CN116162729B - 用于鉴别或辅助鉴别小麦sds-沉降值的kasp引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS‑沉降值的KASP引物组及其应用，该KASP引物组包括1)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.3所示的引物KASP1‑F1、KASP1‑F2和KASP1‑R；2)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.6所示的引物KASP2‑F1、KASP2‑F2和KASP2‑R；3)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.9所示的引物KASP3‑F1、KASP3‑F2和KASP3‑R；携带高SDS‑沉降值单倍型小麦SDS‑沉降值显著高于携带低SDS‑沉降值单倍型小麦；该KASP引物检测简便快捷，结果精确度好，分析通量高，适合大规模育种材料的高效检测，且不受作物生长阶段的限制，可对收获后品质性状进行早期鉴定，缩短育种时间，提高选择效率，也可帮助优势单倍型与其他优良性状进行聚合，加快选育面筋品质突出、综合性状优良的小麦新品种。
Description
技术领域
本发明涉及小麦育种领域，更具体地，涉及一种用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP引物组及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum)是我国三大主要粮食作物之一，其生产和品质是关系到我国粮食安全、人民生活和社会稳定的重要问题。随着人民生活物质水平的不断提高，人们对小麦品质的需求愈加多样，要求也越来越高，然而我国小麦品质状况一直不尽人意，主要表现为二次加工品质欠佳。
小麦的二次加工品质主要受面筋的含量和质量、淀粉以及面筋与淀粉相互作用的控制(Liao L,Zhang F,Lin W,Li Z,Yang J,Park K,Ni L,Liu P(2019)Gluten-starchinteractions in wheat gluten during carboxylic acid deamidation uponhydrothermal treatment.Food Chem 283:111-122)。面筋主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，其含量和质量赋予了小麦面团独特的延展性和弹性，是决定小麦面粉的市场价值、工业价值以及最终加工品质的重要因素(Balakireva A,Zamyatnin A(2016)Properties ofgluten intolerance:Gluten Structure,Evolution.Pathog Detoxif Capab Nutr8:644.；Biesiekierski JR(2017)What is gluten？J Gastroenterol Hepatol32:78-81)。
SDS(十二烷基硫酸钠)-沉降值是衡量小麦面筋数量和质量以及面团流变学特性的综合间接指标。SDS-沉降值与小麦面粉的面筋强度、烘烤品质等都有很强的相关性(Oelofse R M,Labuschagne M T,Van Deventer C S(2010)Influencing factors ofsodium dodecyl sulfate sedimentation in bread wheat.J Cereal Sci 52:96-99)。例如，小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Bx7或1By9的缺失突变会弱化海绵类蛋糕的加工品质，相比于野生型，突变体SDS-沉降值也呈现出显著下降(Chen Q,Zhang W,Gao Y,Yang C,GaoX,Peng H,Hu Z,Xin M,Ni Z,Zhang P,Ma H,Sun Q,Yao Y(2019)High Molecular WeightGlutenin Subunits1Bx7 and 1By9 Encoded by Glu-B1 Locus affect wheat doughproperties and sponge cake quality.J Agr Food Chem 67:11796-11804)。国内外已将SDS-沉降值作为评价专用小麦质量标准的重要指标之一，如我国对面包专用小麦要求沉降值大于45ml，而对饼干专用小麦则要求沉降值小于18ml等。研究表明，SDS沉降值在基因型间遗传差异显著，具有较高的遗传力，是开展小麦加工品质遗传分析和辅助品质育种的理想指标(Oelofse R M,Labuschagne M T,Van Deventer C S(2010)Influencing factorsof sodium dodecyl sulfate sedimentation in bread wheat.J Cereal Sci 52:96-99)。
然而，SDS沉降值属于典型的数量遗传性状，受多基因控制，且表型往往受到环境因素的影响，因而性状变异受遗传基础和环境条件交织作用，表现复杂，常规的生化测定方法往往费时费工，且存在误差。特别地，如小麦SDS沉降值等反映小麦品质的性状必须要在其籽粒成熟收获后才能进行测定和分析，周期较长，因此对该品质性状的育种工作造成极大阻碍。
