CN109593876A - 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用，本发明属于分子遗传育种技术领域，涉及一种利用高通量SNP分子标记检测高油酸花生AhFAD2B基因分型的专用引物组合及其应用。所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：带有标签A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；带有标签B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明针对高油酸花生AhFAD2B新型突变814C>T等位变异设计了高通量KASP分子标记基因分型的特异引物，可以有效鉴别该AhFAD2B新型突变体，解决了现有技术的鉴别方法只能鉴别AhFAD2B经典F435突变位点448G>A等位变异的问题。

Description

高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及 其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，涉及一种利用高通量SNP分子标记检测高油酸花生AhFAD2B基因分型的专用引物组合及其应用。

背景技术

花生是重要的食用植物油和蛋白质来源，油酸含量是影响花生油及花生加工制品理化稳定性和营养价值的重要品质指标。油酸属于单不饱和脂肪酸，油酸分子中仅含有一个双价不饱和键，与含有两个或者多个双价不饱和键的多不饱和脂肪酸(如亚油酸等)相比，油酸的化学稳定性更强，高油酸花生制品不易氧化酸败，货架期长，高油酸花生油比普通油酸含量花生油的贮藏期能延长14倍以上，高油酸花生烘焙产品的储存期是普通油酸含量花生烘焙产品储存期的8倍以上。与亚油酸相比，油酸可以在降低人体中低密度脂蛋白胆固醇含量的同时，维持高密度脂蛋白胆固醇的含量，从而保证人体对有益胆固醇的需求又不至于提高有害胆固醇的浓度，因此油酸对人体营养健康也十分有利。目前及今后一段时期内，发掘、创新高油酸花生种质资源和培育高油酸花生新品种将是花生品质遗传改良、实现花生主推品种高油酸化的重要基础性研究工作。

已有的植物脂肪酸合成代谢分子生物学研究表明，Δ¹²脂肪酸脱氢酶基因(FAD2)是负责将油酸(C18:1)第12碳位上的氢键催化去饱和转化为含有2个不饱和键的亚油酸(C18:2)的关键基因。因为油酸通常以油酸-CoA、油酸-PLA、油酸-PC、油酸-DAG和油酸-TAG等形式参与油酸代谢，是多种脂肪酸的前体，所以FAD2基因的表达水平对合成脂肪酸的类型及数量起着重要作用。花生中位于基因组A09、B09染色体上的两对同源非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B的表达及酶活性对种子油酸含量具有重要影响。前人研究指出，AhFAD2A和AhFAD2B两个基因对花生的油酸含量和亚油酸含量均有贡献，只有两个基因转录受抑制或编码酶活性降低，花生才表现出高油酸性状。

当前，国内外育成的高油酸花生品种和创制的高油酸花生种质大多是以二十世纪80年代美国科学家鉴定筛选的油酸含量80％(亚油酸2％)的自然突变体F435为高油酸基因供体亲本进行杂交培育而来的。对F435及其衍生系的高油酸性状遗传分析和AhFAD2A、AhFAD2B基因分型发现，高油酸花生油酸表型受两对隐性基因控制，高油酸花生中AhFAD2A基因编码区448bp位点发现1个核苷酸突变448G>A，编码的氨基酸由天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)，使得AhFAD2A编码酶活性大大降低；同时在AhFAD2B基因编码区442bp位点处有1个碱基A插入(442insA)，造成移码突变，导致编码的蛋白序列提前终止。因此，一般普遍认为花生高油酸性状的形成是AhFAD2A和AhFAD2B基因同时发生突变的结果。

截至目前，我国培育的高油酸花生品种中AhFAD2A和AhFAD2B的基因类型基本为F435型，造成育成的高油酸花生品种遗传多样性低，高油酸基因类型过于单一。高油酸花生种质资源稀少已经严重阻碍了高油酸花生育种的进程。在栽培花生中，AhFAD2A普遍存在2个等位基因突变型，即AhFAD2A-G448A突变型和野生型，而AhFAD2B基因比较保守，自然突变的有利变异几率较小，但AhFAD2B基因对提高花生油酸含量可能具有更重要的影响。我们通过对大量种质资源油酸含量性状和基因型筛选后，发掘出1个不同于以往的新型高油酸花生突变体C814T(中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会综述与摘要集)，其AhFAD2A基因类型与F435一致，但其AhFAD2B基因类型有别于F435的AhFAD2B基因类型，C814T的AhFAD2B基因开放读码框区自5’端核苷酸序列第442位并没有碱基A插入，而是在第814位出现C>T的碱基替换，使编码蛋白序列的第272位氨基酸由组氨酸(H)变为酪氨酸(Y)，最终也产生高油酸表型，推测AhFAD2B-814可能是高油酸性状的关键位点。所以，C814T作为一种新的高油酸花生种质资源，在培育和研究不同类型高油酸花生品种以及品质特性方面具有重要意义。

