BRPI1003739B1 - Métodos para a seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem da soja (sbr) compreendendo pelo menos um alelo que confere resistência a sbr e composição compreendendo um par de iniciador de amplificação - Google Patents

Abstract

marcadores associados com resistência a ferrugem de soja e métodos de uso destes. são fornecidos métodos para transferir resistência à ferrugem da soja (sbr) em germoplasma de soja não resistente. em algumas modalidades, os métodos incluem a introgressão de resistência à ser em uma soja não resistente com o uso de um ou mais marcadores de ácido nucléico para reprodução assistida por marcador entre linhagens de soja a serem usadas em um programa de reprodução de soja, em que os marcadores são ligados e/ou associados a resistência à sbr. também são fornecidos polimorfismos de nucleotídeo único (snps) associados a resistência à sbr; plantas de soja, sementes e culturas de tecido produzidas por qualquer um dos métodos revelados; semente produzida pelas plantas de soja reveladas; e composições que incluem pares de iniciador de amplificação capazes de iniciar a polimerização de dna por uma dna polimerase em modelos de ácido nucléico de soja para gerar amplicons de marcador de soja.

Description

MÉTODOS PARA A SELEÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA RESISTENTE À FERRUGEM DA SOJA (SBR) COMPREENDENDO PELO MENOS UM ALELO QUE CONFERE RESISTÊNCIA A SBR E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM PAR DE INICIADOR DE AMPLIFICAÇÃO

Referências cruzadas a pedidos relacionados o

N° benefício de Pedido de série 61/153.495,

Este pedido reivindica

Provisório de Patente U.S.

depositado em 18 de fevereiro de 2009, cuja revelação é aqui incorporada em sua totalidade por referência.

Campo técnico

O assunto aqui revelado relaciona-se a marcadores associados com resistência à ferrugem da soja (SBR) e métodos de uso destes. Mais particularmente, o assunto aqui revelado relaciona-se ao rastreamento de linhagens de soja para resistência a SBR e para produção de linhagens de soja com melhor resistência a SBR, os métodos envolvendo a análise de marcador genético.

Fundamento

Patógenos de planta são conhecidos por causarem grandes danos a importantes safras, resultando em significativas perdas na agricultura com conseqüências disseminadas para o mercado de alimentos e outras indústrias que se baseiam em materiais de plantas. Como tal, há uma necessidade de longo tempo por redução da incidência e/ou impacto das pestes da agricultura na produção da agricultura.

A ferrugem da soja (SBR), que é causada pelo patógeno fúngico Phakopsora pachyrhizi H. Sydow & Sydow, foi primeiramente relatada no Japão em 1902. Em 1934, o patógeno foi relatado em vários outros países da Ásia e na

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Austrália. Mais recentemente, a infecção por P. pachyrhizi tem sido relatada na África, e se disseminou rapidamente por todo o continente africano.

Em novembro de 2004, P. pachyrhizi foi primeiramente 5 relatado nos Estados Unidos continental, e o patógeno agora tem sido relatado em mais de 300 condados dos EUA, no Canadá e no México. Em 2007, aproximadamente 0,5 milhão de hectares de soja foi pulverizado para o controle de SBR nos

Estados Unidos.

SBR tem o potencial de causar perdas significativas de rendimento nos EUA, como indicado por experimentos fungicidas na Geórgia e na Flórida que relataram perdas de rendimento de 30 a 33% em grupos de controle não tratados. No Brasil, a perda total do rendimento na estação de crescimento de 2006-2007 devido a SBR foi estimada como sendo de mais de $2,26 bilhões de dólares com uma medida de 2,3 aplicações de fungicida necessárias por estação. Perdas de rendimento de até 80% foram relatadas devido a surtos severos de SBR, que resultam em queda precoce das folhas, o que inibe o “pod set”. Perdas econômicas consistentes no

Brasil nos últimos anos devido a fortes surtos de SBR despertaram preocupação com relação ao potencial impacto dessa doença nos Estados Unidos. Cultivares de soja atualmente disponíveis comercialmente nos Estados Unidos são todos suscetíveis a SBR em algum grau, e as aplicações de fungicida são atualmente empregadas para controlar a doença.

Portanto, são necessário cultivares resistentes à ferrugem da soja para reduzir os custos de fungicida e perdas de rendimento devido à SBR.

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Sumário

A matéria aqui revelada fornece métodos para transmitir resistência à ferrugem da soja (SBR) em germoplasma de soja não resistente. Em algumas modalidades, os métodos compreendem introgressão de resistência à SBR em uma soja não resistente com o uso de um ou mais marcadores de ácido nucleico para reprodução assistida por marcador entre linhagens de soja a serem usadas em um programa de reprodução de soja, em que os marcadores são ligados a um lócus de resistência a SBR selecionado do grupo que consiste em Rppl, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5.

A matéria aqui revelada também fornece métodos para introgressão de modo confiável e previsível resistência à ferrugem da soja (SBR) em germoplasma de soja não resistente. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o emprego de um ou mais marcadores de ácido nucleico para reprodução assistida por marcador entre linhagens de soja a serem usadas em um programa de reprodução de soja.

A matéria aqui revelada também fornece métodos para a produção de uma planta de soja adaptada para conferir resistência à ferrugem da soja (SBR). Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) seleção de uma primeira linhagem parental doadora que possui uma resistência a SBR desejada e que tem pelo menos um dos lócus residentes selecionado de um lócus que mapeia para Rpp1 e mapeado por um ou mais dos marcadores Id. de Seq. Nos: 1-3; um lócus que mapeia para Rpp2 e mapeado por um ou mais dos marcadores Id. de Seq. Nos: 4-6; um lócus que mapeia para Rpp3 e mapeado por um ou mais dos marcadores

Id. de Seq. Nos: 7 e 8; um lócus que mapeia para Rpp4 e

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4/52 mapeado por um ou mais dos marcadores Id. de Seq. Nos: 9 e 10; e um lócus que mapeia para Rpp5 e mapeado por um ou mais dos marcadores Id. de Seq. Nos: 11-13; (b) cruzamento da primeira linhagem parente doadora com uma segunda linhagem parental em combinação híbrida para produzir uma população separada de plantas; (c) rastreamento da população separada de plantas para lócus cromossômicos identificados de um ou mais genes associados à resistência a SBR; e (d) seleção de plantas da população que tem os lócus cromossômicos identificados para rastreamento adicional até que seja obtida uma linhagem que é homozigótica para resistência à SBR em lócus suficientes para gerar resistência à SBR.

A matéria aqui revelada também fornece métodos para a seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem da soja (SBR). Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) a genotipagem de uma ou mais plantas de soja com relação a um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs); e (b) seleção de uma planta de soja que inclui pelo menos um alelo de resistência associado aos SNPs, desse modo selecionando uma planta de soja resistente à SBR.

Em algumas modalidades, OS métodos aqui revelados compreendem (a) a isolação de um ou mais ácidos nucleicos de várias plantas de soja; (b) detecção nos referidos ácidos nucleicos isolados da presença de uma ou mais moléculas de marcador associadas à resistência a SBR, em que a referida molécula do marcador é selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. Nos: 1-13; e (c) seleção de uma planta de soja que compreende uma ou mais moléculas do marcador, desse modo selecionando uma planta de soja

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5/52 resistente à SBR.