育种实践证明，分子标记辅助选择(Marker-Assisted Selection,MAS)可以从DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，且不受作物生育周期限制，结果精确稳定，能够辅助目标性状的鉴定、选择以及功能基因的聚合，加快育种进程。KASP(Kompetitive AlleleSpecific PCR)作为一种基于荧光信号的同质基因分型新型技术，可实现对单核苷酸多态性(SNP)的检测，具有高通量、低成本、准确性高等优点，近年已经逐渐被应用于小麦产量、品质、抗病性等性状的遗传学研究和分子标记辅助育种工作。
然而，受限于小麦基因组大而复杂，且与品质相关性状形成的复杂性，迄今与SDS沉降值相关的QTL/基因尚待明确，尤其是育种可用的高通量分子标记鲜有报道。NAC转录因子是近年来发现的植物所特有的、具有多种生物功能的转录因子，其家族基因参与小麦、水稻、玉米籽粒蛋白的积累已有证实。最近在小麦中报道了一个与小麦SDS沉降值相关的NAC基因TraesCS3B02G092800(Gao Y,An K,Guo W,et al.(2021)The endosperm-specifictranscription factor TaNAC019 regulates glutenin and starch accumulation andits elite allele improves wheat grain quality.The Plant Cell 33(3):603-622)。然而，该基因与小麦SDS沉降值相关的优异等位变异有待进一步明确，能够高通量检测优异变异的育种可用的KASP标记也有待开发。目前，研发适用于高通量分子筛选的小麦SDS-沉降值相关的KASP分子标记已成为小麦品质育种领域亟待解决的技术难题。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本申请提供一种用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP分子标记引物组及其应用，为满足不同品质需求的小麦品种育种提供高通量分子育种的有力新工具。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
首先，本发明提供了用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP分子标记引物组合。
1)该引物组包含如下三组核心引物：(1)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1,SEQ IDNO.2,SEQ ID NO.3所示的引物FSNP1-F1、FSNP1-F2和KASP1-R；(2)核苷酸序列依次如SEQID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6所示的引物FSNP2-F1、FSNP2-F2和KASP2-R；(3)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9所示的引物FSNP3-F1、FSNP3-F2和KASP3-R。
2)基于核心引物的KASP引物组：(1)KASP1组：核苷酸序列依次如SEQ ID NO.12,SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.3所示的正向竞争性引物KASP1-F1、正向竞争性引物KASP1-F2和反向通用性引物KASP1-R；(2)KASP2组：核苷酸序列依次如SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.6所示的正向竞争性引物KASP2-F1、正向竞争性引物KASP2-F2和反向通用性引物KASP2-R；(3)KASP3组：核苷酸序列依次如SEQ ID NO.16,SEQ ID NO.17,SEQ ID NO.9所示的正向竞争性引物KASP3-F1、正向竞争性引物KASP3-F2和反向通用性引物KASP3-R。
其次，本发明提供了上述KASP引物组在鉴别或辅助鉴别小麦(如中国小麦品种)SDS-沉降值中的应用。即以所述待测小麦的基因组DNA为模板，以上述KASP引物组进行PCR扩增，扫描荧光信号，以已测序小麦中国春(IWGSC RefSeq v1.0)Chr3B染色体上TraesCS3B02G092800基因序列，即SEQ ID NO.18所示序列为参考序列，通过对基因TraesCS3B02G092800的鉴定，判断待测小麦SDS-沉降值。具体方法如下：
1)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，以KASP1组为引物进行PCR扩增，获得扩增产物I，利用荧光定量PCR仪对扩增产物I进行荧光信号扫描；若荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61895978位为“-”基因型(基因型缺失)；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61895978位为“T”基因型；
2)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，以KASP2组为引物进行PCR扩增，获得扩增产物II，利用荧光定量PCR仪对扩增产物II进行荧光信号扫描；若待测小麦扩增产物II的荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896033位为“T”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896033位为“C”基因型；
