CN115039694A

CN115039694A - 用于改进植物对大豆孢囊线虫的抗性的方法及其组合物

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Publication number: CN115039694A
Application number: CN202210876182.3A
Authority: CN
Inventors: J-R·陈; V·康西比多; S·库珀; F·汉科克; I·胡西奇; J·莱德奥克斯; J·耶茨; 叶湘海
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2022-09-13
Also published as: AR100520A1; BR112016026973B1; WO2015179378A2; WO2015179378A3; CN106455509A; US10982293B2; US20170101690A1; BR112016026973A2

Abstract

本公开属于植物育种和遗传学领域，具体地讲本公开涉及大豆属。更具体地，本发明涉及用于生产具有增强的对大豆孢囊线虫的抗性的大豆植物种群的方法和组合物。所述方法使用与大豆孢囊线虫抗性基因座连锁的分子遗传标记的检测来选择展示出增强的大豆孢囊线虫抗性表型的植物。

Description

用于改进植物对大豆孢囊线虫的抗性的方法及其组合物

本申请是申请日为2015年5月19日、申请号为201580026149.X、发明名称为“用于改进植物对大豆孢囊线虫的抗性的方法及其组合物”的发明专利申请的分案申请。

序列表的并入

序列表包含在创建于2015年5月15日的37,831字节(在MS-Windows中测量)名为“60233_PROV_SeqList.txt”的文件中，所述序列表包含76个核苷酸序列，同时通过USPTO的EFS系统提供并且以引用的方式整体并入本文。背景

大豆(soybean；Glycine max(L.)Merril)(大豆(Glycine max)或大豆(soybean))作为植物油和蛋白质的主要来源是世界上种植的主要经济作物之一(Sinclair和Backman，Compendium of Soybean Diseases，第3版.APS Press，St.Paul，MN，p.106(1989))。不断增长的对低胆固醇和高纤维饮食的需求也增加了大豆作为保健食品的重要性。

在美国，大豆产量由于疾病每年都在降低。每公顷的高产量是农民利润率的关键，特别是在大豆低价格时期。由大豆疾病引起的经济损失对农村经济和城市地区相关工业的经济都很重要。最终全世界的大豆市场都会感受到这些损失的影响。在美国，由于疾病的损失的估计值每年都有所变化，且随着疾病不同而变化。在美国，1999年至2002年，大豆产量损失估计值在8百万公吨至1千万公吨范围内(Wrather等，Online.Plant Health Progressdoi：10：1094/PHP-2003-0325-01-RV)。最近在美国完成的一项三年研究估计，大豆孢囊线虫(cyst nematode)(大豆异皮线虫(Heterodera glycine))造成12.86亿美元(1.286亿蒲式耳)的年损失。

大豆孢囊线虫(SCN)，大豆异皮线虫(Heterodera glycines Ichinohe)是1954年在美国Castle Hayne，N.C.在大豆上鉴定出的专性寄生虫(Winstead等，Plant Dis.Rep.，39：9-11(1955))。自发现以来，SCN已被公认为大豆中最具破坏性的害虫之一。据报道，在种植大豆的几乎所有的州中，它在若干个州造成了主要的生产问题，在中西部州中尤其具有破坏性。一般参见：Caldwell等，Agron.J.，52：635-636(1960)；Rao-Arelli和Anand，Crop.Sci.，28：650-652(1988)；Baltazar和Mansur，Soybean Genet.Newsl.，19：120-122(1992)；Concibido等，Crop Sci.34：240-246(1993)。例如，在艾奥瓦州SCN品种3滋生的地点，敏感的大豆栽培种具有比抗性栽培种低5.7-35.8％的种子产量(Niblack和Norton，Plant Dis.，76：943-948(1992))。目前用于管理SCN的方法包括与非宿主作物(通常是玉米)轮作以降低SCN种群密度，使用SCN抗性栽培种使产量最大化，以及最近的SCN抗性栽培种轮作以最小化SCN种群的适应性。

SCN占大豆总病害的大约40％，并且可导致显著的产量损失(高达90％)。目前，最具成本效益的控制措施是作物轮作以及使用宿主植物抗性。虽然育种者已经成功地开发了SCN抗性的大豆品系，但由于抗性的复杂和多基因性质，育种既困难又耗时。抗性常常是品种特异性的，并且由于本领域中SCN种群的改变不能提供随时间的稳定性。此外，当在不存在SCN的情况下种植时，许多抗性大豆变种带来显著的产量损失。

在美国发现SCN后不久，就鉴定出了SCN抗性的来源(Ross和Brim，PlantDis.Rep.，41：923-924(1957))。一些品系(诸如Peking和植物引种(PI)PI88788)被迅速纳入了育种计划。由于Peking缺乏农学上不希望的性状而被广泛用作抗性来源，且Pickett是发布的第一个SCN抗性栽培种(Brim和Ross，Crop Sci.，6：305(1966))。

SCN的野生种群是遗传变异的。在20世纪60年代初，研究人员发现地理上不同的SCN种群在抗性大豆栽培种或植物引种(PI)上的繁殖能力各不相同。这些PI是来自大豆起源的东方(中国、日本和俄罗斯)的大豆近缘种。某些SCN抗性种群可以克服抗性栽培种的认识导致了SCN抗性的另外来源的广泛筛选。目前，已知超过130个PI具有SCN抗性。

线虫学家和大豆育种者基于对栽培种Peking和Pickett以及亚洲PI 88788和90763的两个大豆植物引种的鉴别宿主试验建议将这些变异的种群称为“品种”(Golden等“Terminology and identity of infraspecific forms of the soybean cyst nematode(Heterodera glycines)”Plant Disease Reporter.1970；54：544-546)。栽培种Lee被推荐为易于进行品种测定试验的标准。经典的分类包括基于四个鉴别上的所有可能组合的16个品种(Riggs和Schmitt，“Complete Characterization of the Race Scheme forHeterodera glycines”J Nematol.1988年7月；20(3)：392-5)(参见表1)。

表1：SCN品种分类

SCN抗性或部分抗性根据Schmitt，J.Nematol.20：392-395(1988)中所阐述的方法通过比较所讨论的植物与已知的SCN敏感的宿主Lee 74来确定。在美国，SCN品种3被认为是中西部大豆生产州的突出品种，同时SCN品种1的流行正在增加。在东部海岸和沿密西西比接壤的地区，SCN品种2盛行。SCN品种流行率的类似转变也发生在其他大豆生产地区，包括例如巴西。因此，开发赋予广谱SCN品种抗性的大豆变种是很重要的。

最近，引入了一种替代方案，大豆异皮线虫(HG)型分类方案来表征SCN的野生种群(“A Revised Classification Scheme for Genetically Diverse Popul ations ofHeterodera glycines.”Niblack等J Nematol.2002年12月；34(4)：279-88)。HG型分类利用七种植物引种(PI)作为“指示品系”(表2)(Niblack，“Soybean Cyst Nematode ManagementReconsidered，”Plant Diseases，89(10)：1020-1026(2005))，这意味着它们是给定SCN种群的合适的宿主。然后基于观察到的宿主“指示品系”的感染，将一系列指示编号分配给种群。例如，SCN品种1种群对应于HG 2.5.7型种群(克服PI 88788、PI 209332和Cloud)。SCN品种2种群对应于HG 1.2.5.7型(克服Peking、PI 88788、PI 209332和Cloud)，而SCN品种3种群对应于HG 0型(有时为HG 7型，意味着它不能克服(雌性指数大于10％)指示品系中的任一个或者仅克服Cloud)。

表2：SCN种群的HG型分类

概述

本公开提供了用于产生具有增强的大豆孢囊线虫抗性的大豆植物种群的方法，其包括：

a.提供大豆植物的第一种群；

b.在所述第一种群中检测以20cM或更少与连锁群B1上的大豆孢囊线虫抗性基因座遗传连锁的遗传标记的存在；

c.从大豆植物的所述第一种群中选择含有所述标记的一个或多个大豆植物；和

d.由至少一种所述选择的大豆植物生产后代种群。

本公开还提供方法，其中所检测的遗传标记以小于15cM、更优选小于10cM与连锁群B1上的大豆孢囊线虫抗性基因座遗传连锁。

在另一实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接Glyma11g33160和BARCSOYSSR_11_1442的染色体区间内的遗传标记。在另一个实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接Glyma11g33490和Glyma11g36970的染色体区间内的遗传标记。在另一个实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接Glyma11g33910和Glyma11g37440的染色体区间内的遗传标记。在另一个实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接Glyma11g34850和Glyma11g38050的染色体区间内的遗传标记。

在另一个实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.44的染色体区间内的遗传标记。在另一个实施方案中，本公开提供检测位于包含并侧接SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.39的染色体区间内的遗传标记。在一个优选实施方案中，所述遗传标记选自由SEQ ID NO.1-44组成的组中的至少一个。

根据本发明，大豆孢囊线虫抗性基因座源自Peking栽培种。在本发明的另一实施方案中，大豆孢囊线虫的一部分为大豆异皮线虫品种1、2或3。具体而言，在本发明的一个实施方案中，大豆孢囊线虫的一部分为大豆异皮线虫HG 0型、HG 7型、HG 2.5.7型或HG1.2.5.7型。

本公开也提供了产生包含与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的至少一个等位基因的大豆植物种群的方法，所述等位基因包含选自由SEQ ID NO：1至44组成的组的至少一个序列，所述方法包括以下步骤：

a.对大豆植物的第一种群进行基因分型，所述种群含有与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的至少一个等位基因，所述与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的至少一个等位基因包含选自由SEQ ID NO：1至44组成的组的至少一个序列；

b.从所述第一种群中选择含有与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的所述至少一个等位基因的一个或多个鉴定的大豆植物，所述等位基因包含选自由SEQ ID NO：1至44组成的组的至少一个序列；和

c.由所述选择的大豆植物生产第二种群，从而产生包含与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的至少一个等位基因的大豆植物种群，所述基因包含选自由SEQ ID NO：1至44组成的组的至少一个序列。

在一个实施方案中，Peking栽培种中也存在与增强的大豆孢囊线虫抗性相关的等位基因。

本公开还提供了用于产生具有增强的大豆孢囊线虫抗性的大豆植物种群的方法，其包括：

a.提供大豆植物的第一种群；

b.同时在所述第一种群中检测以20cM或更少与rhg1、Rhg4和rhg1d中每一个遗传连锁的至少一个遗传标记的存在；

c.从大豆植物的所述第一种群中选择含有所述至少一个标记的一个或多个大豆植物；和

d.由至少一种所述选择的大豆植物生产后代种群。

在一个实施方案中，检测的至少一个遗传标记以小于15cM与rhg1、Rhg4和rhg1d中的至少一个遗传连锁。在另一实施方案中，检测的至少一个遗传标记以小于10cM与rhg1、Rhg4和rhg1d中的至少一个遗传连锁。

附图简述

图1示出了根据本公开的一方面rhg1d SCN抗性等位基因对大豆对SCN品种1的抗性的影响的结果。

图2示出了根据本公开的一方面rhg1d SCN抗性等位基因对大豆对SCN品种1的抗性的影响与对SCN品种3的抗性相比的结果。

图3示出了根据本公开的一个方面在用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理的种子的温室研究中大豆根上的SCN孢囊的数量，其中用品种2 SCN攻击两个SCN品种2易感性大豆品系和SCN抗性大豆品系。

图4示出了根据本公开的一个方面在使用

单独或与3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑结合处理的种子的温室研究中大豆根上的SCN孢囊的数量，其中用SCN攻击SCN易感性大豆品系和SCN抗性大豆品系。

