CN110656198B

CN110656198B - 与小麦株高相关的kasp引物组及其应用

Info

Publication number: CN110656198B
Application number: CN201911006441.1A
Authority: CN
Inventors: 姜朋; 马鸿翔; 何漪; 张旭; 吴磊
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110656198A

Abstract

本发明提供一种与小麦株高相关的KASP引物组，涉及小麦育种领域；该KASP引物组包括：1)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性引物组；2)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的特异性引物组；结合使用该两组引物可初步区对小麦株高进行筛选，为筛选长江中下游冬麦区携带优异等位基因的小麦品种(材料)提供了方便，加快了育种进程。

Description

与小麦株高相关的KASP引物组及其应用

技术领域

本申请涉及小麦育种领域，特别是一种与小麦株高相关的KASP标记引物组及其应用。

背景技术

株高是小麦重要的农艺性状，影响植株的形态结构，并与田间群体产量密切相关。小麦矮秆基因的利用是绿色革命的重要组成部分，对现代小麦育种具有深远影响(参见文献：Hedden P.The Genes of the Green Revolution.Trends Genet,2003,19:5-9.)。经典遗传学研究表明，小麦株高是一个复杂性状，由多个基因控制，存在主效基因，也有微效位点。迄今为止，已有25个Rht基因被命名(参见文献：Mo Y,Vanzetti L S,Hale I,SpagnoloE J,Guidobaldi F,Al-Oboudi J,Odle N,Pearce S,Helguera M,DubcovskyJ.Identification and Characterization of Rht25,a Locus on Chromosome Arm 6asAffecting Wheat Plant Height,Heading Time,and Spike Development.Theor ApplGenet,2018,131:2021-2035；文献:Tian X,Wen W,Xie L,Fu L,Xu D,Fu C,Wang D,ChenX,Xia X,Chen Q,He Z,Cao S.Molecular Mapping of Reduced Plant Height GeneRht24 in Bread Wheat.Front Plant Sci,2017,8；文献：McIntosh R A,Dubcovsky J,Rogers W J,Morris C,Xia X C.Catalogue of gene symbols for wheat:2017supplement.https://shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/macgene/supplement2017.pdf.Accessed 17 Feb 2018)。位于4B和4D染色体上的Rht-B1和Rht-D1基因，以及2D染色体上的Rht8基因在世界范围内广为应用，其相关分子标记已成功开发(参见文献：Ellis M,Spielmeyer W,Gale K,Rebetzke G,Richards R."Perfect"Markers forthe Rht-B1b and Rht-D1b Dwarfing Genes in Wheat.Theor Appl Genet,2002,105:1038-1042；文献：Asplund L,Leino M W,Hagenblad J.Allelic Variation at the Rht8Locus in a 19th Century Wheat Collection.The Scientific World J,2012,2012:385610；)。此外，在小麦21条染色体上均检测到影响株高的QTL(参见文献：