Em algumas modalidades, um ou mais marcadores de ácido nucleico são selecionados do grupo que consiste em Id. de Seq. Nos: 1-13, e fragmentos informativos destes. Em algumas modalidades, os métodos e composições da matéria aqui revelada empregam uma molécula do marcador mapeada em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 centiMorgans ou menos da molécula do marcador selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. Nos: 1-13.

Em algumas modalidades, a reprodução assistida por marcador compreende análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Em algumas modalidades, os métodos também compreendem o rastreamento de uma planta de soja introgressida, ou uma célula ou tecido desta, para resistência à SBR.

Em algumas modalidades dos métodos aqui revelados, pelo menos um alelo de resistência está associado a um alelo que tem uma A no nucleotídeo 428 de Id. de Seq. N°:

	1; uma	T na	posição	895 de Id. de	Seq. N°: 2; uma G	na
20	posição	932	de Id. de Seq. N° : 2;	uma T na posição 57	de
	Id. de	Seq.	N°: 3; uma G na posição	213 de Id. de Seq.	N°:
	4; uma	G na	posição	441 de Id. de	Seq. N°: 4; uma A	na
	posição	70 de Id. de	Seq. N°: 5; uma T na posição 348	de
	Id. de	Seq.	N°: 5; uma A na posição	715 de Id. de Seq.	N°:
25	6; uma	C na	posição	377 de Id. de	Seq. N°: 7; uma T	na
	posição	100	de Id. de	Seq. N°: 8; uma G na posição 113	de
	Id. de	Seq.	N°: 8; uma T na posição	147 de Id. de Seq.	N°:
	9; uma	C na	posição	205 de Id. de	Seq. N°: 10; uma A	na
	posição	102	em Id. de	Seq. N°: 11; uma T na posição 159	de
30	Id. de	Seq.	N°: 12;	e/ou uma G na	posição 357 de Id.	de

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Seq. N°: 13.

A matéria aqui revelada também fornece plantas de soja resistentes à ferrugem da soja (SBR), partes desta (incluindo, sem limitação, pólen, óvulo, folha, embrião, raiz, ponta da raiz, antera, flor, fruto, caule, broto, semente; rizoma, protoplasto e calo), e prole desta, selecionados com o uso dos métodos revelados.

Portanto, é um objetivo da matéria aqui revelada o fornecimento de métodos para transmitir resistência à SBR ao germoplasma de soja não resistente, cujo objetivo é atingido no total ou em parte pela atual matéria aqui revelada.

Breve descrição dos desenhos

As Figuras 1A-1E são mapas de ligação genética que 15 descrevem grupos de ligação e que mostram posições relativas de vários marcadores ligados a Rpp1 - Rpp5, respectivamente.

Breve descrição da listagem de seqüência

Id. de Seq. Nos: 1-13 são seqüências de nucleotídeos 20 do genoma da soja que compreendem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) identificados como sendo associados com o gene de Rpp1, o gene de Rpp2, o gene de Rpp3, o gene de Rpp4 e/ou o gene de Rpp5 como apresentado na Tabela 1.

Os Id. de Seq. Nos: 14-81 são seqüências de nucleotídeos de iniciadores de oligonucleotídeo que podem ser empregados para amplificar e/ou analisar uma subseqüência do genoma da soja que está associado aos lócus Rpp1-Rpp5 como também apresentado na Tabela 1.

Tabela 1

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Iniciadores de amplificação e detecção

Gene Subseqüência de Rpp ^Genôm^ica

Id. De Seq.

N° :

Iniciador de amplificação Id. De Seq.

Nos .

Iniciadores de detecção Id. De Seq. Nos

1	1	14	e	15	16	e	17
1	2	18	e	19	20	e	21
1	2	22	e	23	24	e	25
1	3	26	e	27	28	e	29
2	4	30	e	31	32	e	33
2	4	34	e	35	36	e	37
2	5	38	e	39	40	e	41
2	5	42	e	43	44	e	45
2	6	46	e	47	48	e	49
3	7	50	e	51	53	e	53
3	8	54	e	55	56	e	57
3	8	58	e	59	60	e	61
4	9	62	e	63	64	e	65
4	10	66	e	67	68	e	69
5	11	70	e	71	72	e	73
5	12	74	e	75	76	e	77
5	13	78	e	79	80	e	81

Id. de Seq. Nos: 82-94 correspondem às subseqüências da montagem preliminar da seqüência genômica da soja (Glycine max) presente no banco de dados de Phytozyme, que corresponde aos Id. de Seq. Nos: 1-13 como apresentado na

Tabela 2.

Tabela 2

Localização de Id. de Seq. Nos: 1-13 No Banco de dados de Phytozyme

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Id. de	Nucleotídeos	Posições dos	Percentual
Seq. N°:	Relevantes	Nucleotídeos no Banco de dados de Phytozyme	de identidade
1	1-459	60469363-60469821	99,8
2	1-1101	60577757-60578858	99,1
3	23-424	60291869-60292270	98,8
4	1-470	27963429-27963894	99,6
5	1-489	30065112-30065600	99,4
6	1-794	30330727-30331520	98,7
7	1-568	46665732-46666299	99,3
8	1-503	41676695-41677197	98,8
9	1-769	56338383-56339144	97,9
10	1-513	55961511-55962023	99,6
11	1-281	33395967-33396246	99,3
12	36-916	33200392-33201274	97,4
13	5-479	35318068-35318542	99,4

Descrição detalhada

A matéria aqui revelada relaciona-se pelo menos em parte à identificação de vários SNPs associados com resistência à SBR em Glycíne sp. Portanto, são aqui revelados métodos de transmitir resistência à SBR em germoplasma de soja não resistente, que emprega um ou mais dos SNPs identificados em várias abordagens.

Todas as referências listadas abaixo, bem como todas as referências citadas na atual revelação, incluindo, sem limitação, todas as patentes, pedidos de patentes e publicações destas, artigos de revistas científicas e entradas de bases de dados (por exemplo, entradas de bases de dados GENBANK® e todas as anotações disponíveis), são

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9/52 aqui incorporados em suas totalidades por referência na extensão em que eles suplementam, explicam, fornecem uma base, ou ensinam metodologia, técnicas, e/ou composições aqui empregadas.

I. Definições

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual a matéria aqui revelada pertence.

Seguindo a convenção de legislação de patente consagrada, os artigos um, uma e o/a referem-se a “um ou mais quando usados neste pedido, incluindo nas reivindicações. Por exemplo, a frase um marcador referese a um ou mais marcadores. De modo similar, a frase pelo menos um, quando aqui empregada para referir-se a uma entidade, refere-se, por exemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais daquela entidade, incluindo, sem limitação, valores numéricos totais entre 1 e 100 e maiores que 100.

A menos que indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação e assim por diante usados na especificação e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo cerca de. Portanto, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados nesta especificação e reivindicações em apêndice são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se deseja obter pela presente matéria aqui revelada.

Como aqui usado, o termo cerca de, quando em

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10/52 referência a um valor ou a uma quantidade de massa, peso, tempo, volume, concentração ou percentagem deve englobar variações de, em algumas modalidades, ±20%, em algumas modalidades ±10%, em algumas modalidades ±5%, em algumas modalidades ±1%, em algumas modalidades ±0,5%, e em algumas modalidades ±0,1% da quantidade especificada, uma vez que tais variações são adequadas para realizar o método revelado.