图5示出了根据本公开的一个方面在低品种1 SCN压力(即，约536 SCN卵/100cc土壤)下使用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑在现场试验中获得的产量的增加。

图6示出了根据本公开的一个方面在高品种1 SCN压力(即，约1645 SCN卵/100cc土壤)下使用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑在现场试验中获得的产量的增加。

详述

除非另外定义，否则本文所用的技术性和科学性术语具有与本领域中技术人员通常所理解的相同含义。本领域的技术人员将了解很多方法可以在本公开的实践中使用。实际上，本公开决不限于所述方法和材料。本文中引用的任何参考文献均以引用的方式整体并入本文。

Concibido等报道了Peking提供对SCN品种1的抗性(Crop Sci.37：258-264)。然而，在某些背景下的育种实验期间，发现正如所料由Peking来源赋予的品种1抗性不受2基因模型调节。本公开已经发现对于品种1抗性，需要来自Peking的第三基因座。如本文所提供，此第三基因座可认为是涉及Peking型抗性的两个先前已知的基因座中的一个的复制。本公开提供了具有Peking型抗性的变种。本公开包括并提供了将抗性引入现有原种品系中以提供广谱SCN品种抗性品系的方法作为SCN管理策略的一部分。本公开鉴定了来自Peking的rhg1d基因座和rhg1d等位基因，提供了紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)，并且证明了rhg1d SCN抗性等位基因对于品种1和可能的品种2抗性是很重要的。

如本文所提供，Peking型抗性可以使用标记rhg1d的Peking等位基因的标记获得。此类标记可以在早期世代中使用以选择具有抗性的种群，或在后代中用于表征和优先考虑哪种材料以进行产量测试试验。本文提供的标记也提供将并入所有已知的SCN抗性等位基因的植物育种成单一品系。本公开提供了用于育种程序的Peking型抗性材料的扩展基础，并且这种更大的基础允许具有Peking型抗性的农学上可接受的和高产量的变种。

染色体区间

术语“染色体区间”是指驻留在植物中单条染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。所述术语也指由本发明阐述的标记中的任一个限定的任何以及所有基因组区间。位于单条染色体区间上的遗传因子是物理连锁的，并且染色体区间的大小没有特别限制。在一些方面，位于单条染色体区间内的遗传因子是遗传连锁的，通常具有例如小于或等于20cM、或可选地小于或等于10cM的遗传重组距离。也就是说，单条染色体区间内的两个遗传元件分别以小于或等于20％或10％的频率进行减数分裂重组。

染色体区间的边界可以由遗传重组距离或由标记进行限定。在一个实施方案中，染色体区间的边界包含标记。在另一实施方案中，染色体区间的边界包含将被连锁到控制感兴趣的性状的基因的标记，即位于给定区间内的任何标记，包括限定区间的边界的末端标记以及可用作标记疾病耐受性存在或不存在的标记。在一个实施方案中，本文所述的区间涵盖与疾病耐受性共分离的标记簇。标记的簇集发生在染色体上相对较小的结构域中，表明在那些染色体区域中存在控制感兴趣的性状的遗传基因座。所述区间涵盖映射在区间内的标记以及限定末端的标记。

由限定区间端点的末端标记描述的区间将包括所述末端标记和定位于所述染色体结构域内的任何标记，无论那些标记是目前已知的还是未知的。尽管预期的是本领域技术人员可以在本文鉴定的标记内部和周围的标记基因座处描述另外的多态性位点，但是本文所述的与疾病耐受性相关的染色体区间内的任何标记都在本发明的范围内。

“数量性状基因座(Quantitative trait loci)”或“数量性状基因座(quantitative trait locus)”(QTL)是影响可以以定量术语描述的表型的遗传结构域，并且可以指定对应于表型性状的数量值的“表型值”。QTL可以通过单基因机制或通过多基因机制起作用。在一些方面，本发明提供QTL染色体区间，其中那些区间中包含与疾病耐受性分离的QTL(或多个QTL)。在本发明的一个实施方案中，染色体区间的边界被绘制为涵盖将被连锁到一个或多个QTL的标记。换句话说，染色体区间被绘制使得位于所述区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)与QTL遗传连锁。每个区间包含至少一个QTL，并且此外，确实可以包含多于一个QTL。在相同区间中多个QTL的紧密接近可以模糊特定标记与特定QTL的相关性，因为一个标记可以证明与多于一个QTL的连锁。相反，例如，如果两个非常接近的标记显示与所需的表型性状的共分离，那么有时则不清楚这些标记中的每一个是否识别相同的QTL或两个不同的QTL。无论如何，知道在特定区间中有多少QTL对于实现或实施本发明是不必要的。

在一个实施方案中，本公开提供包含选自由SEQ ID NO：1-44和其片段以及两者的互补序列组成的组的核酸分子的植物。在另一实施方案中，本公开也提供了包含rhg1d染色体区间或其片段和互补序列的等位基因的植物。本公开也提供了包含与选自由SEQ ID NO：1-44组成的组的至少一个标记连锁的一个或多个疾病抗性基因座的任何组合的任何植物。

rhg1d基因座和包含与rhg1d基因座紧密连锁的标记的染色体区间在大豆基因组中的位置在表3中公开。遗传图谱位点以cM表示，位置零是Monsanto内部一致性图谱(MON图谱)和GmConsensus 4.0大豆基因组图谱上的染色体开始处的已知的第一个(最远端)标记，其可从Soybase.org网站自由公开获得并且通常由本领域技术人员使用。表3中也公开了由美国能源部联合基因组研究所(DOE-JGI)生物群落测序项目(CSP)在Glyma1.0公共组件上报道的基因座的物理位置，其可在phytozome.net网站上获得(Schmutz J，等(2010).“Genome sequence of the palaeopolyploid soybean.”Nature 463，178-183)。

表3：与rhg1d相关的标记和染色体区间的遗传图谱位置和物理图谱位置

cM＝厘摩；**精确坐标未知。可以基于具有已知坐标的最近的侧翼基因座来估计坐标。

在表3中，“cM”是指厘摩的经典定义(Haldane 1919 J Genet 8：299-309)，其中1cM等于一个遗传基因座处的性状将与另一基因座处的性状由于单个减数分裂中的交叉而分离的1％的机会(意味着性状99％的时间共分离)，并且这种限定在本文中用于描绘涉及本发明的图谱位置。

例如，位于LG B1上的rhg1d染色体区间含有SEQ ID NO.1-44，并且侧接标记Glyma11g34850和Glyma11g38050，其在内部来源的遗传图谱上分开约15cM。此染色体区间涵盖在所研究的群体中以-Log10(P值)≥3.0与SCN抗性共分离的标记簇。rhg1d染色体区间的子区间的实例是侧接在内部来源的遗传图谱上分开约15cM的SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.44的子区间，其定义了涵盖在所研究的群体中以-Log10(P值)≥3.0研究与SCN抗性共分离的标记簇的染色体区间。

因此，本领域技术人员可以使用本发明通过将疾病耐受表型与大豆基因组中先前未知的疾病耐受基因座处的基因型相关联来提高育种效率以改进大豆的疾病耐受性。本文公开了包含负责疾病耐受的和疾病易感的大豆品系之间的表型差异的等位基因的染色体区间。染色体区间实例的特征在于在染色体B1上包括并侧接并包括标记Glyma11g34850和Glyma11g38050的基因组区域，并且包含rhg1d基因座内的或与rhg1d基因座紧密连锁(20cM内)的标记。本发明也包含其边界在Glyma11g33160和BARCSOYSSR_11_1442之间并包括Glyma11g33160和BARCSOYSSR_11_1442的其他区间，或与那些区间紧密连锁的任何区间。

可用于此目的的标记的实例包括表3中所列的SNP标记或映射在本文所述的染色体区间(包括区间的末端)内的任何标记，或与那些标记连锁的任何标记。此类标记可以在单个样品或样品群中同时或依次测定。

因此，本公开的标记和方法可以用于指导MAS或培育具有与优异的农艺性能(耐受性，以及用于产量、疾病抗性等的任何其他可获得的标记)相关的染色体区间的等位基因形式的所需互补序列(组)的大豆变种。公开的标记等位基因的任一个都可以经由基因渗入通过传统育种被引入大豆品系中(或经由转化或两者引入)以产生具有优异的农艺性能的大豆植物。可以被引入或存在于本公开的大豆植物中的与耐受性相关的等位基因的数目在一至本文公开的等位基因的数目范围内，其每个整数如同明确叙述并入本文。

使用位于DNA基因座任一侧侧翼的另外的标记的标记辅助选择(MAS)提供了进一步的效率，因为将会需要不太可能的双重组事件来同时断开基因座与两个标记之间的连锁。而且，MAS领域的技术人员使用紧密位于基因座侧翼的标记可以通过更精确地选择具有较少潜在有害的供体亲本DNA的个体来减少连锁阻力。连接到本文所述的染色体区间或位于其中的任何标记都可以是有用的并且在本发明的范围内。

类似地，通过鉴定缺乏所需标记基因座的植物，可以鉴定并且(例如)从随后的杂交中消除易感的或低耐受的植物。类似地，这些标记基因座可以作为旨在增强产量的整体MAS育种程序的一部分被渗入到任何所需的基因组背景、种质、植物、品系、变种等中。本发明也提供了染色体QTL区间，其在MAS中等同地用于选择显示出疾病耐受性或改进的耐受性的植物。类似地，QTL区间也可以用于反选择对疾病易感或具有降低的耐受性的植物。

在一些实施方案中，本公开提供了用于选择具有增强的SCN抗性的大豆植物的方法。这些方法包括在侧接了表3中所列的标记基因座中的任何两个的染色体区段中的多态性基因座处检测SCN抗性等位基因。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.1-44中的任何两个的染色体区段中的多态性基因座处检测SCN抗性等位基因。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.1-44中的任何两个的染色体区段中检测SCN抗性单倍型。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.11-44中的任何两个的染色体区段中的多态性基因座处检测SCN抗性等位基因。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.11-44中的任何两个的染色体区段中检测SCN抗性单倍型。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.11-39中的任何两个的染色体区段中的多态性基因座处检测SCN抗性等位基因。在其他实施方案中，这些方法包括在侧接了标记基因座SEQ ID NO.11-39中的任何两个的染色体区段中检测SCN抗性单倍型。

本公开也扩展到制备子代大豆植物的方法。所述方法包括使第一亲本大豆植物与第二大豆植物杂交，以及在植物生长条件下培养雌性大豆植物以产生大豆植物子代。杂交和培养大豆植物的方法完全在本领域普通技术人员的能力范围内。此种大豆植物子代可以测定与耐受性相关的等位基因，从而测定所选择的所需后代。此种子代植物或种子可以商业出售用于大豆生产，用于食品，加工以获得大豆的所需成分，或进一步用于随后的育种轮次。第一大豆植物或第二大豆植物中的至少一个是本公开的大豆植物，因为其包含本公开的标记的至少一种等位基因形式，使得子代能够继承所述等位基因。

通常，将本公开的方法应用于至少一种相关的大豆植物，诸如来自目标大豆植物系谱中的祖先品系或后代品系，使得可以追踪所需耐受性等位基因的遗传。分离接受本公开的方法的大豆植物的代数一般为1至20、常为1至5、并且通常为1、2或3代分离，并且常常是直接后代或亲代的大豆植物将经受所述方法(即，一代分离)。