A,Schumann E,Fürste A,

H,Leithold B,

S,Weber E.Mapping ofQuantitative Trait Loci Determining Agronomic Important Characters inHexaploid Wheat(Triticum Aestivum L.).Theor Appl Genet,2002,105:921-936；文献：Peng J,Yefim R,Tzion F,RiDer M S,Youchun L,Eviatar N,Abraham K.DomesticationQuantitative Trait Loci in Triticum Dicoccoides,the Progenitor of Wheat.PNatl Acad Sci USA,2003,100:2489-2494；文献：Liu G,Xu S B,Ni Z F,Xie C J,Qin DD,Li J,Lu L H,Zhang J P,Peng H R,Sun Q X.Molecular Dissection of Plant HeightQtls Using Recombinant Inbred Lines from Hybrids between Common Wheat(TriticumAestivumL.)and Spelt Wheat(Triticum SpeltaL.).Chin.Sci.Bull.,2011,56:1897-1903；文献：Griffiths S,Simmonds J,Leverington M,Wang Y,Fish L,SayersL,Alibert L,Orford S,Wingen L,Snape J.Meta-Qtl Analysis of the GeneticControl of Crop Height in Elite European Winter Wheat Germplasm.Mol Breeding,2012,29:159-171；文献：Tobias W,Langer S M,Longin C F H.Genetic Control ofPlant Height in European Winter Wheat Cultivars.Theor Appl Genet,2015,128:865-874)。McCartney等(参见文献：Mccartney C A,Somers D J,Humphreys D G,Lukow O,Ames N,Noll J,Cloutier S,Mccallum B D.Mapping Quantitative Trait LociControlling Agronomic Traits in the Spring Wheat Cross Rl4452x'ac Domain'.Genome,2005,48:870.)利用RL4452×’AC’Domain构建的DH群体对包括株高在内的多个农艺性状进行QTL分析，在2D、4B、4D、5B、7A和7B染色体检测到6个株高QTL，其中QHt.crc-4B和QHt.crc-4D的定位区间与Rht-B1和Rht-D1位置重合。Griffiths等(参见文献：GriffithsS,Simmonds J,Leverington M,Wang Y,Fish L,Sayers L,Alibert L,Orford S,WingenL,Herry L,Faure S,Laurie D,Bilham L,Snape J.Meta-Qtl Analysis of the GeneticControl of Ear Emergence in Elite European Winter Wheat Germplasm.Theor ApplGenet,2009,119:383-395.)利用四个DH群体进行了株高meta-QTL分析，在除3D、4A、5D及第7同源群的三条染色体上找到16个meta-QTL。Liu(参见文献：Liu G,Xu S B,Ni Z F,Xie CJ,Qin D D,Li J,Lu L H,Zhang J P,Peng H R,Sun Q X.Molecular Dissection ofPlant Height Qtls Using Recombinant Inbred Lines from Hybrids between CommonWheat(Triticum Aestivum L.)and Spelt Wheat(Triticum Spelta L.).Chin.Sci.Bull.,2011,56:1897-1903.)在5个生长阶段对小麦株高进行了跟踪调查，利用条件与非条件QTL作图方法进行分析，检测到8个条件QTL与9个非条件QTL。其中QHt-4B-2在两个时期被重复检测到，表型贡献率达13.42％-16.13％，此研究表明株高基因的表达具有一定的时空特异性。

分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可以在苗期进行选择，降低表型评价的成本，提高小麦育种效率。单核苷酸多态性(SNP)标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析，目前市场中已存在多种适用于不同动植物的SNP芯片，在遗传研究中发挥着越来越重要的作用。通过遗传分析找到重要性状的标记位点后，需要将其转化为易用的分子标记。KompetitiveAllele Specific PCR(KASP)标记技术通过荧光探针，可以将SNP标记的不同等位变异区分，并且KASP技术通量高、快速、稳定，是一种较为理想的分子标记。

长江中下游冬麦区(参见文献：程顺和,郭文善,王龙俊.中国南方小麦.南京:江苏科学技术出版社,2012.p26)是我国第二大麦区，同时也是我国最大的弱筋小麦产区，是我国小麦生产的重要组成部分。宁麦9号与扬麦158分别是由江苏省农业科学院与江苏里下河地区农科所育成的高产优质抗病小麦品种，都曾经是生产上的主栽品种，具有较大的推广面积，而且目前仍是重要的骨干亲本，以此为基础育成了数十个小麦品种(参见文献：张晓,张伯桥,江伟,吕国锋,张晓祥,李曼,高德荣.扬麦系列品种品质性状相关基因的分子检测.中国农业科学,2015,48:3779-3793；文献：Jiang P,Zhang P P,Zhang X,Ma H X.GeneticContribution of Ningmai 9 Wheat to Its Derivatives Evaluated by Using SnpMarkers.Int J Genomics,2016,2016:3602986)。宁麦9号的衍生品种宁麦13、扬辐麦4号等，扬麦158的衍生品种扬麦20等均已成为当前生产中的主栽品种及常用亲本。据统计，近3年长江中下游冬麦区通过审定的小麦品种中，发现超过80％的品种是宁麦9号或扬麦158的衍生后代，其遗传信息广泛分布于该麦区的小麦材料中，挖掘其重要性状的遗传控制位点对本麦区的育种工作具有重要意义。在生产中，宁麦9号株高一般在80-85cm，扬麦158约为90-95cm，呈现较大差异，目前尚无对二者株高控制位点的系统研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明，利用illumina 90k小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到宁麦9号和扬麦158中2个与株高相关的位点Qph-2D与Qph-5A，并据此开发两个KASP标记引物，用以对长江中下游冬麦区种植小麦株高进行高效筛选，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明首先提供了与小麦株高相关的KASP引物组，该引物组包括以下两组KPSP引物：