Como aqui usado, o termo alelo refere-se a qualquer 10 uma de uma ou mais formas alternativas de um gene, todas elas relacionadas a pelo menos um traço ou característica. Em uma célula diplóide, dois alelos de um dado gene ocupam lócus correspondentes em um par de cromossomos homólogos, embora uma pessoa de habilidade comum na técnica compreenda que os alelos em qualquer indivíduo em particular não representam necessariamente todos os alelos que estão presentes na espécie. Uma vez que a matéria aqui revelada relaciona-se a SNPs, em alguns casos é mais preciso referir-se a um haplótipo (ou seja, um alelo de um segmento cromossômico) em vez de alelo. No entanto, em tais casos, o termo alelo deve ser entendido como compreendendo o termo haplótipo.

Como aqui usado, a frase associado a refere-se a uma relação reconhecível e/ou analisável entre duas entidades.

Por exemplo, um traço, lócus, QTL, SNP, gene, marcador, fenótipo etc. é associado à resistência se a presença ou ausência do traço, lócus, QTL, SNP, gene, marcador, fenótipo etc. influencia uma extensão ou grau de resistência (por exemplo, resistência à SBR). Em algumas modalidades, um alelo associado à resistência à SBR

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11/52 compreende um alelo que tem uma A no nucleotídeo 428 de Id. de Seq. N°: 1; uma T na posição 895 de Id. de Seq. N°: 2;

uma G na posição 932 de Id. de Seq. N°: 2; uma T na posição 57 de Id. de Seq. N°: 3; uma G na posição 213 de Id. de

Seq. N°: 4; uma G na posição 441 de Id. de Seq. N°: 4; uma

A na posição 70 de Id. de Seq. N°: 5; uma T na posição 348 de Id. de Seq. N°: 5; uma A na posição 715 de Id. de Seq. N°: 6; uma C na posição 377 de Id. de Seq. N°: 7; uma T na posição 100 de Id. de Seq. N°: 8; uma G na posição 113 de

Id. de Seq. N°: 8; uma T na posição 147 de Id. de Seq. N°:

9; uma	C na	posição	205 de Id. de	Seq. N°	10; uma A	na
posição	102	at Id. de	Seq. N°: 11;	uma T na	posição 159	de
Id. de	Seq.	N°: 12;	e/ou uma G na	posição	357 de Id.	de
Seq. N°	: 13.

Como aqui usado, o termo retrocruzamento, e variantes gramaticais deste, referem-se a um processo em que um criador cruza uma prole individual de volta a um de seus pais, por exemplo, um híbrido de primeira geração F1 com um dos genótipos parentais do híbrido F1. Em algumas modalidades, um retrocruzamento é realizado repetidamente, com uma prole individual de um retrocruzamento sendo em si retrocruzada ao mesmo genótipo parental.

O termo cromossomo é aqui usado em seu sentido reconhecido na técnica de estrutura genética de auto25 replicação no núcleo celular que contém o DNA celular e que porta em sua seqüência de nucleotídeos o arranjo linear de genes.

Como aqui usado, os termos cultivar e variedade referem-se a um grupo de plantas similares que por características estruturais ou genéticas e/ou performance

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12/52 podem ser distintas de outras variedades na mesma espécie.

Como aqui usado, o termo gene refere-se a uma unidade hereditária que inclui uma seqüência de DNA que ocupa uma localização específica em um cromossomo e que contém a instrução genética para uma característica ou traço particular em um organismo.

Como aqui usado, o termo híbrido no contexto de reprodução de planta refere-se a uma planta que é a descendente de pais geneticamente diferentes produzidos por cruzamento de plantas de diferentes linhagens ou tipos ou espécies, incluindo, sem limitação, o cruzamento entre duas linhagens inatas.

Como aqui usado, o termo inato refere-se a um indivíduo ou linhagem substancialmente homozigótico.

Como aqui usado, a frase fragmento informativo refere-se a uma molécula de ácido nucleico e/ou sua seqüência de nucleotídeos que permite a identificação adequada de alelo de um conjunto de alelos (por exemplo, um SNP) a molécula de ácido nucleico e/ou a seqüência de nucleotídeos que corresponde a ela. Por exemplo, enquanto o SNP que corresponde ao Id. de Seq. N°: 1 relaciona-se a uma A ou G na posição 42 8, um fragmento informativo de Id. de Seq. N°: 1 deve ser qualquer seqüência que compreende a posição 428 de Id. de Seq. N°: 1, assim permitindo que seja determinado o nucleotídeo que está presente naquela posição.

Como aqui usado, os termos introgressão, introgressida, e introgressar referem-se a um processo natural e artificial segundo o qual regiões genômicas de uma espécie, variedade ou cultivar sejam movidas ao genoma

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13/52 de outra espécie, variedade ou cultivar, por cruzamento daquela espécie. O processo pode ser opcionalmente completado por retrocruzamento ao parente recorrente.

Como aqui usado, o termo ligação refere-se a um 5 fenômeno em que alelos no mesmo cromossomo tendem a ser transmitidos juntos mais freqüentemente que o esperado se sua transmissão for independente. Portanto, em algumas modalidades, dois alelos no mesmo cromossomo são ditos como sendo ligados quando eles se separam um do outro na próxima geração em menos que 50% do tempo, menos que 25% do tempo, menos que 20% do tempo, menos que 15% do tempo, menos que 10% do tempo, menos que 5% do tempo, menos que 4% do tempo, menos que 3% do tempo, menos que 2% do tempo, ou

menos que 1%	do	tempo. Portanto, dois	lócus são	ligados	se
15 eles estão	em	50, 25, 20, 15, 10,	5, 4,	3, 2 ou	1
centiMorgans	(cM) um do outro. Por	exemplo,	em algumas
modalidades,	um	SNP é ligado a um marcador se	ele está	em
50, 25, 20,	15,	10, 9, 8, 7, 6, 5,	4, 3, 2	ou 1 cM	do

marcador.

Como aqui usado, a frase grupo de ligação refere-se a todos os genes ou traços genéticos que estão localizados no mesmo cromossomo. No grupo de ligação, esses lócus que estão próximos o suficiente podem exibir ligação em cruzamentos genéticos. Uma vez que a probabilidade de cruzamento aumenta com a distância física entre os lócus em um cromossomo, os lócus para os quais as localizações são removidas em um grupo de ligação não devem exibir qualquer ligação detectável em testes genéticos diretos. O termo grupo de ligação é principalmente usado para se referir a loci genético que exibem comportamento ligado em sistemas

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14/52 genéticos em que as determinações cromossômicas ainda não foram feitas. Portanto, o termo “grupo de ligação” é sinônimo da entidade física de um cromossomo, embora uma pessoa de habilidade comum na técnica entenderá que um grupo de ligação também pode ser definido como correspondente a uma região (ou seja, menos que o total) de um cromossomo dado.

Como aqui usado, o termo “lócus” refere-se a uma posição que um dado gene ou uma seqüência reguladora ocupa em um cromossomo de uma espécie dada.

Como aqui usado, o termo “marcador” refere-se a uma posição identificável em um cromossomo cuja hereditariedade pode ser monitorada. Em algumas modalidades, um marcador compreende uma seqüência de ácidos nucleicos conhecida ou detectável.