因此，利用本发明，本领域技术人员可以在大豆植物的基因组中检测疾病耐受性基因型是否存在，作为标记辅助选择程序的一部分。在一个实施方案中，育种者在针对含有疾病耐受性等位基因的疾病耐受的亲本的一个或多个标记处确定了所述基因型，并且在针对缺乏耐受性等位基因的易感的亲本的一个或多个标记处确定了所述基因型。例如，本公开的标记可以在涉及原种大豆品系x外来大豆品系的杂交中用于MAS，所述标记通过使分离的子代经受MAS以维持疾病耐受性等位基因或在疾病状况下与产量相关的等位基因。然后，育种者可以通过随后源自两个亲本之间杂交的种群通过用亲本上使用的标记对后代进行基因分型并将那些标记的基因型与亲本的基因型进行比较来可靠地追踪耐受性等位基因的遗传。根据标记等位基因与性状如何紧密连锁，可以可靠地预测与疾病耐受的亲本共享基因型的子代表达耐受的表型；与疾病易感的亲本共享基因型的子代表达易感的表型。因此，避免了针对疾病抗性手工对子代进行表型分型的费力和低效的过程。

通过提供大豆基因组中的区间和其中的疾病耐受性相关标记的位置，本发明也允许本领域技术人员鉴定本文公开的区间内的其他标记或与本文公开的染色体区间连锁的其他标记。

在感兴趣基因座侧翼紧密连锁的具有与所述基因座处的抗性等位基因处于连锁不平衡中的等位基因的的标记可以有效地用于选择对疾病状况具有增强的耐受性的子代植物。因此，本文所述的标记，诸如表3所列的那些以及遗传映射或物理映射到相同染色体区间的其他标记，可用于选择对疾病状况具有增强耐受性的大豆植物。通常，将在基因上方的侧翼区域中使用一组这些标记(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个)，并且在基因下方的侧翼区域中使用类似的一组。任选地，如上所述，也可以使用实际的基因和/或基因座内的标记。针对这些标记组筛选亲本及它们的子代，并且使用在两个亲本之间多态的标记进行选择。在基因渗入程序中，这使得在更近端多态性标记处选择基因或基因座基因型，并在更远端多态性标记处选择轮回亲本基因型。

实际用于实施本发明的标记的选择没有特别限制，并且可以是映射在本文所述的rhg1d染色体区间内的任何标记，与rhg1d染色体区间中的标记紧密连锁(在20cM内)的任何标记，或选自SEQ ID NO：1-44或表3中所列的标记中的任何标记。此外，由于存在本领域已知的许多不同类型的标记检测测定法，因此不旨在以任何方式限制用于实施本发明的标记检测测定法的类型(例如RAPD、RFLP、SNP、AFLP等)。

另外的遗传标记可以与表3中提供的标记结合使用，或者独立于表3中提供的标记使用来实施本发明的方法。可以从其中获得有用标记的可公开获得的标记数据库包括但不限于由美国农业研究局(United States Agricultural Research Service)、美国农业部(United States Department of Agriculture)和艾奥瓦州立大学(Iowa StateUniversity)管理的互联网(World Wide Web)上的soybase.org网站。可以使用并且已经在文献中描述的另外的大豆标记包括但不限于Hyten等，BMC Genomics.11：38，2010；Choi等，Genetics.176(1)：685-96，2007；Yoon等，Theor Appl Genet.2007年3月；114(5)：885-99；和Hyten等Crop Sci.201050：960-968。

表3中的SEQ ID NO.1-44的序列可以从序列表中获得。表3中公开的可公开获得的标记的序列可以使用来自以下互联网位置的第1列(标记/基因座名称)中提供的标识符在万维网(或因特网)上获得：

a.“soybase.org”(在Grant等，Nucleic Acids Research，2010，卷38，Data baseissue D843-D846中描述)或soybase.org/gbrowse/cgi-bin/gbrowse/gmax1.01/(参见Hyten DL，Choi I-Y，Song Q，Specht JE，Carter TE等(2010)A high density integratedgenetic linkage map of soybean and the development of a 1，536 Universal SoyLinkage Panel for QTL mapping.Crop Science 50：960-968以及Hyten DL，Cannon SB，Song Q，Weeks N，Fickus EW等(2010).High-throughput SNP discovery through deepresequencing of a reduced representation library to anchor and orientscaffolds in the soybean whole genome sequence.BMC Genomics 11(1)：38)。

b.“phytozome.net”或“phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean/”；

c.“www.plantgdb.org”或“plantgdb.org/GmGDB/(Assembly versionGlyrna1.170(2009年4月)”；以及

d.“ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez”和子网站“ncbi.nlm.nih.gov/nucest”、“ncbi.nlm.nih.gov/dbEST”、“ncbi.nlm.nih.gov/genbank/”、“.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome”、“ncbi.nlm.nih.gov/unigene”和“ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi？TAXID＝3847”。

分子遗传标记

如本文所用，“标记”、“遗传标记”、“分子标记”、“标记核酸”和“标记基因座”是指当鉴定连锁基因座时用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白质)。标记可以源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，剪接的RNA、cDNA等)或编码的多肽，并且可以由一个或多个特定变体序列或共有序列表示。在另一个意义上，标记是此种序列的分离变体或共有序列。所述术语还指与标记序列互补或侧接的核酸序列，诸如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“标记探针”是可用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。另选地，在一些方面，标记探针是指能够区分(即，基因分型)存在于标记基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。“标记基因座”是可用于追踪第二连锁基因座的存在的基因座，例如编码或促成表型性状表达的连锁基因座。例如，标记基因座可以用于监测等位基因在遗传或物理连锁到标记基因座的基因座(诸如QTL)处的分离。因此，“标记等位基因”，另选地“标记基因座的等位基因”是在标记基因座多态性的种群中的标记基因座处发现的多个多态性核苷酸序列之一。

如本文所用，“标记”也是指与基因组序列互补的核酸序列，诸如用作探针的核酸。可以通过本领域完善的方法检测对应于种群成员之间的遗传多态性的标记。这些包括，例如，基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(RFLP)的检测、同工酶标记的检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)的多核苷酸多态性检测、植物基因组扩增可变序列的检测、自我维持序列复制的检测、简单序列重复(SSR)的检测、单核苷酸多态性(SNP)的检测或扩增片段长度多态性(AFLP)的检测。完善的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)以及源自EST序列和随机扩增多态性DNA(RAPD)的SSR标记。

标记的有利等位基因是与所需表型(例如，疾病耐受性)共分离的标记的等位基因。如本文所用，尽管所述标记可能具有在种群中发现的两个或更多个有利的等位基因，QTL标记具有最少一个有利的等位基因。所述标记的任何有利的等位基因可以有利地用于鉴定和构建疾病耐受的植物品系。任选地，不同标记的一个、两个、三个或更多个有利的等位基因在植物中进行鉴定或渗入进植物中，并且可以在MAS期间进行选择或对抗。所需的是，鉴定具有至少一个与疾病耐受性或改进的疾病耐受性正相关的这种有利等位基因的植物或种质。另选地，与疾病易感性共分离的标记等位基因也可用于本发明，因为所述等位基因可用于鉴定和对抗选择疾病易感的植物。此种等位基因可以在育种期间用于排除目的，来鉴定与耐受性负相关的等位基因，从后续育种轮次中消除易感的植物或种质。在本公开中，有利的等位基因赋予SCN抗性。赋予SCN抗性的有利的等位基因可被称为“抗性等位基因”。

标记与影响表型的DNA基因座的连接越紧密，标记在MAS中越可靠，因为拆开标记和基因座的重组事件的可能性降低。含有性状的因果突变或者在致病基因的编码序列内的标记是理想的，因为在它们和负责表型的DNA序列之间预计没有重组。

遗传标记在多核苷酸长度和/或序列的基础上可以彼此区分(以及与任何特定标记的多个等位基因区分)。大量的大豆分子标记是本领域已知的，并且可以从各种来源(诸如soybase.org网络资源)公开或获得。总的来说，在子代中分离的任何差异遗传的多态性性状(包括核酸多态性)都是潜在的遗传标记。

在本公开的一些实施方案中，选择一个或多个标记等位基因用于单个植物或植物种群中。在这些方法中，选择含有来自多于一个耐受性标记的有利等位基因的植物，或者另选地，使来自多于一个耐受性标记的有利等位基因渗入到所需种质中。技术人员认识到，有利的标记等位基因的鉴定是种质特异性的。对于研究中的特定种质，确定哪些标记等位基因与耐受性(或易感性)相关。技术人员认识到用于鉴定有利的等位基因的方法是本领域已知的。此类有利的等位基因的鉴定和使用在本发明的范围内。此外，在除了本文使用或描述的种群之外的植物种群中的有利的标记等位基因的鉴定也在本发明的范围内。

标记检测

在一些方面，本公开的方法利用扩增步骤来检测/基因分析标记基因座，但是扩增并不总是标记检测(例如Southern印迹和RFLP检测)的要求。在扩增/检测方法中也可以省略单独的检测探针，例如通过执行实时扩增反应，所述实时扩增反应通过在将相关扩增引物掺入产物中时修饰相关扩增引物，将标记的核苷酸掺入扩增子来检测产物形成，或通过监测与未扩增的前体相比扩增子的分子旋转属性的变化(例如，通过荧光偏振)。

“扩增”在核酸扩增的上下文中是指由此产生所选核酸(或其转录形式)的额外拷贝的任何过程。在一些实施方案中，使用基于扩增的标记技术，其中引物或扩增引物对与从第一植物或种质中分离的基因组核酸混合，并且其中所述引物或引物对与标记基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用植物基因组核酸作为模板通过DNA聚合酶引发DNA聚合。引物或引物对在具有DNA聚合酶和模板基因组核酸的DNA聚合反应中延伸以产生至少一个扩增子。在其他实施方案中，植物RNA是扩增反应的模板。在一些实施方案中，QTL标记是SNP型标记，且检测的等位基因是SNP等位基因，并且检测方法为等位基因特异性杂交(ASH)。

总的来说，对于它们的检测，大多数遗传标记依赖于的核酸的一种或多种属性。典型的扩增方法包括基于聚合酶的各种复制方法(包括聚合酶链式反应(PCR))，连接酶介导的方法(诸如连接酶链式反应(LCR))和基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。“扩增子”是扩增的核酸，例如通过任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)扩增模板核酸产生的核酸。“基因组核酸”是细胞中在序列上对应于可遗传核酸的核酸。常见的实例包括核基因组DNA和其扩增子。在一些情况下，基因组核酸不同于剪接的RNA或相应的cDNA，因为剪接的RNA或cDNA(例如通过剪接机械)进行加工以除去内含子。基因组核酸任选地包含非转录序列(例如染色体结构序列、启动子区、增强子区等)和/或非翻译序列(例如内含子)，而剪接的RNA/cDNA通常不具有非转录序列或内含子。“模板核酸”是在扩增反应(例如，基于聚合酶的扩增反应诸如PCR，连接酶介导的扩增反应诸如LCR，转录反应等)中充当模板的核酸。模板核酸可以是来源于基因组，或者另选地可以源自表达的序列，例如cDNA或EST。关于这些和其他扩增方法的使用细节可以在多种标准文本中的任何一篇中找到。许多可用的生物学文本也具有关于PCR和相关扩增方法的扩展讨论，并且技术人员将理解，基本上任何RNA都可以转化为适合于限制性消化、PCR扩增和使用逆转录酶和聚合酶测序的双链DNA。

