BRPI1106716B1 - método para identificar uma planta compreendendo pelo menos um marcador de resistência associado ao nemátodo do cisto de soja (scn) em uma variedade de soja e conjunto de iniciadores - Google Patents

Abstract

MARCADORES DE SOJA LIGADOS A RESISTÊNCIA A SCN - Esta descrição se refere a composições e métodos para identificar o fenótipo resistente a SCN em soja. Em algumas modalidades, a descrição se refere a métodos para a realização de reprodução assistida por marcadores e seleção de plantas que transportam um ou mais determinantes de resistência a SCN em soja.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório norte-americano N° de série 61/410,783, depositado em de novembro de 2010, cuja descrição fica aqui incorporada na sua totalidade para esta referência.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente descrição refere-se à resistência a doenças de plantas. Em algumas modalidades, a descrição se refere à resistência ao nemátodo do cisto da soja (SNC) em soja. Em modalidades particulares, a descrição se refere a composições e métodos para a identificação de uma característica de resistência a SNC em um organismo, por exemplo, marcadores moleculares que estão intimamente ligados à resistência a SNC. Modalidades adicionais se referem a composições e métodos para a introdução de uma característica de resistência a SNC em um organismo hospedeiro, por exemplo, usando marcadores moleculares fortemente ligados à resistência a SNC.

ANTECEDENTES

[0003] A soja, Glycine max, é uma das principais culturas cultivadas no mundo econômico como fonte primária de óleo vegetal e proteína. A crescente demanda por um colesterol baixo e dietas com alta fibra aumentou a importância da soja como um alimento. Mais de 10.000 variedades de soja já foram introduzidas nos Estados Unidos, das quais um número limitado forma a base genética das cultivares desenvolvida a partir de hibridação e seleção de programas. Johnson e Bernard, The Soybean, Norman Ed., Academic Press, N.Y., 1 - 73 pp, 1963.

[0004] Nemátodo de cisto da soja (SNC, Heterodera glycines (HG) Ichinohe) é a única praga mais prejudicial que afeta a soja nos EUA, assim como na maioria dos outros principais países produtores de soja do mundo. A redução na produção estimada nos Estados Unidos foi entre aproximadamente 2,9 e 3,4 milhões de toneladas em 2003 e 2004, que resultou em uma perda anual estimada em aproximadamente US $ 1,5 bilhões. Wrather et al. (2001); Wrather e Koenning (2006). O fenótipo de SNC é uma característica muito complexa, que é controlado por vários genes, tanto recessivos quanto dominantes. Concibido et al. (2004). Fenotipagem de SNC é demorada, de custo e trabalho intensivo.

[0005] Infecção por SNC provoca vários sintomas que podem incluir a clorose das folhas e caules, necrose de raízes, perda no rendimento de sementes, e supressão de crescimento de raiz e ramo. Os sintomas de infecção por SNC acima não são exclusivos à infecção por SNC, e poderiam ser confundidos com deficiência de nutrientes, em particular deficiência de ferro, estresse da seca, lesões herbicidas ou outra doença. Os primeiros sinais de infecção são os grupos de plantas com amarelecimento das folhas que têm crescimento retardado. O patógeno também pode ser difícil de detectar nas raízes, uma vez que as raízes atrofiadas são também um sintoma comum de estresse ou de doenças de plantas. Fêmeas adultas e cistos de SNC são de cerca de 1 / 32 de polegada de comprimento e, assim, visíveis sem ampliação. Observação de fêmeas adultas e cistos nas raízes é a única maneira precisa para detectar e diagnosticar a infecção por SNC no campo.

[0006] A presença de SNC geralmente não é óbvia no momento da infestação inicial do solo. A densidade populacional de SNC deve aumentar no solo até que seja suficiente para causar sintomas acima do solo em plantas ou uma diminuição no rendimento. Densidades populacionais podem levar vários anos para chegar a números significativos. Assim, os danos de SNC atuais é o resultado de infestações que têm crescido por vários anos. Apesar da soja ser o hospedeiro primário de SNC, outras leguminosas podem servir como hospedeiras, por exemplo: feijão verde, feijão-vagem, feijão em grão, feijão vermelho, feijão de lima, feijão mungo, feijão bush, feijão Adzuki, ervilhas, e feijão fradinho. Existem 30 dias no ciclo de vida de SNC. Assim, uma única estação de crescimento abrange várias gerações do parasita. Além disso, os ovos de SNC podem permanecer intactos no solo por vários anos antes de chocar.

[0007] No passado, uma população de SNC foi dada como uma designação de "raça", comparando a sua reprodução em um conjunto de quatro linhas de germoplasma de soja com aquela em um padrão de cultivares de soja suscetíveis a SNC. O esquema de raça mais comumente usado identificou 16 raças de SNC. A designação de raça permitiu nematologistas e criadores de soja de compartilhar informações sobre a capacidade de certas populações de SNC para reproduzir em variedades de soja que contêm certos genes para resistência a SNC.

[0008] Em 2003, o teste do tipo HG foi desenvolvido para substituir o teste de raça. Este novo teste inclui sete fontes de resistência (linhagens de germoplasma) e os resultados são mostrados como uma porcentagem, indicando o quanto a população de nemátodos de uma amostra de solo aumentou em cada uma das sete linhagens. Este teste indica que fontes de resistência seriam boas para um campo específico a ser testado, e que seriam pobres. Uma vez que as fontes genéticas de resistência são atualmente limitadas em variedades de soja disponíveis no mercado, é importante mudar essas "fontes de resistência" para retardar o acúmulo de uma população de SNC virulenta.

[0009] Logo após a descoberta do SNC nos Estados Unidos, fontes de resistência a SNC foram identificadas. Ross e Brim (1957) Plant Dis. Rep. 41:923 4. Algumas linhagens, como Pequim e Pl 88.788, foram rapidamente incorporadas em programas de melhoramento. Pequim tornou-se amplamente utilizada como fonte de resistência devido à sua falta de características agronomicamente indesejáveis, com Pickett como o primeiro cultivar resistente a SNC liberado. O reconhecimento de que certas populações resistentes a SNC poderiam superar cultivares resistentes levou a uma ampla triagem por fontes adicionais de resistência a SNC. Pl 88788 surgiu como uma fonte popular de raça 3 e 4 de resistência, embora tivesse um índice de cisto superior a 10% (mas menos de 20%) contra a raça 4, e Pequim e seus derivados emergiram como uma fonte popular para as raças 1 e 3. Pl 437654 foi posteriormente identificado como tendo resistência a todas as raças conhecidas e sua resistência a SNC foi descrita em Forrest. Atualmente, existem mais de 130 Pis conhecidos por terem resistência a SNC. Pl 209332 e Pl 90.763 são outros exemplares de linhagens de sementes de soja resistentes a SNC. Nem todas as variedades com a mesma fonte de resistência têm rendimentos comparáveis, nem respondem de forma idêntica a SNC.

[00010] Variedades de soja resistentes são a ferramenta mais eficaz disponível para lidar com SNC. Densidades de SNC geralmente diminuem quando as sojas resistentes são cultivadas porque a maioria dos SNC jovens é incapaz de alimentar e se desenvolver nas raízes das variedades resistentes. No entanto, em qualquer campo naturalmente infestado, poucos SNCs jovens (< 1%) serão capazes de se reproduzir nas variedades resistentes atualmente disponíveis. O número de SNC jovens que pode reproduzir em variedades de soja resistentes pode aumentar quando as variedades resistentes são cultivadas repetidamente. Eventualmente, a população de SNC pode ser capaz de se reproduzir tão bem em uma variedade resistente como uma variedade suscetível se a soja resistente a SNC for cultivada cada vez que a soja é produzida em um campo infestado. Felizmente, o número de SNC jovem que pode se reproduzir em variedades resistentes diminui quando variedades de soja suscetíveis são cultivadas porque estes nemátodos não competem bem por alimentos com os outros SNCsjovens no solo que não pode alimentaras variedades resistentes.

[00011] Raça 3 de SNC é considerada como sendo a raça mais proeminente no Meio-Oeste dos estados produtores de soja. Um esforço considerável tem sido dedicado à genética e melhoramento para resistência à raça 3. Embora ambos Pequim e PI 88.788 sejam resistentes à raça 3 do SNC, estudos de genética clássica sugerem que eles abriguem diferentes genes de resistência à raça 3. Rao Arelli e Anand (1988) Crop Sci.. 28:650 2. Resistência à raça 3 está provavelmente sob o controle de três ou quatro genes diferentes. Id;. Vide também Mansur et al. (1993) Crop Sci.. 33:1249 53. Um maior QTL resistente a SNC que mapeia a ligação do grupo G é rhg 1. Concibido et al. (1996) Theor. Appl. Genet. 93:234 41. Outros QTLs de resistência a SNC mapeiam para grupos de ligação A2, C1, M, D, J, L25, L26, e K. Id;. Patente US 5.491.081. QTLs de resistência a SNC se comportam de uma maneira específica de raça, pelo menos por contabilização de diferentes proporções da variação fenotípica total com relação a raças diferentes de SNC. Concibido et al. (1997) Crop Sci.. 37:258 64. No entanto, o locus rhg 1 no grupo de ligação G pode ser necessário para o desenvolvimento de resistência a qualquer uma das raças SNC identificadas. Mas ver Qui et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98:356 64.

[00012] Marcadores que estão ligados a características de SNC incluem RFLPs, SSRs e SNPs. Os marcadores de SNP identificados nesta descrição podem ser usados para fazer genotipagem de SNC para apoiar um programa de melhoramento. Usar os marcadores de SNP atualmente divulgados para realizar genotipagem de SNC em apoio a um programa de melhoramento fornece: custo e economia de tempo, seleção precoce de progénie desejada e comercialização mais precisa e rápida de variedades de soja resistentes a SNC.

