CN114410827B - 一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与应用 - Google Patents

一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与应用，属于水稻遗传育种领域；本申请首次发现并验证了调控淀粉粘滞特性的新等位基因型RAmy1AA，其核苷酸序列第54bp处具有显著的SNP位点A/C，携带RAmy1AA等位基因型的水稻的粘滞特性(PKV值)与食味值高于携带RAmy1AC等位基因型的水稻品种；本申请根据该SNP位点设计KASP引物组，能够应用于鉴别水稻品种是否含有RAmy1AA等位基因，可应用于筛选粘滞特性较好的水稻品种，提高食味品质；本申请提供KASP引物组具有准确性高、简单快捷等优点，在改良稻米粘滞特性与食味品质的辅助育种中具有重要的应用价值。

Description

一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与应用
技术领域
本发明属于水稻遗传育种领域，涉及水稻RAmy1A新等位基因型以及其KASP分子标记引物组与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。近年来，随着生活水平的提高，人们的消费观也正从“吃的饱”向“吃的好”改变，具有优良食味品质的稻米越来越受到消费市场的重视(“2021.2020年我国水稻产业形势分析及2021年展望[J]”.徐春春等，中国稻米,27(02):1-4.)。食味品质主要是指米饭的外观、香味、口感等，通常用直链淀粉含量(Amylosecontent,AC)、糊化温度(Gel Latinization temperature,GT)、胶稠度、粘滞特性和食味值来表示(Zhou H,Xia D,Zhao D,Li Y,Li P,et al.“The origin of Wxla provides newinsights into the improvement of grain quality in rice”.Journal ofIntegrative Plant Biology,DOI:10.1111/jipb.13011.2020)。
稻米淀粉的粘滞特性指稻米淀粉在加热糊化过程中的粘度变化，与稻米的食味品质密切相关，可以用快速粘度分析仪(Rapid visco analyzer,RVA)测定，经过分析可以得到热浆粘度(HPV)、峰值粘度(PKV)、冷胶粘度(CPV)、消减值(SBV)、崩解值(BDV)和回复值(CSV)共6个主要特征值。RVA特征值与稻米的食味品质呈现显著相关性，RVA特征值可以综合反映稻米的食味品质、直链淀粉含量和胶稠度等特性，前人研究表明PKV和BDV值与食味品质呈现显著正相关，而SBV和CSV与食味品质呈现显著负相关(“稻米淀粉RVA谱特征与品质性状相关性研究.”中国农业科学,38(4):657-663,2005；Pang Y,Ali J,Wang X,FranjeNJ,Revilleza JE,et al.2016.Relationship of rice grain amylose,gelatinizationtemperature and pasting properties for breeding better eating and cookingquality of rice varieties.Plos One,11(12):e0168483；Balet S,Guelpa A,Fox G,Manley M.2019.Rapid Visco Analyser(RVA)as a Tool for Measuring Starch-RelatedPhysiochemical Properties in Cereals:a Review.Food Analytical Methods,12:2344–2360.)。稻米淀粉的粘滞特性受到多种因素的调控，PKV、HPV和CPV均受到一个主效基因即颗粒结合型淀粉合成酶基因Wx的调控，直链淀粉含量(AC)会显著影响淀粉的粘滞特性，同时QTL定位结果显示SSIIIb、GBSSII、ISA1等淀粉合成相关基因可能与RVA谱密切相关(Bao JS.2012.Toward understanding the genetic and molecular bases of theeating and cooking qualities of rice.Cereal Foods World,57(4):148–156.；TongC,Chen Y,Tang F,Huang Y,Chen H,et al.2014.Genetic diversity of amylosecontent and RVA pasting parameters in 20rice accessions grown in Hainan,China.Food Chemistry,161:239–245.；Chen Z,Lu Y,Feng L,Hao W,Li C,etal.2020.Genetic Dissection and Functional Differentiation of ALKa and ALKb,Two Natural Alleles of the ALK/SSIIa Gene,Responding to Low GelatinizationTemperature in Rice.Rice,13(1).)。总体而言，影响粘滞特性的因素研究较多，但是其直接调控基因研究仍然较少，在育种上的应用也不成熟，因此挖掘调控稻米粘滞特性的新基因、深入理解水稻淀粉粘滞特性的调控机制兵培育优质食味新品种已成为水稻育种中亟待解决的技术难题。