也可以根据本公开执行使用通常称为“TaqMan^TM”探针的双标记荧光寡核苷酸探针的PCR检测和定量。这些探针由用两种不同荧光染料标记的短(例如，20-25个碱基)寡脱氧核苷酸组成。在每个探针的5′末端是报告染料，并且在每个探针的3′末端发现淬灭染料。寡核苷酸探针序列与存在于PCR扩增子中的内部靶序列互补。当探针完整时，在两个荧光基团之间发生能量转移，并且报告基团的发射被淬灭基团通过FRET淬灭。在PCR的延伸期期间，探针被反应中使用的聚合酶的5′核酸酶活性切割，从而从寡核苷酸-淬灭基团中释放报告基团并产生报告基团发射强度的增加。TaqMan^TM探针是具有标签和淬灭基团的寡核苷酸，其中所述标签在扩增期间通过用于扩增的聚合酶的核酸外切酶作用释放，提供合成期间扩增的实时测量。多种TaqMan^TM试剂可商购获得，例如，来自Applied Biosystems以及来自多个专业供应商诸如Biosearch Technologies。

在一个实施方案中，简单地通过多多态性标记区域的核苷酸测序来确定分子标记的是否存在。如上述其他方法，此方法容易适应高通量分析，例如使用可用的高通量测序方法诸如杂交测序。

在另选的实施方案中，可以使用计算机模拟方法来检测感兴趣的标记基因座。例如，包含感兴趣的标记基因座的核酸序列可以存储在计算机中。所需的标记基因座序列或其同源序列可以使用由例如容易获得的程序(诸如BLAST)或甚至简单的字处理程序所提供的合适的核酸搜索算法来鉴定。

虽然在本文的图和表中提供的示例性标记是任一SNP标记，但是在本公开的上下文中可以采用上述标记类型的任一种来鉴定涵盖有助于优异的农艺性能(例如疾病耐受性或改进的疾病耐受性)的遗传元件的染色体区间。

引物和探针

总的来说，用于制备寡核苷酸(包括探针、引物、分子信标、PNA、LNA(锁核酸)等)的合成方法是已知的。例如，寡核苷酸可根据所述的固相亚磷酰胺三酯法进行化学合成。寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸，也可以从多种商业来源订购。

可以克隆和/或合成针对标记基因座的核酸探针。任何合适的标签都可以与本公开的探针一起使用。适合与核酸探针一起使用的可检测标签包括，例如，可通过光谱、放射性同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何组合物。有用的标签包括，用于标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠、荧光染料、放射性标签、酶和比色标签。其他标签包括与用荧光基团标记的抗体结合的配体、化学发光试剂和酶。探针也可以构成用于产生放射性标记的扩增子的放射性标记的PCR引物。

不旨在将本公开的核酸探针限于任何特定大小。

在一些优选的实施方案中，使用合适的基于PCR的检测方法检测本公开的分子标记，其中PCR扩增子的大小或序列指示标记(例如，特定标记等位基因)是否存在。在这些类型的方法中，PCR引物与多态性标记区域侧翼的保守区杂交。如本领域所用，用于扩增分子标记的PCR引物有时被称为“PCR标记”或简称为“标记”。应当理解，尽管本文提供了引物的许多具体实例，但是可以使用任何合适的方法设计用于本发明的合适的引物。不旨在将本发明限于任何特定的引物或引物对。在一些实施方案中，本公开的引物通过任何合适的方式(例如，使用非放射性荧光标签)进行放射性标记或标记，以使得在扩增反应之后不需要任何另外的标记步骤或可视化步骤就能够快速可视化不同大小扩增子。在一些实施方案中，引物不进行标记，并且扩增子根据其大小分辨率，例如在琼脂糖凝胶电泳之后可视化。在一些实施方案中，根据大小分辨率的PCR扩增子的溴化乙锭染色使得不同大小的扩增子可视化。不旨在将本公开的引物限于产生任何特定大小的扩增子。例如，本文中用于扩增标记基因座和等位基因的引物不限于扩增相关基因座的全部区域。引物可以产生比本文公开的那些更长或更短的任何合适长度的扩增子。在一些实施方案中，标记扩增产生长度为至少20个核苷酸、或者另选地长度为至少50个核苷酸、或者另选地长度为至少100个核苷酸、或者另选地长度为至少200个核苷酸的扩增子。除本文所述的那些之外的标记等位基因也可用于本公开。

连锁分析和QTL

连锁分析

“连锁”或“遗传连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其他基因座(例如，耐受基因座)“相关”的程度。例如，如果基因座A具有基因“A”或“a”，而基因座B具有基因“B”或“b”，并且具有AABB的亲本1和具有aabb的亲本2之间的交叉将产生四个可能的配子，基因在其中被分离为AB、Ab、aB和ab。未预期的是，将存在独立的等同分离为四种可能的基因型中的每一种，即每种基因型的1/4的配子都没有连锁。将配子分离成不同于1/4的基因型归因于连锁。如本文所用，连锁可以早两个标记之间，或者另选地在标记和表型之间。标记基因座可以与性状相关(连锁)，例如，当标记基因座与耐受性性状处于连锁不平衡(LD)时，标记基因座可以与对植物病原体的耐受性或改进的耐受性相关。测量分子标记与表型性状(例如QTL)的连锁程度，例如，作为所述分子标记与表型的共分离的统计概率。

如本文所用，给出分子标记与表型之间的连锁关系是表型与特定标记等位基因是否存在的特定组合是随机的统计可能性。因此，概率分数越低，表型和特定标记将会共分离的可能性越大。在一些实施方案中，随机分配的概率分数为0.05(p＝0.05或5％的概率)被认为是共分离的显著性指标。然而，本公开不限于此特定标准，并且可接受的概率可以是小于50％(p＜0.5)的任何概率。例如，显著性概率可以小于0.25、小于0.20、小于0.15或小于0.1。在本申请中短语“紧密连锁”意指两个连锁基因座之间的重组以等于或小于约10％的频率发生(即在遗传图谱上分开不超过10cM)。在一个方面，本公开的任何标记物与距离等于或小于50cM的任何其他标记物连锁(遗传上和物理上)。在另一方面，本公开的任何标记物与距离非常接近、例如等于或小于10cM的任何其他标记物紧密连锁(遗传上和物理上)。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可以定位于距离彼此20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。

经典连锁分析可以被认为是不同性状的共分离的相对频率的统计描述。连锁分析是性状如何基于它们一起分离的频率分组在一起的良好表征的描述性框架。也就是说，如果两个非等位基因性状以大于随机频率一起遗传，则称它们为“连锁的”。性状一起遗传的频率是性状连锁紧密程度的主要量度，即，以较高频率一起遗传的性状比以较低(但仍高于随机)频率遗传的性状连锁更紧密。基因位于染色体上越远，它们一起分离的可能越小，因为同源染色体在减数分裂期间重组。因此，基因位于染色体上越远，在减数分裂期间将存在交叉事件的可能越大，这将导致标记和负责性状的DNA序列，所述标记被设计为在子代中分别追踪分离。连锁的常用度量是性状共分离的频率。这可以表示为共分离的百分比(重组频率)，或者也常以厘摩(cM)表示。

连锁分析用来确定哪个多态标记等位基因表现了与耐受性表型(例如，“耐受性标记等位基因”)共分离的统计学可能性。在鉴定与耐受性表型共分离的标记等位基因后，可以使用所述标记快速、准确地筛选耐受性等位基因的植物品系，而不需要通过其生命周期培养植物并等待表型评价，并且此外，即使当实际的耐受性QTL的分子身份是未知的时，也允许针对特定耐受性等位基因的遗传选择。组织样品可以例如从胚乳、胚胎或成熟/发育植物中获取，并用适当的分子标记筛选，以快速确定哪些后代含有所需的遗传特征。连锁标记也消除了可以经常影响表型表达的环境因素的影响。

因为染色体距离与性状之间的交叉事件的频率近似成比例，所以存在与重组频率相关的近似物理距离。标记基因座本身是性状，并且可以根据标准连锁分析通过在分离期间追踪标记基因座来评估。因此，在本公开的上下文中，由于在单个世代中交叉，1cM等于标记基因座将与另一个基因座(其可以是任何其他性状，例如另一个标记基因座或编码QTL的另一个性状基因座)分离的1％的机会。

当提及两个遗传元件(诸如有助于耐受性的遗传元件和近端标记物)之间的关系时，“相引”相连锁指示在所述耐受性基因座处的“有利”等位基因在相同染色体链上作为各自连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理缔合的状态。在相引相中，两个有利的等位基因由遗传所述染色体链的后代遗传在一起。在“相斥”相连锁中，感兴趣基因座处(例如，用于耐受性的QTL)的“有利”等位基因与近端标记基因座处的“不利”等位基因物理连锁，并且两个“有利”等位基因不是一起遗传的(即，两个基因座彼此“异相”)。

数量性状基因座

QTL的等位基因可以包含甚至在连续的基因组区域或连锁群(例如单倍型)内的多个基因或其他遗传因素。如本文所用，疾病抗性基因座的等位基因可以涵盖多于一个基因或核苷酸序列，其中每个个体基因或核苷酸序列也能够表现等位基因变异，并且其中每个基因或核苷酸序列也能够引发所讨论的数量性状的表型效应。在本公开的一个方面，QTL的等位基因包含也能够表现等位基因变异的一个或多个基因或核酸序列。因此，术语“QTL的等位基因”的使用不旨在排除包含多于一个基因或其他遗传因素的QTL。具体地，本发明中的“QTL的等位基因”可以表示单倍型窗(haplotype window)内的单倍型，而表型可以是疾病抗性。单倍型窗是可以用一组一个或多个多态性标记定义和追踪的连续基因组区域，其中所述多态性指示血缘一致性(identity by descent)。所述窗内的单倍型可以通过每个标记处的等位基因的独特指纹来定义。当存在于染色体上给定基因座处的所有等位基因都相同时，所述植物在所述基因座处是纯合的。如果存在于染色体上给定基因座处的等位基因不同，那么所述植物在所述基因座处是杂合的。本公开的植物在任何特定疾病基因座或对于特定多态性标记可以是纯合的或杂合的。

用于计算标记和有用QTL之间或基因组中任何基因座之间的连锁的QTL分析和统计方法的原理在本领域是熟知的。示例性方法包括惩罚回归分析、岭回归、单点标记分析、复杂谱系分析、贝叶斯MCMC、血缘一致性分析、区间映射、复合区间映射和Haseman-Elston回归。QTL分析常常借助于可从本领域技术人员已知的多种公共和商业来源获得的计算机和专用软件来执行。

在本公开的一些实施方案中，“LOD分数”用于指示标记与QTL相关的可能性。LOD分数基本上表示假设QTL存在出现的数据比不存在QTL的数据的可能性大多少。用于避免具有给定置信度(例如95％)的假阳性的LOD阈值取决于标记的数量和基因组的长度。指示LOD阈值的图表在Lander和Botstein，Genetics，121：185-199(1989)中阐述，并且由Arús和Moreno-González，Plant Breeding，Hayward，Bosemark，Romagosa(编)Chapman & Hall，London，pp.314-331(1993)进一步描述。优势比(LOD)的log₁₀计算如下：LOD＝log₁₀(对于QTL的存在的MLE(给定没有连锁QTL的MLE))，其中MLE是最大似然估计。如本文所用，核酸标记与QTL遗传连锁，其中如通过区间作图所判断的，对于SCN抗性或部分抗性，所述标记核酸分子表现大于2.0的LOD分数，优选其中如通过区间作图所判断的，对于SCN抗性或部分抗性，所述标记核酸分子表现大于3.0的LOD分数，更优选其中如通过区间作图所判断的，对于SCN抗性或部分抗性，所述标记核酸分子表现大于3.5的LOD分数，并且甚至更优选地，其中如通过区间作图所判断的，对于基于最大似然法的SCN抗性或部分抗性，所述标记核酸分子表现约4.0的LOD分数，所述最大似然法由Lander和Botstein，Genetics，121：185-199(1989)描述并且在软件包MAPMAKER/QTL(缺省参数)(Lincoln和Lander，Mapping GenesControlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL，Whitehead Institute forBiomedical Research，Massachusetts(1990))中实施。