DESCRIÇÃO

[00013] Marcadores moleculares que estão ligados a um fenótipo de SNC podem ser utilizados para facilitar a seleção assistida por marcadores para a característica de resistência a SNC em soja. Seleção assistida por marcadores oferece vantagens significativas em relação ao tempo, custo e trabalho, quando comparada com fenotipagem de SNC. Surpreendentemente, é divulgado aqui que, entre os 15 marcadores de SNP identificado como estando dentro ou perto de regiões QTL de resistência a doenças de SNC no genoma da soja, que foram polimórficos em genótipos pais, apenas três estavam ligados à característica de resistência a SNC. Esses três marcadores de SNP, então, oferecem utilidade superior na seleção assistida por marcadores de variedades de soja resistentes a SNC.

[00014] Aqui descritos são marcadores moleculares de ácidos nucleicos que são ligados (por exemplo, ligados, intimamente ligados, ou extrema e fortemente ligados) a um fenótipo de resistência a SNC. Nos exemplos particulares, os marcadores moleculares podem ser marcadores de SNP. Também aqui descritos são métodos de uso de marcadores moleculares de ácidos nucleicos que estão ligados a um fenótipo de resistência a SNC, por exemplo, e sem limitação, para identificar as plantas com um fenótipo de resistência a SNC, introduzir um fenótipo de resistência a SNC em novos genótipos de planta (por exemplo, por meio de marcador de reprodução assistida ou de transformação genética), e cultivar as plantas que são suscetíveis a terem um fenótipo de resistência a SNC.

[00015] Além disso, são descritos meios para introduzir um fenótipo de SNC na soja e meios para a identificação de plantas com um fenótipo de SNC. Em alguns exemplos, um meio para a introdução de um fenótipo de SNC à soja pode ser um marcador que está ligado (por exemplo, ligado, fortemente ligado, ou extrema e intimamente ligado) a um fenótipo de SNC. Em alguns exemplos, um meio para a identificação de plantas com um fenótipo de SNC pode ser uma sonda que hibridiza especificamente um marcador que está ligado (por exemplo, ligado, fortemente ligado, ou extrema e intimamente ligado) a um fenótipo de SNC.

[00016] Também aqui descritos são plantas e produtos vegetais que são derivados de plantas tendo um fenótipo de SNC identificado utilizando marcadores moleculares descritos neste documento. Assim, plantas de soja que são produzidas por seleção assistida por marcadores usando um ou mais marcadores moleculares que estão ligados a um fenótipo de resistência a SNC são descritas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00017] As figuras 1a e 1b incluem uma lista de QTLs associados à resistência a SNC que foram relatados na literatura de SNC.

[00018] A figura 2 inclui uma representação do genoma de soja, incluindo cromossomos e grupos de ligação (GL).

[00019] A figura 3 inclui uma representação do cromossomo de soja 18 (grupo de ligação G), e QTLs e intervalos de QTL associados à resistência a SNC e SNPs localizados nele.

[00020] A figura 4 inclui uma representação do cromossomo de soja 8 (grupo de ligação A2), e QTLs e intervalos de QTL associados à resistência a SNC e SNPs localizados nele.

[00021] A figura 5 inclui uma representação do cromossomo de soja 11 (grupo de ligação B1), e QTLs e intervalos de QTL associados à resistência a SNC e SNPs localizados nele.

[00022] A figura 6 inclui uma representação do cromossomo de soja 20 (grupo de ligação I), e QTLs e intervalos de QTL associados à resistência a SNC e SNPs localizados nele.

[00023] A figura 7 inclui conjuntos de 24 cultivares relacionados a SNC de soja ou linhagens pais em quatro loci de SNP. Também está incluída uma tabela mostrando os 24 cultivares de soja e os pais de mapeamento de SNC utilizados. Na tabela, a primeira linha de amostras e as duas últimas amostras na segunda linha foram suscetíveis a SNC (verde), e as primeiras dez amostras na segunda linha foram resistentes a SNC (amarelo). As últimas três amostras na segunda linha foram linhagens pais de duas populações de mapeamento de SNC.

[00024] A figura 8 inclui grupos de 96 linhagens em três loci de SNPs que mostraram a cossegregação com a característica de resistência a SNC.

[00025] A figura 9 inclui a distribuição dos índices de SNC atribuídos às populações de mapeamento. O histograma mostra um intervalo de 0,01 a 3,8, com uma média de 0,63, e mediana de 0,465.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[00026] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequências explicativa são mostradas utilizando abreviações padrão para bases de nucleotídeos, conforme definido em 37 CFR § 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácidos nucleicos é mostrado, mas entende-se que o filamento complementar esteja incluído por qualquer referência ao filamento exibido. Na listagem de sequência de acompanhamento:

[00027] SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de iniciador usada em um ensaio de sistema de genotipagem KBiosciences Competitive Allele- Specific PCR SNP (Kaspar™) que é específico para o alelo rhg 1-3995: GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAATTATGTTGGGTTTTTTTTCTT TCTGT.

[00028] SEQ ID NO: 2 mostra uma segunda sequência de iniciador usada em um ensaio KASPAR™ que é específico para o alelo rhg1- 3995: TTTTCTTTCTGG GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATTATGTTGGGTTTT.

[00029] SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de iniciador reversa comum usada em um ensaio KASPAR™ para rhg 1-3995: GCCCAGAAAAAAGGGATAAATAACGGATA.

[00030] SEQ ID NO: 4 mostra uma sequência de iniciador usada em um ensaio KASPAR™ que é específico para o alelo NCSB_004074: GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTATGTTGTAACACAA ATTTGCACCTCAT.

[00031] SEQ ID NO: 5 mostra uma segunda sequência de iniciador usada em um ensaio KASPAR™ que é específico para o alelo NCSB_004074: GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGTTGTAACA CAAATTTGCACCTCAG.

[00032] SEQ ID NO: 6 mostra uma sequência de iniciador reversa comum usado em um ensaio KASPAR™ para NCSB_004074: CTATACAACTAAATCGTAATTCCATTGTAT.

[00033] SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de iniciador usada em um ensaio KASPAR™ que é específico para o alelo BARC_010889- 01691: GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAAAATAAAATTGATCATCACAT ATGGTTAG.

[00034] SEQ ID NO: 8 mostra uma segunda sequência de iniciador usada em um ensaio KASPAR™ que é específico para o alelo BARC_010889-01691: GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAAAAATAAAATTGATCATCACAT ATGGTTAA.

[00035] SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de iniciador reversa comum usado em um ensaio KASPAR™ para BARC_010889-01691: TAAGTGAGGGCAATGTATTAGTATYAAGTA.

[00036] SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência NCSB_004074 de marcador: CACGATTTTGTTGTGTTACATAAATTACTATACAACTAAATCGTAAT TCCATTGTATTAC[A/C]TGAGGTGCAAATTTGTGTTACAACATAATT GTAATTTTATTGTACGATAAAAACTATAAC

[00037] SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência BARC_010889- 01691 de marcador: CTCTTCACACCTTTAAGGAAGTTAGTACCATTCCACTATTCAAGTA TTTTTTTTAATTCAAAATTATTAAGTGAGGGCAATGTATTAGTATNA AGTA[C/T]TAACCATATGTGATGATCAATTTTATTTTTTCATGGCTTT GTCGAAAGTAACATTATATTGTGGTTTTAAATGAAAATCTGTGATTT GOAT.

[00038] SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência rhg1-3995 de marcador: TCTGATAACTATGACAGCATCTTCCAAGATAATGACTTCCAAGTTC CAACACTGGCTCTGTACATTTGAACTAATTTTATATCATTTATCTAT TGTGATTGAAATATAAAATTGAAGTGATGTGAACAATACAAATCAC ATCTTGAATTAAAATATCTAACAACTGGAACAAATAAGAGGCCCAG AAAAAAGGGATAAATAACGGATAACAAG[A/C]CAGAAAGAAAAAAA ACCCAACATAATTCCAACTTCAAAATTCACTCAATAAAAAGTTTAAC ATGTAAATTTACTTGGAAACAAAACTCATAACCAATAATAATAATAA TAAAAGAAATCAGTTTTATAGCATTAATTTGGGATGCTCTGCTTGTA TGCAAATGGCACAACCTTACCCTCAAGATTGCAAAACACAGATGA GTAACAGATGCAATGTGAATCAATAAAAAGTATTGTTGCGTTGTTG ATGACACAACCTTACTCATAAAAAATGCAT

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral de diversas modalidades

[00039] Modalidades particulares incluem três marcadores de SNP exemplares (rhg 1-3995, BARC_010889_01691 e NCSB_004074) que mostram a cossegregação com características de resistência do nemátodo de cisto da soja (SNC) em 96 linhagens de soja testadas. Marcadores que cossegregam com resistência a SNC estão ligados a essa característica e, portanto, podem ser úteis na seleção assistida por marcadores e melhoramento genético. Aqui também divulgada é uma estratégia usada para identificar esses três marcadores de SNP exemplares ligados à resistência a SNC. As posições de mapa físico destes três marcadores de SNP exemplares no genoma Glycine max são fornecidas. Usando os três marcadores de SNP exemplares aqui descritos, um ensaio específico utilizando sistema de genotipagem KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR SNP (Kaspar™) foi desenvolvido de forma rápida e precisa para identificar plantas carregando as características de resistência a SNC. Enquanto modalidades da invenção são descritas com base em três marcadores de SNP exemplares ligados à resistência a SNC, os versados na técnica irão apreciar que marcadores equivalentes adicionais podem ser identificados usando as técnicas descritas neste documento. Marcadores de SNP ligados à resistência a SNC podem ser usados, por exemplo, em genotipagem de SNC para selecionar indivíduos resistentes a SNC a partir de populações de reprodução de soja.

