에 저항성을 나타난다고 보고하였다.
또한 Zhong(2002)는 CR 신황의 DH(Doubled Haploid) 집단을 이용한 결과, 단인자 우성유전자가 배추의 저항성을 지배한다고 보고하였다. 본 결과에서도 "CR-새로나"의 경우는 단인자 우성이 지배하는 것으로 나타났으며, 특히 "CR-새로나"는 기존의 저항성 Source와 다른 저항성원을 이용하는 것으로 알려져 있어 병저항성 도입을 위한 육종 소재로 이용이 가능할 것으로 판단되었다.
<표 1> "CR-새로나"의 BC1P1, BC1P2, F1과 F2 집단의 병저항성 유전양식분석.
집단 표현형 기대분리비 (R:S) x2 p-value
전체 저항성(R) 감수성(S)
BC1P1 53 39 14 1:1 0.056 0.811*
BC1P2 54 51 3 1:0 10.888 0.0009
F1 31 31 0 1:0 7 0.008
F2 203 154 49 3:1 0.080 0.776*
(단포자 유래병원균 레이스 4 이용) P1: 감수성 자방친, P2: 저항성 화분친,
F1: "CR-새로나" (Resistant Variety), F2: "CR-새로나" F2 집단
<실시예 2> 배추뿌리혹병 저항성 유전자 연관 DNA 표지인자 개발
식물재료 및 Genomic DNA 추출
식물재료는 "CR-새로나"의 양친, F1, 및 F2 집단을 이용하였다. 또한 저항성 유전양식 분석을 위해 2개의 Backcross 세대(BC1P1, BC1P2)를 제작하여 저항성 검정을 수행하였다.
식물체 DNA 추출은 Plant DNA Exraction Kit(G-Spin IIpTM, Invitrogen, Korea, USA)를 이용하였으며, 추출된 DNA는 DNA Fluorometer (NanoDrop ND-100, Nanodrop Tech, USA)을 이용하여 정량하여 10ng/ul로 희석하였으며, 1.4% agarose 젤 전기영동으로 확인하였다.
BSA-RAPD 분석
배추 뿌리혹병 저항성 유전자와 밀접하게 연관된 DNA 표지인자를 찾기 위해 "CR-새로나"의 F2 집단 중 감수성 개체와 저항성 개체 5개씩을 이용하여 Bulked Segregant Analysis(BSA)를 수행하였다. 저항성과 감수성 각 5개체의 DNA를 동량으로 섞어 2개의 DNA Bulk를 제작하였다. RAPD는 2004년과 2005년에 걸쳐 총 300종류의 Random Primer Kit (Operon Tech., USA)를 수행하여 두 DNA Bulk 간에 다형화 밴드를 조사하였다.
RAPD 조건은 Genomic DNA 20ng, Primer 100nM, dNTP 200 μM, Taq Polymerase(Bioneer, Korea) 1.0U, 10X Buffer 2㎕(500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH 8.3, 15mM MgCl2, 0.01% Gelatin)을 첨가한 후, 총 반응액 20㎕로 하여 수행하였다.
PCR 조건은 Pre-Denaturation을 94℃에서 5분 후 94℃에서 Denaturation 30초, Annealing 온도를 35℃에서 30초간 수행하였고, 72℃에서 Extension을 1분으로 하여 45회 반응시켰다. 끝으로 Post-Extension을 위해 72℃에서 5분간 수행하였다.
PCR Machine은 DNA Engine(MJ Research, USA)를 이용하였고, PCR 반응 후 1.4 % Agarose Gel 전기영동하여 EtBr 염색 후 Image Analyzer II(Bioneer, Korea)을 이용하여 촬영하였다. 배추 뿌리혹병 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자를 개발하기 위하여 BSA-RAPD를 수행하였다.
"CR-새로나"의 F2 집단 중 저항성과 감수성 개체의 DNA 각 10개를 동량으로 섞어 2개의 Bulk를 만들어 총 300개의 Random Primer(OPERON OPA, OPB, OPC, OPD, OPJ, OPK, OPQ, OPR, OPS, OPT, OPU, OPW, OPV, OPX, OPZ)를 이용하여 BSA-RAPD를 수행한 결과, 하기의 <사진 3>과 같이 OPJ에서 양친 및 저항성 Bulk에서 특이적으로 증폭되는 밴드를 확인할 수 있었다. 즉, OPERON Primer 300종류를 이용하여 RAPD를 수행한 결과로 OPJ05(5'-CTC CAT GGG G-3')에서 저항성 개체 DNA Bulk에서는 약 1,200bp를 증폭하여 밴드가 나타나는 반면, 감수성 개체 DNA bulk에서는 증폭되지 않는 다형성 밴드를 알 수 있다.
<사진 3> BSA-RAPD (OPJ05)를 이용한 배추 뿌리혹병의 저항성 유전자 연관 DNA 표지인자.