遗传作图

“遗传图谱”是给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座之间遗传连锁的关系，通常以图解或表格形式描绘。“遗传作图”是通过使用遗传标记，分离标记的种群以及重组频率的标准遗传原理来定义基因座的连锁关系的过程。“遗传图谱位置”是遗传图谱上相对于相同连锁群上的周围遗传标记的位置，其中可在给定物种中发现特定标记。相比之下，基因组的物理图谱是指绝对距离(例如，以碱基对或分离和重叠的连续遗传片段(例如重叠群)测量)。基因组的物理图谱不考虑物理图谱上不同点之间的遗传行为(例如，重组频率)。“遗传重组频率”是两个遗传基因座之间交叉事件(重组)的频率。可以通过追踪减数分裂后的标记和/或性状的分离来观察重组频率。基因重组频率可以以厘摩(cM)表示。在一些情况下，两个不同的标记可以具有相同的遗传图谱坐标。在这种情况下，两个标记彼此非常接近，使得在它们之间发生的重组具有非常低的频率以致于检测不到。

基因图谱是基因组(或基因组的一部分，诸如单个染色体)的图形表示，其中标记之间的距离通过它们之间的重组频率测量。植物育种者使用分子标记的遗传图谱通过标记辅助选择(MAS)来增加育种效率，所述标记辅助选择过程中感兴趣的性状的选择不基于性状本身，而是基于与所示性状连锁的标记的基因型。证明与表型性状可靠连锁的分子标记为植物种群中的间接选择性状提供了有用的工具，特别是当准确的表型分型困难、缓慢或昂贵时。

总的来说，在遗传图谱上更接近的两个标记或基因组基因座，它们在物理图上也彼此更靠近。由于基因重组的可能性在整个基因组中不均匀的事实，cM距离和物理距离之间精确的比例的缺乏可以存在；一些染色体区域是交叉“热点”，而其他区域仅显示罕见的重组事件(如果有的话)。

也可以在相同作物物种的不同种群之间观察到遗传作图变异性。尽管在种群之间可能发生遗传图谱的这种变异性，但是从一个群体来源的遗传图谱和标记信息在鉴定具有所需性状的植物、反选择具有不需要的性状的植物以及指导MAS方面通常在多个种群中依然有用。

如本领域技术人员将认识到的，在任何特定种群中的重组频率(并且其结果是遗传图谱位置)都不是静态的。分开两个标记(或标记和QTL)的遗传距离可以根据图谱位置如何确定而变化。例如，变量诸如所使用的亲本作图种群、在标记物作图或QTL作图中使用的软件以及由作图软件的用户输入的参数可以有助于QTL标记遗传图谱关系。然而，本发明不旨在限于任何特定的作图种群、使用任何特定的软件或任何特定的软件参数组来确定特定标记或染色体区间与疾病耐受表型的连锁。将本文所述的新特征外推至任何基因库或感兴趣的种群并使用任何特定软件和软件参数，完全在本领域普通技术人员能力之内。实际上，除了本文所述的那些种群之外，关于种群中的遗传标记和染色体区间的观察结果可以使用本公开的教导很容易地完成。

关联作图

在一个方面，本公开提供了用于进行SCN抗性的全基因组关联作图的染色体区间、标记基因座、种质。示例性染色体区间和标记基因座在表3中提供。也考虑由表中公开的任何两个标记基因座限定的较小的区间。关联作图或LD作图技术目的在于鉴定显著的基因型-表型关联。它对于异型杂交物种中的精细作图是有效的，其中杂合子中的频率重组可以导致快速LD衰变。LD是个体集合中等位基因的非随机关联，反映所述区域的重组历史。因此，LD衰变平均值可以帮助确定全基因组关联研究产生具有所需水平的分辨率的遗传图谱所必需的标记的数量。

大种群更适合于检测重组，而较老龄种群通常与更高水平的多态性相关，这两者都有助于加速LD衰变。然而，较小的有效种群大小往往显示出较慢的LD衰变，这可以导致更广泛的单倍型保守。理解多态性和重组之间的关系在开发用于从这些资源有效地提取信息的策略中是有用的。关联分析对比了植物的表型分数与不同基因座的基因型。随后，可以使用任何合适的大豆遗传图谱(例如，复合图谱)来帮助使用先前确定的标记物的图谱位置观察所鉴定的QTL标记和/或QTL标记簇的分布。

标记辅助选择、植物育种和基因组基因渗入

标记辅助选择

“基因渗入”是指所需的遗传基因座的等位基因从一种遗传背景到另一种遗传背景的传递。例如，在指定基因座处所需的等位基因的基因渗入可以经由相同物种的两个亲本之间的有性杂交传递给至少一个子代，其中至少一个所述亲本在其基因组中具有所需的等位基因。另选地，例如，等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需的等位基因可以是，例如所选择的标记的等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，包含所需等位基因的后代可以重复回交至具有所需遗传背景的品系，并且选择所需等位基因以使等位基因在所选择的遗传背景中固定。

作物物种中分子标记开发的主要动机是通过标记辅助选择(MAS)提高植物育种效率的潜力。遗传标记被用于鉴定在一个或多个基因座处含有所需基因型的植物，并且预期将所需的基因型连同所需的表型一起转移到它们的后代。遗传标记被用于鉴定在一个基因座处或在几个不连锁或连锁的基因座(例如单倍型)处含有所需基因型的植物，并且将预期将所需的基因型连同所需的表型一起转移到它们的后代。本公开提供了通过鉴定具有与rhg1d连锁的指定等位基因的植物来鉴定耐受的植物、表现出改进的耐受性的植物或对SCN感染易感的植物的方式。

总的来说，MAS使用已经鉴定为具有与耐受性性状共分离的显著可能性的多态性标记。此类标记被假定为在给予植物耐受性表型的一个或多个基因附近作图，并且被认为是所需性状的指示，并且被称为QTL标记。测试植物在QTL标记中是否存在所需等位基因。

包括与一个或多个耐受性性状连锁的一个或多个标记基因座的植物或种质的鉴定提供了执行标记辅助选择的基础。选择包含有利标记或有利等位基因的植物，同时可以反向选择包含与耐受性负相关的标记或等位基因的植物。所需的标记和/或等位基因可以渗入具有所需(例如，原种的或外来的)遗传背景的植物中以产生渗入耐受的植物或种质。在一些方面，考虑多个耐受性标记被依次或同时地选择和/或渗入。在单个植物中选择的耐受性标记的组合不受限制，并且可以包括本文公开的标记、或与本文公开的标记连锁的任何标记、或位于本文限定的QTL区间内的任何标记的任何组合。

在一些实施方案中，所检测的等位基因是与疾病耐受性或改进的疾病耐受性正相关的有利等位基因。在选择了多于一种标记的情况下，为每个标记选择等位基因；因此，选择两个或更多个等位基因。在一些实施方案中，可以是标记基因座将具有多于一个有利的等位基因的情况，并且在这种情况下，可以选择任一等位基因。应当理解，鉴定与大豆植物对疾病状况的耐受性、改进的耐受性或易感性相关的QTL标记基因座等位基因的能力同样提供了用于选择具有有利的标记基因座的植物的方法。也就是说，可以选择被鉴定为包含所需标记基因座(例如，与耐受性正相关的标记等位基因)的任何植物，同时可以反向选择缺乏基因座或具有与耐受性负相关的基因座的植物。

在一些实施方案中，可以将疾病耐受的第一大豆植物或种质(供体)与第二大豆植物或种质(受体，例如原种的或外来的大豆，取决于子代中所需的性状)杂交以产生作为设计用于改进受体大豆植物或种质的疾病耐受性的育种程序的一部分的基因渗入的大豆植物或种质。在一些方面，受体植物也可以含有一个或多个疾病耐受基因座，其可以是质量性状基因座或数量性状基因座。在另一方面中，受体植物可以含有转基因。

在一些实施方案中，与第一大豆植物或种质相比，受体大豆植物或种质通常表现出对疾病状况的降低的耐受性，而与第二植物或种质相比，基因渗入的大豆植物或种质将显示对疾病状况的增加的耐受性。通过这些方法产生的基因渗入的大豆植物或种质也是本发明的特征。

MAS是选择所需的表型以及将所需的性状渗入到栽培种中(例如，将所需的性状渗入原种品系中)的有力捷径。MAS容易适应于高通量分子分析方法，其可以快速地在植物或种质遗传材料中筛选大量感兴趣的标记，并且比提高和观察植物的可见性状更有成本效益。

当种群分离影响一个或多个性状的多个基因座(例如，涉及耐受性的多个基因座、或分别涉及对不同疾病的耐受性或抗性的多个基因座)时，MAS的效率与表型筛选相比变得更大，因为所有的基因座都可以在实验室中从单个DNA样品中一起评估。

标记辅助回交

MAS的一个应用是使用耐受性或改进的耐受性标记以增加目的在于将耐受性QTL引入所需的(通常是高产量)背景的基因渗入工作的效率。如果来自植物的核酸对于所需的遗传标记等位基因是阳性的，则植物可以进行自花受精以产生具有相同基因型的纯种品系，或者其可以与具有相同标记或具有其他性状的植物杂交以产生有性杂交的杂种世代。

植物育种中MAS的另一个用途是通过回交育种来协助轮回亲本基因型的回复。回交育种是将后代与其亲本或亲本品系之一杂交的过程。回交通常是出于将来自供体亲本(例如，包含所需的耐受性标记基因座的亲本)的一个或一些基因座渗入来自轮回亲本另外所需的遗传背景(例如，另外的高产量品系)中的目的完成。所完成的回交的循环越多，轮回亲本对所得渗入变种的遗传贡献越大。这常常是必要的，因为耐受的植物可能是其他方面不需要的，例如，由于低产量、低繁殖力等。相比之下，作为密集育种程序的结果的植株可以具有优异的产量、繁殖力等，仅仅缺乏一种所需的性状，诸如对SCN感染的耐受性。

而且，在另一方面，在保持引入的标记与抗性相关的同时，可以通过回交或其他合适的方法降低提供疾病抗性的植物的遗传贡献。在一个方面，源自植物中的供体材料的核遗传材料可以是来自植物中的供体材料的核基因材料可以小于或约50％、小于或约25％、小于或约13％、小于或约5％、3％、2％或1％，但是受体仍然对疾病抗性。

遗传多样性对于任何育种程序中的长期遗传获得量都是重要的。由于有限的多样性，当所有有利的等位基因已经在原种种群中固定时，遗传获得量将最终稳定。一个目标是将多样性纳入原种库，而不丧失已经得到的遗传获得量，并且尽可能少的投入。MAS提供了来自原始祖先的哪些基因组区域和哪些有利等位基因已经被选择并随时间保守的指示，这有助于怀着找到目前原种基因库中不存在的有利等位基因的希望从外来的种质资源(与原种基因库无关的亲本)引入有利的变种。