1)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性KASP引物组，该组KASP引物可特异性的检测标记IACX9152；

2)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的特异性引物组，该组KASP引物可特异性的检测标记BobWhite_c1796_701。

其次，本发明还提供了上述小麦株高相关的KASP引物组在检测小麦株高中的应用。具体而言，该应用的具体检测步骤如下：

5)提取样品小麦DNA。

该提取步骤为本领域常规方法，可以通过本领域常规DNA提取方法由样品小麦中提取，或者使用DNA提取试剂盒由样品小麦中提取；

6)利用IACX9152引物组对样品小麦进行PCR扩增，PCR扩增同时加入宁麦9号与扬麦158的DNA作为对照，若样品小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有IACX9152引物组的非优势等位变异基因型C，如与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有IACX9152引物组的优势等位变异基因型T；

所述IACX9152引物组包括IACX9152_F1、IACX9152_F2以及KASP通用引物IACX9152_R；引物IACX9152_F1的核苷酸序列与SEQ ID NO.1一致，并在SEQ ID NO.1序列前部(5’端)连接可与FAM荧光基团结合的特异性序列SEQ ID NO.7(即引物IACX9152_F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)；引物IACX9152_F2的核苷酸序列与SEQ ID NO.2一致，并在SEQ ID NO.2序列前部(5’端)连接能够与HEX荧光基团结合的特异性序列SEQ ID NO.8(即引物IACX9152_F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；引物IACX9152_R的核苷酸序列与SEQ ID NO.3一致。

7)利用BobWhite_c1796_701引物组对样品小麦进行PCR扩增，PCR扩增同时加入宁麦9号与扬麦158的DNA作为对照，若样品小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有BobWhite_c1796_701引物组的非优势等位变异基因型G，如与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有BobWhite_c1796_701引物组的优势等位变异基因型T；

所述BobWhite_c1796_701引物组包括BobWhite_c1796_701_F1、BobWhite_c1796_701_F2以及KASP通用引物BobWhite_c1796_701_R；引物BobWhite_c1796_701_F1的核苷酸序列与SEQ ID NO.4一致，并于SEQ ID NO.4序列前部(5’端)连接可与FAM荧光基团结合的特异性序列SEQ ID NO.7(即引物BobWhite_c1796_701_F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)；引物BobWhite_c1796_701_F2的核苷酸序列与SEQ ID NO.5一致，并于SEQ ID NO.5序列前部(5’端)连接能够与HEX荧光基团结合的特异性序列SEQ ID NO.8(即引物BobWhite_c1796_701_F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)；引物BobWhite_c1796_701_R的核苷酸序列与SEQ ID NO.6一致。

8)若步骤2)和步骤3)的PCR检测的样品小麦的对应基因型均为T(优势等位变异)，则认为该样品小麦株高显著低于对应基因型为C或G的小麦；

进一步而言，上述样品小麦优选长江中下游冬麦区种植的小麦。

进一步而言，上述步骤2)所述PCR检测是指：反应总体系为5μL，包含2×KASPMaster Mix 2.5μL、KASP Assay Mix1 0.07μL、浓度为20ng μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43μL；其中，每100μL KASP Assay Mix1包含：浓度为100μM的IACX9152_F1 12μL，浓度为100μM的IACX9152_F2 12μL，浓度为100μM的IACX9152_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；

反应程序为，第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，共进行26个循环。

进一步而言，上述步骤3)所述PCR检测是指：反应总体系为5μL，包含2×KASPMaster Mix 2.5μL、KASP Assay Mix2 0.07μL、浓度为20ng μL^-1的样品小麦模板DNA2.43μL；其中，每100μL KASP Assay Mix2包含：浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F1 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F2 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_R30μL，ddH₂O补足至100μL；

第三，本发明还提供了一种用于检测小麦株高的试剂盒，所述试剂盒包括：

3)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.3所示的特异性引物IACX9152_F1、IACX9152_F2以及KASP通用引物IACX9152_R；

4)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.6所示的特异性引物BobWhite_c1796_701_F1、BobWhite_c1796_701_F2以及KASP通用引物BobWhite_c1796_701_R。

进一步而言，上述试剂盒成分优选包括；

1)2×KASP Master Mix 2.5μL、KASP Assay Mix1 0.07μL、浓度为20ng μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43μL；

