CN1813517A - 滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法 - Google Patents

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谭学林
谭亚玲
张忠林
赵银河
张雪梅
黄大军
金寿林
洪汝科
许红云
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Abstract

本发明涉及一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，属于育种领域。本发明的技术方案是材料种植与常规方法相同，将待鉴定材料播种及移栽种植；移栽15－40天取叶片，提取水稻总DNA；测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；然后用位于水稻第10染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记OSR33、RM228作引物，进行PCR反应；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染法检测PCR产物及电泳结果；再鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。本发明可快速、有效筛选滇型杂交稻的恢复系。

Description

滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法
技术领域
本发明涉及一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于育种领域。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，上世纪70年代杂交水稻的育成为我国粮食生产、解决温饱问题做出了巨大的贡献。1998年的统计表明，我国杂交水稻种植面积约占水稻面积的50％以上，累计增产粮食3500亿千克。滇型杂交粳稻自1973年滇型杂交粳稻实现三系配套以来，迄今已育成十种不同细胞质类型的滇型不育系，并组配成功一序列优良的粳型杂交组合，为粮食生产作出了贡献。尽管如此，滇型杂交稻的应用一直无大的突破，其主要原因是滇型不育系没有现成的品系可作恢复系，恢复基因只存在于籼稻中，不存在于粳稻品种中，而且不是所有的籼稻都具有恢复基因。此外，选育滇型恢复系时，没有形态特征可用于鉴别恢复系。所以，选育优良的恢复系一直是滇型杂交稻育种中的重点和难点。
目前，选育滇型恢复系必须通过籼粳交，从籼稻中引入恢复基因，然后再经过后代测恢。这一方法需经历两个生长季节，需要人工测交及田间鉴定程序，必须具有田间测恢所需的不育系，而且结果的准确性常受环境条件的影响。目前，还没有一种技术较完善、有效的滇型杂交稻恢复系选择鉴定的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有滇型恢复系选育方法的不足，提供一种快速、高效、准确的鉴定滇型恢复系的方法。
本发明的技术方案是保持目前粳稻恢复系选育的田间栽培方式，种植材料之间的株距、行距和密度、田间的栽培管理、种子的繁殖方法均与常规方法相同，其步骤是：将待鉴定材料播种及移栽种植；移栽15-40天取叶片，提取水稻总DNA；测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；然后用位于水稻第10染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记OSR33、RM228作引物，进行PCR反应；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染法检测PCR产物及电泳结果；用微卫星标记OSR33、RM228作引物时，含恢复基因，可作恢复系材料的PCR产物的分子量分别是320bp，250bp；不能作滇型杂交稻恢复系的材料，其PCR产物的分子量为330bp、270bp，由此鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。用微卫星标记OSR33或RM228作引物，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下：
反应液组成：ddH2O6-10ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 1-3ul、Taq酶0.5-1.5U，
总体积18-25ul
扩增程序：93-95℃4min；
          93-95℃1min、50-60℃1min、68-75℃1min，35个循环；
          72℃4min
本发明的有益效果是由于利用了分子遗传学及分子生物学技术，结合我们对滇型恢复基因精确标记及分子定位的结果，从稻种资源及籼粳交后代中早期筛选鉴定恢复系，减少育种的盲目性，提高育种效率，为组配强优势组合、解决杂交粳稻面临的问题提供了有力的工具。具体表现为：
1、用OSR33、RM228鉴别恢复系准确性高，其中OSR33鉴定选择恢复系的准确率为96％、RM228为92％，而且时间上只需一个生长季节，缩短了育种进程；
2、选择不受季节及材料数量的限制，避免了人工测交及田间鉴定的繁琐程序，且不需田间测恢必需的不育系。
附图说明
图1是用微卫星标记OSR33作引物，经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测所得到的电泳图谱。
图2是用微卫星标记RM228作引物，经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测所得到的电泳图谱。
具体实施例
具体实施方式为选择106份不能作滇型恢复系的材料、179份滇型恢复系材料，按常规方法的田间栽培管理模式种植(栽插规格为148.8cm×154cm，每行10苗，单本栽插)。待移栽15-40天后，取叶片提取DNA，测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul，然后PCR扩增，最后用银染法检测鉴定。
实施例一
移栽15天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述：
反应液组成：ddH2O6ul、10×buffer2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 1ul、Taq酶0.5U，总体积17ul
扩增程序：93℃4min；
          93℃1min、50℃1min、68℃1min，35个循环；
          72℃4min
试验结果见表1。
             表1黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率
                   OSR33                            RM228
  相关关系及T测验   分子鉴定准确率         相关关系及T测验       分子鉴定准确率
与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％) 与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)
  0.8613※※   22.41   95.32   94.88   0.8102※※   17.61   91.45   92.06
                                                                   T0.05值为1.96，T0.01值为2.63
实施例二
移栽30天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述：
反应液组成：ddH2O 8ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 2ul、Taq酶0.5U，总体积20ul
扩增程序：94℃4min；
          94℃1min、55℃1min、72℃1min，35个循环；
          72℃4min试验结果见表2。
               表2黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率
                       OSR33                            RM228
  相关关系及T测验   分子鉴定准确率       相关关系及T测验      分子鉴定准确率
与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％) 与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)
  0.8913※※   24.41   96.32   96.18   0.8302※※   19.71   92.45   92.36
                                                                T0.05值为1.96，T0.01值为2.63
实施例三
移栽40天后取叶片提DNA，PCR反应液组成及扩增程序如下所述：
反应液组成：ddH2O 12ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 3ul、Taq酶1.5U，总体积25ul
扩增程序：95℃4min；
          95℃1min、60℃1min、75℃1min，35个循环；
          72℃4min
试验结果见表3。
           表3黑染花粉率与群体标记基因型间的相关关系及分子鉴定准确率
                      OSR33                          RM228
  相关关系及T测验     分子鉴定准确率          相关关系及T测验     分子鉴定准确率
与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％) 与黑染花粉率的相关系数(r) T值   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)   分子鉴定非恢复系材料的准确率(％)
  0.8513※※   22.41   94.32   94.18   0.7982※※   17.71   90.45   89.88
                                                            T0.05值为1.96，T0.01值为2.63
表4是分子鉴定方法与常规方法比较。
                                     表4不同鉴定方法的比较
                          OSR33                     RM228 鉴定所需时间及成本
与黑染花粉率相关系数(r) T值   非恢复系材料的准确率(％) 恢复系材料的准确率(％) 与黑染花粉率相关系数(r) T值   非恢复系材料的准确率(％) 恢复系材料的准确率(％)
例一 0.8613※※ 22.41 95.32 94.88 0.8102※※ 17.61 91.45 92.06   6.54元/样60天
例二 0.8913※※ 24.41 96.32 96.18 0.8302※※ 19.71 92.45 92.36   6.67元/样75天
例三 0.8513※※ 22.41 94.32 94.18 0.7982※※ 17.71 90.45 89.88   6.76元/样85天
常规 0.7913※※ 16.41 89.32 81.18   6.72元/样2年
                                                                          T0.05值为1.96，T0.01值为2.63
由表1～表4可看出，用微卫星标记OSR33、RM228鉴别106份不能作滇型恢复系的材料及179份滇型恢复系材料时，两个微标记基因型值分别与测交F1黑染花粉率呈极显著的正相关，且均比常规方法鉴定的准确率高，准确率为90％以上，其能准确鉴别材料有无恢复基因，材料能否作滇型恢复系，可用于滇型杂交粳稻恢复系的分子辅助选择。就两个微卫星标记而言，OSR33鉴别的准确性较RM228高。分子技术鉴定与用常规方法鉴定的成本基本相同，但可明显缩短育种进程(表4)。三个实施例案相比而言，例二的结果最好。