SCN抗性的三基因模型(Tri-genic Model)

如Concibido等在2004的年综述文章(CropSci.44：1121-1131)中所指出的，针对SCN抗性性状的大多数QTL作图研究已经鉴定了连锁群G和A2的rhg1和Rhg4区域分别对SCN抗性表型做出最显著的贡献。这两个基因座据报道解释了超过98％的SCN抗性(Meksem等(2001)TAG 103(5)：710-717)。认识到这一点，两个连锁群已经在两个区域内克隆了候选基因(Hauge等2001；Lightfoot and Meksem，2002)。Concibido等2004年引用的大多数研究使用SCN品种3完成，但是同样的已经发现对于SCN品种1也是正确的(Guo等2006)。在这里，我们第一次报道了对于SCN品种1抗性，需要三个基因座：rhg1、Rhg4和rhg1d(图1和图2)。rhg1d基因座位于连锁群B1上。基于品种1抗性的大豆系与品种1易感的品系的基因组区域之间的指纹数据的比较，在rhg1d基因座处出现匹配的共分离模式。进一步的分析显示所述区域包括rhg1等位基因的区域的重复。因此，我们将所述新基因座称为rhg1d。虽然先前使用rhg1和Rhg4基因座产生了SCN品种1抗性品系，但是育种者不能维持SCN品种1抗性。本公开使育种者能够通过跟踪与先前描述的rhg1和Rhg4基因座结合的rhg1d基因座的存在来维持品种1抗性。

本公开包括并提供了使用分子标记产生SCN抗性的大豆植物的方法以选择含有来自rhg1、Rhg4和rhg1d中每一种的至少一种标记的一种或多种大豆植物。遗传连锁的并且可用于选择rhg1和Rhg4基因座的标记是本领域熟知的。本文描述了与rhg1d基因座遗传连锁的标记(表3)。

在一些实施方案中，本公开提供了用于产生对SCN品种1至16中的至少一种具有抗性或中等抗性的大豆植物种群的方法，所述方法包括：(a)在大豆植物或种子的第一种群中检测至少一个标记等位基因的存在，所述至少一个标记等位基因与rhg1、Rhg4和rhg1d SCN抗性基因座遗传连锁并且在约20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.25cM内；(b)选择含有遗传连锁的标记等位基因的大豆植物或种子；和(c)从所选择的大豆植物或种子产生后代种群。在一些实施方案中，与rhg1、Rhg4和rhg1dSCN抗性基因座中的每一个遗传连锁的标记等位基因的检测同时进行，例如在多重反应中进行。在其他实施方案中，与rhg1、Rhg4和rhg1d SCN抗性基因座中的每一个遗传连锁的标记等位基因的检测分开进行，例如在独立反应中进行。

在本公开的一些实施方案中，所述方法能够产生对SCN品种1抗性的植物。在本公开的一些实施方案中，所述方法能够产生对SCN品种3抗性的植物。在本公开的一些实施方案中，所述方法能够产生对SCN品种2抗性的植物。在本公开的一个优选实施方案中，SCN抗性的来源是Peking来源的。

使用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑增强中等抗性大豆种质中的SCN抗性

如通过与SCN抗性相关的许多QTL及其对SCN品种的特异性的综合评价所示，本领域技术人员可以理解与控制SCN感染相关的复杂性。虽然育种者已经成功地开发了SCN抗性的大豆品系，但由于抗性的复杂和多基因性质，育种既困难又耗时。抗性常常是品种特异性的，并且由于本领域中SCN种群的改变不能提供随时间的稳定性。此外，当在不存在SCN的情况下培养时，许多抗性大豆变种带来显著的产量损失。因此需要其中改进给定大豆种质的SCN抗性的方法。

本文提供了进一步改进某些大豆种质的产量和/或对SCN的抗性的方法。具体而言，已经发现，表现出一定水平的SCN抗性的某些转基因和非转基因大豆种质的产量和/或SCN抗性可以通过使用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物进一步增强。在一些实施方案中，这样的改进可以包括对SCN品种易感的大豆种质中的SCN品种的抗性水平的增加。在一些实施方案中，表现出品种3SCN抗性但仅表现出可忽略的中等品种1 SCN抗性的源自PI88788的大豆种质在用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物处理时可以表现出对品种1 SCN抗性的出乎意料的增加，其超过由单独的化合物赋予的品种1 SCN抗性。如本文所用，短语“3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物”是指下式的化合物：

其中A和C为芳基，其可以各自独立地被一个或多个取代基和其盐取代。

如本文所用，短语“大豆孢囊线虫抗性种质”和“SCN抗性种质”是指包含赋予对至少一种SCN品种的至少中等SCN抗性的转基因或赋予对至少一种SCN品种的至少中等SCN抗性的内源染色体基因座的大豆植物。

在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的SCN抗性种质包含与SCN抗性相关的单倍型。此类单倍型在大豆种质中发现，其包括但不限于Peking、PI88788、PI437654和其衍生物。此类大豆种质通过使种质经受各种SCN品种的感染并对所观察到的SCN抗性的水平进行评分可以很容易地鉴定。

通常，本文所用的方法包括用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物处理大豆植物、大豆种子或用于培养大豆的土壤。可以使用的示例性式(Ia)或(Ib)的3，5-二取代-1，2，4-噁二唑和其盐包括下式的化合物

其中Ar₁为苯基、吡啶基、吡嗪基、噁唑基或异恶唑基，它们可以各自任选地独立地被一个或多个取代基取代。在一个实施方案中，Ar₁任选地独立地被选自由烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、卤素、酰基、酯和腈组成的组的一个或多个取代基取代，其可以各自任选地独立地被取代。在一个实施方案中，Ar₁任选地独立地被选自由卤素、CF₃、CH₃、OCF₃、OCH₃、CN和C(H)O组成的组的一个或多个取代基取代。在某些实施方案中，Ar₂是噻吩基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基或苯基，其可以各自任选地独立地被取代。在一个实施方案中，Ar₂任选地独立地被选自由氟、氯、CH₃和OCF₃组成的组的一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，Ar₁是未取代的苯基。在其他实施方案中，Ar₁是单取代的苯基，其中取代基为卤素。在其他实施方案中，Ar₁是二取代的氯烷基苯基。在一些实施方案中，Ar₂是取代的噻吩基或取代的呋喃基。在一些实施方案中，Ar₂是未取代的噻吩基或未取代的呋喃基。

在一些实施方案中，3，5-二取代-1，2，4-噁二唑是式(III)的化合物或其盐，

其中R₁和R₅独立地选自氢、CH₃、F、Cl、Br、CF₃和OCF₃；R₂和R₄独立地选自氢、F、Cl、Br和CF₃；R₃选自氢、CH₃、CF₃、F、Cl、Br、OCF₃、OCH₃、CN和C(H)O；R₇和R₈独立地选自氢和氟；R₉选自氢、F、Cl、CH₃和OCF₃；并且E为O、N或S。用于制备3，5-二取代-1，2，4-噁二唑的方法公开于美国专利申请US 20090048311和共同转让的美国专利申请号13/933,616中，所述申请各自以引用的方式整体明确地并入本文。

可用于本文提供的方法中的包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的组合物也包括但不限于，各种水性悬浮浓缩物，其中3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物以悬浮固体颗粒的形式提供。包含固体颗粒形式的3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的水性悬浮浓缩物以及在共同转让的美国专利申请号13/933,616中公开的所述化合物的制备方法以引用的方式整体明确地并入本文。

包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的组合物可以改进对至少一种SCN品种表现出至少中等抗性的大豆种质中的SCN抗性。当用约500至约1,000个SCN卵每100立方厘米土壤或约1,000至约2,000个SCN卵每100立方厘米土壤的SCN攻击化合物处理的大豆种质时，可以获得此类SCN抗性的改进。在一些实施方案中，当对至少一种SCN品种表型出至少中等抗性的大豆种质用另一种大豆种质易感的SCN品种进行攻击时，获得了SCN抗性的改进。在一些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的产量的改进超过通过大豆种质单独使用或所述化合物单独使用所获得的产量的改进。在一些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的SCN复制的降低是通过大豆种质单独使用以及所述化合物单独使用所获得的产量的改进的累加总和。在一些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的SCN复制的降低大于通过大豆种质单独使用以及所述化合物单独使用所获得的产量的改进的累加总和。在一些实施方案中，通过使用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物所获得的SCN种质中SCN抗性的改进，与未用所述化合物处理的SCN抗性种质相比，在用所述化合物处理的SCN抗性种质中包含至少约5％、10％、20％、30％、或更大的SCN复制的降低。在一些实施方案中，通过使用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物所获得的SCN种质中SCN抗性的改进，与已经用所述化合物处理的SCN易感种质相比，在用所述化合物处理的SCN抗性种质中包含至少约5％、10％、20％、30％、或更大的SCN复制的降低。在一些实施方案中，对SCN的第一品种具有中等抗性但对SCN的第二品种敏感的SCN抗性种质在用所述化合物处理时对SCN的第二品种可以表现出中等抗性。在一个具体实施方案中，对品种1 SCN易感的源自PI18788的大豆种质在用所述化合物处理时对品种1SCN可以表现出中等抗性，其超过种质单独或化合物单独赋予的对品种1SCN的抗性。

包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的组合物也可以改进对至少一种SCN品种表现出至少中等抗性的大豆种质的产量。当用约500至约1,000个SCN卵每100立方厘米土壤、或约1,000至约2,000个SCN卵每100立方厘米土壤、或约2,000个SCN卵或更多每100立方厘米土壤的SCN攻击化合物处理的大豆种质时，可以获得此类产量的改进。在一些实施方案中，当对至少一种SCN品种表型出至少中等抗性的大豆种质用另一种大豆种质易感的SCN品种进行攻击时，获得了产量的改进。在某些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的产量的改进超过通过大豆种质单独使用或所述化合物单独使用所获得的产量的改进。在一些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的产量的改进是通过大豆种质单独使用以及所述化合物单独使用所获得的产量的改进的累加总和。在某些实施方案中，通过3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物与SCN抗性大豆种质结合使用所获得的产量的改进大于通过大豆种质单独使用以及所述化合物单独使用所获得的产量的改进的累加总和。在某些实施方案中，通过使用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物所获得的SCN种质的产量的改进，与未用所述化合物处理的SCN抗性种质相比，在用所述化合物处理的SCN抗性种质中包含至少约5％、10％、20％、30％、或更大的产量的改进。在一些实施方案中，通过使用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物所获得的SCN种质的产量的改进，与用所述化合物处理的SCN易感种质相比，在用所述化合物处理的SCN抗性种质中包含至少约5％、10％、20％、30％、或更大的产量的改进。在一些实施方案中，对SCN的第一品种具有中等抗性但对SCN的第二品种敏感的SCN抗性种质在用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物处理时对SCN的第二品种可以表现出中等抗性。在另一实施方案中，对品种1 SCN易感的源自PI18788的大豆种质在用3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物处理时对品种1 SCN可以表现出中等抗性，其超过种质单独或3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物单独赋予的对品种1 SCN的抗性。