花生高油酸相关的两个基因都是隐性突变基因，采用传统的杂交、回交、表型选择进行高油酸育种的周期长、成本高。然而，分子标记辅助育种可以从基因型上筛选高油酸表型，极大地提高育种效率。但是，传统的连锁标记主要是基于基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，而且操作复杂、通量小、成本高。油酸合成基因的克隆，使得通过目标基因AhFAD2A和AhFAD2B关键突变位点开发功能性分子标记来进行育种材料的有利等位基因变异鉴定成为可能。针对F435型高油酸花生AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP和插入/缺失(InDel)等位差异，近年来开发了多种用于检测的标记和检测方法，如CAPS法(酶切扩增多态性序列法)、AS-PCR法(等位基因特异PCR法)、测序法、qRT-PCR法(荧光定量PCR法)和TaqMan探针法(申请号：201510051695.0，公开号CN 104593510A)等，实现了对F435型高油酸花生育种进行分子标记辅助选择。然而，AhFAD2B-814突变基因的共显性标记还未见报道。

另一方面，目前在AhFAD2B-814突变基因育种应用过程中，一般采用传统杂交和回交选择，这就需要在大规模的杂交或回交育种群体中进行准确、高效的基因型鉴定和选择。上述基于SNP和InDel标记的检测技术除了TaqMan探针法外，其他几种标记技术均难以通过1个PCR反应鉴别等位变异位点的杂合与纯合，且皆存在通量小、成本高等缺陷，无法实现高通量检测，使其在分子标记辅助选择应用中具有局限性。TaqMan探针检测技术虽然可以实现样品的高通量检测，但是由于该方法荧光标记的探针为基因特异性探针，成本相对较高。

近年来，KASP基因分型技术在多种作物SNP和InDel的分子标记检测中得到广泛应用。该技术是一种独特的竞争性等位基因特异性PCR技术，它将高通量荧光检测与等位特异性PCR相结合，通过引物末端碱基的特异性匹配来对SNP以及InDel位点进行高精度的双等位基因分型。KASP检测通过一次PCR反应就可鉴别样品的基因型，能达到高通量的要求，提高检测效率；KASP使用通用荧光探针，又使检测成本大大降低。目前对于AhFAD2B-814突变基因的KASP高通量分型技术仍为空白。因此，开发基于AhFAD2B-814突变基因的KASP检测引物和检测技术，可以提高新型高油酸突变基因的应用水平，丰富高油酸花生种质资源，加速高油酸花生新品种培育进程。

发明内容

本发明的目的是提供一套基于KASP检测技术的用于花生高油酸基因AhFAD2B分型的引物组合及其应用。针对高油酸花生新型突变基因AhFAD2B-814，提供一种高通量检测AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物及检测方法，该方法具有检测通量高、检测时间短、检测成本低、分型结果准确率高等特点，为高油酸花生分子标记辅助选择提供了新的高效技术手段。

一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：

带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

所述带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，标签序列A为SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列A的核苷酸序列与5’端标记了FAM荧光基团的通用荧光探针A的核苷酸序列一致；该野生型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的第22-46位单链DNA，是野生型AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第813-837位碱基的反向互补序列。标签序列A的核苷酸序列与LGC公司KASP Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，通用荧光探针的5’端标记了FAM荧光基团。

所述带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，标签序列B为SEQ ID No.2所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列B的核苷酸序列与5’端标记了HEX荧光基团的通用荧光探针B的核苷酸序列一致；该突变型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的第22-45位单链DNA，是突变型AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第813-838位碱基的反向互补序列。标签序列B的核苷酸序列与LGC公司KASP Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，通用荧光探针的5’端标记了HEX荧光基团。

AhFAD2B基因通用引物，由28个碱基组成，其核苷酸序列为AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第693-721位碱基序列。AhFAD2B-814C>T是位于AhFAD2B基因上的非同义突变位点。花生AhFAD2A和AhFAD2B同时突变可获得高油酸表型，所以在基因AhFAD2A-448G>A纯合突变基础上，若AhFAD2B-814携带C等位变异的材料为野生型普通油酸含量材料；若AhFAD2B-814携带T等位变异的材料为突变型高油酸材料。但是，由于花生AhFAD2A和AhFAD2B同源基因之间序列上具有高度的相似性，KASP标记难以区分序列高度相似的同源基因，从而会对KASP检测结果带来干扰。因此，本发明选择在AhFAD2B-814C>T位点上下游两个基因序列存在差异的位置(SNP)设计基因特异KASP引物，将该通用引物(序列3)的3’端碱基设计在该SNP位点处，即AhFAD2B基因(突变型或野生型)开放读码框区自5’端第721位碱基处，用于区分A基因组和B基因组。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测花生高油酸基因AhFAD2B-814突变体的试剂盒：含有权利要求1所述引物组的用于高油酸花生C814T中AhFAD2B基因分型的检测试剂盒。

本发明所提供的用于检测花生AhFAD2B-814突变基因的试剂盒含有所述的KASP引物，还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团；所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

在本发明中，所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX；所述淬灭基团为BHQ。

在本发明中，所述荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B存在于KASPV4.02×Master Mix中，其中所述KASP V4.02×Master Mix为英国LGC公司产品，其产品目录号为KBS-1016-002(适用于96/384孔板)。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助选择具有AhFAD2B基因814C>T突变位点的高油酸花生的方法。