α-淀粉酶是调节水稻生长和生命周期中的关键酶，在种子成熟过程中可以调节淀粉粒的形成；在种子萌发过程中可以分解淀粉粒来为萌发过程提供营养物质(Damaris RN,Lin Z,Yang P,He D.2019.The Rice Alpha-Amylase,Conserved Regulator of SeedMaturation and Germination.International Journal of Molecular Sciences,20(2):450.)。α-淀粉酶可以通过随机水解α-1,4糖苷键来降解淀粉，从而减小淀粉分子的大小并降低淀粉悬浮液的粘度(Van SB,Pareyt B,Brijs K,Delcour JA.2013.Combined impactofBacillus stearothermophilus maltogenic alpha-amylase and surfactants onstarch pasting and gelation properties.Food Chemistry,139:1113-1120.)。
在水稻中存在约10个α-淀粉酶基因，根据其同源性可以分为RAmy1，RAmy2，RAmy3三个家族，这些基因的功能、表达模式等也存在一定的差异(Huang N,Sutliff TD,LittsJC,Rodriguez RL.1990.Classification and characterization of the rice alpha-amylase multigene family.Plant Molecular Biology,14:655-668.8.；Liao DQ,ZhangHL,Li ZC,John B.2010.Characterization of Evolution and Tissue-Expression ofRice(Oryza sativa L.)α-Amylase Genes.Acta Agronomica Sinica,36(1):17-27.)。
目前对于RAmy1A的研究主要集中于种子萌发方面，该基因在稻米品质的调控网络中发挥的详细作用尚不明确，对其调控粘滞特性的分子机理未见报道。
发明内容
本发明利用全基因组关联分析技术(GWAS)定位到一个新的调控淀粉粘滞特性的SNP位点，该位点可以用于稻米淀粉粘滞特性的辅助育种改良。同时根据该SNP位点设计了其功能特异性KASP分子标记引物组，该引物组可用于育种时对优良粘滞特性水稻的辅助选择，可大幅提高筛选效率。
具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：
首先，本申请提供了一组源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组RAmy1Apro-KASP1947，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-HEX、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-FAM、核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的后引物RAmy1Apro-KASP1947-R。
由于Wx基因是调控粘滞特性的主效基因，因此为了排除Wx基因对GWAS结果的影响，申请人在前期工作中选取了92份相同Wxb基因型的粳稻材料，连续两年对这92份Wxb基因型粳稻材料进行RVA测定，随后利用GWAS的方法在水稻第2号染色体32.25Mb附近首次检测到一个尚未报道的与PKV、HPV显著相关的位点。进一步通过精细定位以及功能验证，确认候选基因为RAmy1A，且最显著SNP位点位于RAmy1A基因起始密码子前1947bp的启动子区域即第2染色体32252091bp。该SNP位点存在两种等位基因型“A”或者“C”，该SNP位点位于转录因子结合元件“amylase box”区域。申请人进一步研究表明携带RAmy1AA等位基因型的品种相对携带RAmy1AC等位基因型的品种具有较高的PKV值，同时利用食味仪(SATAKE STA-1B)对测序品种的食味值进行测定，发现携带RAmy1AA等位基因型的品种相对携带RAmy1AC等位基因型的品种食味值显著较高，即有利基因型为“A”。
该位于水稻第2号染色体32.25Mb处的新基因型“RAmy1AA”的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；序列长度为3305bp，包含启动子序列2000bp及CDS序列1305bp，序列表中第54bp碱基即为显著SNP位点，具有等位基因A/C；具有等位基因A的水稻的PKV值高于具有等位基因C的水稻品种。
其次，本申请提供了上述KASP分子标记引物组在水稻育种中的应用。即利用该特异性KASP分子标记对优良粘滞特性的辅助选择，提高筛选效率。具体而言，该应用方法步骤如下：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)以待测样品基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4所述的KASP引物组进行竞争性、特异性PCR反应扩增；
(3)PCR反应结束后，利用荧光定量PCR仪或其它设备收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定水稻材料携带的基因型。若荧光信号为HEX，则携带基因型为RAmy1AA；若荧光信号为FAM，则携带基因型为RAmy1AC；若同时存在两种信号，则为杂合株系；判定基因型为A的水稻样品的PKV值与食味值高于基因型为C的水稻样品。