在其他实施方案中，包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物和SCN抗性种子的组合物可以进一步包含另外的杀虫活性剂，其包括但不限于杀真菌剂和杀虫剂。在一个实施方案中，杀真菌剂和杀虫剂选自由嗜球果伞素类(例如唑菌胺酯、嘧菌酯和氟嘧菌酯)、三唑类(例如种菌唑和丙硫菌唑)、新烟碱类(例如噻虫胺、噻虫嗪和吡虫啉)、苯酰胺类(例如甲霜灵和精甲霜灵)、二酰胺类(例如溴氰虫酰胺和氯虫苯甲酰胺)、甲酰胺类(例如氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺和环丙吡菌胺)、苯基吡咯(例如咯菌腈)和苯并咪唑(例如噻苯达唑噻菌)组成的组。

在一些实施方案中，本公开提供了包含赋予对选自由品种1至16组成的组的一个或多个SCN品种的低等或中等抗性的SCN抗性基因座组合的大豆种子，其中所述大豆种子用包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的组合物包被。在其他实施方案中，本文提供的大豆种子用选自约0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.5和2.0mg/种子组成的组中的剂量的3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物包被。

在一些实施方案中，本公开进一步提供了在具有中等或高等SCN压力的田地中培养大豆植物的方法，所述方法包括：(a)在具有中等或高等SCN压力的田地中种植包含赋予对选自由品种1至16组成的组的一个或多个SCN品种的低等或中等抗性的SCN抗性基因座组合的大豆种子，其中所述大豆种子用包含3，5-二取代-1，2，4-噁二唑化合物的组合物包被；以及(b)从所述大豆种子中培养大豆植物。田地中的SCN压力的水平可以根据表8中的比例进行评估。SCN压力可以选自由250和500之间、350和600之间、450和700之间、550和800之间、650和900之间、750和1000之间、850和1100之间、950和1200之间、1050和1300之间、1150和1400之间、1250和1500之间、1350和1600之间、1450和1700之间、1550和1800之间、1650和1900之间、1750和2000之间的SCN卵每100立方厘米土壤组成的组。

包括用于选择包含感兴趣的标记的植物和/或用于将标记的存在与耐受性相关联的自动化系统的系统也是本公开的特征。这些系统可以包括与标记基因座检测相关的探针、用于检测探针上的标签的检测器、适当的流体处理元件以及混合探针和模板和/或扩增模板和系统指令的温度控制器，所述系统指令将标签检测与特定标记基因座或等位基因相关联。

在一方面，本发明可以用于选自大豆属(Glycine Willd)的任何植物上。在另一方面，所述植物选自物种大豆(Glycine max)(驯化的大豆)或野大豆(Glycine soja)(野生大豆)。

在一个优选的方面，本公开提供了通过任何方法测定对疾病的抗性或易感性的植物，以确定植物是否具有抗性、易感性或者是否表现出一定程度的抗性或易感性。植物种群可以以这种方式类似地表征，或随着对疾病耐受性性状的分离进一步表征。

还应理解，本公开的植物可以表现出任何相对成熟期组的特征。在一个方面，成熟组选自由早熟变种、中季成熟变种和全季变种组成的组。

本公开还提供了本公开的植物部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本公开的一个特别优选的方面，所述植物部分是种子。

在另一方面，大豆种子可以经受各种处理。例如，可以通过引发种子或通过消毒处理种子以防止种子携带的病原体来改进萌发。在另一方面，种子可以用任何可用的包衣进行包被以改进例如适种性、种子出苗以及防止种子携带的病原体。种子包衣可以是任何形式的种子包衣，其包括但不限于造粒、膜包衣和结壳。

在另一方面，与非抗性对照大豆植物相比，大豆植物可以显示出比较抗性。在这方面，除了所讨论的疾病抗性等位基因之外，对照大豆植物将优选为遗传上相似的。此类植物可以在与等同或接近等同暴露于病原体的类似条件下生长。

在另一方面，本公开提供由所公开的大豆植物制备的加工产物。此类产物包括但不限于粕、油、植物提取物、淀粉或者发酵或消化产物。

本文引用了各种专利和非专利出版物，其公开分别以引用的方式整体并入本文。

因为可在不脱离本公开的范围的情况下对本文描述和说明的结构和方法做出各种修改，所以意图在前面描述中含有的以及在附图中显示的所有事项都应解释为说明性的而不具有限制性意义。本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案限制，而应仅根据以下所附权利要求和其等效物定义。

用于描述本公开的用于杂交和生产变种的常用育种术语和方法的描述可以在若干参考书之一中找到(Allard，“Principles of Plant Breeding，”John Wiley & Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(编)，Center for Agricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，于：Soybeans：Improvement，Production and Uses，第2版，Monograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory and Technique，(卷1)和Crop Species Soybean(卷2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376，1987)。

所提供的定义和方法限定本公开并且在本公开的实践中指导那些本领域的普通技术人员。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。描述与本文所用的分子生物学相关的许多术语的资源的实例可见于：Alberts等，Molecular Biology of The Cell，第5版，Garland Science Publishing，Inc.：New York，2007；Rieger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；King等，A Dictionary of Genetics，第6版，Oxford UniversityPress：New York，2002；以及Lewin，Genes Icom，Oxford University Press：New York，2007中。使用如37 CFR § 1.822所阐述的DNA碱基的命名法。

定义

本文定义的术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”的术语不旨在仅指单数实体，而是包括可以用于说明的具体实例的一般类别。本文中的术语用于描述本公开的具体实施例，但是它们的使用不限制本发明，除非在权利要求中概述。

“等位基因”通常是指在特定基因座处的另选的核酸序列；等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但通常更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在另一个同源染色体上，例如在杂合个体的不同染色体中出现，或者在种群中不同的纯合或杂合个体之间出现。有利的等位基因是赋予或有助于农学上所需的表型的特定基因座处的等位基因，或者另选地，是允许鉴定可以从育种程序或种植中移除的易感植物的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型分离、或者另选地与易感植物表型分离从而提供鉴定易患疾病的植物的益处的标记等位基因。染色体区间的有利等位基因形式是包括在物理上位于染色体区间上的一个或多个遗传基因座处的有助于优异的农学性能的核苷酸序列地染色体区间。“等位基因频率”是指等位基因存在于个体内、品系内或品系种群内的基因座处的频率(比例或百分比)。例如，对于等位基因“A”，基因型“AA”、“Aa”或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5或0.0的等位基因频率。可以通过平均来自所述品系的个体样本的等位基因频率来估计品系内的等位基因频率。类似地，可以通过平均组成群体的品系的等位基因频率来计算品系种群内的等位基因频率。对于具有有限数目的个体或品系的种群，等位基因频率可以表示为含有等位基因的个体或品系(或任何其他指定分组)的计数。当等位基因与性状连锁并且当等位基因的存在是在包含等位基因的植物中将出现所需性状或性状形式的指示时，等位基因与所述性状正相关。当等位基因与性状连锁并且当等位基因的存在是在包含等位基因的植物中将不会出现所需性状或性状形式的指示时，等位基因与所述性状负相关。

“杂交(Crossed)”或“杂交(cross)”意指通过受精(例如细胞、种子或植物)产生子代，并且包括植物之间的杂交(有性的)和自体受精(自交)。

“原种品系”是指由优良农学性能的育种和选择产生的任何品系。许多原种品系是可获得的并且是大豆育种领域技术人员已知的。“原种种群”是在给定作物物种(诸如大豆)的农学上优异的基因型方面可以用于代表现有技术水平的原种个体或品系的分类。类似地，“原种种质”或种质的原种株系是农学上优异的种质，其通常源自和/或能够产生具有优异的农学性能的植物，诸如现有的或新开发的大豆原种品系。相比之下，“外来品系”或“外来种质”是源自不属于可获得的原种品系或种质株系的植物的品系或种质。在两个植物或种质品系之间的杂交的上下文中，外来种质在血缘上不与与其杂交的原种种质密切相关。最常见地，外来种质不源自作物的任何已知的原种品系，而是选择将遗传元件(通常是所需的等位基因)引入育种程序中。

“基因”是指具有功能显著性的DNA可遗传的序列，即基因组序列。术语“基因”也可以用于指例如由基因组序列编码的cDNA和/或mRNA，以及所述基因组序列。

“基因型”是与可观察到的性状(表型)形成对比的一个或多个遗传基因座处的个体(或个体群)的遗传构成。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指在单个基因座、多个基因座处的个体遗传构成，或者更通常地，术语基因型可用于指个体对其基因组中所有基因的遗传组成。“单倍型”是在多个遗传基因座处个体的基因型。通常，由单倍型描述的遗传基因座在物理上和遗传上是连锁的，即在相同的染色体区间上。术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状。表型可以通过肉眼或通过本领域已知的任何其他评价方式例如显微镜、生物化学分析、基因组分析、特定疾病抗性的测定等观察到。在一些情况下，表型由单个基因或遗传基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

“种质”是指个体(例如植物)，一群个体(例如植物品系、变种或家族)，或源自品系、变种、物种或培养物的克隆的或者来自其中的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以自生物体或细胞中分离。总的来说，种质为遗传物质提供特定的分子组成，其为生物体或细胞培养物的一些或所有遗传性质提供物理基础。如本文所用，种质包括可以培养新植物的细胞、种子或组织，或者可以培养成整株植物的植物部分诸如叶、茎、花粉或细胞。

“表型”意指可以受基因型影响的细胞或生物体的可检测形状。

“植物”是指整个植物的任何部分或源自植物的细胞或组织培养物，其包含以下任一种：完整植物、植物部件或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其子代。植物细胞是取自植物或通过培养取自植物的细胞来源的植物的生物细胞。

“多态性”意指种群中存在一种或多种变异。多态性可表现为核酸的核苷酸序列的变异或蛋白质的氨基酸序列的变异。多态性包括在一个或多个个体的种群中一个或多个基因座处的核酸序列或核酸特征的一个或多个变异的存在。所述变异可以包括但不限于一个或多个核苷酸碱基变化、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可以从核酸复制中的随机过程、通过诱变、因为移动的基因组元件、从拷贝数变异以及在减数分裂过程期间(例如不等交叉、基因组复制以及染色体断裂和融合)出现。变异可以是常见的或可以以低频率存在于种群内，前者在一般植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变异相关。有用的多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标记、基因、DNA衍生序列、RNA衍生序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微小RNA、siRNA、耐受基因座、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式也可以包含多态性。此外，前述的拷贝数的存在、不存在或变异可以包含多态性。

“植物种群(population of plants)”或“植物种群(plant population)”意指包括任何数目(包括一个)的个体、物体或数据的集合，从其中获取样本用于评价，例如估计QTL效应。最常见地，所述术语涉及植物育种种群，从其中选择成员并在育种程序中杂交以产生子代。植物种群可以包括单个育种杂交或多个杂交杂交的子代，并且可以是实际植物或植物衍生物质，或者是植物的计算机表示形式。种群成员不需要与选择用于随后的分析循环中的种群成员或最终选择用于获得最终的子代植物的那些种群成员一致。通常，植物种群源自单个双亲交叉，但也可以源自相同或不同亲本之间的两个或更多个杂交。尽管植物种群可以包含任何数量的个体，但是本领域技术人员将认识到，植物育种者常使用一个或两百个个体至数千个体范围的种群大小，并且最高性能的5-20％的种群常选择用于随后的杂交以便改进种群后续世代的性能。

“抗性等位基因”意指与对疾病的抗性或耐受性相关的核酸序列。

关于核酸或多肽的“重组”指示已经被人为干预改变的物质(例如重组核酸、基因、多核苷酸、多肽等)。术语重组也可以指携带重组物质的生物体，例如，包含重组核酸的植物被认为是重组植物。