Em algumas modalidades, um marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Glycíne sp. com dois iniciadores de oligonucleotídeo, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR). Como aqui usado, a frase “corresponde a um produto de amplificação” no contexto de um marcador refere-se a um marcador que tem uma seqüência de nucleotídeos que é a mesma (permitindo mutações introduzidas pela reação de amplificação em si) que um produto de amplificação que é gerado por amplificação de DNA genômico de Glycíne sp. com um conjunto particular de iniciadores. Em algumas modalidades, a amplificação é por PCR, e os iniciadores são iniciadores de PCR que são desenhados para hibridizar a filamentos opostos do DNA genômico de Glycíne sp. para amplificar uma seqüência de

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DNA genômico de Glycíne sp. presente entre as seqüências às quais os iniciadores d4e PCR hibridizam no DNA genômico de Glycíne sp.. Em algumas modalidades, um marcador que “corresponde a” um fragmento amplificado é um marcador que tem a mesma seqüência de um dos filamentos do fragmento amplificado.

Como aqui usado, o termo “soja” refere-se a uma planta, ou uma parte desta, do gênero Glycíne, incluindo, sem limitação, Glycíne max.

Como aqui usado, a frase “seqüência de DNA específica para soja” refere-se a uma seqüência de polinucleotídeos que tem uma homologia de seqüência de nucleotídeos, em algumas modalidades, de mais que 50%, em algumas modalidades mais que 60%, em algumas modalidades mais que

70%, em algumas modalidades mais que 80%, em algumas modalidades mais que 85%, em algumas modalidades mais que 90%, em algumas modalidades mais que 92%, em algumas modalidades mais que 95%, em algumas modalidades mais que 96%, em algumas modalidades mais que 97%, em algumas modalidades mais que 98%, e em algumas modalidades mais que 99% com a seqüência do genoma da espécie Glycíne que mostra a maior similaridade a ela. No caso de marcadores para qualquer um dos genes de Rpp, uma “seqüência de DNA específica para soja” pode compreender uma parte da seqüência de DNA de um genoma da soja que flanqueia e/ou é uma parte de uma seqüência de gene de Rpp.

Como aqui usado, a frase “marcador molecular” referese a um indicador que é usado nos métodos para visualizar diferenças nas características de seqüências de ácidos nucleicos. Exemplos de tais indicadores são marcadores de

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16/52 polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações de inserção e deleção (INDEL), marcadores micro-satélites (SSRs), regiões amplificadas caracterizadas por seqüência (SCARs), marcadores de seqüência polimórfica amplificada clivada (CAPS) ou marcadores de isozima ou combinações dos marcadores aqui descritos que definem uma localização genética e cromossômica específica. Um marcador molecular “ligado a” ou “associado a” um gene de Rpp como aqui definido pode então se referir a SNPs, mutações de inserção, bem como marcadores de AFLP mais comuns ou qualquer outro tipo de marcador usado no campo.

Como aqui usado, a frase “homologia de seqüência de nucleotídeos” refere-se à presença de homologia entre dois polinucleotídeos. Polinucleotídeos têm seqüências “homólogas” se a seqüência de nucleotídeos nas duas seqüências é a mesma quando alinhada para correspondência máxima. A “percentagem de homologia de seqüência” para polinucleotídeos, como 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 ou 100 por cento de homologia de seqüência, pode ser determinada por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas em uma janela de comparação (por exemplo, cerca de 20-200 nucleotídeos contíguos), em que a porção da seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (ou seja, gaps) quando comparada a uma seqüência de referência para alinhamento ótimo das duas seqüências para comparação

O alinhamento ótimo de pode ser conduzido por seqüências

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17/52 implementações computadorizadas de algoritmos conhecidos, ou por inspeção visual. Algoritmos de alinhamento de seqüência múltipla e de comparação de seqüência prontamente disponíveis são, respectivamente, os programas “Basic Local

Alignment Search Tool” (BLAST; Altschul e cols. (1990) J Mol Biol 215:403-10; Altschul e cols. (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402) e ClustalX (Chenna e cols. (2003) Nucleic Acids Res 31:3497-3500), ambos disponíveis na Internet. Outros programas adequados incluem, sem limitação, GAP,

BestFit, PlotSimilarity e FASTA, que são parte do “Accelrys GCG Package”, disponível por Accelrys Software, Inc. of San Diego, California, United States of America.

Como aqui usado, o termo planta “descendente” referese a qualquer planta que resulta como prole de uma reprodução vegetativa ou sexual de uma ou mais plantas parentes ou descendentes destas. Por exemplo, uma planta descendente pode ser obtida por clonagem ou autofecundação (selfing) de uma planta parente ou por cruzamento de duas plantas parentes e incluem autofecundações bem como as gerações F1 ou F2 ou gerações ainda posteriores. Uma F1 é uma primeira geração descendente produzida a partir de parentes, sendo que pelo menos um deles é usado pela primeira vez como doador de um traço, enquanto descendente de segunda geração (F2) ou gerações subseqüentes (F3, F4, e outros) são espécimes produzidos a partir de autofecundações ou cruzamentos de F1s, F2s e outros. Um F1 pode ser assim (e em algumas modalidades é) um híbrido que resulta de um cruzamento entre dois pais de reprodução verdadeiros (“reprodução verdadeira” refere-se a um indivíduo que é homozigótico para um ou mais traços),

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18/52 enquanto um F2 pode ser (e em algumas modalidades é) um descendente que resulta de auto-polinização dos híbridos

F1.

Como aqui usado, o termo fenótipo refere-se a uma 5 característica detectável de uma célula ou organismo, cujas características são pelo menos parcialmente uma manifestação de expressão gênica.

Como aqui usado, a frase parte da planta refere-se a uma parte da planta, incluindo células únicas e tecidos de células como células de planta que são intactas em plantas, grupos de células, e culturas de tecido das quais as plantas podem ser regeneradas. Exemplos de partes de planta incluem, sem limitação, células únicas e tecidos de pólen, óvulos, folhas, embriões, raízes, pontas da raiz, anteras, flores, frutos, caules, ramos e sementes; bem como brotos, rizoma, protoplastos, calos e outros.

Como aqui usado, o termo população refere-se a uma coleção geneticamente heterogênea de plantas que partilham uma derivação genética comum.

Como aqui usado, o termo iniciador refere-se a um oligonucleotídeo que é capaz de anelar a um alvo de ácido nucleico e serve como um ponto de iniciação de síntese de DNA quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão de iniciador é induzida (por exemplo, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização como DNA polimerase e em uma temperatura e pH adequados) . Um iniciador (em algumas modalidades um iniciador de extensão e em algumas modalidades um iniciador de amplificação) é em algumas modalidades de filamento único para máxima eficiência em extensão e/ou amplificação. Em

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19/52 algumas modalidades, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo. Um iniciador é tipicamente suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão e/ou de amplificação na presença do agente para polimerização. Os comprimentos mínimos dos iniciadores podem depender de vários fatores, incluindo, sem limitação, temperatura e composição (conteúdo de A/T vs. G/C) do iniciador.

No contexto de iniciadores de amplificação, esses são 10 tipicamente fornecidos como um par de iniciadores bidirecionais que consistem em um iniciador adiante e um iniciador reverso ou fornecido como um par de iniciadores adiante como comumente usado na técnica de amplificação de

DNA como em amplificação por PCR.