[00040] Resistência a nemátodo de cisto da soja (SNC) é uma característica muito complexa. Infestação por SNC pode ser causada por uma ou mais diferentes raças de Heterodera glycines, a resistência de cada uma das quais pode exigir diferentes genes de resistência localizados em diferentes grupos de ligação. Vide a Tabela 1. Os três marcadores divulgados na Tabela 1 estão todos localizados no grupo de ligação G. Os genes de resistência a SNC no grupo de ligação G é pensado como sendo responsável pela resistência às raças 3 e 14.

[00041] A estratégia aqui descrita é usada para identificar marcadores em grupos de ligação (por exemplo, A2, B1, e I) que estão ligados à resistência a SNC. Assim, métodos para identificar tais marcadores também são fornecidos. A estratégia geral também é usada para mapear outras características de interesse. A estratégia é mais eficiente do que estratégias de mapeamento tradicionais e pode ser particularmente útil em programas de reprodução molecular. Tabela 1: Fontes de Resistência a SNC

II. Termos

[00042] População de mapeamento: Como usado aqui, o termo "população de mapeamento"pode se referir a uma população de plantas usada para o mapeamento de gene. Populações de mapeamento são normalmente obtidas a partir de cruzamentos controlados de genótipos pai. Decisões sobre a seleção dos pais e tipo de acasalamento para o desenvolvimento de uma população de mapeamento, e o tipo de marcadores utilizados, dependem do gene a ser mapeado, da disponibilidade de marcadores, e do mapa molecular. Os pais de plantas dentro de uma população de mapeamento devem ter variação suficiente para a característica de interesse em ambas as sequências de ácido nucleico e o nível de fenótipo. Variação da sequência de ácido nucleico dos pais é usada para rastrear eventos de recombinação nas plantas da população de mapeamento. A disponibilidade de marcadores polimórficos informativos depende da quantidade de variação de sequência de ácido nucleico.

[00043] Retrocruzamentos: Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de retrocruzamentos tem sido amplamente utilizada há décadas para introduzir novas características em plantas. N. Jensen, Ed., Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um protocolo de retrocruzamento típico, a variedade original de interesse (pai recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (pai não recorrente) que carrega um gene de interesse a ser transferido. A progénie resultante deste cruzamento é, então, cruzada novamente com o pai recorrente, e o processo é repetido até que uma planta seja obtida em que praticamente todas as características desejadas morfológicas e fisiológicas da planta recorrente sejam recuperadas na planta convertida, além do gene transferido a partir do pai não recorrente.

[00044] Sistema de genotipagem PCR SNP de Específico para Alelo Competitivo (Kaspar™): Kaspar™ é um sistema homogêneo fluorescente disponível comercialmente para determinar genótipos SNP (KBiosciences Ltd., Hoddesdon, UK). Um ensaio KASPAR™ compreende uma "mistura de ensaio" específico de SNP, que contém três iniciadores não rotulados, e uma "mistura de reação", que contém todos os outros componentes necessários, por exemplo, um sistema de repórter fluorescente universal. Além dessas misturas, o usuário fornece, inter alia, um leitor de placas capas de FRET, placa (s) de microtitulação, e amostras de DNA que contêm cerca de 5 ng / L de DNA.

[00045] Um ensaio KASPAR™ típico compreende as etapas de: projetar iniciadores específicos de alelo (por exemplo, usando PrimerPicker ™, que é um serviço gratuito disponível pela internet no site da KBiosciences), preparação de mistura de reação incluindo os iniciadores alelo específico, misturar a mistura de reação em amostras de DNA em uma placa de microtitulação termociclagem, leitura da placa em um leitor de placas fluorescentes, e plotagem e pontuação dos dados fluorescentes. Dados a partir de cada amostra são plotados juntos em um gráfico bidimensional, onde os eixos x e y correspondem a valores de fluorescência FAM e VIC. Amostras tendo o mesmo cluster de genótipo SNP juntas no esquema (isto é, A/A, A/a, e a/a). Mais informações técnicas sobre o sistema de Kaspar, incluindo um guia de soluções para problemas comuns, é obtido através de KBiosciences Ltd. (por exemplo, KASPAR SNP Genotyping System Reagent Manual).

[00046] Ligado, fortemente ligado, ou extrema e intimamente ligado: Como usado aqui, ligação entre genes ou marcadores pode se referir ao fenômeno em que genes ou marcadores em um cromossomo mostram uma probabilidade mensurável de serem passados adiante juntamente com os indivíduos na próxima geração. Quanto mais perto, dois genes ou marcadores são um do outro, mais perto (1) esta probabilidade se torna. Assim, o termo "ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que são passados em conjunto com um gene com uma probabilidade superior a 0,5 (o que é esperado de segregação independente, onde os marcadores / genes estão localizados em cromossomos diferentes). Quando a presença de um gene contribui para um fenótipo de um indivíduo, marcadores que são ligados ao gene podem ser ditos como ligados ao fenótipo. Assim, o termo "ligado" pode se referir a uma relação entre um marcador e um gene, ou entre um marcador e um fenótipo.

[00047] Devido à proximidade de dois genes ou marcadores em um cromossomo estar diretamente relacionada com a probabilidade de que os genes ou marcadores serão passados juntamente com os indivíduos na próxima geração, o termo "ligado" também pode se referir aqui a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 2,0 Mb um do outro no mesmo cromossomo. Assim, dois genes ou marcadores "ligados" podem ser separados por cerca de 2,1 Mb, 2,00 Mb, cerca de 1,95 Mb, cerca de 1,90 Mb, cerca de 1,85 Mb, cerca de 1,80 Mb, cerca de 1,75 Mb, cerca de 1,70 Mb, cerca de 1,65 Mb, cerca de 1,60 Mb, cerca de 1,55 Mb, cerca de 1,50 Mb, cerca de 1,45 Mb, cerca de 1,40 Mb, cerca de 1,35 Mb, cerca de 1,30 Mb, cerca de 1,25 Mb, cerca de 1,20 Mb, cerca de 1,15 Mb, cerca de 1,10 Mb, cerca de 1,05 Mb, cerca de 1,00 Mb, cerca de 0,95 Mb, cerca de 0,90 Mb, cerca de 0,85 Mb, cerca de 0,80 Mb, cerca de 0,75 Mb, cerca de 0,70 Mb, cerca de 0,65 Mb, cerca de 0,60 Mb, cerca de 0,55 Mb, cerca de 0,50 Mb, cerca de 0,45 Mb, cerca de 0,40 Mb, cerca de 0,35 Mb, cerca de 0,30 Mb, cerca de 0,25 Mb, cerca de 0,20 Mb, cerca de 0,15 Mb, cerca de 0,10 Mb, cerca de 0,05 Mb, cerca de 0,025 Mb, e cerca de 0,01 Mb. Exemplos específicos de marcadores que estão "ligados" ao fenótipo de SNC na cultura da soja incluem sequências de nucleotídeos no cromossomo 18 do genoma da soja.

[00048] Como usado aqui, o termo "fortemente ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 0,5 Mb um do outro no mesmo cromossomo. Assim, dois genes ou marcadores "fortemente ligados" podem ser separados por cerca de 0,6 Mb, cerca de 0,55 Mb, 0,5 Mb, cerca de 0,45 Mb, cerca de 0,4 Mb, cerca de 0,35 Mb, cerca de 0,3 Mb, cerca de 0,25 Mb, cerca de 0,2 Mb, cerca de 0,15 Mb, cerca de 0,1 Mb, e cerca de 0,05 Mb.

[00049] Como usado aqui, o termo "extrema e fortemente ligado" pode se referir a um ou mais genes ou marcadores que estão localizados dentro de cerca de 100 kb um do outro no mesmo cromossomo. Assim, dois genes ou marcadores "extrema e fortemente ligados" podem ser separados por cerca de 125 kb, cerca de 120 kb, cerca de 115 kb, cerca de 110 kb, cerca de 105 kb, 100 kb, cerca de 95 kb, cerca de 90 kb, cerca de 85 kb, cerca de 80 kb, cerca de 75 kb, cerca de 70 kb, cerca de 65 kb, cerca de 60 kb, cerca de 55 kb, cerca de 50 kb, cerca de 45 kb, cerca de 40 kb, cerca de 35 kb, cerca de 30 kb, cerca de 25 kb, cerca de 20 kb, cerca de 15 kb, cerca de 10 kb, cerca de 5 kb, e cerca de 1 kb. Exemplos específicos de marcadores que são "extrema e intimamente ligados" ao fenótipo de SNC na cultura da soja incluem rhg 1-3995, BARC_010889_01691 e NCSB_004074.

[00050] Em vista do exposto, será apreciado que os marcadores ligados a um gene em particular ou fenótipo incluem aqueles marcadores que estão intimamente ligados, e aqueles marcadores que são extrema e intimamente ligados, ao gene ou fenótipo. Marcadores genéticos ligados, fortemente ligados, e extrema e intimamente ligados do fenótipo de SNC podem ser úteis em programas de reprodução assistida por marcadores para identificar variedades de soja resistentes a SNC, e para reproduzir essa característica em outras variedades de soja para conferir resistência a SNC.

[00051] Locus: Como usado aqui, o termo "locus"se refere a uma posição no genoma que corresponde a uma característica mensurável (por exemplo, uma característica). Um locus de SNP é definido por uma sonda que hibridiza com DNA contido dentro do locus.

[00052] Marcador: Como usado aqui, um marcador refere-se a um gene ou sequência de nucleotídeos que pode ser usado para identificar plantas tendo um alelo particular. Um marcador pode ser descrito como uma variação em um dado locus genômico. Um marcador genético pode ser uma sequência de DNA curta, tal como uma sequência em torno de uma única mudança de par de base (polimorfismo de nucleotídeo único, ou "SNP"), ou uma longa, por exemplo, uma repetição de sequência de microssatélites / simples ("SSR"). Um "alelo marcador"refere-se à versão do marcador que está presente em um indivíduo em particular.