植物对疾病状况的“耐受性”或“改进的耐受性”指示与较低耐受的更“易感”的植物相比，植物就产量、存活力和/或其他相关农学量度而言受疾病状况的影响较小。耐受性是相对术语，其指示与在相似疾病状况下生长的不同(较低耐受的)植物(例如，不同的大豆品系植株)相比，“耐受的”植物在疾病状况下存活和/或产生更好的产量。如本领域所用，疾病“耐受性”有时可与疾病“抗性”互换使用。技术人员将理解植物对疾病状况的耐受性变化很大，并且可以代表更高耐受或更低耐受的表型的谱。然而，通过简单观察，技术人员通常可以确定不同植物、植物品系或植物科在疾病状况下的相对耐受性或易感性，此外，还将识别“耐受的”表型等级。

实施例

现在提及以下实施例，其连同上文描述一起以非限制性方式说明本公开。

实施例1：接种和SCN抗性表型的评估

大豆植物在种植后1周通过从茎的基部注射含有每英寸2000个大豆异皮线虫卵的溶液进行接种。接种后二十八(28)天，通过使用筛提取器计数从根球提取的孢囊的数目，目测评估每株植物中大豆孢囊线虫侵袭的严重性。将每株植物上的雌性孢囊的数量与易感检查的雌性孢囊的数量进行对比。标准易感检查(常为Lee74)中的雌性孢囊的平均数量应≥100。雌性指数(FI)通过将每个样本植物的孢囊数除以易感检查植物上的孢囊数来计算(Schmitt和Shannon，Crop Science，32：275-277(1992))。基于表4中的阈值分配疾病抗性的等级。

表4：相对SCN耐受性表型的评定量表

实施例2：用于检测rhg1d介导的SCN抗性基因型的测定

通过同时选择rhg1、Rhg4和rhg1d抗性等位基因可以获得Peking来源的品种1 SCN的抗性。使用先前在美国专利号7,485,770和学术文献中描述的方法可以实现rhg1和Rhg4SCN抗性等位基因的检测。为了方便起见，在表5中提供了用于扩增与rhg1d抗性等位基因连锁的SNP标记基因座的引物序列以及用于对相应的SNP序列进行基因分型的探针。可以产生其他引物和探针序列，其在本领域技术范围内，例如使用表3的序列。本领域技术人员也将立即认识到，可以使用给定引物任一侧的其他序列代替给定引物，只要所述引物可以扩增与待检测的等位基因物理连锁的区域。另外，应当理解，用于检测的精确探针可以变化，例如，可以鉴定待检测的标志物扩增子区域的任何探针可以替代本文提供的那些实例。而且，扩增引物和检测探针的构型当然可以变化。因此，本公开不限于本文具体叙述的引物、探针或标记序列。

说明性的rhg1d介导的SCN抗性标记DNA序列SEQ NO：25、26、27、28、30、33、38或40可以分别使用表6中所示的引物使用SEQ ID NO：45和46、61和62、65和66、69和70、73和74、49和50、53和54或57和58进行扩增，并且分别使用表6所示的如SEQ ID NO：47和48、63和64、67和68、71和72、75和76、51和52、55和56或59和60的探针进行检测。

实施例3：标记-性状相关性研究

观察到如基于二个基因模型所预期SCN品种1抗性不传递给予代植物，分析400个预先商用的品系的遗传单倍型与SCN品种1抗性表型的共分离模式。为了比较，分析中包括Peking、Forest、PI 88788、Williams和Essex品系。来自超过400个预先商用的品系的遗传指纹和SCN品种1抗性数据的分析显示了在LG B1上的33cM区域中的rhg1、Rhg4和单倍型与来自Peking来源的品系中的抗性和易感表型的共分离。进一步的分析显示了LG B1上的共分离区域包括rhg1的重复。此重复的基因座命名为rhg1d。对SCN品种1的抗性，至少在Peking来源的品系中需要存在所有三个区域：rhg1、Rhg4和rhg1d。单倍型和表型呈现于表5中。

标记-性状相关性研究的结果也在源自Peking背景的近300个预先商用的品系的表型研究中得到了证实。运行一组标记以选择所有品系中Peking来源的rhg1和Rhg4的存在。也运行标记以选择rhg1d抗性等位基因的存在和不存在。然后如实施例1所述的筛选品系的品种1 SCN抗性。与仅rhg1和Rhg4的同时选择相比，rhg1、Rhg4和rhg1d抗性等位基因的同时选择导致了FI的5倍的减少(图1)。当用品种3 SCN接种时，含有rhg1、Rhg4和rhg1d抗性等位基因的品系与仅含有rhg1和Rhg4的品系反应出相似水平的抗性(图2)。

表5：与rhg1d抗性等位基因相关的单倍型和用于预测Peking来源的品种1 SCN抗性的示例性标记

表6：用于检测rhg1d介导的SCN抗性的引物和探针

遗传单倍型和SCN表型的共分离在来自横跨4个生长季节的900个预先商用的品系的历史数据的研究中被进一步证实。这些品系被包括在相关性研究中以映射SCN抗性因子。标记-性状相关性研究证实了LG B1上的rhg1d以及分别在LGs G和A2上的已知的SCN抗性基因座rhg1和Rhg4的重要性(表7)。

表7：从历史数据中鉴定的品种1 SCN抗性基因座

LG	抗性基因座	Pos(峰值)	cM区间	-Log10(P)	var％
						G	rhg1	13.7	12.5-20.9	8.7	0.24
A2	Rhg4	66.7	63.0-68.2	5.6	0.00
						B1	rhg1d	160.3	144.0-177.6	12.0	0.29

实施例4：3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑在温室研究中的转基因品种2抗性品系中提供了对SCN的增强的控制

根据标准工业方案，用化合物3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理各种大豆品系。3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑的结构为：

未处理的种子或仅用着色剂处理的种子用作标准对照。将单个大豆种子种植在装有与沙子混合并经蒸汽灭菌的田间土壤的3”X 3”的盆中。萌发10天后，用保持在适当的大豆种质上以保持指定的品种的培养物中分离的2000-3000个SCN卵接种幼苗。接种后，将土壤温度保持在28℃，16小时日长，持续28-30天。在孵育期的最后一天，将个体植物连根拔起。通过用加压水喷射根部并洗涤土壤，同时将释放的孢囊截留在筛子上收集来自每株植物的孢囊。将从个体植物中收集的孢囊转移到计数皿中。在解剖显微镜下计数来自个体植物的孢囊的总数。数据报告为从个体盆收集的孢囊的数目，并且代表6-8次重复的平均值。

图3中提供的温室评价的结果表明，用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑的处理增强了对品种2 SCN的抗性。在存在和不存在3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑的情况下用SCN攻击易感大豆品系的试验也表明3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理提供了较低的SCN孢囊计数。所有植物用

(Monsanto Company，St.Louis，MO，USA)处理以减少真菌疾病。

实施例5：田间测试中SCN的改进的控制

在种植前，根据标准工业方案用化学剂处理种子。将六个不同的未处理和处理的品系种植在八个地块中。基于对品种1和品种3 SCN的抗性反应选择所述的六个品系。三个品系来自Peking源种质，并且显示对SCN敏感性、中等抗性或抗性。三个品系来自PI88788源种质，并且显示对SCN敏感性、中等抗性或抗性。基本上如Schmitt，D.P.和Shannon，G.，CropSci.，32：275-277(1992)所述根据表4测定抗性水平。

在出苗时收集植物根部区域附近的土芯。取多个土壤样品，合并，并压碎成小的均匀尺寸的颗粒。将样品等分试样与允许静置的水合并，然后搅拌。然后将样品倒入漏斗中并在土壤淘析器中加工。计数所述样品，给出的最终数目作为每100cc土壤的卵数。基于每100cc土壤的卵数，将田地分类为低至高压，其中每100cc土壤约0至约180个卵被认为是低压，每100cc土壤约180个卵至约1100个卵被认为是中压，并且每100cc土壤大于约1100个卵被认为是高压。用于评估SCN压力的比例在表8中提供。

表8：SCN田地压力比例

将品系种植在含有品种1大豆孢囊线虫的四个中压田地和四个高压田地中。中压田地每100cc土壤含有536个卵，而高压田地每100cc土壤含有1645个卵。在收获时测定产量。源自Peking种质的品系提供了针对品种1 SCN的保护，而源自PI88788种质的品系提供了针对品种3 SCN的保护。在中压田地中，没有观察到Peking或PI88788敏感性、中等抗性和抗性品系的3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑未处理组和处理组之间在产量上的统计学差异(图5)。在高压田地中，用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理的Peking敏感品系(品系1)比未处理的具有统计学上更高的产量。在高压田地中，Peking抗性(品系3)、PI88788敏感(品系4)和PI88788抗性(品系6)品系在3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理和未处理之间没有表现出统计学差异。在高SCN品种1压力的田地中，用3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑处理的Peking中等抗性(品系2)和PI88788中等抗性(品系5)比未处理的Peking中等抗性(品系2)和PI88788中等抗性(品系5)具有出乎意料的统计学上更高的产量(图6)。品系的描述在表9中提供。在高压田地中，与未处理的相比，处理的两个中等抗性品系显示出平均每英亩5.8蒲式耳的优势。

表9：在田间测试中使用的大豆品系

名称	来源	SCN等级
			品系1	Peking	R
品系2	Peking	MR
			品系3	Peking	S
品系4	PI88788	R
			品系5	PI88788	MR
品系6	PI88788	S

实施例6：在田间测试中增加的产量

将11个不同的未处理和处理的品系种植在总共43个单独的田间试验中，每个位置单一变种。基于它们对品种3 SCN的抗性反应选择11个品系。11个品系开发自PI88788源种质，并且对品种3 SCN显示中等抗性或抗性。

将3-苯基-5-(噻吩-2-基)-1，2，4-噁二唑与商业杀真菌剂和杀虫剂在混合有着色剂、聚合物和水的罐匀浆中以推荐的速率合并，并使其充分混合。使用Gustafson连续批量种子包衣机装载种子批料，注入处理匀浆，并且允许混合物翻滚35-40秒，然后排出到纸储存袋中。

在田间试验实施之前进行预测线虫取样以确保线虫压力的适当水平。在所使用的试验区域中，线虫压力为中至高(参见表8)。基于土壤类型、作物历史、耕作、排水、受精和其他农学因素，将试验区分为2英亩的区段。在每个田地区段内，使用Z字形图案收集10至15个6至8英寸的总深度的土芯。将每个处理区域的土芯置于桶中，并且在不破碎的情况下温和充分地混合以产生每个地块的复合土壤样品。从每个复合样品中取出亚样品(～1品脱的土壤)并置于塑料袋中，进行适当处理以确保线虫的活力，并送至实验室进行线虫定量。

用于田间试验的实验设计由带状地块(8行×250英尺)组成，其中每个带代表一个复制。将如上所述处理的种子以代表标准农学实践的密度种植。叶面除草剂、杀真菌剂和/或杀虫剂按照标准农学实践的需要施用。

在种植后8周，使用根和土壤样品进行定量季节线虫采样用于试验。对于根部取样，使用Z字形图案，从土壤中提取来自每个处理的5个活的植物，确保根部保持完整并用足够的土壤封闭以维持根部干燥。在土壤线处切下植物的顶部，并将包被有土壤的根置于塑料袋中。如上所述进行土壤取样用于预测线虫取样。将样品送至实验室进行线虫定量。

使用可商购获得的的收获设备收获每个地块来收集产量数据。通过取每个地块的平方英尺上的谷粒重量并调节到13％的水分，计算数据以表示每英亩蒲式耳。

表10：平均产量数据