Como tal, será entendido que o termo iniciador, como aqui usado, pode se referir a mais que um iniciador, particularmente no caso em que há alguma ambigüidade na informação em relação à seqüência(s) terminal da região alvo a ser amplificada. Portanto, um iniciador pode incluir uma coleção de oligonucleotídeos iniciadores que contêm seqüências que representam as possíveis variações na seqüência ou incluem nucleotídeos que permitem um pareamento típico de base.

Os iniciadores podem ser preparados por qualquer método adequado. Métodos para a preparação de oligonucleotídeos de seqüência específica são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, clonagem e restrição de seqüências adequados e síntese química direta. Métodos de síntese química podem incluir, por exemplo, o método de fosfo di- ou tri-éster, o método de dietilfosforamidato e o

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20/52 método de suporte sólido revelado na Patente U.S. No.

4.458.066.

Os iniciadores podem ser rotulados, se desejado, por incorporação de porções detectáveis, por exemplo, por porções espectroscópicas, de fluorescência, fotoquímicas, bioquímicas, imunoquímicas, ou químicas.

O método de PCR é bem descrito em livros texto e conhecido por pessoa habilitada. Depois da amplificação por PCR, polinucleotídeos alvo podem ser detectados por hibridização com um polinucleotídeo marcador que forma um híbrido estável com aquele da seqüência alvo sob condições de lavagem e hibridização rigorosas e moderadamente rigorosas

Se é esperado que os marcadores sejam essencialmente completamente complementares (ou seja, cerca de 99% ou mais) à seqüência alvo, condições rigorosas podem ser usadas. Se alguma discrepância for esperada, por exemplo, se cepas variantes são esperadas com o resultado que o marcador não será completamente complementar, a rigidez da hibridização pode ser reduzida. Em algumas modalidades, as condições são escolhidas para remover ligação não específica/casual. As condições que afetam a hibridização, e que selecionam contra ligação não específica, são conhecidas na técnica, e são descritas, por exemplo, em Sambrook & Russell (2001) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, United States of America. Geralmente, concentração de sal mais baixa e maior temperatura de hibridização e/ou lavagens aumentam o rigor das condições de hibridização.

Em continuação, o termo marcador refere-se a uma

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21/52 seqüência de oligonucleotídeos de filamento único que formará uma dupla ligada a hidrogênio com uma seqüência complementar em um analito de seqüência de ácidos nucleicos alvo ou seus derivados de cDNA.

Como aqui usado, os termos Rpp1”, Rpp2, Rpp3,

Rpp4 e Rpp5” referem-se a loci que foram associados a resistência à SBR como definido pelos marcadores aqui definidos. Para os objetivos da atual revelação, esses loci são ditos como sendo presentes em grupos de ligação de

Glycine G, J, C2, G, e N, e ligados aos marcadores mostrados nas Figuras 1A-1E, respectivamente.

Como aqui usado, o termo lócus de traço quantitativo” (QTL; plural, loci de traço quantitativo; QTLs) refere-se a um lócus genético (ou loci) que controla em algum grau um traço numericamente representável que, em algumas modalidades, é continuamente distribuído. Como tal, o termo QTL é aqui usado em seu sentido reconhecido na técnica para referir-se a uma região cromossômica que contém alelos (por exemplo, na forma de genes ou seqüências reguladoras) associada à expressão de um traço fenotípico quantitativo. Portanto, um QTL associado a” resistência à SBR refere-se a uma ou mais regiões localizadas em um ou mais cromossomos e/ou em um ou mais grupos de ligação que incluem pelo menos um gene cuja expressão influencia um nível de resistência e/ou pelo menos uma região reguladora que controla a expressão de um ou mais genes envolvidos na resistência à SBR. QTLs podem ser definidos por indicação de sua localização genética no genoma de um acesso específico de Glycine sp. com o uso de um ou mais marcadores genômicos moleculares. Um ou mais marcadores, por sua vez, indicam um

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22/52 lócus específico. Distâncias entre os loci são comumente medidas pela freqüência de cruzamentos entre os loci no mesmo cromossomo. Quanto mais afastados dois loci estiverem, mais provavelmente ocorrerá um cruzamento entre eles. De modo inverso, se dois loci são próximos, é menos provável que ocorra um cruzamento entre eles. Tipicamente, um centiMorgan (cM) é igual a 1% de recombinação entre os loci. Quando um QTL pode ser indicado por múltiplos marcadores, a distância genética entre os marcadores de ponto final é indicativa do tamanho do QTL.

e variantes

Como aqui usado, o termo regenerar gramáticas deste, referem-se à produção de uma planta a partir de cultura de tecido.

Como aqui usado, os termos resistente e resistência englobam resistência parcial e completa à infecção (por exemplo, infecção por um patógeno que causa SBR). Uma planta suscetível pode ser não resistente ou ter menores níveis de resistência à infecção em relação a uma planta resistente. O termo é usado para incluir tais formas 20 separadamente identificáveis de resistência como resistência total, imunidade, resistência intermediária, resistência parcial e hipersensibilidade.

Como aqui usado, a frase condições de hibridização 25 rigorosas refere-se a condições sob as quais um polinucleotídeo hibridiza a sua subseqüência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente a nenhuma outra seqüência. As condições rigorosas são seqüência-dependentes e podem ser diferentes sob diferentes circunstâncias. Diretrizes de exemplo para a

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23/52 hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas em Tijssen (1993) em Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology, Elsevier, New York, New York, United States of America; Ausubel e cols. (1999) Short Protocols in Molecular Biology Wiley, New York, New York, United States of America; e Sambrook & Russell, 2001 (supra). Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5-10°C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em pH de força iônica definido.

O Tm é a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração de ácidos nucleicos) em que 50% dos marcadores complementares ao alvo hibridizam à seqüência alvo em equilíbrio (como as seqüências alvo são presentes em excesso, em Tm, 50% dos marcadores são ocupados em equilíbrio). Condições rigorosas são aquelas em que a concentração de sal é de menos que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para marcadores curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para marcadores longos (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser atingidas com a adição de agentes de desestabilização como formamida. Exemplos de condições de hibridização rigorosas incluem: 50% formamida, 5x SSC, e 1% SDS, incubação a 42°C; ou 5x SSC, 1% SDS, incubação a 65°C; com uma ou mais lavagens em 0,2x SSC e 0,1% SDS a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36°C é tipicamente para amplificação de baixo rigor, embora as temperaturas de anelamento possam variar entre cerca de 32°C e 48°C (ou

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24/52 maior) dependendo do comprimento do iniciador.

Como aqui usado, o termo suscetível refere-se a uma planta que não tem resistência à doença que resulta na planta sendo afetada pela doença, resultando em sintomas da doença. O termo suscetível é, portanto, equivalente a não resistente. Alternativamente, o termo suscetível pode ser empregado em um contexto relativo, em que uma planta é considerada suscetível porque ela é menos resistente a um patógeno particular que uma segunda planta (que no contexto desses termos em um uso relativo pode ser referida como a planta resistente).