3)以所述待测小麦的基因组DNA为模板，以KASP3组为引物进行PCR扩增，获得扩增产物III，利用荧光定量PCR仪对扩增产物III进行荧光信号扫描；若待测小麦扩增产物III的荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896379位为“G”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896379位为“A”基因型。
4)当待测小麦基因组Chr3B染色体第61895978位点基因型为缺失类型“-”，第Chr3B染色体61896033位点基因型为“T”，第Chr3B染色体61896379位点基因型为“A”时，则认为待测小麦上述3个位点变异组合形成的单倍型为单倍型Ⅰ，即为HAPI型小麦；
若待测小麦基因组Chr3B染色体第61895978位点基因型为“T”，第Chr3B染色体61896033位点基因型为“C”，第Chr3B染色体61896379位点基因型为“G”时，则认为待测小麦上述3个位点变异组合形成的单倍型为单倍型Ⅱ，即为HAPII型小麦；则HAPI型小麦的SDS-沉降值高于HAPII型小麦。小麦SDS-沉降值较高，面筋强度大，面粉的烘烤品质相应较好。
以上涉及的PCR扩增反应体系(10μL)：包括浓度为120ng/ul的模板DNA2.5μL,2×KASP Master Mix 5μL,0.14μL KASP Assay Mix,加ddH2O补齐至10μL；
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的两条正向竞争性(KASP)引物各12μL、浓度为100μM的反向通用性引物30μL、加入46μLddH2O补足至100μL。
PCR扩增反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s；10个touch-down循环，每循环降低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。
本发明利用小麦已公布的重测序数据，结合特异性PCR扩增、基因测序、单倍型分析和表型测定数据，明确了优异等位基因的特异性位点，并基于KASP基因分型平台设计引物进行验证评估，开发了适用于高通量筛选和辅助小麦高SDS-沉降值鉴别和利用的KASP分子标记、检测体系和应用方法。
本发明的有益效果在于：
1)利用本发明提供的用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP分子标记引物组合进行小麦SDS-沉降值性状相关基因TraesCS3B02G092800基因型的检测，简便快捷，精确度好，分析通量高，非常适合大量样品同时检测。
2)利用本发明提供的KASP分子标记引物组合和单倍型判定方法，能够在小麦任何生育时期实现对小麦SDS-沉降值高低的鉴别或辅助鉴别，打破了因生长阶段限制造成的性状鉴别困难，轻松实现了对小麦收获后品质性状的早期鉴定。
3)利用本发明提供的KASP分子标记引物组合，单倍型判定方法和小麦SDS-沉降值鉴定方法，通过在306份包括地方品种和育成品种的中国小麦自然群体中检测，证明应用本发明提供的分子标记引物组合和实施方法所筛选出的高SDS-沉降值单倍型小麦其SDS-沉降值显著高于低SDS-沉降值单倍型小麦。说明本发明提供的分子标记引物组合可实现以SDS-沉降值为育种靶标的小麦早期鉴定和辅助选择，提高育种效率；也可帮助SDS-沉降值优异单倍型与其他优良性状进行聚合，加快选育品质突出、综合性状优良的小麦新品种。
附图说明
图1为本发明所开发的KASP分子标记对应SNP的位置示意图。
其中：5’UTR,3’UTR,Exon和Intron分别表示SNP所在基因的5端非翻译区,3’端非翻译区,外显子区和内含子区；红色标注SNP即为KASP标记对应的3个功能性SNP(FSNP1，FSNP2和FSNP3)。
图2为实施例2中对KASP分子标记检测SNP的准确性和高分辨性的验证示意图。
其中，A-C表示用测序方法检出的3个SNP变异类型，D-F表示用本发明所开发的KASP分子标记对上述位点的检测效果，坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，黑点代表阴性对照(NTC)(即ddH20)，蓝、红点分别代表不同基因型。
图3为实施例3中利用本发明所开发的KASP分子标记组合对供试材料的扩增检测结果。
其中坐标轴数值代表等位基因荧光信号强度，黑点代表阴性对照(NTC)(即ddH20)，蓝、红点分别代表不同基因型。
图4为实施例3中供试群体经KASP分子标记检测出的两种不同单倍型的SDS-沉降值比较结果图。其中，HAPⅠ：单倍型Ⅰ，HAPⅡ：单倍型Ⅱ。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术内容和优点更加清楚，特举以下实施例详细说明。
本发明中所使用的术语，除非有特殊说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。实施实例中，未详细描述的各种过程和方法均为本领域中公知的常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中所用的小麦材料均为扬州大学农学院-江苏省省级种质资源库(农作物)保存的种质资源材料，可被本领域技术和研究人员获得使用。