Claims (2)

1一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，保持目前粳稻恢复系选育的田间栽培方式，种植材料之间的株距、行距和密度、田间的栽培管理、种子的繁殖方法均与常规方法相同，其步骤是：
1)将待鉴定材料播种及移栽种植；
2)移栽15-40天取叶片，提取水稻总DNA；
3)测定样品DNA浓度并将DNA定量稀释为25ng/ul；
4)然后用位于水稻第10染色体的且与滇型恢复基因紧密连锁的微卫星标记OSR33、RM228作引物，进行PCR反应；
5)聚丙烯酰胺凝胶电泳；
6)银染法检测PCR产物及电泳结果；
7)用微卫星标记OSR33、RM228作引物时，含恢复基因，可作恢复系材料的PCR产物的分子量分别是320bp，250bp；不能作滇型杂交稻恢复系的材料，其PCR产物的分子量为330bp、270bp，由此鉴定待测材料有无恢复基因，能否作滇型杂交稻的恢复系。
2根据权利要求1所述的一种滇型杂交稻恢复系分子辅助选择的方法，其特征是：用微卫星标记OSR33或RM228作引物，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序如下所述：
反应液组成：ddH2O 6-10ul、10×buffer 2ul、MgCl2(25mM)2ul，dNTP(2.5umol/L)2ul、引物(2umol/L)各2ul，模板DNA 1-3ul、Taq酶0.5-1.5U，总体积18-25ul
扩增程序：93-95℃4min；
93-95℃1min、50-60℃1min、68-75℃1min，35个循环；
72℃4min。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101709330B (zh) * 2009-11-26 2012-02-01 云南农业大学 一种粳稻不育系混杂含恢复基因可育株分子鉴别的方法
CN103740838A (zh) * 2014-01-18 2014-04-23 浙江农科种业有限公司 籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法
CN107871039A (zh) * 2017-11-06 2018-04-03 浙江工业大学 一种基于虚拟模型的水稻株距优化方法

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