本发明所提供的检测或者辅助选择花生高油酸基因AhFAD2B-814基因型的方法如下：以待检测花生基因组DNA为模板，采用所述试剂盒中所述的KASP引物(所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX)进行PCR扩增，将所获得的扩增产物进行荧光信号扫描，采用SNPViewer软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下方法确定所述待检测花生材料的AhFAD2B基因型，即若所述待检测花生材料扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈现蓝色(FAM探针荧光)，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为BB(SNP分型为C：C基因型)；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈现红色(HEX探针荧光)，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为bb(SNP分型为T：T基因型)；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈现绿色，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为Bb(SNP分型为C：T基因型)。

以上KASP标记特异引物也可用于检测以花生AhFAD2B突变位点814C>T的高油酸突变体作为高油酸基因供体亲本的杂交后代AhFAD2B基因型检测。

在所述应用当中，若花生AhFAD2B的KASP标记SNP分型为C：C的，则待检测花生为普通油酸含量材料或其高油酸突变基因AhFAD2B属非814C>T突变类型；若花生AhFAD2B的KASP标记SNP分型为T：T或C：T的，则待检测花生材料高油酸突变基因AhFAD2B属814C>T突变类型。

权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生品种改良中的应用。

权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在鉴定高油酸花生品种或种质中的应用。

权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生分子标记辅助选择育种中的应用。

权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生AhFAD2B基因等位变异辅助筛选中的应用。

根据上述任意一项所述的应用，包括如下步骤：

(1)提取待检测花生样品的叶片或种子的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行高通量荧光PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)采用荧光检测仪对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行单倍型分析，当检测到仅含有FAM探针的荧光时，测试样品为携带C等位变异的纯合型材料，即野生基因型，记为BB；当检测到仅含有HEX探针的荧光时，则测试样品为携带T等位变异的纯合型材料，即突变基因型，记为bb；当同时检测到FAM探针和HEX探针的荧光时，则测试样品为携带C/T等位变异的杂合基因型材料，记为Bb。

所述步骤(2)中的高通量荧光PCR反应体系为5μL，包括2μL模板DNA：浓度20ng/μL、引物混合液0.07μL、2.5μL 2×KASP Master Mix、0.43μL ddH₂O。

所述步骤(2)中的高通量荧光PCR反应程序为：94℃预变性15min；第一步扩增反应：94℃变性20s，61-55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应：94℃变性20s，55℃退火并延伸60s，27个循环。

本发明的有益效果：

1、本发明针对高油酸花生AhFAD2B新型突变814C>T等位变异设计了高通量KASP分子标记基因分型的特异引物，可以有效鉴别该AhFAD2B新型突变体，解决了现有技术的鉴别方法只能鉴别AhFAD2B经典F435突变位点448G>A等位变异的问题。

2、本发明基于KASP高通量基因分型检测技术，根据目标基因AhFAD2B关键突变位点设计引物，利用引物末端碱基的特异匹配来对SNP进行精准的双等位基因分型。该方法无论与SSR还是PCR产物测序法、CAPS法、荧光定量PCR法、AS-PCR法或TaqMan探针法相比，具有高通量、结果准确可靠、快速高效、低成本等优势。

3、本发明可用于高通量检测杂交F1以及杂交、回交育种中的Bb基因型后代，通过对杂交后代的基因型检测，选择出基因型为Bb的后代；能准确快速地选择出高油酸育种自交后代中AhFAD2B所有基因型，即BB、Bb和bb，有利于田间大规模筛选以814C>T新型突变基因AhFAD2B-814为供体亲本的高油酸后代单株，大大缩短了高油酸花生AhFAD2B-814新突变基因的转育进程，增加了高油酸性状选择的准确性，提高了育种效率。

附图说明

图1为KASP标记检测16份花生种质资源AhFAD2B-814位点C/T等位差异分型图。图中红色(用●表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为bb，蓝色(用■表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为BB，黑色(用◇表示)指示无模板对照(NTC)。

图2为KASP标记检测“冀花6号×C814T”杂交组合F1单株AhFAD2B-814位点C/T等位差异分型图。图中蓝色(用■表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为BB，绿色(用▲表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为Bb，黑色(用◇表示)指示无模板对照(NTC)。

图3为KASP标记检测“冀花6号×C814T”杂交组合F2群体单株AhFAD2B-814位点C/T等位差异分型图。图中红色(用●表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为bb，蓝色(用■表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为BB，绿色(用▲表示)指示待检测花生AhFAD2B基因的基因型为Bb，粉色(用○表示)指示KASP PCR扩增产物无信号或信号弱，黑色(用◇表示)指示无模板对照(NTC)。

图4为“冀花6号×C814T”杂交组合F2群体4个单株AhFAD2B-814位点测序结果。图中箭头所指为AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基测序峰图，201508-15和201508-33单株在第AhFAD2B-814位为T碱基纯合，201508-28为C碱基纯合，201508-61为C/T杂合基因型。

图5为“冀花6号×C814T”杂交组合F2群体90个bb基因型单株采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.6引物组检测AhFAD2B-814位点C/T等位差异分型图。图中红色(用●表示)指示结果为bb基因型，绿色(用▲表示)指示结果为Bb基因型，粉色(用○表示)指示KASP PCR扩增产物无信号或信号弱，黑色(用◇表示)指示无模板对照(NTC)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下对本发明的原理和特征进行描述，所述实施例仅用于说明本发明，但并非用于限定本发明的范围。