进一步而言，上述PCR反应体系为：20ng/μL的DNA模板2.5μL，2x KASP Master mix2.5μL，KASPAssay mix 0.07μL；
每100μL KASP Assay mix的配置方法为：浓度为100μM的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-HEX(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)12μL、浓度为100μM的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-FAM(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)12μL、浓度为100μM的后引物RAmy1Apro-KASP1947-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)30μL，ddH2O补足至100μL，备用。
PCR扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，55℃60s，循环10次(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃复性60s，循环26次。
本申请首次发现并验证了调控淀粉粘滞特性的新等位基因型RAmy1AA，其核苷酸序列第54bp处具有显著的SNP位点，具有等位基因A/C，具有等位基因A的水稻的粘滞特性(PKV值)与食味值高于具有等位基因C的水稻品种；申请人根据该SNP位点设计KASP引物组RAmy1Apro-KASP1947，在早期育种中，可以利用该KASP引物组对水稻基因型的筛选获得粘滞特性较好的品种，也可以利用分子标记辅助选择的方法，导入粘滞特性较差遗传背景进而改良其粘滞特性，提高其食味品质。本申请提供KASP引物组具有准确性高、简单快捷等优点，在改良稻米粘滞特性与食味品质的辅助育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为RVA表型分析结果示意图；
A：92份水稻品种的区域分布情况，圆圈位置为选择的品种所在区域，数字为的品种数量；B：不同年份RVA谱特征值重复性分析；C：92份水稻品种的RVA谱特征值相关性分析。
图2为GWAS定位分析结果示意图；
A、B：不同年份PKV及HPV的GWAS定位分析结果示意图；C：候选区间结构及SNP位点分析结果示意图；D：候选基因显著SNP位点结合元件分析结果示意图。
图3为预测表达模式及突变体表型分析结果示意图；
A：RAmy1A表达模式分析，DAF(水稻开花后不同时期发育期胚乳)；B：筛选获得的CRISPR/Cas9编辑系突变类型；C：突变体外观表型分析；D：突变体RVA表型分析。
图4为RAmy1AA育种应用结果示意图；
A-D分别为携带RAmy1AA与携带RAmy1AC等位基因型的品种直链淀粉含量、胶稠度、食味值、峰值粘度检测统计结果。
图5为特异性SNP变异位点开发的KASP标记的分型效果示意图。
具体实施方式
实施例1淀粉粘滞特性调控位点RAmy1A基因启动子新等位基因型的定位
1.1测序品种基因型分析与RVA表型鉴定
表1 92份Wxb基因型测序材料
本实施例利用各地搜集的92份Wxb基因型常规粳稻品种(见表1)进行后续实验，该92份水稻品种在国内地理分布情况如图1中A所示。首先对这些品质进行简易基因组测序，参考基因组为日本晴参考基因组(IRGSP-1.0，https://rapdb.dna.affrc.go.jp)，序列比对分析软件为BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net)，SNP信息提取质量控制参数设置为：每个位点的mapping质量值大于20、变异质量值大于50，而且每个碱基至少有2个以上reads数据的支持，MAF值>0.05，SNP提取软件为GATKV4.1.4.1。
将这92份粳稻品种收获的精米研磨成粉末，称取3g，加水25mL，制成悬浮液。利用快速粘度分析仪RVA(RVA-3D,Newport Scientific,Narrabeen,Australia)对溶液进行测定，并用配套分析软件进行分析。设定程序如下：在50℃保持1min，以12℃/min升温速率加热到95℃，在95℃保持2.5min，然后以12℃/min的降温速率冷却到50℃，并保持在50℃1.4min。实验重复三次，使用SPSS20.0统计软件的Tukey检验对表型数据进行单因素方差分析(ANOVA)、Pearson相关性分析和Student's t-test。
RVA分析结果显示连续两年的分析结果表明不同年份之间PKV、HPV、BDV、CPV、SBV和CSV数据比较稳定，重复性很好。同时相关性分析结果显示不同指标基本呈现偏正态分布(如图1中B所示)，相关性分析结果表明HPV与CPV极显著正相关，与PKV、CSV显著正相关；SBV与CSV和CPV显著正相关，与BDV显著负相关(如图1中C所示)；AC与CSV呈显著正相关。上述结果证实数据可靠，与前人研究结果相符合，可以用于下一步数据分析工作。
1.2候选基因RAmy1A启动子显著SNP位点的定位
将以上获得的品种基因型和RVA特征值表型数据分别导入Tassle(5.0)软件中，计算群体亲缘关系Kingship值，结合淀粉粘滞特性表型数据，采用MLM混合线性模型进行全基因组关联分析。在R环境下，运用R语言程序包CMPLOT绘制关联分析曼哈顿图(Manhattanplot)。
全基因组关联分析结果显示在第二染色体上存在与连续两年测得的PKV、HPV值显著相关的SNP位点SNP 2:32252091(如图2中A、B所示的虚线框处)，进一步研究发现该最显著位点SNP 2:32252091(-log10(p)>4.2)可以与RAmy1A基因共定位(如图2中C所示)，该位点位于α-淀粉酶基因RAmy1A上游启动子区域，该SNP位点存在两种等位基因型，分别为“C”和“A”(图2中D所示)。
