CN116516046A - 水稻耐盐相关qtl定位及其分子标记的开发应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种水稻耐盐相关分子标记开发及应用。其位于水稻7号染色体的GWAS信号位点，与该位点紧密连锁的SNP为m7_1993，位于水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位，多态位点为G/A。利用该分子标记从水稻自然资源中快速筛选该位点AA基因型水稻品种，作为后期田间水稻耐盐性目标品种，减少田间试验工作量。在育种中，通过杂交将AA基因型导入GG基因型受体品种，利用该分子标记从分离群体鉴定AA基因型个体，结合农艺性状评价，加快耐盐分子标记育种进程。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种水稻耐盐相关分子标记开发及应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，提高水稻产量对于保证我国粮食安全具有重大意义。我国耕地占世界的10％，人口却占世界的22％，所以解决吃饭问题是我国的头等大事。然而水稻产量却经常受病虫害、高温、高盐等胁迫的威胁，导致减产甚至绝收。我国受盐渍化威胁的土地面积占总耕地面积的20％，为保证我国人民粮食产量基本满足需要，在广大面积的盐碱地中种植作物是一个具有潜在价值的重要途径。同多数作物相同，水稻对盐胁迫敏感，严重制约滨海、东北及河套地区稻作区的水稻产量。因而，培育高产、优质、耐盐水稻新品种是我国当前水稻生产急需应对的重大问题。
传统育种方法培育耐盐水稻新品种面临周期长、成本高、基因资源有限等限制因素。现代生物技术是改良作物性状的重要手段，但是因为植物耐盐性是受微效多基因控制的性状，目前仍然缺乏具有重要育种价值的水稻耐盐相关基因资源。水稻自然种质资源因其遗传多样性丰富，通过关联分析鉴定耐盐相关有利等位基因，将为利用现代生物技术培育耐盐水稻新品种提供理论依据和育种材料。
因为易于实验室内操作水稻耐盐相关位点的定位主要集中于苗期耐盐性状的鉴定，但是对于农业生产而言，成熟期性状与产量更为密切，但是目前缺乏与盐胁迫下水稻产量相关的基因资源。
发明内容
本发明的目的是公布全基因组关联分析鉴定出一个与水稻盐胁迫下产量相关位点，并开发出其分子标记，用于耐盐水稻新品系的筛选。
因此，本发明提一种水稻耐盐相关分子标记，其位于水稻7号染色体的GWAS信号位点，与该位点紧密连锁的SNP为m7_1993，位于水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位，多态位点为G/A。
本发明还提供一种鉴定水稻耐盐相关分子标记的方法，该方法检测所述的水稻耐盐相关分子标记的多态性，即水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位为G基因型或A基因型。
所述的方法，其中所述检测采用PCR扩增来进行。
所述的方法，所述PCR为KASP技术。
所述的方法，PCR扩增采用的引物如下：
SNP_G 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTagagtcttgccacttgcctcttG-3’；
SNP_A 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTagagtcttgccacttgcctcttA-3’；
Common 5’-acccctagatatgttgcacattgc-3’。
上述的方法，是利用所述引物及KASP Master Mix，以水稻基因组DNA为模板，采用KASP进行实时定量荧光PCR仪上开展PCR扩增，荧光检测和数据分析。
所述的方法，PCR程序为：94℃15分钟；94℃20秒，60℃60秒，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃20秒，55℃60秒，30个循环；反应完成后读取FAM和HEX通道荧光信号，FAM信号对应G基因型，HEX信号对应A基因型。
同时，本发明还提供所述的水稻耐盐相关分子标记或所述的方法在水稻育种中的应用。
所述的应用，其中，所述育种是培育或筛选耐盐的目的水稻品种；所述标记用于分子标记辅助选择。
所述的应用，所述目的水稻品种为AA基因型。
本发明具有以下有益效果：