其中，每100μL KASP Assay Mix1包含浓度为100μM的IACX9152_F1 12μL，浓度为100μM的IACX9152_F2 12μL，浓度为100μM的IACX9152_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；

2)2×KASP Master Mix 2.5μL、KASP Assay Mix2 0.07μL、浓度为20ng μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43μL；

其中，每100μL KASP Assay Mi2x包含浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F1 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F2 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_R30μL，ddH₂O补足至100μL。

本申请通过QTL作图检测到2个与株高相关的位点Qph-2D与Qph-5A，Qph-2D位于2D染色体短臂中部，与位于2D染色体短臂末端的Rht8相距较远；通过物理位置比对，同位于5A染色体长臂的Qph-5A与Rht9至少相距100Mb。因此，Qph-2D与Qph-5A为不同于之前报道的株高控制位点，申请人将该2个标记转化为2个KASP标记，经验证结合这两个标记可初步区对小麦株高进行筛选，为筛选长江中下游冬麦区携带优异等位基因的小麦品种(材料)提供了方便，加快了育种进程。

附图说明

图1为实施例2KASP验证试验标记扩增检测结果示意图；

图2为实施例2KASP标记应用试验扩增检测结果示意图。

具体实施方式

以下实施例所涉及的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：aacagagtctcaGtctctccA；

SEQ ID NO.2：aacagagtctcaGtctctccG；

SEQ ID NO.3：gcctgtCattctcttttcctAtCtT；

SEQ ID NO.4：ggccccggatccaaaatcT；

SEQ ID NO.5：ggccccggatccaaaatcG；

SEQ ID NO.6：Acggagcaaagtggtcttgt；

SEQ ID NO.7：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

SEQ ID NO.8：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；

SEQ ID NO.9：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTaacagagtctcaGtctctccA；

SEQ ID NO.10：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTaacagagtctcaGtctctccG；

SEQ ID NO.11：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTggccccggatccaaaatcT；

SEQ ID NO.12：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTggccccggatccaaaatcG。

实施例1筛选SNP位点

本实施例以282份来源于“宁麦9号×扬麦158”的重组自交系(F_2:8)为材料，2016-2017、2017-2018和2018-2019连续3个生长季将RIL群体及其亲本种植于江苏省农业科学院六合基地。采用随机区组设计，单行种植，每行60粒，行长1.6m，行距0.25m，两次重复，常规田间管理。小麦成熟后，每行随机抽取10株调查株高，从茎基部到小麦穗部顶端的距离(不包括芒长)，取10株平均值。

采用CTAB法提取基因组DNA，利用illumina 90k芯片获取基因型，并构建遗传图谱。遗传图谱覆盖21条染色体，包含41个连锁群，2285个bin标记，总长为3022cM。采用IciMapping 4.1软件的完备区间作图法(inclusive composite interval mapping，ICIM)进行QTL定位，walking step设为0.1cM，LOD阈值设为2.5。

本实施例中所述CTAB法为本领域常规技术，可参见文献“He X,Lillemo M,Shi J,Wu J,

Belova T,Dreisigacker S,Duveiller E,Singh P.QtlCharacterization of Fusarium Head Blight Resistance in Cimmyt Bread WheatLine Soru#1.Plos One,2016,11:e0158052.”中公开的方法，或者也可以使用市售DNA提取试剂盒提取基因组DNA。上述ICIM法同样为本领域常规技术，可参见文献“Li H,Ye G,WangJ.A Modified Algorithm for the Improvement of Composite IntervalMapping.Genetics,2007,175:361-374.”中公开的作图法。

获得两个相对稳定的株高控制位点Qph-2D与Qph-5A，对应染色体区间分别为BS00022211_51～RAC875_c173_905与wsnp_Ex_c12440_19836844～Ex_c6161_335，两个QTL均在2017与2019两个环境中检测到，未在2018环境中检测到。

进一步从两个QTL区间中依据标记同源性初步筛选SNP标记，选择两个区间中同源性较低的SNP标记进行KASP标记转化，最终成功将IACX9152与BobWhite_c1796_701两个标记转化为KASP标记(表1)，其对应变异位点分别为T/C与T/G。就小麦育种来说，一般降低株高为优势等位变异，这两个位点的优势等位变异均为T，分别来源于宁麦9号与扬麦158，非优势等位变异为C和G。

利用Polymarker(http://www.polymarker.info/)进行KASP引物设计(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 KASP引物组