实施例2候选基因RAmy1A功能的确定
2.1基因表达模式分析
为验证RAmy1A与稻米淀粉粘滞特性的相关性，本实施例通过荧光定量PCR(Applied Biosystems,QuantStudio 6Flex)的方法对其时空表达模式进行初步分析，分析表明RAmy1A在水稻籽粒发育的后期高表达(如图3中A所示)，种子发育后期是种子灌浆成熟的重要阶段，该结果表明RAmy1A可能在胚乳灌浆过程中发挥重要作用，进而影响了淀粉的粘滞特性。
2.2基因敲除表型分析
为了验证RAmy1A基因的功能，本实施例构建该基因CRISPR-Cas9敲除突变体，突变体背景为粳稻中花11(ZH11)，由百格基因科技有限公司使用BGK032载体创建。使用PCR法对基因敲除突变体突变位点进行扩增测序鉴定，最终获得了两个纯合突变体，分别为ramy1a-1和ramy1a-2(如图3中B所示)，表型分析结果显示突变体外观表型与亲本相比无明显差异(如图3中C所示)。使用RVA测定突变体的淀粉粘滞特性，分析结果显示两个突变体的HPV、CPV和PKV均发生改变，其粘滞特性发生明显变化(如图3中D所示)。上述结果表明候选基因RAmy1A突变会造成水稻淀粉粘滞特性的改变，证明二者具有明显的相关性。
实施例3新等位基因型RAmy1AA的育种分析与应用
3.1新等位基因型RAmy1AA的功能分析
通过以上分析92份Wxb基因型粳稻材料的测序数据，我们发现其CDS序列没有差异，其差异仅存在于RAmy1A的启动子区域即SNP2:32252091(-log10(p)>4.2)，因此该位点的SNP类型决定了淀粉粘滞特性。
随后我们根据该SNP类型对92个Wxb基因型粳稻材料进行分类，进一步统计分析结果显示测序品种中携带RAmy1AA等位基因型的品种具有较高的PKV值，且测得的食味值相对较高(如图4中A-D所示)。基于上述结果认为RAmy1AA为有利基因型，携带RAmy1AA等位基因型的品种较携带RAmy1AC等位基因型的品种具有更好的粘滞特性且食味品质更佳。
3.2RAmy1AA功能特异性KASP分子标记开发及育种应用
根据显著SNP 2:32252091的碱基“A”和“C”的差异，本实施例设计了其特异性KASP分子标记RAmy1Apro-KASP1947引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-HEX、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-FAM、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的后引物RAmy1Apro-KASP1947-R。
具体基因型检测步骤如下：
(1)使用DNA提取试剂盒(TIANGEN DP320)提取水稻叶片DNA，以其为模板，以RAmy1Apro-KASP1947为引物，进行PCR扩增；
PCR反应体系：20ng/μL的DNA模板2.5μL，2x KASP Master mix 2.5μL，KASPAssaymix 0.07μL；将体系置于PCR仪(Eppendorf,Mastercycler nexus)中进行反应；
每100μl KASP Assay mix预混液的配置方法为：浓度为100μM的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-HEX 12μL、浓度为100μM的前引物RAmy1Apro-KASP1947-F-FAM 12μL、浓度为100μM的后引物RAmy1Apro-KASP1947-R 30μL，ddH2O补足至100μL，备用。
PCR扩增程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，55℃60s，循环10次(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃复性60s，循环26次。
(2)循环结束后置于荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems,QuantStudio 6Flex)中检测分型结果，携带基因型为RAmy1AA的荧光信号为HEX，携带基因型为RAmy1AC的荧光信号为FAM。
使用该分子标记检测对92份测序品种进行分型，其结果如图5所示，即HEX荧光信号强度高时，携带基因型为RAmy1AA；FAM荧光信号强度高时，携带基因型为RAmy1AC，基因型为A的水稻样品的PKV值与食味值高于基因型为C的水稻样品，该方法对于所有水稻品种均适用。
序列表
<110> 江苏里下河地区农业科学研究所
<120> 一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与应用
<141> 2022-03-01
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3305
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
acggaaataa gccgaccgat cctttattgc tctatctttt tcccttggaa taaaaaacag 60
cccaattaaa atctgggatg aaactatggc tagctgttcg cggtgtcagt tctcgggacg 120
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acatagctac tccctttatc ttaaaatata ataattttta actctcagta tttgtcctaa 480