II. Considerações gerais

Estudos prévios sobre resistência de hospedeiro a P. pachyrhizi resultaram na identificação dos quatro principais genes de resistência, Rppl, Rpp2, Rpp3 e Rpp4, em soja acessos PI 200492, PI 230970, PI 462312, e PI 459025B, respectivamente. Três desses genes (Rpp2, Rpp3 e Rpp4) conferem uma lesão de cor marrom avermelhada resistente (RB) em oposição à lesão de cor castanha suscetível (TAN). Rppl, por outro lado, confere resistência a alguns isolados de ferrugem. Esses quarto genes foram mapeados nos grupos de ligação (LGs) G, J, C2 e G, respectivamente. Um gene de resistência de tipo de lesão RB Rpp?(Hyuuga) do cultivar japonês Hyuuga foi mapeado à mesma região em LG C2 como Rpp3. Um quinto gene, Rpp5, foi recentemente identificado de PI200456 e mapeado em LG N. Com a disponibilidade da cobertura de seqüência 7X do genoma da soja possível por esforços do U. S. Department of Energy-Joint Genoma Institute (DOE-JGI), Rppl foi mapeado finamente a uma região de 23 kb no scaffold 21 de

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LG G, e vários marcadores próximos a esse gene foram identificados (Hyten e cols. (2008) Theor Appl Genet 116:945-952).

A resistência conferida por Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e 5 Rpp5 pode ser específica para raça, e pode ser superada por vários isolados de P. pachyrhizi. Por exemplo, resistência em linhagens de soja que portam genes Rpp1 ou Rpp3 foi falha no Brasil em dois anos do estabelecimento da doença.

A matéria aqui revelada fornece em algumas modalidades 10 variedades de soja que são resistentes a SBR, métodos para identificação de plantas de soja que portam genes de resistência desejáveis, e métodos para introdução de tais genes de resistência desejáveis na soja.

III. Reprodução da planta

A matéria aqui revelada fornece melhores modelos para reprodução assistida por marcador (MAB). A matéria aqui revelada, portanto, relaciona-se a métodos de reprodução de planta e a métodos para seleção de plantas, em particular plantas de soja, particularmente plantas de soja cultivadas como plantas reprodutoras para uso em programas de reprodução ou plantas de soja cultivadas para terem as propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas, em particular relacionadas à produção de sojas valiosas, sendo aqui também referidas como plantas comercialmente valiosas. Aqui, uma planta cultivada é definida como uma planta sendo propositalmente selecionada ou que foi derivada de uma planta que foi propositalmente selecionada na prática agricultural ou de horticultura para ter propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas, por exemplo, uma planta obtida por endogamia.

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A matéria aqui revelada também fornece métodos para a seleção de uma planta do gênero Glycíne que exibe resistência a SBR que compreende a detecção na planta da presença de um ou mais alelos de resistência como aqui definido. Em uma modalidade exemplar dos métodos aqui revelados para a seleção de tal planta, o método compreende o fornecimento de uma amostra de DNA genômico da planta da soja; e (b) detecção na amostra de DNA genômico de pelo menos um marcador molecular associado a resistência à SBR.

Em algumas modalidades, a detecção pode compreender a detecção de um ou mais SNPs que são associados a resistência à SBR.

O fornecimento de uma amostra de DNA genômico da planta de soja pode ser realizado por métodos de isolação padrão de DNA bem conhecidos na técnica.

A detecção de um marcador molecular pode em algumas modalidades compreender o uso de um ou mais conjuntos de pares de iniciador que podem ser usados para produzir um ou mais produtos de amplificação que são marcadores adequados para um dos SNPs. Tal conjunto de iniciadores pode compreender, em algumas modalidades, seqüências de nucleotídeos como apresentado em Id. de Seq. Nos: 14-81.

Em algumas modalidades, a detecção de um marcador molecular pode compreender o uso de um marcador de ácido nucleico que tem uma seqüência base que é substancialmente complementar à seqüência de ácidos nucleicos que define o marcador molecular e cujo marcador de ácido nucleico hibridiza especificamente sob condições rigorosas com uma seqüência de ácidos nucleicos que define o marcador molecular. Um marcador de ácido nucleico adequado pode, por

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27/52 exemplo, ser um filamento único do produto de amplificação que corresponde ao marcador. Em algumas modalidades, a detecção de um marcador molecular é desenhada para discriminar se um alelo particular de um SNP está presente ou ausente em uma planta particular.

Os métodos aqui revelados também podem incluir a detecção de um fragmento de DNA amplificado associado à presença de um alelo particular de um SNP. Em algumas modalidades, o fragmento amplificado associado a um alelo particular de um SNP tem um comprimento previsto ou seqüência de ácidos nucleicos, e a detecção de um fragmento de DNA amplificado que tem o comprimento previsto ou a seqüência de ácidos nucleicos prevista é realizada de modo que o fragmento de DNA amplificado tem um comprimento que corresponde (mais ou menos algumas bases; por exemplo, um comprimento de uma, duas ou três bases mais ou menos) ao comprimento esperado com base em uma reação similar com os mesmos iniciadores com o DNA da planta em que o marcador foi primeiramente detectado ou a seqüência de ácidos nucleicos que corresponde (ou seja, tem uma homologia em algumas modalidades de mais que 80%, em algumas modalidades mais que 90%, em algumas modalidades mais que 95%, em algumas modalidades mais que 97%, e em algumas modalidades mais que 99%) à seqüência esperada com base na seqüência do marcador associado àquele SNP na planta em que o marcador foi primeiramente detectado. Após uma revisão dessa revelação, uma pessoa de habilidade comum na técnica deve perceber que marcadores (por exemplo, alelos de SNP) que são ausentes em plantas resistentes, embora eles estivessem presentes no parente suscetível (assim chamados transPetição 870180138580, de 08/10/2018, pág. 36/67

28/52 marcadores), também podem ser úteis em ensaios para a detecção de resistência entre plantas descendentes.

A detecção de um fragmento de DNA amplificado que tem o comprimento previsto ou a seqüência de ácidos nucleicos prevista pode ser realizada por qualquer uma de inúmeras técnicas, incluindo, sem limitação, técnicas padrão de eletroforese em gel ou pelo uso de seqüenciadores automatizados de DNA. Os métodos não são aqui descritos em detalhes uma vez que eles são bem conhecidos por pessoa habilitada, embora abordagens de exemplo sejam apresentadas nos EXEMPLOS.

IV. Marcadores moleculares e SNPs

Marcadores moleculares são usados para a visualização de diferenças nas seqüências de ácidos nucleicos. Essa visualização pode ser devida a técnicas de hibridização DNA-DNA depois de digestão com uma enzima de restrição (por exemplo, uma RFLP) e/ou devido a técnicas que usam a reação de cadeia de polimerase (por exemplo, STS, SSR/microsatélites, AFLP, e outras). Em algumas modalidades, todas as diferenças entre dois genótipos parentais se separam em uma população de mapeamento com base no cruzamento desses genótipos parentais. A separação dos diferentes marcadores pode ser comparada e as freqüências de recombinação podem ser calculadas. Métodos para o mapeamento de marcadores em plantas são revelados em, por exemplo, Glick & Thompson (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, United States of America; Zietkiewicz e cols. (1994) Genomics

20:176-183.