根据SNP位点和侧翼序列设计PCR扩增引物，开发KASP分子标记。每个标记设计2条SNP特异性引物(F1/F2)和一条通用引物(R)，F1前部(5’端)添加能够与FAM荧光结合的特异性序列SEQ ID NO.7，F2前部(5’端)添加能够与HEX荧光结合的特异性序列SEQ ID NO.8。

具体而言，标记IACX9152 KASP特异性引物IACX9152_F1、IACX9152_F2以及KASP通用引物IACX9152_R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.3所示；标记BobWhite_c1796_701 KASP特异性引物BobWhite_c1796_701_F1、BobWhite_c1796_701_F2以及KASP通用引物BobWhite_c1796_701_R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.6所示。

KASP反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix(LGC Genomics,Beverly,USA)2.5μL、KASP Assay Mix1或KASP Assay Mix2 0.07μL、浓度为20ng μL^-1的模板DNA 2.43μL；

其中，每100μL KASP Assay Mix1针对IACX9152位点检测，包含：浓度为100μM的IACX9152_F1 12μL，浓度为100μM的IACX9152_F2 12μL，浓度为100μM的IACX9152_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；KASP Assay Mix2针对BobWhite_c1796_701位点进行检测，包括：浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F1 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_F2 12μL，浓度为100μM的BobWhite_c1796_701_R 30μL，ddH₂O补足至100μL。

KASP反应程序为，第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，共进行26个循环。

在进行上述KASP样品检测时，同时加入宁麦9号与扬麦158的DNA作为对照。

本实施例中，PCR在购买自LGC公司型号为Hydrocycler 16的水浴PCR仪中进行，通过KASP荧光分析仪(LGC公司型号为PHERAstar plus)扫描分析PCR结果。

判定基因型:若针对IACX9152位点的待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则该位点的基因型为C(非优势等位变异)，如显示与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则该位点的基因型为T(优势等位变异)；若针对BobWhite_c1796_701_R位点的待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则该位点的基因型为G(非优势等位变异)，如显示与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则该位点的基因型为T(优势等位变异)。

实施例2 SNP位点验证及应用

1、验证试验步骤如下：

从实施例1中的重组自交系群体中随机选取46份按实施例1方法进行KASP标记扩增检测，检测结果如图1所示。其中，图1(a)为IACX9152位点基因型检测结果，图1(b)为BobWhite_c1796_701位点基因型检测结果，图1中，黑点为水(空白对照)。图1显示分型结果良好，并且与实施例1中的illumina 90k芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测。

2、KASP引物组的应用

从2019国家及江苏省区域试验

(https://www.natesc.org.cn/Html/2018_10_30/28216_28782_2018_10_30_ 455974.html与

http://www.jsseed.cn/pinzhongguanli/tongzhigonggaot6drahf/2349.html,)中随机选取101份品种材料，在其成熟期每行随机抽取10株调查株高，从茎基部到小麦穗部顶端的距离(不包括芒长)，取10株平均值。

利用实施例1获得的KASP引物组对这101份材料进行基因分型(检测结果见图2及表2所示)，图2中，图2(a)为IACX9152位点基因型检测结果，图2(b)为BobWhite_c1796_701位点基因型检测结果。同时结合表型鉴定数据进行统计分析(t检验)，统计软件采用SPSS19.0，结果如表3所示。

表2随机抽样检测结果

表3统计分析结果

^*表示0.05显著水平。

以上实施例表明，当单独使用1个标记时，IACX9152与BobWhite_c1796_701分别产生1.84cm、1.32cm的平均组间差异，IACX9152对株高有显著影响，BobWhite_c1796_701对株高的影响未达显著水平。当聚合IACX9152与BobWhite_c1796_701两个标记时，携带优势等位变异的材料的株高较携带非优势等位变异的材料低4.03cm，差异达到显著水平。

以上实施例表明，通过利用标记IACX9152和标记BobWhite_c1796_701的KASP引物检测，可以用于预测小麦的株高，同时携带两个位点优势等位变异的样品小麦株高显著低于携带非优势等位变异的样品小麦，故可将该两个位点的SNP变异同时应用于小麦育种株高筛选中，在种子阶段即可筛选适宜株高的材料，缩短育种时间，提高筛选效率。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与小麦株高相关的KASP引物组及其应用