所述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

所述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

所述实施例中所使用的引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

所述实施例中所使用的花生种质、品种均由河北省农林科学院粮油作物研究所提供，公众可以从河北省农林科学院粮油作物研究所获得。

实施例1用于检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记设计及其专用引物开发

本发明涉及的高油酸花生油酸含量相关基因为AhFAD2B及其突变基因AhFAD2B-814。

一、供试花生材料及其基因组DNA的提取

1、供试花生材料选取

本发明供试花生材料为高油酸花生新型突变体C814T、高油酸花生品种冀花16号、普通油酸含量花生品种冀花5号，这些花生品种的AhFAD2B基因型已经有报道(具体参见中国专利文献“一种高油酸花生突变基因AhFAD2B-814及应用”，申请号201810774992.1)，其中C814T的AhFAD2B基因型为bb(814C>T型)，冀花16号的AhFAD2B基因型为b’b’(448G>A型，即F435型)，冀花5号的AhFAD2B基因型为BB。

2、基因组DNA的提取

(1)取少量幼嫩花生叶片(约1g)置于研钵中，用液氮研磨至粉状，加入已经在65℃水浴中预热的700μL 2％CTAB和0.2β-巯基乙醇抽提缓冲液中，轻轻混匀；

(2)置于65℃的水浴槽中，每隔10min轻轻摇动混匀一次，40min后取出；

(3)置于室温冷却5min后，加入300μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，剧烈振荡充分混匀2-3min；

(4)放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600μL的4℃预冷的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

(5)移液器轻轻吸取离心管上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，-20℃放置30min；

(6)在离心机上10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出；

(7)用70％的乙醇洗涤沉淀2-3次，将离心管倒立于铺开的纸巾上，室温下风干；

(8)加入50μL 0.5×TE(含0.5μL RNase 10mg/mL)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱1h，使RNA消解；

(9)取0.5μL样品用紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度，结果显示提取的样品DNA A260/A280比值介于1.8-2.0，表明所提取的DNA纯度较高，根据测定的浓度值将样品浓度统一调整为20ng/μL。

(10)置于-20℃保存，备用。

二、检测AhFAD2B基因814位C>T置换突变的高通量分子标记引物开发

采用文献“Zhao S,Li A,Li C,Xia H,Zhao C,Zhang Y,Hou L,WangX.Development and application of KASP marker for high throughput detection ofAhFAD2 mutation in peanut.Electronic Journal of Biotechnology,2017,25:9-12”中开发的基于F435型高油酸花生AhFAD2A基因448位G>A等位变异和AhFAD2B基因442位->A等位变异的KASP标记分别扩增C814T、冀花16号和冀花5号基因组DNA，结果显示，检测的3个花生材料AhFAD2A基因分型均与F435型AhFAD2A一致；AhFAD2B基因分型结果材料间存在差异，其中高油酸花生C814T与普通油酸含量花生品种冀花5号中AhFAD2B基因442位碱基的SNP分型均为双缺失的-：-基因型，即野生基因型；而高油酸花生品种冀花16号中AhFAD2B基因442位碱基的SNP分型均为A：A基因型，即第442位为A碱基纯合，为突变基因型。因此，说明该KASP标记不能用于高油酸花生C814T中AhFAD2B分子标记辅助育种，也表明C814T中的AhFAD2B基因突变类型不同于冀花16号(F435型突变)，需要进一步开发适用于C814T的SNP共显性分子标记。

根据文献“Chu Y,Holbrook CC,Ozias-Akins P.Two alleles of control thehigh oleic acid trait in cultivated peanut.Crop Science,2009,49(6):2029-2036.”和文献“Chu Y,Wu CL,Holbrook CC,Tillman BL,Person G,Ozias-AkinsP.Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleictrait in peanut.The Plant Genome Journal,2011,4(2):110-117.”所使用的花生AhFAD2B基因特异引物如下：

bF19:5’-cagaaccattagctttg-3’

R1/FAD:5’-ctctgactatgcatcag-3’

AhFAD2B基因特异性扩增PCR反应体系(25μL)：40ng基因组DNA，2.5μL含15mMMgCl2的10×Buffer；1.0μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA高保真聚合酶；2.0μL浓度均为10μM的上下游混合引物；ddH2O补足为25μL。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；扩增反应，94℃变性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃最终延伸7min；4℃保存。

分别扩增出了C814T、冀花16号和冀花5号中AhFAD2B基因序列全长，切胶回收，PCR产物送北京华大基因测序。将序列进行比对发现，上述花生材料的AhFAD2B基因开放读码框内存在2个SNP位点，一个是在AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第442位碱基处，冀花5号和C814T为1个碱基缺失，而冀花16号为A，存在-/A单碱基等位变异；另一个是在AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基处，冀花5号和冀花16号为C，而C814T为T，存在C/T单碱基等位变异。