As freqüências de recombinação de marcadores

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29/52 moleculares em diferentes cromossomos e/ou em diferentes grupos de ligação são geralmente 50%. Entre os marcadores moleculares localizados no mesmo cromossomo ou no mesmo grupo de ligação, a freqüência de recombinação geralmente 5 depende da distância entre os marcadores. Uma baixa freqüência de recombinação corresponde tipicamente a uma distância genética baixa entre os marcadores em um cromossomo. A comparação de todas as freqüências de recombinação resulta na ordem mais lógica dos marcadores moleculares nos cromossomos ou nos grupos de ligação. Essa ordem mais lógica pode ser mostrada em um mapa de ligação. Um grupo de marcadores adjacentes ou contíguos no mapa de ligação que está associado a um nível aumentado de resistência à doença, por exemplo, a uma incidência reduzida de aquisição da doença após contato infeccioso com o agente da doença e/ou uma taxa de crescimento de lesão reduzida após estabelecimento da infecção, pode fornecer a posição de um lócus associado a resistência àquela doença.

Os marcadores aqui revelados podem ser usados em vários aspectos da matéria aqui revelada como apresentado abaixo. Aspectos da matéria aqui revelada não devem ser limitados ao uso dos marcadores aqui identificados, no entanto. Deve-se observar que os aspectos também podem fazer uso de marcadores não explicitamente aqui revelados ou mesmo ainda a serem identificados. Diferente da unidade genética gene, em que a expressão fenotípica depende de um grande número de fatores que não podem ser previstos, a unidade genética QTL denota uma região do genoma que é diretamente relacionada a um traço fenotípico quantificável.

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Os marcadores fornecidos pela matéria aqui revelada podem ser usados para a detecção da presença de um ou mais alelos de resistência a SBR da matéria aqui revelada em uma planta de soja suspeita resistente a SBR, e podem ser, portanto, usados nos métodos que envolvem reprodução assistida por marcador e seleção de plantas de soja resistentes a SBR. Em algumas modalidades, a detecção da presença de um alelo particular de um SNP da matéria aqui revelada é realizada com pelo menos um dos marcadores para os loci de resistência aqui definidos. A matéria aqui revelada, portanto, relaciona-se em outro aspecto a um método para a detecção da presença de um alelo particular associado a resistência a SBR, que compreende a detecção da presença de uma seqüência de ácidos nucleicos do SNP em uma planta de soja suspeita resistente a SBR, cuja presença pode ser detectada pelo uso dos marcadores revelados e oligonucleotídeos.

A seqüência de nucleotídeos de um SNP da matéria aqui revelada pode ser, por exemplo, solucionada por determinação da seqüência de nucleotídeos de um ou mais marcadores associados ao SNP e desenho de iniciadores internos para as seqüências do marcador que podem ser usadas para determinar qual alelo do SNP está presente na planta.

Em modalidades de tais métodos para a detecção da presença de um SNP em uma planta de soja suspeita resistente a SBR, o método também pode compreender o fornecimento de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo capaz de hibridizar sob condições de hibridização rigorosas a uma seqüência de ácidos nucleicos particular de um SNP,

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31/52 em algumas modalidades selecionados dos SNPs aqui revelados, o contato do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo com ácido nucleico genômico (ou um fragmento deste, incluindo, sem limitação, um fragmento de restrição deste) de uma planta de soja suspeita resistente a SBR, e determinação da presença de hibridização específica do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo ao ácido nucleico genômico (ou o fragmento deste).

Em algumas modalidades, o método é realizado em uma 10 amostra de ácido nucleico obtida da planta de soja suspeita resistente a SBR, embora métodos de hibridização in situ também possam ser empregados. Alternativamente, uma pessoa de habilidade comum na técnica pode desenhar marcadores específicos de hibridização ou oligonucleotídeos capazes de hibridizar sob condições de hibridização rigorosas à seqüência de ácidos nucleicos do alelo associado a resistência à SBR e pode usar tais marcadores de hibridização nos métodos para a detecção da presença de um alelo de SNP aqui revelado em uma planta de soja suspeita resistente a SBR.

V. Produção de plantas de soja suspeitas resistentes a

SBR

A matéria aqui revelada também se relaciona a métodos para a produção de uma planta de soja resistente a SBR que compreende a realização de um método para a detecção da presença de um alelo associado a resistência à SBR em uma planta de soja doadora de acordo com a matéria aqui revelada como acima descrito, e transferência da seqüência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um alelo assim detectado, ou uma parte que confere resistência à SBR

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32/52 desta, da planta doadora a uma planta de soja receptora suscetível a SBR. A transferência da seqüência de ácidos nucleicos pode ser realizada por qualquer um dos métodos aqui descritos.

Uma modalidade de exemplo de tal método compreende a transferência por introgressão da seqüência de ácidos nucleicos de uma planta de soja doadora resistente à SBR em uma planta de soja receptora suscetível à SBR- por cruzamento das plantas. Essa transferência pode ser assim adequadamente realizada pelo uso de técnicas tradicionais de reprodução. Os loci de resistência à SBR são introgressidas em algumas modalidades em variedades comerciais de soja com o uso de seleção assistida por marcador (MAS) ou reprodução assistida por marcador (MAB).

MAS e MAB envolvem o uso de um ou mais dos marcadores moleculares para a identificação e seleção daquelas plantas descendentes que contêm um ou mais dos genes que codificam para o traço desejado. No contexto da matéria aqui revelada, tal identificação e seleção é baseada em seleção de alelos de SNP da matéria aqui revelada ou marcadores associados a eles. MAB também pode ser usado para desenvolver linhagens quase isogênicas (NIL) que abrigam o QTL de interesse, permitindo um estudo mais detalhado de cada efeito de QTL, e é também um método eficaz para o desenvolvimento de populações de linhagem inata de retrocruzamento (BIL). Plantas de soja desenvolvidas de acordo com essas modalidades podem derivar uma grande parte de seus traços da planta receptora, e derivar resistência à SBR da planta doadora.

Como acima discutido, técnicas tradicionais de

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33/52 reprodução podem ser usadas para introgressar a seqüência de ácidos nucleicos que codifica resistência à SBR em uma planta de soja receptora suscetível a SBR. Em algumas modalidades, uma planta de soja doadora que exibe resistência à SBR e que compreende uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica resistência à SBR é cruzada com uma planta de soja receptora suscetível a SBR que em algumas modalidades exibe características comercialmente desejáveis, como, sem limitação, resistência a doença, 10 resistência a insetos, características nutricionais valiosas, e outras. A população da planta resultante (que representa os híbridos F1) é então auto-polinizada e autosemeada (sementes F2) . As plantas F2 que crescem a partir das sementes F2 são então rastreadas para resistência à

SBR. A população pode ser rastreada em inúmeras formas diferentes.

Primeiro, a população pode ser rastreada com o uso de um rastreamento de doença tradicional. Tais rastreamentos de doença são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um bioensaio quantitativo é usado. A seguir, reprodução assistida por marcador pode ser realizada com o uso de um ou mais dos marcadores moleculares aqui descritos para identificar aquelas proles que compreendem a seqüência de ácidos nucleicos que codifica para resistência à SBR.

Outros métodos, acima referidos pelos métodos para a detecção da presença de um alelo associado a resistência à SBR, podem ser usados. Também, a reprodução assistida por marcador pode ser usada para confirmar os resultados obtidos dos bioensaios quantitativos, e, portanto, vários métodos também podem ser usados em combinação.