Figure 112006082951049-PAT00004
※ 상기 사진에서 M: 바이오니어 DNA Marker (100bp ladder), P1: 감수성 자 방친, P2: 저항성 화분친, F1: CR 새로나, BR: 저항성 5개체 DNA Bulk, BS : 감수성 5개체 DNA Bulk, 화살표는 저항성과 감수성간의 DNA 표지인자(1.2kb)의 표시임.
<사진 4> 배추뿌리혹병 저항성 유전자 연관 DNA 표지인자를 이용한 "CR-새로나" F2 집단의 개체별 저항성 및 감수성 개체판별.
Figure 112006082951049-PAT00005
※ 상기 사진에서 R: 저항성 개체, S: 감수성 개체, 화살표: DNA 표지인자(1.2kb)를 나타냄.
<사진 4>는 BSA-RAPD에서 선발된 DNA 표지인자(OPJ05)를 "CR 새로나" F2 집단의 각 개체별로 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행한 결과, 단포자 유래병원균(Race 4)를 이용하여 유묘검정을 저항성 검정결과와 1.2kb의 밴드가 나타나면 저항성(R)으로, 반면에 나타나지 않으면 감수성(S)으로 판별한 결과를 비교한 현미경 사진으로 1.2kb의 밴드 유무와 저항성과 감수성이 일치함을 알 수 있다.
F 2 집단 개체별 genotyping 및 연관거리 검정
BSA-RAPD에서 선발된 OPJ1200을 "CR-새로나" F2 집단 185개체에 적용시킨 결과, 하기의 <표 2>에서 보는 것처럼 선발된 마커(Marker)는 배추 뿌리혹병 저항성 유전자와 3.1cM 거리로 밀접하게 연관된 것으로 나타났다.
<표 2> "CR-새로나" F2집단을 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 연관 DNA 표지인자(OPJ1200)의 유전분석.
표현형 식물체수 OPJ1200 표지인자의 분리 재조합빈도(cM)
Present Absent
저항성 139z 131 8 3.1
감수성 46y 1 45
※ z :유묘검정에서 저항성으로 나타난 154개체 중 15개체는 DNA표지인자 개발에서 제외, y :유묘검정에서 감수성으로 나타난 48개체 중 3개체는 DNA 표지인자 개발에서 제외됨.
본 발명은 배추 뿌리혹병 저항성 개체를 선발할 때 병원균을 인공으로 접종한 후 뿌리의 감염정도를 이용하여 저항성 개체를 선발하는 종래의 방법을 개선한 것인바, DNA 표지인자(RAPD, Randomly Amplified Polymorphic DNA)를 이용하여 저항성 개체를 선발함으로서 시간적 공간적 비용을 획기적으로 절약 할 수 있어 배추 뿌리혹병 저항성 육종에 획기적인 효과를 제공할 것으로 기대된다.
즉, 지금까지 배추 뿌리혹병의 방제하기 위해 주로 농약을 사용하는 화학적 방제법인 유묘검정법이 이용되고 있으나, 이는 방제율이 낮고 농약의 과도한 사용 으로 인한 환경오염에 직접적인 영향을 미칠 가능성이 있었다. 그러나 본 발명을 이용할 경우 이러한 유묘검정법을 생략할 수 있을 뿐만 아니라 판별시간도 파종 후 일주일 내에 판별할 수 있어 배추 뿌리혹병의 저항성 육종효율을 높일 수 있는바, 이는 원균의 분리, 병원균 밀도 분석, 인공접종, 판별 등의 확인 과정을 거치지 않고 실험실에서 단기간에 효과적으로 배추 뿌리혹병의 저항성 유전자의 판별이 가능할 수 있다.

Claims (3)

  1. 배추 뿌리혹병 저항성 유전자형을 RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA) 표지인자로 확인 후 저항성 개체 "CR-새로나"를 선발하는 것을 특징으로 하는 알에이피디(RAPD) 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 저항성 개체 "CR-새로나" 품종의 저항성 유전분석을 위하여 단포자 유래 병원균(Rrace 4, Willinams법)과 F2, BC1P1, BC1P2의 집단을 이용하여 배추 뿌리혹병의 저항성 유전양식을 판별하는 단계, F2 집단 203개체의 저항성과 감수성 개체별 DNA를 추출하여 BSA-RAPD(Bulked Segregant Analysis-Randomly Amplified Polymorphic DNA)방법으로 저항성 유전자와 밀접하게 연관된 1.2kb의 DNA 표지인자를 선개발하는 처리과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 알에이피디(RAPD) 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성 유전자 판별방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 RAPD 표지인자는 RAPD 프라이머(OPJ05)를 이용하여 배추의 Genome 중 PCR(Polymerization Chain Reaction) 반응으로 특이적으로 증폭된 약 1.2kb의 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 알에이피디(RAPD) 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저 항성 유전자 판별방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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