相应的，在KASP高通量检测中，若该SNP分型为C：C基因型，则以待测花生样品基因组DNA为模板，采用引物对bF19和R1/FAD进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基处为C的纯合型(即扩增产物单一，如SEQ ID No.4所示)，AhFAD2B基因型为BB；若该SNP分型为T：T基因型，则以待测花生样品基因组DNA为模板，采用引物对bF19和R1/FAD进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基处为T的纯合型(即扩增产物单一，如SEQ ID No.5所示)，AhFAD2B基因型为bb；若该SNP分型为C：T基因型，则以待测花生样品基因组DNA为模板，采用引物对bF19和R1/FAD进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基处为C/T的杂合型(即扩增产物为两种，分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示)，AhFAD2B基因型为Bb。

根据AhFAD2B基因突变信息特点，设计高通量KASP分型引物。利用Primer5.0软件(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html)设计包含AhFAD2B基因814位C>T位点的KASP分型引物，包括根据AhFAD2B-814位点设计2条特异性引物和1条通用引物，在2条特异性引物的3’末端碱基分别包含AhFAD2B-814位点的2个等位变异。设计引物时，为了保证引物的特异性，除考虑AhFAD2B基因814位C/T的SNP等位差异外，还要充分考虑AhFAD2A和AhFAD2B基因序列开放阅读框区序列相似性高和差异碱基少等特点，二者仅存在10-11个碱基的差异，而且要尽可能保证扩增片段在150bp以内。所以，将用于区分C/T等位差异的引物AhFAD2B-814F/C和AhFAD2B-814F/T设计为基因的反向互补序列，C/T差异位于引物的3’端，并且在该2个引物的5’端分别标记了标签序列A和标签序列B，这2条加尾序列与LGC公司KASP Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针A和通用荧光探针B序列相同，该两个探针的5’端分别标记了FAM荧光基团和HEX荧光基团。具体序列设计如下：

用于高通量检测的KASP分子标记序列如下，

AhFAD2B-814F/C：

AhFAD2B-814F/T：

针对SNP位点，上述引物3’端为等位变异碱基(斜体下划线部分G或A)。将该2个特异引物5’端加上的相应的通用接头序列(荧光标签序列)分别是，

标签序列A：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(FAM荧光标签序列)；

标签序列B：5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(HEX荧光标签序列)；

进一步得到相应的KASP高通量检测分子标记引物序列如下，

SEQ ID No.1：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctAATCATAGTGAGGCAATGATGCATG-3’(其中gaaggtgaccaagttcatgct为FAM荧光标签序列，AATCATAGTGAGGCAATGATGCATG为AhFAD2B基因野生型开放读码框区自5’端第813-838位碱基的反向互补序列)；

SEQ ID No.2：

5’-gaaggtcggagtcaacggattATCATAGTGAGGCAATGATGCATA-3’(其中gaaggtcggagtcaacggatt为HEX荧光标签序列，ATCATAGTGAGGCAATGATGCATA为AhFAD2B基因突变型开放读码框区自5’端第813-837位碱基的反向互补序列)。

等位差异检测所使用的反向通用引物AhFAD2B-814R/common设计为基因的正向序列，靠近引物的3’端包含1个与AhFAD2A基因差异的碱基，体现AhFAD2A和AhFAD2B基因序列差异。具体序列设计如下：

SEQ ID No.3：通用引物AhFAD2B-814R/common序列如下，

(该单链DNA为AhFAD2B基因突变型开放读码框区自5’端第693-721位碱基序列。斜体下划线部分T为AhFAD2B和AhFAD2B基因的A和B基因组之间的SNP位点，即AhFAD2B基因开放读码框区5’端第721位碱基。)

上述所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2高通量KASP分子标记检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因突变位点814C>T的方法建立

一、基因组DNA的提取

花生品种叶片基因组DNA的提取参见实施例1步骤一。

二、PCR扩增反应

以上述步骤一提取的基因组DNA为模板，采用实施例1开发的用于检测花生AhFAD2B基因的KASP标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

KASP基因分型PCR反应体系(5μL)：包括2μL模板DNA(浓度约20ng/μL)、引物混合液0.07μL、2.5μL 2×KASP Master Mix、0.43μL ddH₂O。

其中，引物混合液中的引物AhFAD2B-814F/C和AhFAD2B-814F/T的终浓度均为12μM，通用引物AhFAD2B-814R/common终浓度为25μM。LGC公司产品2×KASP Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶、dNTP等组成，荧光探针A的序列为5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’，5’末端连接FAM荧光基团；荧光探针B的序列为5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接HEX基团；相应于荧光探针A和荧光探针B，各设计一个3’末端淬灭探针，即淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。

KASP反应在LGC SNPline XL水浴PCR仪中进行。KASP基因分型PCR反应程序：94℃预变性15min；第一步扩增反应：94℃变性20s，61-55℃梯度退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应：94℃变性20s，55℃退火并延伸60s，27个循环。

PCR反应体系中同时设置不加模板DNA的阴性对照(NTC)。

三、PCR产物的荧光扫描

当PCR反应结束后，反应温度降至4℃以下采用BIO-RAD CFX荧光定量PCR仪对KASP反应产物进行荧光数据读取。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。数据分析使用LGC公司的SNPViewer软件进行。

四、AhFAD2B等位基因分型

对于AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第814位碱基等位差异检测，使用两种荧光探针(分别识别等位基因引物5’端的加尾序列)，标记有FAM的探针与野生基因型完全匹配，标记有HEX的荧光探针与突变基因型完全匹配。