aatataacaa attctccatc aacattatct tcccaaccaa tcacaaccct tcatcattaa 540
ttttttcccc ctacctccac tactcatcta atcacaaccc tccaacactc acttctatct 600
actttcttaa taactgtgtt caaccctaaa acttcttata ttttaggacg gagggagtat 660
gtaaatattt cataaaaaaa atgttaagat agataaagaa gatataaacc actatgcaaa 720
catgcacatc aaaatttaat ttacagtaaa gaaacagaaa taacatattc tatttgtgct 780
ggagatgtac tgttcacaat attgtttttt tattttttat ttatctgatt atatatctgt 840
ttcagccttg catggttgtg tatgtttgtg tatagactta tgccattgtg attgatgcta 900
ccaattattt tcaaactatt tttttataga ggaattttat agttcttgag aaaatacctt 960
gaagtatcta aattttacac taaaattgtt ggtaccttga ggtataaagt acctagaggt 1020
accaaatttt actagaaaat tgtggcacct ttaggtacct tctcaaaaat agtacaatta 1080
tgggccgttt tggatttagt gccaaaacgt gctctacaaa tattttgata gtttgaacag 1140
tgcataagac gggtttggtt tgaagccaaa tcattggcat tgccaatgtc caatttgata 1200
ttttctatat tatgctaaaa gcttggttct aaattggcct ccaaccaaat acaactctac 1260
tctaccaaaa aatttgtagt gccaaaactt gcctaggttt tgtcactacc aacattttgg 1320
taagtattaa accaaacaag ccctacattt ttttatgtac atttaagttg tatgtaaatg 1380
atgggtgcgg ttgcacctag gtgaaaaaaa atacatattc gccacaactc gcaacatgta 1440
ccaattcagc agcaagtgta agagagaaga tttctctcgt tttacacgcg caccgttcaa 1500
ttcctgaact actaaacggt atgatttttt gcaaaaattt tctataggaa agttacttaa 1560
aaattatatt aatctatttt taaaatttaa aatagttaat actcaattaa ttatacgtta 1620
atggctcagc tcgttttgcg tacattctca atcgattctt ttcctctgct ctcaaatgct 1680
ctgtgtgcga tcaggtattc atgttcagct cgcacaagca caagcaagac agatggaatt 1740
cctactgacc tgcgcctttt gagtgctcca actctcaaag tctcaaggcc attaaattgc 1800
ctatgggctc accagccaat aacaaactcc ggctgttatc catccaatcc agtgtcccaa 1860
agcaacattc aagcccagcc aggcctccaa aagttgcaag ttgagcatgg caaaatcccc 1920
ggcaattctc gactataaat acctgaccag acacacccag gagcttcatc aatcatccat 1980
ctccgaagtg tgtctgcagc atgcaggtgc tgaacaccat ggtgaacaaa cacttcttgt 2040
ccctttcggt cctcatcgtc ctccttggcc tctcctccaa cttgacagcc gggcaagtcc 2100
tgtttcaggg attcaactgg gagtcgtgga aggagaatgg cgggtggtac aacttcctga 2160
tgggcaaggt ggacgacatc gccgcagccg gcatcaccca cgtctggctc cctccgccgt 2220
ctcactctgt cggcgagcaa ggctacatgc ctgggcggct gtacgatctg gacgcgtcta 2280
agtacggcaa cgaggcgcag ctcaagtcgc tgatcgaggc gttccatggc aagggcgtcc 2340
aggtgatcgc cgacatcgtc atcaaccacc gcacggcgga gcacaaggac ggccgcggca 2400
tctactgcct cttcgagggc gggacgcccg actcccgcct cgactggggc ccgcacatga 2460
tctgccgcga cgacccctac ggcgatggca ccggcaaccc ggacaccggc gccgacttcg 2520