实施例1
本实施例用来说明用于鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP分子标记的设计及其专用引物序列(KASP标记引物组合)的开发。
一、功能性SNP获取
第一步：获取了已测序小麦品种中国春(IWGSC RefSeq v1.0)Chr3B染色体上TraesCS3B02G092800基因序列，即SEQ ID NO.18所示序列，并以此序列作为参考序列用于后续分析。结果发现，SEQ ID NO.18全长1092bp，编码区包括两个外显子(分别为508bp和171bp)和一个内含子(129bp)，具体参见图1。该信息结果来源于Ensembl Plants数据库，网站为http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index。
第二步，本发明利用小麦基因组变异联合数据库中已公布的小麦重测序数据进行比对，确定了该基因存在的自然变异位点。结果一共发现了6个SNP变异位点，分别位于Chr3B染色体61895978位、61896033位、61896379位、61896551位、61896907位和61896951位；该信息结果来源于Hubs数据库，网站为http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index。
第三步，以第一步所得的SEQ ID NO.18序列作为参考序列，将第二步所得的6个变异位点比对到参考序列上，发现第61895978位、第61896033位、第61896379位SNP变异均发生在外显子区(Exon)，第61896551位SNP变异发生在内含子区(Intron)，第61896907位和61896951位SNP变异发生在3'端非编码区域(UTR)；因为外显子突变会造成编码区碱基组成或排列顺序的变化，从而影响基因结构，导致基因功能发生变化，因此我们认定位于外显子区的3个SNP，即第61895978位、61896033位、61896379位SNP为功能性SNP，分别命名为FSNP1、FSNP2和FSNP3(参见图1)，其等位变异分别为T/-，C/T和G/A(参见表1)。
表1功能性SNP的位置和类型
| FSNP1 | FSNP2 | FSNP3 | |
| 变异位点 | 61895978 | 61896033 | 61896379 |
| 参考序列基因型 | T | C | G |
| 自然变异基因型 | - | T | A |
注：以中国春(IWGSC RefSeq v1.0)为参考序列；“-”表示缺失。
二、KASP标记引物的开发
以中国春(IWGSC RefSeq v1.0)Chr3B染色体上TraesCS3B02G092800基因序列，即SEQ ID NO.18序列为参考序列，分别调取第61895978位(即FSNP1)、61896033位(即FSNP2)、61896379位(即FSNP3)上下游65bp的序列信息，利用Primer Premier5(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计多组KASP引物，然后利用DNAMAN对设计的引物质量进行评估，利用Ensembl Plants数据库对引物序列特异性进行检测。每组引物均包括2条正向竞争性引物和1条反向通用性引物，组成KASP核心引物。如上述方法，经过多次人工检测和筛选最终获得扩增效果好、特异性强的三组核心引物，序列为：(1)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3所示的引物FSNP1-F1、FSNP1-F2和KASP1-R；(2)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6所示的引物FSNP2-F1、FSNP2-F2和KASP2-R；(3)核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9所示的引物FSNP3-F1、FSNP3-F2和KASP3-R。
在上述每组核心引物的2条正向竞争性引物序列5’端分别加上FAM(接头序列如SEQ ID NO.10所示)和HEX(接头序列如SEQ ID NO.11所示)荧光基团接头，连同每组中的一条反向通用性引物，最终获得可用于高通量检测的KASP分子标记引物组合。三组KASP分子标记引物组合具体是：(1)KASP1组,核苷酸序列依次如SEQ ID NO.12,SEQ ID NO.13和SEQID NO.3所示的引物KASP1-F1、KASP1-F2和KASP1-R；(2)KASP2组,核苷酸序列依次如SEQ IDNO.14,SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.6所示的引物KASP2-F1、KASP2-F2和KASP2-R；(3)KASP3组,核苷酸序列依次如SEQ ID NO.16,SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.9所示的引物KASP3-F1、KASP3-F2和KASP3-R。
实施例2
本实施例用来说明实施例1中所开发的KASP分子标记引物组合检测SNP位点的准确性和高分辨性。