[00053] O termo marcador como aqui utilizado pode se referir a um segmento clonado de DNA de soja cromossômico (por exemplo, um segmento incluindo rhg 1-3995, BARC_010889_01691, ou NCSB_004074), e também pode ou, alternativamente, se referir a uma molécula de DNA que é complementar a um segmento clonado do DNA cromossômico de soja (por exemplo, DNA complementar a um segmento incluindo rhg 1-3995, BARC_010889_01691, ou NCSB-004074).

[00054] Em algumas modalidades, a presença de um marcador em uma planta pode ser detectada através do uso de uma sonda de ácido nucleico. A sonda pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. Sondas de RNA podem ser sintetizadas por meio conhecido na técnica, por exemplo, utilizando um modelo de molécula de DNA. Uma sonda pode conter todos ou uma parte da sequência de nucleotídeos do marcador e sequência de nucleotídeos contígua adicional a partir do genoma da planta. Isto é aqui referido como uma "sonda contígua." A sequência de nucleotídeos contígua adicional é referida como "a montante" ou "a jusante" do marcador original, dependendo de se a sequência de nucleotídeos contígua do cromossomo da planta está no lado 5' ou 3' do marcador original, como convencionalmente entendido. Como é reconhecido por aqueles versados na técnica, o processo de obtenção de sequência de nucleotídeos contígua adicional para inclusão em um marcador pode ser repetido quase indefinidamente (limitado apenas pelo tamanho do cromossomo), desse modo identificando marcadores adicionais ao longo do cromossomo. Todos os marcadores acima descritos podem ser usados em algumas modalidades da presente invenção.

[00055] Uma sequência de sonda de oligonucleotídeo pode ser preparada sinteticamente ou por clonagem. Vetores de clonagem adequados são bem conhecidos pelos versados na técnica. Uma sonda de oligonucleotídeos pode ser rotulada ou não rotulada. Uma grande variedade de técnicas existe para rotulagem de moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, e sem limitação: radiorrotulagem por Nick translation, priming aleatório, caracterização com deoxitransferase terminal, ou similar, onde os nucleotídeos empregados são rotulados, por exemplo, com 32P radioativo. Outros rótulos que podem ser utilizados incluem, por exemplo, e sem limitação: enzimas fluoróforas (por exemplo, FAM e VIC), substratos de enzimas, co-fatores de enzimas, inibidores de enzimas, e assim por diante. Alternativamente, o uso de um rótulo que fornece um sinal detectável, por si só ou em conjunto com outros agentes reativos, pode ser substituído por ligantes aos quais receptores se ligam, onde os receptores são rotulados (por exemplo, os rótulos acima indicados) para fornecer sinais detectáveis, seja por si só ou em conjunto com outros reagentes. Vide, por exemplo, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80:4045 9.

[00056] A sonda pode conter uma sequência de nucleotídeos que não é contígua aquela do marcador original; esta sonda é aqui referida como uma "sonda não contígua". A sequência da sonda não contígua está localizada suficientemente perto da sequência do marcador original no genoma de modo que a sonda não contígua é geneticamente ligada ao mesmo gene ou característica (por exemplo, a resistência a SNC). Por exemplo, em algumas modalidades, uma sonda não contígua está localizada em 500 kb, 450 kb, 400 kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 150 kb, 125 kb, 100 kb, 0,9 kb, 0,8 kb, 0,7 kb, 0,6 kb, 0,5 kb, 0,4 kb, 0,3 kb, 0,2 kb, ou 0,1 kb do marcador original no genoma da soja.

[00057] A sonda pode ser uma cópia exata de um marcador a ser detectado. A sonda também pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência de nucleotídeos que é substancialmente idêntica a de DNA cromossômico de um segmento clonado do organismo do indivíduo (por exemplo, soja). Como usado aqui, o termo "substancialmente idêntica" pode se referir a sequências de nucleotídeos que são mais de 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica pode ser de 85,5%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou 99,5% idêntica à sequência de referência.

[00058] A sonda também pode ser uma molécula de ácido nucleico que é "especificamente hibridizável" ou "especificamente complementar" a uma cópia exata do marcador a ser detectado ("alvo de DNA"). "Especificamente hivbridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e o alvo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo a ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico a sequências não-alvo em condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, em condições de hibridização severas.

[00059] Condições de hibridização que resultam em graus particulares de rigor irão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridação. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridação irão determinar o rigor da hibridação, através de tempos de lavagem que também influenciam o rigor. Cálculos relativos às condições de hibridização necessárias para alcançar graus particulares de rigor são conhecidos por aqueles versados na técnica, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções mais detalhadas e orientação em relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontrados, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, NY, 1995.

[00060] Como usado aqui, "condições de rigor"englobam condições em que a hibridação só irá ocorrer se houver incompatibilidade de menos de 50% entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. "Condições severas" incluem níveis mais particulares de rigor. Assim, como usado aqui, condições de "rigor moderado" são aquelas em que moléculas com mais de 50% de incompatibilidade de sequência não hibridizam; condições de "rigor alto" são aquelas em que sequências com incompatibilidade de mais de 20% não hibridizam; e condições de "rigor muito alto" são aquelas em que sequências com incompatibilidade com mais de 10% não hibridizam.

[00061] A seguir são condições de hibridização não limitantes, representativas.

[00062] Rigor Muito Alto (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em tampão 5x SSC a 65 °C por 16 horas, lavagem duas vezes em tampão 2x SSC em temperatura ambiente por 15 minutos cada, e lavar duas vezes em tampão 0.5x SSC a 65 °C por 20 minutos cada.

[00063] Rigor Alto (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em tampão 5x - 6x SSC a 65 - 70 °C por 16 - 20 horas, lavar duas vezes em tampão 2x SSC em temperatura ambiente por 5 - 20 minutos cada, e lavar duas vezes em tampão 1x SSC a 55 - 70 °C por 30 minutos cada.

[00064] Rigor Moderado (detecta sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência): Hibridização em tampão 6x SSC em temperatura ambiente a 55 °C por 16 - 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão 2x - 3x SSC em temperatura ambiente a 55 °C por 20 - 30 minutos cada.

[00065] Com respeito a todas as sondas discutidas, supra, a sonda pode incluir sequências de ácido nucleico adicionais, por exemplo, promotores, sinais de transcrição e/ou sequências de vetores. Qualquer uma das sondas discutidas, supra, pode ser usada para definir marcadores adicionais que estão intimamente ligados a um gene envolvido na resistência a SNC, e marcadores assim identificados podem ser equivalentes aos marcadores exemplares nomeados na presente descrição e, portanto, estão dentro do escopo da invenção.

[00066] Reprodução assistida por marcadores: Conforme usado neste documento, o termo "reprodução assistida por marcadores" pode se referir a uma abordagem para diretamente reproduzir uma ou mais características complexas (por exemplo, resistência a SNC). Na prática atual, os reprodutores de plantas tentam identificar características facilmente detectáveis, como cor da flor, a aparência do tegumento, ou variantes de isoenzima que estão ligadas a uma característica agronômica desejada. Os reprodutores de plantas então seguem a característica agronômica na segregação, populações de reprodução, seguindo a segregação da característica facilmente detectável. No entanto, existem muito poucas dessas relações de ligação disponíveis para uso em reprodução de plantas.

[00067] Reprodução assistida por marcadores provê um processo de custo e tempo eficientes para a melhoria das variedades de plantas. Vários exemplos da aplicação de reprodução assistida por marcadores envolvem o uso de marcadores isoenzimáticos. Vide, por exemplo, Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Um exemplo é um marcador de isoenzima associado a um gene de resistência a uma praga de nemátodos na cultura do tomate. A resistência, controlada por um gene designado Mi, está localizada no cromossomo 6 do tomate e é muito fortemente ligada ao Aps1, uma isoenzima fosfatase ácida. Uso do marcador de isoenzima Aps1 para selecionar indiretamente o gene Mi uma vez que as vantagens que segregam em uma população possam ser determinadas de forma inequívoca com as técnicas de electroforese; o marcador de isoenzima pode ser marcado no tecido das mudas, evitando a necessidade de manter as plantas à maturidade, e codominância dos alelos de marcador de isoenzima permite discriminação entre homozigotos e heterozigotos. Vide Rick (1983) em Tanksley e Orton, supra.

[00068] Locus de característica quantitativa: Como usado aqui, o termo "locus de característica quantitativa" (QTL) pode se referir a trechos de DNA que foram identificados como prováveis sequências de DNA (por exemplo, genes, sequências de não codificação e/ou sequências intergênicas) que fundamentam uma característica quantitativa, ou fenótipo, que varia em grau, e pode ser atribuído às interações entre duas ou mais sequências de DNA (por exemplo, genes, sequências de não codificação e/ou sequências intergênicas) ou seus produtos de expressão e seu ambiente. Loci de características quantitativas (QTLs) pode ser identificado molecularmente para ajudar a mapear regiões do genoma que contêm sequências envolvidas na especificação de uma característica quantitativa.

[00069] Como usado aqui, o termo "intervalo de QTL" pode se referir a trechos de DNA que são ligados a genes que estão por trás da característica QTL. Um intervalo de QTL é tipicamente, mas não necessariamente, maior do que o QTL em si. Um intervalo de QTL pode conter trechos de DNA que são 5 'e/ou 3' com relação ao QTL.