可以利用该分子标记从水稻自然资源中快速筛选该位点AA基因型水稻品种，作为后期田间水稻耐盐性目标品种，减少田间试验工作量。在育种中，通过杂交将AA基因型导入GG基因型受体品种，利用该分子标记从分离群体鉴定AA基因型个体，结合农艺性状评价，加快耐盐分子标记育种进程。
附图说明
图1.盐胁迫下水稻产量GWAS结果。其中，水平虚线表示显著性阈值p＝10-5，箭头位置表示SNP分子标记m7_1993的位置。
图2.0.3％盐胁迫下不同基因型水稻的单株产量。其中，图中每个点代表一个品种，以t检验作组间比较。
图3.杂交群体子代中SNP分子标记m7_1993检测的不同基因型盐胁迫下单株产量比较。其中，图中每个点代表一个重组自交系，以t检验作组间比较。
具体实施方式
实施例1：水稻耐盐相关QTL的定位
水稻田间耐盐性评价：首先选取包含世界主要水稻产产区和我国水稻主产区500余份代表性水稻自然种质资源，开展田间水稻耐盐性鉴定，方法简述如下：水稻种子常温下浸种1天后，播种于苗床，覆塑料薄膜保温保湿。于4周苗龄时单株插秧，株距15cm，行距25cm。插秧缓苗15天后，灌溉含盐0.3％的盐水，直到成熟。期间不断测定稻田中含盐量，通过调整所灌溉盐水浓度使稻田中盐浓度保持在0.3-0.4％。成熟后单株收获，晒干，脱粒，称重，每个品种10个重复，最后计算产量平均值。
水稻基因型鉴定：通过二代高通量测序方法鉴定水稻基因型，过程如下。Illumina二代测序平台获得测序数据Fastq文件，利用BWA比对到水稻参考基因组IRGSP1.0，按照GATK流程分析SNP/Indel，从而获得水稻SNP/Indel变异位点相关数据。
水稻耐盐相关位点全基因组关联分析(GWAS)：上述水稻SNP/Indel变异位点相关数据经质量过滤、缺失值插补后，结合盐胁迫下水稻产量表型数据，以GEMMA混合线性模型开展关联分析，在7号染色体上发现GWAS信号位点，与该位点紧密连锁的SNP为m7_1993，如图1所示。
实施例2：分子标记PCR鉴定引物开发
SNP分子标记m7_1993位于水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位，多态位点为G/A。从基因组组获取其300bp侧翼序列(序列表SEQ ID No.1)。序列如下：
SEQ1,分子标记m7_1993侧翼300bp序列
TTGTGAATACATATATTTAACACATGAACTCACTCGTTATTGTATCAACAAAGGCAAAAATTGCTATGGGATACCCAAAATACATGGTCTTTGTAGGAGTCATGAGGACATTGCAATAACATGGCTTTGCCCGTGGACACCCTAAAAATATTCACTTTTAGAGAGAGAAATTTCACAAAATGACTGTTTTGCCCATAGAATCAAACTTCTTTGCCACTAGATGTGCTTACTCCCTCTGAAGAGATGTGACCAACTATAACCCGGCGGCCACATCAGGCAGAGTCTTGCCACTTGCCTCTT[G/A]GGTTCAAGAAAGTGTGCAATGTGCAACATATCTaggggtgaaaatggtcatttcgtaaaaatcctctctctagaacaaacaaaaatcataaaatattgcatgtggtatccttcaataaaaaactaaaattttagggcgttcatgggcaaagccacattcttgcgatgtcctctagcaaagatcaagttatttagtgtcttgtagaaatttttgccAAATTGGAGAAAAATTAGTTGACCAAGCTTTCACAAAGGAGTTAATGTGAtttttttGGAGACGATTAGGAATTGGATGTGTTCG
利用Primer3设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)引物如下：
SNP_G 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTagagtcttgccacttgcctcttG-3’；
SNP_A 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTagagtcttgccacttgcctcttA-3’；
Common 5’-acccctagatatgttgcacattgc-3’.