具体是同时利用测序技术和实施例1提供的KASP分子标记对实施例1中的功能性SNP进行检测，若KASP分型数据与测序检测数据完全一致，且扩增性强，结果清晰可辨，则说明KASP标记开发成功，可进一步应用于育种材料检测。具体方法如下：
一、供试小麦品种基因组DNA提取
将包含306份包括地方品种和育成品种的小麦自然群体作为供试材料(如表2所示)，于2021年种植于扬州大学试验基地(119.40°E,32.34°N)，单行播种，行长1.2m，行距0.3m，3次重复。试验基地土壤条件均匀，在成熟收获之前，参考马鸿翔等(2021)(马鸿翔,顾克军,陈怀谷(2021)《小麦产业关键实用技术100问》,中国农业出版社.)公开的方法，给予完全一致的田间管理。于苗期取植株幼嫩叶片，参照Stein等(2001)(Stein N,Herren G,and Keller B(2001)A new DNA extraction method for high-throughput markeranalysis in a large-genome species such as Triticum aestivum.Plant Breed120:354-356)，采用CTAB法从中分离基因组DNA，用灭菌的超纯水将所提取的DNA统一稀释至约120ng/ul。
表2供试小麦名称、基因型与表型数据
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注：检测方法一栏中，"KASP"代表利用本发明所开发KASP分子标记进行的基因型检测；"SEQ"代表用测序方法进行的基因型检测；"KASP(t)"代表如实施例2中所述的利用本发明所开发KASP分子标记随机对测序数据进行的验证。
二、测序检测SNP
从表2小麦材料中随机选取40份材料，提取DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)对TraesCS3B02G092800基因进行扩增。正向引物序列为：5'-GAGACCCGTCACCTGTCATC-3'(SEQID NO.19)，反向引物序列为5'-GAGCCAGCGCATGCAA'(SEQ ID NO.20)(参见：Gao Y,An K,Guo W,et al.(2021)The endosperm-specific transcription factor TaNAC019regulates glutenin and starch accumulation and its elite allele improveswheat grain quality.The Plant Cell 33(3):603-622)。
PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)25μL，正反向引物(10μM)各2μL，DNA模板(120ng/ul)2μL，加ddH2O补齐至50μL。
PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min。
PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，用QIA DNA纯化试剂盒(Qiagen,Germany)纯化。基因测序由南京擎科生物技术公司完成。扩增和测序分别重复3次，正、反向链独立测序，并使用Chromas 2.32(Technelysium Pty.Ltd.)对测序数据质量进一步检查。
测序结果显示，以中国春(IWGSC RefSeq v1.0)Chr3B染色体(即SEQ ID NO.18，TraesCS3B02G092800,IWGSC:3B:61895861:61896952:)序列为参考序列，分别在第61895978位、61896033位和61896379位成功检测出3个功能性突变，突变类型分别为T/-突变、C/T突变、G/A突变，即FSNP1、FSNP2和FSNP3。
测序结果如图2所示,图2中，A-C分别为用以上测序方法检出的3个SNP变异类型FSNP1、FSNP2和FSNP3，D-F表示用本发明所开发的KASP分子标记分别对FSNP1、FSNP2和FSNP3位点的检测效果。
三、KASP分型验证测序结果，证明KASP标记检测目标SNP位点的准确性和高分辨性
随机从上述测序材料中选取包含不同突变类型的材料18个(如表2中KASP(t)所示)，利用实施例1获得的KASP引物组进行基因分型(检测结果见图2)。反应体系、扩增程序和基因型判定方法如下：
KASP反应体系(10μL)：包括2.5μL样品DNA(120ng/ul),2×KASP Master Mix 5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK),0.14μL KASP Assay Mix,加ddH2O补齐至10μL。
其中，KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的两条正向竞争性(KASP)引物各12μL、浓度为100μM的反向通用性引物30μL、加入46μLddH2O补足至100μL。
KASP反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个touch-down循环(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。