[00070] Identidade de sequência: os termos "identidade de sequência" ou "identidade", como aqui utilizados no contexto de dois ácidos nucleicos ou de sequências polipeptídicas, pode referir-se aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[00071] Como usado aqui, o termo "percentagem de identidade de sequência" pode referir-se ao valor determinado pela comparação de duas sequências perfeitamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos) sobre uma janela de comparação, na qual a porção da sequência na janela de comparação pode compreender inclusões ou exclusões (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não inclui acréscimos ou supressões) para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado através da determinação do número de posições em que o nucleotídeo idêntico ou resíduo de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir o percentual de identidade de sequência.

[00072] Métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet etal. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson etal. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculo de homologia podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00073] Ferramenta de Busca Básica de Alinhamento Local do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) (BLAST ™; Altschul et al (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na internet na seção "Ajuda" por BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (blastn) pode ser empregada usando a matriz BLOSUM62 padrão definida para os parâmetros padrão. Sequências de ácidos nucleicos com semelhança ainda maior para as sequências de referência irão mostrar o aumento percentual de identidade, quando avaliadas por este método.

[00074] Polimorfismo de nucleotídeo único: Como usado aqui, o termo "polimorfismo de nucleotídeo único" (SNP) pode se referir a uma variação da sequência de DNA que ocorre quando um único nucleotídeo no genoma (ou outra sequência compartilhada) difere entre os membros de uma espécie ou cromossomos pareados em um indivíduo. Dentro de uma população, SNPs podem ser atribuídos a uma menor frequência do alelo que é a menor frequência de alelos em um locus que é observada em uma determinada população. Ela é simplesmente a menor das duas frequências alélicas de polimorfismos de nucleotídeo único. Espera-se que diferentes populações exibam pelo menos frequências alélicas levemente diferentes. Populações particulares podem apresentar frequências alélicas significativamente diferentes. Em alguns exemplos, os marcadores ligados à resistência a SNC são marcadores de SNP.

[00075] SNPs podem cair dentro de sequências de codificação de genes, regiões de não codificação de genes, ou nas regiões intergênicas entre genes. SNPs dentro de uma sequência de codificação não irá necessariamente mudar a sequência de aminoácidos da proteína que é produzida, devido à degeneração do código genético. Um SNP em que ambas as formas levam a mesma sequência polipeptídica é chamado de "sinônimo" (às vezes chamado de uma mutação silenciosa). Se uma sequência de polipeptídeo diferente é produzida, eles são chamados de "não sinônimos."Uma mudança não sinônima pode ser tanto missentido ou não sentido, mudança missentido resulta em um aminoácido diferente, e uma mudança não sentido resulta em um códon de parada prematuro. SNPs que não estão em regiões codificantes de proteínas ainda podem ter consequências para a combinação de genes, ligação de fator de transcrição, ou a sequência de RNA de não codificação. SNPs são geralmente bialélicos e, portanto, facilmente testados em plantas e animais. Sachidanandam Nature (2001) 409:928 33.

[00076] Característica ou fenótipo: Os termos "característica"e "fenótipo" são utilizados alternadamente neste documento. Para fins da presente descrição, uma característica de particular interesse é a resistência a SNC.

III. Identificação baseada em QTL de marcadores ligados a uma característica de interesse A. Visão Geral

[00077] Em algumas modalidades, uma característica (por exemplo, a resistência a SNC) é mapeada usando uma estratégia que é diferente das abordagens tradicionais de mapeamento. Por exemplo, uma característica pode ser mapeada de acordo com uma estratégia que, por uma questão de conveniência, pode ser descrita como compreendendo quatro etapas. Em uma primeira etapa, as regiões alvo de intervalo de QTL que correspondem a uma característica a ser mapeada podem ser determinadas. Em uma segunda etapa, marcadores (por exemplo, marcadores de SNP) podem ser selecionados os quais estão localizados dentro ou perto de determinados intervalos de QTL do genoma alvo (por exemplo, genoma da soja). Em uma terceira etapa, iniciadores específicos podem ser projetados os quais facilitam a genotipagem dos sujeitos individuais no que diz respeito aos marcadores selecionados. Nos exemplos particulares, iniciadores específicos foram desenvolvidos para uso em um ensaio de genotipagem KASPAR™. Em uma quarta etapa, as populações que mostram a segregação para a característica podem ser selecionadas usando os iniciadores específicos para identificar os marcadores que estão ligados à característica.

B. Marcadores ligados a uma característica de interesse e a identificação dos mesmos

[00078] Determinação de regiões alvo de intervalo de QTL e identificação de marcadores.

[00079] QTLs podem ser determinados por qualquer técnica disponível para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as posições físicas de um QTL que correspondem a uma característica de interesse particular podem ser inicialmente determinadas por referência à localização de genes que são conhecidos por contribuírem para a característica particular. Em algumas modalidades, genes de resistência a SNC podem ser identificados em pelo menos quatro regiões no cromossomo 8, 11, 18 e 20, respectivamente. Vide, por exemplo, Concibido et al. (1996) Theor. Appl. Genet.93:234-41, Concibido etal. (1997) Crop Sei. 37:258-64, Meksem et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 99:1131-42, Qui et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98:356-64, Meksem etal. (2001) Mol. Breeding 7:63-71, Li etal. (2009) Mol. Breeding 24:63-76, Wu et al. (2009) Theor. Appl. Genet. 118:1093-105; Patentes U.S. 5,491,081, 6,096,944, 6,162,967, 6,271,437, 6,284,948, 6,300,541, 6,538,175, 7,154,021, 7,485,770; U.S.S.N.s 20020129402, 20020144310, 20030005491, 20030135881, 20060225150, 20060253919, 20080072352, e 20090100537; e Publicação International PCT Nos. WO1995020669A2, W02001051627A2, e W02008153804A2. Em algumas modalidades, os QTLs identificados inicialmente são agrupados ou divididos em uma lista menos complicada ou extensa de QTLs que pode ter limites no genoma que são os mesmos ou diferentes dos limites do QTLs identificados inicialmente.

[00080] Em algumas modalidades, uma região de DNA pode ser selecionada que é susceptível de conter marcadores que estão ligados à característica de QTL. Esta região pode ser referida como um intervalo de QTL. Por exemplo, um intervalo de QTL pode ser uma região de DNA que inclui o QTL e DNA genômico adicional que está perto do QTL em uma ou outra, ou ambas as direções, a 5' e 3'. Em algumas modalidades, um intervalo de QTL pode ser de cerca de 4 Mb, cerca de 3,5 Mb, cerca de 3 Mb, cerca de 2,5 Mb, cerca de 2 Mb, cerca de 1,5 Mb, ou cerca de 1 Mb.

[00081] Em modalidades particulares, o genoma alvo pode ser pesquisado para identificar marcadores que estão fisicamente localizados nos, próximos, ou entre os QTLs e intervalos de QTL. Se um mapa de referência contendo a localização de marcadores conhecidos está disponível para o genoma alvo, o mapa de referência pode ser usado para identificar marcadores. Sequências de ácido nucleico do genoma alvo também podem ser pesquisadas, por exemplo, pelo software tal como o BLAST ™. Em algumas modalidades, marcadores de SNP podem ser identificados. Em algumas modalidades, os marcadores podem ser identificados os quais estão fisicamente localizados nos, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTL do genoma da soja, que corresponde às características de resistência a SNC. Em exemplos específicos, marcadores de SNP identificados que estão fisicamente localizados nos, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTL do genoma da soja, que corresponde às características de resistência a SNC podem ser selecionados do grupo que consiste nos marcadores listados na Tabela 2.

[00082] Em outras modalidades, os marcadores particulares podem ser selecionados a partir dos marcadores identificados que estão fisicamente localizados nos, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTL que correspondem a uma característica de interesse, que são marcadores polimórficos entre as linhagens pais a partir das quais uma população de mapeamento será gerada. Polimorfismo de um dado marcador entre as linhagens pais está diretamente relacionado com a capacidade de rastrear eventos de recombinação em uma população de mapeamento produzida a partir das linhagens pais.

[00083] Nos exemplos particulares, marcadores polimórficos entre linhagens de soja pais são selecionados para triar populações de mapeamento de resistência a SNC para determinar qual, se houver, dos marcadores polimórficos estão ligados à característica de resistência a SNC. Tais marcadores podem segregar de modo que um alelo do marcador de SNP aparece exclusivamente em indivíduos resistentes a SNC, e outro alelo do marcador de SNP aparece exclusivamente em indivíduos suscetíveis a SNC. Populações de mapeamento podem ser geradas através do cruzamento de uma variedade que é resistente a SNC com outra variedade que é suscetível a SNC. Em modalidades, uma população de mapeamento pode incluir cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500 ou mais indivíduos. Em algumas modalidades, germoplasma de soja 98.860-71 resistente à SNC, pode ser cruzado com um ou mais germoplasmas suscetíveis a SNC (por exemplo, 75.213 e 6CH026-035) para criar populações de mapeamento.

[00084] Em algumas modalidades, os marcadores polimórficos podem ser polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ligados a ou dentro do gene ou QTL correspondente à característica de interesse de resistência a SNC. Estes marcadores de SNP pode ser detectados por sequenciamento através da região contendo o gene ou QTL utilizando qualquer método de sequenciamento de DNA conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a metodologias de sequenciamento Sanger ou sequenciamento de alto rendimento ("Next Generation") que permitem que a sequência curta ou longa leia através da região de interesse. Em tais modalidades, onde a genotipagem por sequenciamento é utilizada para a detecção de marcadores de SNP, iniciadores correspondentes às sequências de flaqueamento da região que contendo os SNPs no gene ou QTL de interesse podem ser usados para o sequenciamento de produtos químicos, a fim de sequenciar através da região de interesse. Em tais modalidades, quando diferentes genótipos são usados para o sequenciamento através da região de interesse para a detecção de SNPs exemplificados aqui, outros SNPs podem ser identificados, além dos SNPs exemplificados aqui. Em modalidades, os SNPs exemplificados aqui por si (SNPs individuais) ou em combinação com outros SNPs ligados a sequências exemplificadas (haplótipos) podem ser utilizados para diferenciar os genótipos para a seleção assistida por marcadores de plantas para a característica de interesse de resistência a SNC. Projeto de Iniciador e triagem de ligação.