采用SNPViewer软件对KASP扩增反应荧光结果进行分析，按照分型明确、阴性对照NTC无特异性扩增的原则进行待测花生样品的AhFAD2B基因SNP分型：当检测到仅有FAM荧光时，则第814位为C碱基纯合，为野生基因型BB；当检测到仅有HEX荧光时，则第814位为T碱基纯合，即为突变基因型bb；同时存在FAM和HEX两种荧光时，为杂合基因型Bb。

具体而言，若待检测花生材料扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈红色，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为bb(SNP分型为T：T基因型)；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈现蓝色，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为BB(SNP分型为C：C基因型)；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经SNPViewer软件分析在所得的分型聚类图中呈现绿色，则所述待检测花生AhFAD2B基因的基因型为Bb(SNP分型为C：T基因型)。分型聚类图中出现粉色可能是因DNA质量较差或者浓度较低，扩增产物无信号或信号弱，紫色为有信号但无明显分型，黑色(位于左下角)为空白对照NTC。

实施例3高通量KASP分子标记在高油酸花生种质鉴定和育种中的应用

一、供试花生材料的选取

1、供试花生种质材料包括：经过AhFAD2B基因全长测序后已知序列信息的16份花生材料，如表1所示，其中AhFAD2B基因为BB基因型的材料10份：远杂9102、花育20号、冀11-17-7-3、冀3-1-3、冀花20号、冀花6号、KX01-6、冀花11号、冀花19号、冀花13号；AhFAD2B基因为bb基因型的材料5份：C814T、201508-412、201508-957、201521-602、201511-023；AhFAD2B基因为Bb基因型的材料1份：201511-0481。

表1用于高通量KASP分子标记检测的花生材料

2、供试花生杂交育种及后代包括：采用高油酸花生突变体C814T与普通油酸含量品种杂交，后代进行自交获得F2分离单株。具体为：于2015年6月花生开花期利用高油酸突变体C814T为父本，与普通油酸含量品种冀花6号组配杂交组合，采用套龙骨瓣杂交授粉技术进行有性杂交，当年10月初收获杂交果，获得杂交种子44粒。2016年5月在石家庄鹿泉区三五零二农场花生育种基地种植F1，单粒播种，自交繁殖，淘汰伪杂株，当年9月中旬成熟后分组合按单株收获，不做选择，分别晾晒，获得38个单株。2017年5月按株行分别种植F2单株，单粒播种，成熟后不做选择，仍按单株收获，2个组合分别获得1071个单株。

二、高通量KASP分子标记检测

利用本发明实施例1中开发的KASP分型标记和实施例2中的高通量KASP分子标记方法体系，分析供试花生材料、育种亲本及其后代的基因型。同时，利用近红外品质测试技术测定供试花生材料的油酸含量，采用目标片段PCR扩增产物直接测序方法确定AhFAD2B-814位点的基因型，进而统计高通量KASP标记检测基因型结果与油酸表型结果的吻合度，以及验证KASP基因型检测分型的准确性。

1、利用KASP标记鉴定花生资源的基因型

利用高通量KASP分子标记体系分析供试的16份花生材料的AhFAD2B基因型，样品检测结果如图1所示，根据AhFAD2B的814位C>T突变位点设计的KASP标记引物将16份花生材料进行SNP分型得到C：C、C：T和T：T三种基因型，分别对应为：BB、Bb和bb基因型。左下角显示◇(代表黑色)的样本为每个PCR板的空白对照，聚合在接近X轴的显示■(代表蓝色)的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型(BB)，聚合在接近Y轴上的显示●(代表红色)的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型(bb)，中间显示▲(代表绿色)的样本的基因型为两种等位基因的杂合型(Bb)，显示○(代表粉色)的样本由于DNA质量较差或浓度低，扩增产物没有被明确分型。

参照PCR产物直接测序结果，本发明高通量KASP分子标记检测体系对16份花生材料获得分型结果与测序结果高度吻合，说明本发明应用的可靠性和准确性高。

参考文献“Chu Y,Ramos L,Holbrook CC,Ozias-Akins P.Frequency of a loss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase(ahFAD2A)in the mini-core of theU.S.peanut germplasm collection.Crop Science,2007,47(6):2372-2378”方法对AhFAD2B的同源基因AhFAD2A进行基因型鉴定，结合本发明对AhFAD2B基因型的鉴定结果，综合分析显示，AhFAD2A基因448位G>A和AhFAD2B基因814位C>T同时发生突变，即基因型为aabb，其油酸含量可达到80％以上，如C814T、201508-412、201508-957、201521-602、201511-023；若只有AhFAD2A基因448位G>A突变，而AhFAD2B基因814位C>T不发生突变，即基因型为aaBB，花生油酸含量在70％以下，如201511-0481；若AhFAD2A-448位和AhFAD2B-814位均未发生突变，即基因型为AABB，其油酸含量仅为39.7％-44.3％，属普通油酸材料，如远杂9102、花育20号、冀11-17-7-3、冀3-1-3、冀花20号、冀花6号。综上，油酸含量表型结果能基本反映基因型差异。