基因型判定：利用荧光定量PCR仪Applied Biosystems ABI Viia7 Real TimePCR System(Thermo Scientific,USA)扫描荧光信号并进行基因分型，具体是：聚合在接近Y轴、显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光基团接头的等位基因型；聚合在接近X轴、显示红的样本的基因型为连接HEX荧光基团接头的等位基因型；聚合在接近原点、显示黑色的样本为空白对照。具体而言，如下：
1)以待测小麦DNA为模板，以KASP分子标记引物组合1(即KASP1组)为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物I,利用荧光定量PCR仪对扩增产物I扫描荧光信号并进行基因分型，若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61895978位SNP为“-/-”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61895978位SNP为“T/T”基因型；
PCR扩增体系(10μL)：包括2.5μL模板DNA(120ng/ul),2×KASP Master Mix 5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK),0.14μL KASP Assay Mix,加ddH2O补齐至10μL。
其中，每100μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的引物KASP1-F1(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)12μL、浓度为100μM的引物KASP1-F2(核苷酸序列如SEQID NO.13所示)12μL、浓度为100μM的反向通用引物KASP1-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)30μL、加入46μL ddH2O补足至100μL。
PCR扩增反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个touch-down循环(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。
2)以待测小麦DNA为模板，以KASP分子标记引物组合2(即KASP2组)为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物II；利用荧光定量PCR仪对扩增产物II扫描荧光信号并进行基因分型，若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61896033位SNP为“T/T”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61896033位SNP为“C/C”基因型；
PCR扩增体系(10μL)：包括2.5μL模板DNA(120ng/ul),2×KASP Master Mix 5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK),0.14μL KASP Assay Mix,加ddH2O补齐至10μL。
其中，每100μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的引物KASP2-F1(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)12μL、浓度为100μM的引物KASP2-F2(核苷酸序列如SEQID NO.15所示)12μL、浓度为100μM的反向通用引物KASP2-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)30μL、加入46μL ddH2O补足至100μL。
PCR扩增反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个touch-down循环(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。
3)以待测小麦DNA为模板，以KASP分子标记引物组合3(即KASP3组)为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物III；利用荧光定量PCR仪对扩增产物III扫描荧光信号并进行基因分型，若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经扫描分析，在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61896379位SNP为“G/G”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测小麦的Chr3B染色体第61896379位SNP为“A/A”基因型。
PCR扩增体系(10μL)：包括2.5μL模板DNA(120ng/ul),2×KASP Master Mix 5μL(LGC Genomics,Hoddeston,UK),0.14μL KASP Assay Mix,加ddH2O补齐至10μL。