[00085] Sondas de oligonucleotídeos (por exemplo, iniciadores) podem ser projetadas especificamente para detectar marcadores que estão fisicamente localizados nos, próximos, ou entre QTLs e intervalos de QTL que correspondem a uma característica de interesse. Em geral, uma sonda de oligonucleotídeos pode ser projetada especificamente para hibridizar apenas um alelo de um marcador. Em algumas modalidades, duas sondas de oligonucleotídeo são projetadas para detectar um marcador de SNP, de forma que cada uma hibridiza especificamente para o alelo SNP para o qual a outra sonda não especificamente hibridiza. Como é entendido por aqueles versados na técnica, o comprimento ou a composição de sondas de oligonucleotídeos para um marcador específico pode variar de acordo com princípios estabelecidos sem renderizar a sonda não específica para um alelo do marcador.

[00086] Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeo podem ser iniciadores. Em modalidades específicas, iniciadores podem ser projetados para detectar marcadores em um ensaio de genotipagem Kaspar™. Em modalidades particulares, iniciadores podem ser projetados para detectar marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC em soja usando um ensaio de genotipagem KASPAR™. Nestas modalidades adicionais, o sistema de detecção pode fornecer uma alta capacidade de vazão e formato conveniente para genotipagem de indivíduos em uma população de mapeamento, o que pode facilitar muito a identificação de indivíduos portadores de um gene particular ou característica, e também pode facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção assistida por marcador.

[00087] Em modalidades específicas, as sondas de oligonucleotídeo podem ser iniciadores projetados para detectar marcadores em um ensaio de genotipagem TaqMan ®. Este método utiliza iniciadores específicos para o marcador intimamente ligado ao gene de resistência a SNC e sondas rotuladas fluorescentes com um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). A sonda de SNP associada à resistência é marcada com um corante fluorescente, tal como FAM, enquanto a sonda associada com a susceptibilidade é marcada com um corante fluorescente diferente, como VIC. Os dados são analisados como a presença ou ausência de um sinal de corante fluorescente. O sistema de detecção pode fornecer uma alta capacidade de vazão e formato conveniente, tal como a multiplexação para genotipagem de indivíduos em uma população de mapeamento, o que pode facilitar muito a identificação de indivíduos portadores de um gene em particular ou característica, e também pode facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção assistida por marcador.

[00088] Marcadores adicionais podem ser identificados como equivalentes a qualquer um dos marcadores exemplares nomeados aqui (por exemplo, marcadores listados na Tabela 3, como, por exemplo, rhg 1-3995, BARC_010889_01691 e NCSB_004074), por exemplo, determinando a frequência de recombinação entre o marcador exemplar e um marcador adicional. Tais determinações poderão utilizar um método de contrastes ortogonais com base no método de Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London, seguido por urn teste de probabiliddade máxima para determinar uma freuqência de recombinação. Allard (1956) Hilgardia 24:235-78. Se o valor da frequência de recombinação for menor ou igual a 0,10 (ou seja, 10%), então o marcador adicional é considerado equivalente ao marcador particular exemplar para os fins previstos nos métodos atualmente divulgados.

[00089] Marcadores que estão ligados a todos e quaisquer genes de resistência a SNC podem ser identificados em modalidades da invenção. Além disso, os marcadores que controlam todo e qualquer loci que contribui para resistência a todas as raças SNC podem ser identificados em modalidades da invenção.

[00090] Um meio para prover resistência a SNC na cultura da soja pode ser um alelo marcador de SNP, a detecção de qual alelo marcador de SNP em plantas de soja pertencentes a, ou derivadas de, germoplasma 98860-71 fornece pelo menos uma indicação forte de que a planta que compõem a sequência de ácido nucleico tem o fenótipo de resistência a SNC. Em alguns exemplos, um meio para prover resistência a SNC na cultura da soja é um marcador selecionado do grupo consistindo nos marcadores listados na Tabela 3. Nos exemplos particulares, um meio para prover resistência a SNC na cultura da soja é um marcador selecionado do grupo consistindo em rhg 1-3995, BARC_010889_01691 e NCSB_004074.

[00091] Um meio para a identificação de plantas de soja com o fenótipo de resistência a SNC pode ser uma molécula que apresenta um sinal detectável quando adicionada a uma amostra obtida a partir de uma planta de soja pertencente a, ou derivada de, germoplasma 98.860- 71 tendo o genótipo de resistência a SNC, mas quais meios não apresentam um sinal detectável quando adicionados a uma amostra obtida a partir de uma planta de soja pertencente a, ou derivada de, germoplasma 98.860-71 que não tem o fenótipo de resistência a SNC. Hibridização específica de ácidos nucleicos é um sinal detectável, e uma sonda de ácido nucleico que hibridiza especificamente para um alelo marcador de SNP que está ligado ao fenótipo de resistência a SNC pode, portanto, ser um meio para a identificação de plantas de soja com o fenótipo de resistência a SNC. Em alguns exemplos, um meio para a identificação de plantas de soja com o fenótipo de resistência a SNC é uma sonda que hibridiza especificamente a um marcador que está ligado ao fenótipo de resistência a SNC.

C. Métodos de usar marcadores ligados a uma característica de interesse

[00092] Métodos do usar marcadores moleculares de ácidos nucleicos que estão ligados a uma característica de interesse (por exemplo, resistência a SNC em soja) para identificar plantas com a característica de interesse podem resultar em uma economia de custos para os desenvolvedores de plantas, porque tais métodos podem eliminar a necessidade de plantas de fenótipo individual geradas durante o desenvolvimento (por exemplo, cruzando variedades de plantas de soja tendo resistência a SNC com variedades de plantas vulneráveis).

[00093] Em modalidades particulares, marcadores ligados à resistência a SNC na soja pode ser usados para transferir segmento (s) de DNA que contém um ou mais determinantes de resistência a SNC. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados de um grupo de marcadores que compreende os marcadores listados na Tabela 3 e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um marcador pode ser selecionado do grupo consistindo em rhg 1-3995, BARC_010889_01691 e NCSB_004074. Em algumas modalidades, um método para usar marcadores ligados à resistência a SNC na cultura da soja para transferir segmento (s) de DNA que contém um ou mais determinantes de resistência a SNC podem incluir a análise do DNA genômico de duas plantas pais com sondas que são especificamente hibridizáveis para os marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC; sexualmente cruzando os dois genótipos de plantas pais para obter uma população de progénie, e analisando aquela progénie para a presença dos marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC; retrocruzamentos da progénie que contêm os marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC para o genótipo destinatário para produzir uma primeira população de retrocruzamento, e depois continuar com um programa de retrocruzamentos até uma progénie final ser obtida que compreende qualquer característica (s) desejada exibida pelo genótipo pai e o fenótipo de resistência a SNC. Em modalidades particulares, progénies individuais obtidas em cada etapa de cruzamento e retrocruzamento são selecionadas por análise de marcador de SNC em cada geração. Em algumas modalidades, a análise do DNA genômico das duas plantas pais com sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC revela que uma das plantas pais compreende poucos dos marcadores ligados para os quais as sondas hibridizam especificamente, ou nenhum dos marcadores ligados para os quais as sondas hibridizam especificamente. Em algumas modalidades, progénies individuais obtidas em cada cruzamento e/ou retrocruzamento são selecionadas pela variação da sequência de plantas individuais.

[00094] Em algumas modalidades, marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC podem ser usados para introduzir um ou mais determinantes de resistência a SNC em uma planta (por exemplo, soja) por transformação genética. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados de um grupo de marcadores que compreende os marcadores listados na Tabela 3 e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um método para a introdução de um ou mais determinantes de resistência a SNC em uma planta por recombinação genética pode incluir a análise do DNA genômico de uma planta (por exemplo, soja) com sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC para identificar um ou mais determinantes de resistência a SNC na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo os marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC, por exemplo, pela extração do DNA genômico e digestão do DNA genômico com uma ou mais enzimas de endonuclease de restrição; opcionalmente, ampliando o segmento isolado de DNA; introduzindo o segmento isolado de DNA em uma célula ou tecido de uma planta hospedeira, e analisando o DNA da planta hospedeira com sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC para identificar um ou mais determinantes de resistência a SNC na planta hospedeira. Em modalidades particulares, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido na planta hospedeira de tal forma que ele é estavelmente integrado no genoma da planta hospedeira.

[00095] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC podem ser usados para introduzir um ou mais determinantes de resistência a SNC em outros organismos, por exemplo, plantas. Em modalidades particulares, os marcadores podem ser selecionados de um grupo de marcadores listados na Tabela 3 e marcadores que são seus equivalentes. Em algumas modalidades, um método para a introdução de um ou mais determinantes de resistência a SNC em um organismo que não seja de soja pode incluir a análise do DNA genômico de uma planta (por exemplo, uma planta de soja) com sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC para identificar um ou mais determinantes de resistência a SNC na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo um ou mais determinantes de resistência a SNC, por exemplo, pela extração do DNA genômico e digestão do DNA genômico com uma ou mais enzimas de endonuclease de restrição; opcionalmente, ampliando o segmento isolado de DNA; introduzindo o segmento isolado de DNA em um organismo que não seja de soja, e analisando o DNA do organismo que não seja de soja com sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC para identificar um ou mais determinantes de resistência a SNC no organismo. Em outras modalidades, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido no organismo de tal forma que ele é estavelmente integrado ao genoma do organismo.