<141> 2019-10-22

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacagagtct cagtctctcc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacagagtct cagtctctcc g 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctgtcatt ctcttttcct atctt 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccccggat ccaaaatct 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggccccggat ccaaaatcg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acggagcaaa gtggtcttgt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc taacagagtc tcagtctctc ca 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat taacagagtc tcagtctctc cg 42

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtgacc aagttcatgc tggccccgga tccaaaatct 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaggtcgga gtcaacggat tggccccgga tccaaaatcg 40

Claims

1.与小麦株高相关的KASP引物组，其特征在于，所述引物组包括以下两组KASP引物：

1）核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.3所示的特异性引物组；

2）核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.6所示的特异性引物组。

2.如权利要求1所述与小麦株高相关的KASP引物组在检测小麦株高中的应用，具体步骤如下：

1)提取样品小麦DNA；

2)利用IACX9152引物组对样品小麦进行PCR扩增，PCR扩增同时加入宁麦9号与扬麦158的DNA作为对照，若样品小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有IACX9152引物组的非优势等位变异基因型C，如与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有IACX9152引物组的优势等位变异基因型T；

所述IACX9152引物组包括IACX9152_F1 、IACX9152_F2 以及KASP通用引物IACX9152_R；引物IACX9152_F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；引物IACX9152_F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的；引物IACX9152_R的核苷酸序列与SEQ ID NO.3一致；

3)利用BobWhite_c1796_701引物组对样品小麦进行PCR扩增，PCR扩增同时加入宁麦9号与扬麦158的DNA作为对照，若样品小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KASP荧光分析仪分析显示与宁麦9号荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有BobWhite_c1796_701引物组的非优势等位变异基因型G，如与扬麦158荧光信号数据聚集在一起，则说明样品小麦具有BobWhite_c1796_701引物组的优势等位变异基因型T；

所述BobWhite_c1796_701引物组包括BobWhite_c1796_701_F1 、BobWhite_c1796_701_F2 以及KASP通用引物BobWhite_c1796_701_R；引物BobWhite_c1796_701_F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；引物BobWhite_c1796_701_F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；引物BobWhite_c1796_701_R的核苷酸序列与SEQ ID NO.6一致；

4)若步骤2）和步骤3）的PCR检测的样品小麦的对应基因型均为T，则认为该样品小麦株高显著低于对应基因型为C或G的小麦；

所述小麦样品为宁麦9号与扬麦158的杂交后代。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：

步骤2）中PCR检测是指：反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASPAssay Mix1 0.07 μL、浓度为20 ng·μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43 μL；其中，每100μLKASP Assay Mix1包含：浓度为100μM 的IACX9152_F1 12μL，浓度为100μM 的IACX9152_F212μL，浓度为100μM 的IACX9152_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；

反应程序为，第一步：94℃，15 min；第二步：94℃，20 s，61~55℃，1 min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20 s，55℃，1 min，共进行26个循环；

步骤3）中PCR检测是指：反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASPAssay Mix2 0.07 μL、浓度为20 ng·μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43 μL；其中，每100μLKASP Assay Mix2包含：浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_F1 12μL，浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_F2 12μL，浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；

反应程序为，第一步：94℃，15 min；第二步：94℃，20 s，61~55℃，1 min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20 s，55℃，1 min，共进行26个循环。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述小麦为长江中下游冬麦区种植的小麦。

5.一种用于检测小麦株高的试剂盒，所述试剂盒包括以下两组引物：

核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.3所示的特异性引物IACX9152_F1 、IACX9152_F2 以及KASP通用引物IACX9152_R；

核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.6所示的特异性引物BobWhite_c1796_701_F1 、BobWhite_c1796_701_F2 以及KASP通用引物BobWhite_c1796_701_R。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

1）2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix1 0.07 μL、浓度为20 ng·μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43 μL；

其中，每100μL KASP Assay Mix1包含浓度为100μM 的IACX9152_F1 12μL，浓度为100μM 的IACX9152_F2 12μL，浓度为100μM 的IACX9152_R 30μL，ddH₂O补足至100μL；

2）2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix2 0.07 μL、浓度为20 ng·μL^-1的样品小麦模板DNA 2.43 μL；

其中，每100μL KASP Assay Mix2包含浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_F1 12μL，浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_F2 12μL，浓度为100μM 的BobWhite_c1796_701_R30μL，ddH₂O补足至100μL。