其中，每100μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的引物KASP3-F1(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)12μL、浓度为100μM的引物KASP3-F2(核苷酸序列如SEQID NO.17所示)12μL、浓度为100μM的反向通用引物KASP3-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)30μL、加入46μL ddH2O补足至100μL。
PCR扩增反应程序：94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个touch-down循环(每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。
检测如表2和图2，结果显示，本发明所开发的KASP分子标记引物组合分型良好，分辨性高，并且与通过测序检验靶标位点变异的数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可应用于育种材料的准确、高通量检测。
实施例3
本实施例用来说明利用用于高通量鉴别或辅助鉴别小麦SDS-沉降值的KASP标记引物组合鉴别小麦SDS-沉降值的方法和应用。
一、KASP分型与单倍型分析
利用实施例1获得的KASP引物组合，本实施例进一步对表2中其余288份未经过KASP检测的供试材料进行基因分型，KASP反应体系、扩增程序和基因型判定方法均与实施例1所述方法一致。
检测结果如表2和图3所示，图3中，A-C分别为288份材料FSNP1、FSNP2和FSNP3三种基因型的检测结果。可见，288份材料在FSNP1(即对比中国春Chr3B染色体第61895978位)、FSNP2(即对比中国春Chr3B染色体第61896033位)和FSNP3(即对比中国春Chr3B染色体第61896379位)检测出T/-突变、C/T突变和G/A突变，并形成两种不同的单倍型，即：
1)单倍型Ⅰ(HAPⅠ)，其FSNP1位点(Chr3B染色体第61895978位)为缺失类型“-”，FSNP2位点(Chr3B染色体第61896033位)为“T”，FSNP3位点(Chr3B染色体第61896379位)为“A”；
2)单倍型Ⅱ(HAPⅡ)，其FSNP1位点(Chr3B染色体第61895978位)为“T”，FSNP2位点(Chr3B染色体第61896033位)为“C”，FSNP3位点(Chr3B染色体第61896379位)为“G”。
二、KASP分子标记组合用于小麦SDS-沉降值的鉴定
供试材料于2022年收获，种子经自然晾干，取约10g磨成全麦粉，称取2g进行微量法SDS-沉降值测定，测定方法参考Axford等(1979)(Axford D,Mcdermott E,and Redman D(1979)Note on sodium dodecyl sulfate test of breadmaking quality；Comparisonwith Pelshenke and Zeleny test.Cereal Chem 56:582-584.)公开的方法，3次技术重复，测定结果参见表2。
统计分析采用SPSS 19.0。对比表2中单倍型Ⅰ、单倍型Ⅱ，和分别携带这两种单倍型材料的SDS-沉降值表型数据，结果发现携带单倍型HAPI类型的小麦SDS-沉降值高于携带单倍型HAPⅡ类型的小麦SDS-沉降值(图4)。
如表3所示，对比供试自然群体的平均SDS-沉降值，结果发现：高SDS-沉降值单倍型(HAPI)与高SDS-沉降值表型(即沉降值高于群体平均值)的符合比例为81％，低SDS-沉降值单倍型(HAPII)与低SDS-沉降值表型(即沉降值低于群体平均值)的符合比例为64％。
表3供试小麦基因型与表型(SDS-沉降值)的对比分析
统计分析(t检验)进一步表明，高SDS-沉降值单倍型(HAPI)与低SDS-沉降值单倍型(HAPII)的表型差异达到极显著水平(表4)。
由此可见，单倍型Ⅰ，即HAPⅠ为小麦高SDS-沉降值的优异单倍型，可在小麦的品质育种中加以利用。
表4统计分析结果
注：*表示显著性水平0.05下呈现差异，**表示显著性水平0.01下呈现差异。
以上实施例供试小麦遍布中国小麦主产区，品种类型包括地方品种和育成品种，因此鉴定获得的两种单倍型可在很大程度上代表存在于中国小麦中的优势单倍型，结果具有代表性，适用性强。通过利用本发明开发的KASP分子标记引物组合，可以用于鉴别或辅助鉴别小麦的SDS-沉降值，实施简便快捷，结果精确度好，分析通量高，非常适合大规模育种材料的高效检测。同时，该方法不受作物生长阶段的限制，实现了对小麦收获后的品质性状的早期鉴定，缩短育种时间，提高筛选效率，也可帮助优势单倍型与其他优良性状进行聚合，实现面筋品质突出，且综合性状优良的小麦新品种选育。
Claims (4)
1.KASP引物组在鉴别小麦SDS-沉降值中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
1）以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用KASP1、KASP2、KASP3三组引物进行PCR扩增，获得扩增产物I、扩增产物II和扩增产物III；
所述KASP1由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.3所示的引物KASP1-F1、KASP1-F2和KASP1-R组成；
所述KASP2由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.6所示的引物KASP2-F1、KASP2-F2和KASP2-R组成；