[00096] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC podem ser usados para identificar uma planta com um ou mais determinantes de resistência a SNC. Em algumas modalidades, a planta pode ser uma planta de soja. Por exemplo, a planta pode ser uma planta de soja de germoplasma 98.860- 71. Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA genômico ou mRNA) podem ser extraídas de uma planta. Moléculas de ácido nucleico extraídas podem então ser colocadas em contato com uma ou mais sondas que são especificamente hibridizáveis para marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC. Hibridização específica de uma ou mais sondas para moléculas de ácido nucleico extraídas é indicativa da presença de um ou mais determinantes de resistência a SNC na planta.

[00097] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligadas a múltiplos determinantes de resistência a SNC podem ser usados simultaneamente. Em outras modalidades, os marcadores que estão ligados a apenas um fator determinante de resistência a SNC podem ser usados. Em exemplos específicos, marcadores que estão ligados à resistência a SNC com relação a uma ou mais raças HG SNC particulares (por exemplo, raça 1, raça 2, raça 3, raça 5 e raça 14) podem ser usados simultaneamente, por exemplo, uma pluralidade de marcadores que estão ligados à resistência a SNC com relação a diferentes raças HG SNC podem ser usados simultaneamente.

[00098] Os exemplos a seguir são providos para ilustrar certas particularidades e/ou modalidades. Estes exemplos não devem ser interpretados de forma a limitar a descrição para as características particulares ou modalidades descritas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Materiais e Métodos

[00099] 24 cultivares de soja e pais de mapeamento de SNC foram utilizados para identificar marcadores ligados ao fenótipo de resistência a SNC. 14 dos cultivares foram suscetíveis a SNC: 75110, 75155, 75163, 99630, 99726, 95895-755PRU, 99345-31,75192, 75209, 75159, Essex, Williams82, 75213, e 6CH026 035. 10 dos cultivares foram resistentes a SNC: Maverick, Pequim, PI209332, PI437654, 99811, 99294, Forrest, PI88788, PI437654, e 98.860-71.

[000100] Bioensaio de SNC: bioensaios de SNC foram realizados para gerar informações de fenótipo de populações de mapeamento provenientes do cruzamento de uma variedade de soja resistente à SNC 98.860-71 com variedades de soja suscetíveis a SNC 75213 e 6CH026- 035. As informações de fenótipo da população de mapeamento utilizadas são listadas na Tabela 3. A indústria não tem uma abordagem uniforme para categorizar os níveis de resistência em variedades de soja. Portanto, os níveis de resistência foram categorizados em termos de "pontuação de SNC:" Pontuação de SNC 0 10 = R (resistência); pontuação de SNC 10,1 - 29,9 = MR (resistência média); pontuação de SNC 30,0 - 59,9 = MS (suscetível média) e 60+ = S (suscetível). Valores de índice de SNC foram determinados pela comparação de linhas de testes para conhecer as linhagens resistentes e suscetíveis. A pontuação do índice foi diretamente com base no percentual de suscetibilidade a SNC observado para a amostra. Por exemplo, se uma linha de teste tinha 10 cistos em cada uma das nove plantas, e Williams (suscetível) tinha 100 cistos em cada uma das nove, a linha de testes foi categorizada com um índice de 10%. O índice final foi a média das pontuações das nove plantas.

[000101] Reações de KASPAR™: iniciadores Kaspar™ foram projetados utilizando ferramenta PrimerPicker™ em KLIMS™ (KBioscience Laboratory Management System) fornecendo as sequências de DNA com SNPs. Três iniciadores, A1 (iniciador específico de alelo 1), A2 (iniciador específico de alelo 2) e C (iniciador reverso comum) foram projetados para cada sequência de SNP com base na química KASPAR™. Uma mistura de ensaio de cada reação de KASPAR™ foi preparada como no Sistema de Genotipagem de SNP KASPAR™ v2.0. O volume final de reação foi de 5 pL por reação, incluindo um modelo de DNA de 1 pL (5 ng/pL), 2,5 pL de Mistura de reação 2x, 0,06875 pL de mistura de ensaio, 0,04 pL 50 mM de MgCh e 1,39125 pL de ddbW. O ensaio foi realizado em um formato de 384 poços. As condições de termociclo utilizadas durante o ensaio estavam de acordo com as instruções do fabricante: 94 °C por 15 minutos, 20 ciclos de 94 °C por 10 segundos, 57 °C por 5 segundos, e 72 °C por 10 segundos e 22 ciclos de 94 °C por 10 segundos, 57 °C por 20 segundos e 72 °C por 40 segundos. Placas de PCR foram centrifugadas e intensidades FAM e VIC específicas de alelo foram lidas em um espectrofluorímetro (Tecan GENios™, Mannedorf, Suíça) à temperatura ambiente. Os dados foram diretamente carregados e analisados em KLIMS™ utilizando Kluster Caller™.

Exemplo 2: Identificação de posições físicas de QTLs e Intervalos de QTL que estão ligados a genes de resistência a SNC

[000102] QTLs que estão envolvidos na resistência a SNC foram inicialmente identificados pelo estudo da literatura de SNC. O QTLs associados a SNC identificados inicialmente encontrados na literatura de SNC estão listados nas figuras 1a e 1b.

[000103] A partir da lista de QTLs que inicialmente foram identificados na literatura de SNC, vários intervalos distintos de QTL que estão envolvidos na resistência às diferentes raças de SNC foram determinados por referência ao mapa do genoma da soja. Vide, por exemplo, figura 2. Por exemplo, os intervalos de QTL no grupo de ligação (LG) G foram determinados como mostrado na figura 3; intervalos de QTL em LG A2 foram determinados como mostrado na figura 4; intervalos de QTL em LG Bi foram determinados como mostrado na figura 5; e intervalos de QTL em LG foram determinados como mostrado na figura 6. A Tabela 2 lista QTLs exemplares e seus intervalos de QTL determinados correspondentes que estão associados com resistência às diferentes raças de SNC.

Exemplo 3: Identificação de marcadores de SNP que estão fisicamente localizados em / perto / entre os QTLs e intervalos de QTL que estão ligados a genes de resistência a SNC

[000104] O genoma da soja foi pesquisado utilizando BLAST™ para marcadores de SNP que estão fisicamente localizados no, próximo, ou entre os intervalos de QTL que foram determinados. A hipótese era que alguns desses marcadores de SNP podiam estar ligados ao fenótipo de resistência a SNC. Um total de 79 marcadores de SNP foram selecionados para uma triagem inicial com 24 linhagens de soja (14 SNC suscetíveis e 10NCS resistentes) para determinar qual, se houver, desses marcadores de SNP estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC. 25 dos 79 marcadores foram localizados em LG G, 12 dos marcadores foram localizados em LG A2, 22 dos marcadores foram localizados em LG Bi, e 20 dos marcadores foram localizados em LG I. Todos os 79 marcadores selecionados são listados na Tabela 2. Tabela 2: Lista dos 79 SNPs para triagem com 24 linhagens de soja

Exemplo 4: Desenvolvimento de ensaio Kaspar™

[000105] Triagem inicial dos 79 marcadores de SNP nas 24 linhagens pais foi realizada utilizando ensaios de genotipagem KASPAR™. 75 dos marcadores de SNP foram validados.

[000106] 21 marcadores de SNP em LG G (Gm 18) foram validados: NCSB_004072, BARC_015277_01929, NCSB_004073, NCSB_004074, NCSB_004075, NCSB_004076, NCSB_004077, NCSB_004078, NCSB_004079, NCSB_004080, NCSB_004081, NCSB_004082, NCSB_004083, NCSB_004084, NCSB_004085, NCSB_004086, NCSB_004097, NCSB_004098, NCSB_004107, NCSB_004108 e NCSB_004109.

[000107] 12 marcadores de SNP em LG A2 (Gm 08) foram validados: BARC-025911-05089, BARC_019419_02921, NCSB_001710, NCSB-001711, NCSB-001712, NCSB_001713, NCSB_001714, NCSB-001715, NCSB-001716, NCSB_001717, NCSB_001718 e NCSB-001719.

[000108] 22 marcadores de SNP em LG B1 (Gm 11) foram validados: NCSB-002644, NCSB_002645, NCSB_002646, NCSB_002647, NCSB-002648, NCSB_002649, NCSB_002650, NCSB_002651, NCSB-002652, NCSB_002653, NCSB_002654, NCSB_002655, NCSB-002656, NCSB_002657, BARC_007704_00091, BARC-010269-00537, BARC_904050_01007, BARC_019557_03202, BARC-018649-03221, BARC_025703_04999, BARC_013547_01157 e BARC-035379-07178.

[000109] 20 marcadores de SNP em LG I (Gm 20) foram validados: NCSB-004974, NCSB_004975, NCSB_004977, NCSB_004979, NCSB-004882, NCSB_004883, NCSB_004884, NCSB_004886, NCSB-004887, NCSB_004889, NCSB_004880, NCSB_004882, NCSB-004883, NCSB_004884, NCSB_004885, NCSB_004887, NCSB-004888, NCSB_004899, NCSB_004900 e NCSB_004903.

[000110] A triagem inicial identificou 44 dos marcadores de SNP como polimórficos entre as 24 linhagens pais. 24 marcadores polimórficos foram selecionados (NCSB_001716 (LG A2), NCSB_002645 (Bi), NCSB-002646 (Bi), NCSB_002648 (Bi), NCSB_002651 (Bi), NCSB-002652 (Bi), NCSB_002654 (Bi), NCSB_002656 (Bi), BARC_013547_01157 (Bi), NCSB_004073 (G), NCSB_004074 (G), NCSB-004078 (G), NCSB_004080 (G), NCSB_004084 (G), NCSB-004085 (G), NCSB_004097 (G), NCSB_004109 (G), BARC_012237_01755 (G), rgh 1-689 (G), rgh 1-757 (G), rgh 1-2564 (G), rgh 1-3995 (G), e NCSB_004900 (I)) para o teste de ligação adicional com as populações de mapeamento provenientes do cruzamento da variedade de soja resistente à SNC 98.860-71 com variedades de soja suscetíveis a SNC 75213 e 6CH026-035. Afigura 7 mostra os dados de genotipagem representativos do ensaio KASPAR™ para quatro dos marcadores polimórficos.