利用上述引物及KASP Master Mix，以下表中水稻叶片基因组DNA为模板，采用KASP技术在LGC SNPline平台，或ABI7500/7900等实时定量荧光PCR仪上开展PCR扩增及荧光检测和数据分析。PCR程序为：94℃15分钟；94℃20秒，60℃60秒，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃20秒，55℃60秒，30个循环。反应完成后读取FAM和HEX通道荧光信号，FAM信号对应G基因型，HEX信号对应A基因型。
以上述方法检测了23种水稻自然种质资源分子标记m7_1993基因型，结果如下表所示：
| 品种 | 基因型 |
| 辽盐241 | G |
| 辽盐2号 | G |
| 内香3B | A |
| 宁梗16 | G |
| 沈农9741 | G |
| 铁梗4号 | G |
| 盐梗16 | G |
| 盐梗188 | G |
| 盐梗48 | G |
| 中旱3号 | G |
| 广场13 | A |
| 广场矮 | A |
| 桂朝2号 | A |
| 桂阳矮47 | A |
| 华占 | A |
| 华占 | A |
| 黄华占 | A |
| 黄新占 | A |
| 盐3931 | A |
| 盐城156 | A |
| PiNo.4 | G |
| 台山糯 | A |
| 连粳4号 | G |
| 越光 | G |
| IR29 | A |
实施例3：利用分子标记对水稻自然资源开展基因型鉴定
采用实施例2中的方法我们利用分子标记m7_1993检测了180余种水稻自然种质资源的基因型，采用实施1中的方法鉴定了盐胁迫下水稻的产量，结果如图2所示。GG基因型水稻单株产量平均值为23g，AA基因型水稻单株产量27g，而GA杂合型平均产量25g。该结果中AA基因型显著高于GG基因型产量，表明AA为有利基因型，能够提高盐胁迫下水稻单株产量。
实施例4：分子标记辅助选择应用
为了验证SNP分子标记m7_1993是否可以用于辅助育种选择，我们将水稻品种越光(GG基因型)与IR29(AA基因型)杂交，F2群体单粒传代，获得重组自交系群体，然后按照实施例1的方法以0.3％盐水灌溉稻田鉴定水稻产量，并按照实施例2的方法用SNP分子标记m7_1993鉴定重组自交系基因型，结果如下表及图3所示。结果表明基因型AA比GG单株产量高3.1g，及杂合GA比GG单株产量高1.1g基因型。这表明在耐盐水稻选育中可以利用分子标记m7_1993作辅助选择，优先选择产量较高的AA基因型。
Claims (10)
1.一种水稻耐盐相关分子标记，其位于水稻7号染色体的GWAS信号位点，与该位点紧密连锁的SNP为m7_1993，位于水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位，多态位点为G/A。
2.一种鉴定水稻耐盐相关分子标记的方法，其特征在于，检测如权利要求1所述的水稻耐盐相关分子标记的多态性，即水稻参考基因组IRGSP1.0 7号染色体19,933,626位为G基因型或A基因型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测采用PCR扩增来进行。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR为KASP技术。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用的引物如下：
SNP_G 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTagagtcttgccacttgcctcttG-3’;
SNP_A 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTagagtcttgccacttgcctcttA-3’;
Common 5’-acccctagatatgttgcacattgc-3’。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述引物及KASP Master Mix，以水稻基因组DNA为模板，采用KASP进行实时定量荧光PCR仪上开展PCR扩增，荧光检测和数据分析。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR程序为：94 °C 15 分钟；94 °C 20 秒，60°C 60 秒，10 个循环，每个循环降低0.6 °C；94 °C 20 秒，55 °C 60 秒，30 个循环；反应完成后读取FAM和HEX通道荧光信号，FAM信号对应G基因型，HEX信号对应A基因型。
8.如权利要求1所述的水稻耐盐相关分子标记或如权利要求2至7任一项所述的方法在水稻育种中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述育种是培育或筛选耐盐的目的水稻品种；所述标记用于分子标记辅助选择。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的水稻品种为AA基因型。
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