所述 KASP3由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.9所示的引物KASP3-F1、KASP3-F2和KASP3-R组成；
2）对扩增产物I进行荧光信号扫描，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61895978位为“-”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61895978位为“T”基因型；
3)对扩增产物II进行荧光信号扫描，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896033位为“T”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896033位为“C”基因型；
4）对扩增产物III进行荧光信号扫描，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896379位为“G”基因型；若在所得分型聚类图中呈现红色，则认为待测小麦的Chr3B染色体第61896379位为“A”基因型；
5）以小麦中国春IWGSC RefSeq v1.0 Chr3B染色体上如SEQ ID NO.18所示序列为参考序列；若待测小麦基因组Chr3B染色体第61895978位点基因型为缺失类型“-”，且第Chr3B染色体61896033位点基因型为“T”，且第Chr3B染色体61896379位点基因型为“A”时，则认为待测小麦为HAPI型小麦；
若待测小麦基因组Chr3B染色体第61895978位点基因型为“T”，且第Chr3B染色体61896033位点基因型为“C”，且第Chr3B染色体61896379位点基因型为“G”时，则认为待测小麦为HAPII型小麦；则HAPI型小麦的SDS-沉降值高于HAPII型小麦。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述扩增产物I是通过如下方法获得的：以待测小麦DNA为模板，以KASP1为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物I；
PCR扩增体系：浓度为120 ng/ul的模板DNA2.5 μL, 2×KASP Master Mix 5μL, 0.14μL KASP Assay Mix, ddH2O补齐至10 μL；
其中，每100 μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的所述引物KASP1-F112μL、浓度为100μM的所述引物KASP1-F2 12μL、浓度为100μM的所述引物KASP1-R 30μL、ddH2O补足至100 μL；
PCR扩增反应程序：94℃热激活15 min；94℃变性20 s，61～55℃退火和延伸60 s；10个touch-down循环，每循环降低0.6℃；94℃变性20 s，55℃退火和延伸60 s，26个循环。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述扩增产物II是通过如下方法获得的：以待测小麦DNA为模板，以KASP2为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物II；
PCR扩增体系：浓度为120 ng/ul的模板DNA2.5 μL, 2×KASP Master Mix 5μL, 0.14μL KASP Assay Mix, 加ddH2O补齐至10 μL；
其中，每100 μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的所述引物KASP2-F112μL、浓度为100μM的所述引物KASP2-F2 12μL、浓度为100μM的所述引物KASP2-R 30μL、ddH2O补足至100 μL；
PCR扩增反应程序：94℃热激活15 min；94℃变性20 s，61～55℃退火和延伸60 s；10个touch-down循环，每循环降低0.6℃；94℃变性20 s，55℃退火和延伸60 s，26个循环。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述扩增产物III是通过如下方法获得的：以待测小麦DNA为模板，以KASP3为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物III；
PCR扩增体系：浓度为120 ng/ul的模板DNA2.5 μL, 2×KASP Master Mix 5μL, 0.14μL KASP Assay Mix, 加ddH2O补齐至10 μL；
其中，每100 μL KASP Assay Mix的配制方法如下：浓度为100μM的所述引物KASP3-F112μL、浓度为100μM的所述引物KASP3-F2 12μL、浓度为100μM的所述引物KASP3-R 30μL、ddH2O补足至100 μL；
PCR扩增反应程序：94℃热激活15 min；94℃变性20 s，61～55℃退火和延伸60 s；10个touch-down循环，每循环降低0.6℃；94℃变性20 s，55℃退火和延伸60 s，26个循环。
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