将KASP分型结果与油酸含量表型对比还发现，F435型高油酸花生品种(冀花11号、冀花13号和冀花19号)的AhFAD2A基因448位G>A和AhFAD2B基因442位插入A同样可以产生高油酸表型，但采用本发明建立的基于AhFAD2B-814位点的KASP标记并未发现有等位变异，说明本发明的KASP高通量检测体系在筛选和检测AhFAD2B基因814位C>T基因型高油酸花生材料中具有高度的特异性。

2、利用KASP标记检测冀花6号×C814T后代基因型

采用本发明的高通量KASP分子标记检测体系分析了“冀花6号×C814T”杂交组合F1单株50个和F2群体单株1071个。由于检测野生型位点的引物AhFAD2B-814F/C 5’端标记了FAM荧光标签序列，而检测突变型位点的引物AhFAD2B-814F/T标记了HEX荧光标签序列，因此当检测到仅有FAM荧光时，第814位为C碱基纯合，即为野生基因型BB；当仅有HEX荧光时，第814位突变T碱基纯合，即为突变基因型bb；同时存在FAM和HEX两种荧光时，即为杂合基因型Bb。图2和图3分别显示了部分F1和F2世代单株AhFAD2B基因C/T等位差异分型结果。通过一次PCR反应即可鉴别出待测花生样品的基因型是显性纯合体BB、隐性纯合体bb或者杂合体Bb。

利用KASP分子标记分型检测了50个F1单株，发现46个单株检测到同时存在FAM和HEX两种荧光，说明这46个单株为杂合基因型Bb，属于真杂种，即在图2中显示绿色荧光(即▲表示)的部分材料；而有4个单株仅有FAM荧光，说明这4株为野生基因型BB，为野生母本基因型，属于假杂种，即在图2中显示蓝色荧光(即■表示)的部分材料，需要在田间选择时淘汰。对这4个单株AhFAD2B基因序列目标区段进行测序验证也表明，AhFAD2B基因开放阅读框区自5’端第814位为C碱基纯合。综上，实验证明本发明可用于高通量检测F1杂交种子鉴定，通过后代单株检测，选择基因型为Bb的真杂种后代，及时剔除BB基因型假杂种，能极大提高目标性状选择的准确性，大大减少后期选育工作量，实现高油酸花生高效育种。

利用KASP分子标记分型检测了1071个F2单株，基因分型结果显示，KASP标记可以将F2群体分为3种基因型，基因型1：野生型，样本中仅含有纯合基因BB；基因型2：突变型，样本中仅含有纯合基因bb；基因型3：杂合型，样本中同时含有等位基因B和等位基因b。结果如图3显示，野生BB基因型有246个单株(即■表示)，突变bb基因型有228个单株(即●表示)，杂合基因型有515个单株(即▲表示)，另有82个单株的基因型无法准确确定(即○表示)，仅占F2群体单株总量的7.7％。从检测出的基因型分离比例来看，AhFAD2B基因突变位点814G>T在F2群体呈现1:2:1的分离比例(表2)，符合孟德尔单基因遗传规律，因此本发明KASP标记分型可以有效区分后代单株高油酸基因突变位点的基因型。

采用实施例1步骤二方法，使用bF19和R1/FAD引物组，从F2群体中选取4个单株进行AhFAD2B基因序列目标区段PCR扩增产物测序，对KASP分型结果进行验证。测序结果表明，201508-15和201508-33单株在AhFAD2B-814位点均携带有T等位变异，201508-28单株在AhFAD2B-814位点携带有C等位变异，201508-61单株在AhFAD2B-814位点为C/T杂合基因型。4个单株AhFAD2B基因目标序列的测序结果与KASP分型结果一致(图4)。

综上，在以AhFAD2B-814为高油酸供体基因源的杂交组合后代KASP标记选择时，基因型为bb的后代单株，可以作为高油酸基因纯合材料进一步进行扩繁和小区试验，筛选高产、多抗高油酸品种；基因型为Bb的后代可进一步自交，最终获得基因型为bb的后代，作为种质材料用于高产、高油酸新品种的培育。实验证明，本发明开发的KASP标记准确可靠，应用方便快捷，提高了高油酸花生育种效率，加快了育种进程。

表2 KASP标记检测AhFAD2B的突变位点在F2群体中的遗传分离

实施例4用于检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的非特异KASP标记设计与应用

本发明还设计了另外一组针对高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记引物，本实验根据AhFAD2B基因814C>T等位变异设计2条特异性引物仍采用实施例1步骤二中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。作为对比例，本实施例设计的通用引物由25个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因开放阅读框区自5’端第753-777位碱基序列，核苷酸序列见序列表中SEQ ID No.6所示。该通用引物设计时未考虑花生AhFAD2A和AhFAD2B同源基因之间序列上具有高度的相似性，引物的3’末端碱基未包含AhFAD2A和AhFAD2B基因之间的SNP差异位点。