[000111] 15 dos marcadores de SNP foram polimórficos entre os resistentes a SNC e os pais suscetíveis. Estes 15 marcadores de SNP polimórficos foram posteriormente selecionados contra 93 indivíduos na população de mapeamento.

[000112] Dos quinze marcadores de SNP que foram polimórficos entre as linhagens pais que foram testadas contra os indivíduos da população de mapeamento, apenas três SNPs mostraram cossegregação com a característica de resistência a SNC: NCSBJD04074, BARC_010889_01691 e rhg1-3995. figura 8. As sequências de iniciadores KASPAR™ que foram utilizadas para indivíduos de genótipo para estes três marcadores são listadas na tabela 3.

[000113] Usando a sequência de ácido nucleico do genoma de cultivar de soja Williams 82 como referência, BARC_010889_01691 está localizado no cromossomo 18 em 1,674,511 bp; NCSB_004074 está localizado no cromossomo 18 em 1,663,671 bp, e rgh 1-3995 está localizado no cromossomo 18 em 1,714,741 bp. Todos os três marcadores ligados (NSCB_004074, BARC_010889_01691 e rhg1- 3995) estão situados no interior do locus rhg1 (rhg 1-3995), ou próximo a ele no grupo de ligação G (BARC_010889_01691 e NCSB_004074).

[000114] Para os fenótipos resistentes e resistentes ao meio, todos os três genótipos de marcador ligados eram congruentes com o fenótipo. Com relação às linhagens suscetíveis, BARC_010889_01691 tinha 5 incompatibilidades com fenótipos, NSCB_004074 tinha 9 desencontros, e rhg 1-3995 teve 6 desencontros. Vide a tabela 4. Tabela 4: Comparação da pontuação de fenótipo e pontuações de qenótipo de 93 linhagens derivadas de duas populações de mapeamento mais 3 pais. R = resistência: MR = resistência média; S = suscetível; MS = suscetível média, e X = inconsistência.

[000115] Uma vez que foram identificados quaisquer genótipos suscetíveis com estes três marcadores de SNP, há uma taxa de 0% de falso negativo. Em outras palavras, pode-se identificar com exatidão o fenótipo suscetível a SNC usando os 3 marcadores. Também se pode prever o genótipo resistente a SNC, com uma taxa de "falso positivo" de cerca de 10 a 18% (5 ou 9 dividido por 51, o número total de amostras suscetíveis). Portanto, dos genótipos resistentes a SNC identificados, espera-se que apenas 5 - 9% deles exibam um fenótipo suscetível a SNC.

Exemplo 5: marcadores de SNP em LG A2, LG Bi, e LG I que são ligados ao fenótipo de resistência a SNC

[000116] O genoma da soja é pesquisado utilizando BLAST™ para marcadores de SNP que estão fisicamente localizados no, próximos, ou entre intervalos de QTL associados à resistência a SNC em grupos de ligação A2, Bi e I. A lista de marcadores de SNP é produzida pela pesquisa BLAST™. Uma pluralidade de marcadores de SNP é selecionada para uma triagem inicial usando linhagens de soja suscetíveis a SNC e resistentes a SNC para determinar que, se houver, desses marcadores de SNP em grupos de ligação A2, Bi, e I são ligados ao fenótipo de resistência a SNC.

[000117] Triagem inicial dos marcadores de SNP selecionados nas linhagens pais é realizada utilizando ensaios de genotipagem KASPAR™. Um conjunto de marcadores de SNP selecionados é validado, um subconjunto dos quais é identificado como polimórficos entre as linhagens pais. Pelo menos um dos marcadores polimórficos SNP é / são usados para testes de ligação com as populações de mapeamento produzidas cruzando uma variedade de soja resistente a SNC com uma ou mais variedades de soja suscetível SNC. Um ou mais destes marcadores de SNP polimórficos são avaliados contra os indivíduos nas populações de mapeamento.

[000118] SNPs que cossegregam com as características de resistência a SNC em indivíduos das populações de mapeamento são identificados como marcadores de grupos de ligação A2, Bi, e I que estão ligados à resistência a SNC, na variedade dos pais resistentes a SNC. Os genótipos de marcador ligado combinam com os fenótipos observados nos indivíduos da população de mapeamento.

Exemplo 6: Marcadores de SNP ligados ao fenótipo de resistência a SNC em germoplasma JTN-5109

[000119] Uma pluralidade de marcadores de SNP que estão fisicamente localizados no, próximo, ou entre intervalos de QTL associados à resistência a SNC (por exemplo, marcadores de SNP selecionados do grupo de marcadores listados na tabela 3) são selecionados para uma triagem inicial usando variedade de soja resistente a SNC JTN-5109 e linhagens de soja suscetíveis a SNC para determinar qual, se houver, desses marcadores de SNP estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC na variedade de soja JTN-5109.

[000120] Triagem inicial dos marcadores de SNP selecionados nas linhagens pais é realizada utilizando ensaios de genotipagem KASPAR™. Um conjunto de marcadores de SNP selecionados é validado, um subconjunto dos quais é identificado como polimórficos entre variedade de soja JTN-5109 e as linhagens pais suscetíveis a SNC. Pelo menos um dos marcadores polimórficos SNP é / são usados para testes de ligação com as populações de mapeamento provenientes do cruzamento da variedade de soja JTN-5109 com uma ou mais variedades de soja suscetível a SNC. Esses um ou mais marcadores de SNP polimórficos são avaliados contra os indivíduos nas populações de mapeamento.

[000121] SNPs que cossegregam com as características de resistência a SNC em indivíduos das populações de mapeamento são identificados como marcadores que estão ligados à resistência a SNC na variedade de soja JTN-5109. Os genótipos de marcador ligados combinam com os fenótipos observados nos indivíduos da população de mapeamento.

Exemplo 7: Marcadores de SNP que estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC em raças HG diferentes da raça 3

[000122] Populações de mapeamento são desenvolvidas especificamente para uma raça HG diferente da raça 3 pelo cruzamento de uma variedade de soja resistente a SNC selecionada do grupo consistindo em PI 88.788, Peking, PI 437654, PI 90763, PI 438489B, PI 89772, PI209332, PUNCS14, Hartwig, Forrest, e Pirâmide com uma ou mais variedades de soja suscetível a SNC.

[000123] O genoma da soja é pesquisado utilizando BLAST™ para marcadores de SNP que estão fisicamente localizados no, próximo, ou entre intervalos de QTL associados à resistência a SNC com relação à raça HG específica. A lista de marcadores de SNP é produzida pela pesquisa BLAST™. Uma pluralidade de marcadores de SNP é selecionada para uma triagem inicial com a variedade de soja resistente a SNC selecionada e variedades suscetíveis a SNC para determinar qual, se houver, dos marcadores de SNP estão ligados ao fenótipo de resistência a SNC com relação à raça HG específica.

[000124] Triagem inicial dos marcadores de SNP selecionados nas linhagens pais é realizada utilizando ensaios de genotipagem KASPAR™. Um conjunto de marcadores de SNP selecionados é validado, um subconjunto dos quais é identificado como polimórficos entre as linhagens pais. Pelo menos um dos marcadores polimórficos SNP é / são usados para testes de ligação com as populações de mapeamento produzidas pelo cruzamento de variedade de soja resistente a SNC selecionada, com uma ou mais variedades de soja suscetível a SNC. Esses um ou mais marcadores de SNP polimórficos são avaliados contra os indivíduos nas populações de mapeamento.

[000125] SNPs que cossegregam com as características de resistência a SNC em indivíduos das populações de mapeamento são identificados como marcadores que estão ligados à resistência a SNC, na variedade de pais resistentes a SNC com relação à raça HG específica. Os genótipos de marcador ligados combinam com os fenótipos observados nos indivíduos da população de mapeamento.

Claims (7)

1. Método para identificar uma planta compreendendo pelo menos um marcador de resistência associado ao nemátodo do cisto de soja (SCN) em uma variedade de soja, caracterizado pelo fato de que compreende: isolar moléculas de ácido nucleico de uma planta, e selecionar através de sequenciamento de nucleotídeos ou reação em cadeia da polimerase (PCR) alelo-específica as moléculas de ácido nucleico isoladas para um marcador ligado ao fenótipo de resistência ao SCN na variedade de soja ou um equivalente da mesma, em que o marcador está geneticamente ligado ao polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) deNCSB_004074 que é adenina (A) na posição 60 de SEQ ID NO: 10, e a presença do marcador é indicativa de resistência ao SCN na variedade de soja.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido marcador ligado ao fenótipo de resistência ao SCN na variedade de soja ou equivalente do mesmo está no grupo de ligação de soja G.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico isoladas são DNA genômico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variedade de soja é a variedade de soja 98860-71.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que selecionar moléculas de ácido nucleico isoladas para um marcador ligado ao fenótipo de resistência a SCN na variedade de soja ou seu equivalente é realizado utilizando reação em cadeia da polimerase competitiva alelo-específica (PCR).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso de iniciadores de PCR alelo- específico SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, em que a PCR alelo-específica produz um fragmento de amplificação que compreende um rótulo que é um fluoróforo ou radiomarcador.

7. Conjunto de iniciadores de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira sequência de iniciador SEQ ID NO: 4, e uma segunda sequência de iniciador SEQ ID NO: 5.

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