ccgccgcgcc ggacatcgac cacctcaaca agcgcgtcca gcgggagctc attggctggc 2580
tcgactggct caagatggac atcggcttcg acgcgtggcg cctcgacttc gccaagggct 2640
actccgccga catggcaaag atctacatcg acgccaccga gccgagcttc gccgtggccg 2700
agatatggac gtccatggcg aacggcgggg acggcaagcc gaactacgac cagaacgcgc 2760
accggcagga gctggtcaac tgggtcgatc gtgtcggcgg cgccaacagc aacgccacgg 2820
cgttcgactt caccaccaag ggcatcctca acgtcgccgt ggagggcgag ctgtggcgcc 2880
tccgcggcga ggacggcaag gcgcccggca tgatcgggtg gtggccggcc aaggcgacga 2940
ccttcgtcga caaccacgac accggctcga cgcagcacct gtggccgttc ccctccgaca 3000
aggtcatgca gggctacgca tacatcctca cccaccccgg caacccatgc atcttctacg 3060
accatttctt cgattggggt ctcaaggagg agatcgagcg cctggtgtca atcagaaacc 3120
ggcaggggat ccacccggcg agcgagctgc gcatcatgga agctgacagc gatctctacc 3180
tcgcggagat cgatggcaag gtgatcacaa agattggacc aagatacgac gtcgaacacc 3240
tcatccccga aggcttccag gtcgtcgcgc acggtgatgg ctacgcaatc tgggagaaaa 3300
tctga 3305
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tccagatttt aattgggctg tttt 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tccagatttt aattgggctg tttg 44
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaccgatcc tttattgctc tatc 24

Claims (6)

1.一组源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组，其特征在于，所示引物组由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:4所示的引物组成。
2.如权利要求1所示引物组在水稻育种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是指在筛选PKV值与食味值水稻中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用具体步骤如下：
1）获得待测样品基因组DNA；
2）以待测样品基因组DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4所示的引物进行PCR扩增反应；
3）PCR扩增反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，若荧光信号为HEX，则待测样品携带基因型为RAmy1A A ；若荧光信号为FAM，则待测样品携带基因型为RAmy1A C ；若同时存在两种信号，则为杂合株系；判定基因型为A的水稻样品的PKV值与食味值高于基因型为C的水稻样品。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：20 ng/μL的DNA模板 2.5 μL，2 x KASP Master mix 2.5 μL，KASP Assay mix 0.07 μL；
每100μL KASP Assay mix的制备方法为：浓度为100μM的引物SEQ ID NO.2 12μL、浓度为100μM的引物 SEQ ID NO.3 12μL、浓度为100μM的引物SEQ ID NO.4 30μL，ddH2O补足至100μL，备用；
PCR扩增程序：94℃预变性15 min；94℃变性20 s，55℃ 60 s，循环10次，每循环降低0.6℃；94℃变性20 s，55℃复性60 s，循环26 次。
6.一种PCR 检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2 x KASP Master mix 2.5 μL，KASP Assay mix 0.07 μL；
每100μL KASP Assay mix的制备方法为：浓度为100μm的引物SEQ ID NO.2 12μL、浓度为100μM的引物 SEQ ID NO.3 12μL、浓度为100μM的引物SEQ ID NO.4 30μL，ddH2O补足至100μL，备用。
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水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs 的KASP 分子标记开发与利用;白建江等;《分子植物育种》;全文 *

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