选取实施例3中“冀花6号×C814T”杂交组合F2群体中已知基因型为bb的90个单株，采用本发明前述的KASP检测程序及方法，应用本实施例设计的引物组，即SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.6，进行KASP荧光检测。将所获得的扩增产物进行荧光信号扫描，采用SNPViewer软件对扫描数据进行分析，结果如图5所示，所有的90个bb纯合基因型单株中有73个被错误的显示为Bb杂合基因型(即▲表示的样品)，有15个单株样品未能检测出(即○表示的样品)，仅有2个样品被显示为突变型bb基因型(即●表示的样品)。造成样品基因型检测结果错误的原因在于，本对比例采用的通用引物SEQ ID No.6设计在AhFAD2A和AhFAD2B基因序列完全一致的区段内，引物SEQ ID No.2和引物SEQ ID No.6组合配对PCR将含AhFAD2B-814突变位点的区段扩增出来的同时，引物SEQ ID No.1和引物SEQ ID No.6组合配对也将AhFAD2A基因同源区段扩增出来，造成A、B亚基因组间的PCR杂合产物，最终呈现出Bb杂合基因型的结果。

综上，结果表明，本发明建立的用于检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP分型标记具有较高的准确性和适用性。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所

<120> 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc taatcatagt gaggcaatga tgcatg 46

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tatcatagtg aggcaatgat gcata 45

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<400> 3

acatatctgc tatatcacat agcaactt 28

<210> 4

<211> 512

<212> DNA

<400> 4

gcagacccta tgatagattt gcaagccact atgaccctta tgctcccata tactctaaca 60

gggaaaggct tctaatttat gtctcagatt catctgtctt tgctgtaaca tatctgctat 120

atcacatagc aactttgaaa ggtttgggtt gggtggtatg tgtttatggg gtgccattgc 180

tcattgtgaa tgggtttcta gttaccataa cctatttgca gcacacacat gcatcattgc 240

ctcactatga ttcatccgaa tgggactggt taagaggagc attggcaaca gtggacagag 300

attatgggat actgaataag gcatttcatc atataactga tacgcatgtg gctcatcatt 360

tgttctcaac aatgcctcat taccatgcaa tggaagcaac caatgcaata aagccaatat 420

tgggtgatta ctaccaattt gatggcaccc cagtttacaa agcattgtgg agagaagcca 480

aagagtgcct ctatgtggag ccagatgatg ga 512

<210> 5

<211> 512

<212> DNA

<400> 5

gcagacccta tgatagattt gcaagccact atgaccctta tgctcccata tactctaaca 60

gggaaaggct tctaatttat gtctcagatt catctgtctt tgctgtaaca tatctgctat 120

atcacatagc aactttgaaa ggtttgggtt gggtggtatg tgtttatggg gtgccattgc 180

tcattgtgaa tgggtttcta gttaccataa cctatttgca gcacacatat gcatcattgc 240

ctcactatga ttcatccgaa tgggactggt taagaggagc attggcaaca gtggacagag 300

attatgggat actgaataag gcatttcatc atataactga tacgcatgtg gctcatcatt 360

tgttctcaac aatgcctcat taccatgcaa tggaagcaac caatgcaata aagccaatat 420

tgggtgatta ctaccaattt gatggcaccc cagtttacaa agcattgtgg agagaagcca 480

aagagtgcct ctatgtggag ccagatgatg ga 512

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<400> 6

tggggtgcca ttgctcattg tgaat 25

Claims (10)

1.一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述引物组为检测高油酸花生C814T中AhFAD2B基因814位C>T突变位点的KASP标记分型引物组，包括：

带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

AhFAD2B基因通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述带有标签序列A的野生型AhFAD2B基因特异引物，标签序列A为SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列A的核苷酸序列与5’端标记了FAM荧光基团的通用荧光探针A的核苷酸序列一致；该野生型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示的第22-46位单链DNA，是野生型AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第813-837位碱基的反向互补序列。

3.根据权利要求1所述的一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，所述带有标签序列B的突变型AhFAD2B基因特异引物，标签序列B为SEQ IDNo.2所示核苷酸序列的第1-21位，该标签序列B的核苷酸序列与5’端标记了HEX荧光基团的通用荧光探针B的核苷酸序列一致；该突变型AhFAD2B基因特异引物的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示的第22-45位单链DNA，是突变型AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第813-838位碱基的反向互补序列。

4.根据权利要求1所述的一种高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组，其特征在于，AhFAD2B基因通用引物，其核苷酸序列为AhFAD2B基因开放读码框区自5’端第693-721位碱基序列。

5.含有权利要求1所述引物组的用于高油酸花生C814T中AhFAD2B基因分型的检测试剂盒。

6.权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生品种改良中的应用。

7.权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在鉴定高油酸花生品种或种质中的应用。

8.权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生分子标记辅助选择育种中的应用。

9.权利要求1所述引物组或权利要求5所述试剂盒在高油酸花生AhFAD2B基因等位变异辅助筛选中的应用。

10.根据权利要求6-9任意一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检测花生样品的叶片或种子的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行高通量荧光PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)采用荧光检测仪对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行单倍型分析，当检测到仅含有FAM探针的荧光时，测试样品为携带C等位变异的纯合型材料，即野生基因型，记为BB；当检测到仅含有HEX探针的荧光时，则测试样品为携带T等位变异的纯合型材料，即突变基因型，记为bb；当同时检测到FAM探针和HEX探针的荧光时，则测试样品为携带C/T等位变异的杂合基因型材料，记为Bb。