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Linhagens de planta de soja inatas resistentes a SBR podem ser desenvolvidas com o uso das técnicas de seleção recorrente e retrocruzamento, selfing, e/ou dihaplóides, ou qualquer outra técnica usada para confeccionar linhagens parentais. Em um método de seleção recorrente e retrocruzamento, a resistência à SBR pode ser introgressida em uma planta receptora alvo (o parente recorrente) por cruzamento do parente recorrente com uma primeira planta doadora, que difere do parente recorrente e é aqui referida como “parente não recorrente”. O parente recorrente é uma planta que é não resistente ou tem um baixo nível de resistência à SBR e possui características comercialmente desejáveis, como, sem limitação, resistência à doença, resistência a insetos, características nutricionais valiosas, e outras. Em algumas modalidades, o parente não recorrente exibe resistência à SBR e compreende a seqüência de ácidos nucleicos que codifica resistência à SBR. O parente não recorrente pode ser qualquer variedade de planta ou linhagem inata que seja fértil de forma cruzada com o parente recorrente.

A prole que resulta de um cruzamento entre o parente recorrente e parente não recorrente é retrocruzada ao parente recorrente. A população da planta resultante é então rastreada para as características desejadas, cujo rastreamento pode ocorrer em inúmeras formas diferentes. Por exemplo, a população pode ser rastreada com o uso de rastreamentos de patologia fenotípica ou bioensaios quantitativos como conhecido na técnica. Alternativamente, em vez de usar bioensaios, MAB pode ser realizado com o uso de um ou mais dos marcadores moleculares anteriormente

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35/52 descritos, marcadores de hibridização, ou polinucleotídeos para identificar aquela prole que compreende a seqüência de ácidos nucleicos que codifica resistência à SBR. Além disso, MAB pode ser usado para confirmar os resultados obtidos dos bioensaios quantitativos. Em algumas modalidades, os marcadores aqui definidos são adequados para selecionar plantas descendentes adequadas por rastreamento genotípico.

Após rastreamento, as plantas híbridas F1 que exibem 10 um fenótipo resistente à SBR- ou, em algumas modalidades, genótipo e assim compreendem a seqüência de ácidos nucleicos que codifica resistência à SBR, são então selecionadas e retrocruzadas ao parente recorrente por inúmeras gerações para permitir que a planta de soja se torne crescentemente inata. Esse processo pode ser realizado por duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais gerações. Em princípio, a prole que resulta do processo de cruzamento do parente recorrente com o parente não recorrente resistente à SBR é heterozigótica para um ou mais genes que codificam resistência à SBR.

Em geral, um método de introdução de um traço desejado em uma variedade híbrida de soja pode compreender:

(a) cruzamento de um parente de soja inato com outra planta de soja que compreende um ou mais traços desejados, para produzir plantas da prole F1, em que o traço desejado é resistência à SBR;

(b) seleção das plantas da prole F1 que têm o traço desejado para produzir plantas da prole F1 selecionadas, em algumas modalidades com o uso de marcadores moleculares como aqui definido;

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36/52 (c) retrocruzamento de plantas da prole selecionadas com a planta parente de soja inata para produzir plantas de prole de retrocruzamento;

(d) seleção por plantas de prole de retrocruzamento 5 que têm o traço desejado e características morfológicas e fisiológicas da planta parente de soja inata, em que a seleção compreende a isolação de DNA genômico e teste do DNA para a presença de pelo menos um marcador molecular para resistência à SBR, em algumas modalidades como aqui descrito;

(e) repetição das etapas (c) e (d) duas ou mais vezes em sucessão para produzir plantas de prole de terceiro retrocruzamento ou maior;

(f) opcionalmente autofecundação de prole de 15 retrocruzamento selecionada para identificar plantas homozigóticas; e (g) cruzamento de pelo menos uma das plantas autofecundada ou de prole de retrocruzamento com outra planta parente de soja para gerar uma variedade de soja híbrida com o traço desejado e todas as características morfológicas e fisiológicas da variedade de soja híbrida quando cresce nas mesmas condições ambientais.

Como indicado, a última geração de retrocruzamento pode ser autofecundada para fornecer prole de reprodução pura homozigótica (inata) para resistência à SBR. Portanto, o resultado da seleção recorrente, retrocruzamento e autofecundação e a produção de linhagens são geneticamente homogêneas para os genes associados a resistência à SBR, e em algumas modalidades também para outros genes associados a traços de interesse comercial.

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VI. Plantas de soja e sementes suspeitas resistentes a SBR

O desenvolvimento de uma variedade de soja híbrida em um programa de reprodução de planta de soja pode, em algumas modalidades, envolver três etapas: (1) a seleção de plantas de vários grupos de germoplasma para cruzamentos de reprodução iniciais; (2) autofecundação das plantas selecionadas dos cruzamentos de reprodução por várias gerações para produzir uma série de linhagens inatas, que, individualmente gerações verdadeiras e são altamente uniformes; e (3) cruzamento de uma variedade selecionada com uma diferente variedade para produzir a prole híbrida (F1). Depois de uma quantidade suficiente de endogamia de sucessivas gerações filiais ela servirá meramente para aumentar as sementes da planta desenvolvida. Em algumas modalidades, uma linhagem inata compreende alelos homozigóticos em cerca de 95% ou mais de seus loci.

Uma planta de soja resistente à SBR, ou uma parte desta, que pode ser obtida por um método da matéria aqui revelada, é um aspecto da matéria aqui revelada.

As plantas de soja resistentes à SBR da matéria aqui revelada, ou parte destas, podem ser heterozigóticas ou homozigóticas para os traços de resistência (em algumas modalidades, homozigóticas). Embora os loci de resistência à SBR da matéria aqui revelada, bem como partes que conferem resistência desta, possam ser transferidos a qualquer planta para fornecer uma planta resistente à SBR, os métodos e plantas da matéria aqui revelada são em algumas modalidades relacionados a plantas do gênero Glycine.

As linhagens de soja resistentes à SBR aqui descritas

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38/52 podem ser usadas em cruzamentos adicionais para criar plantas resistentes à SBR. Por exemplo, uma primeira planta de soja resistente a SBR da matéria aqui revelada pode ser cruzada com uma segunda planta de soja que possui traços comercialmente desejáveis como, sem limitação, resistência a doença, resistência a insetos, características nutricionais valiosas, e outras. Em algumas modalidades, essa segunda linhagem de soja é em si resistente à SBR. Em algumas modalidades, essa linhagem é heterozigótica ou homozigótica para um ou mais dos loci de resistência à SBR revelados, de modo que um ou mais desses traços sejam expressos nas plantas híbridas descendentes.

Outro aspecto da matéria aqui revelada relaciona-se a um método de produção de sementes que podem crescer em plantas de soja resistentes à SBR. Em algumas modalidades, o método compreende o fornecimento de uma planta de soja resistente a SBR da matéria aqui revelada, cruzamento da planta resistente à SBR com outra planta de soja, e coleta das sementes que resultam do cruzamento, que quando plantadas, produzem plantas de soja resistentes à SBR.

Em algumas modalidades, o método compreende o fornecimento de uma planta de soja resistente a SBR da matéria aqui revelada, cruzamento da planta resistente à SBR com uma planta de soja, coleta das sementes que resultam do cruzamento, regeneração das sementes em plantas, seleção de plantas resistentes à SBR por qualquer um dos métodos aqui descritos, auto-polinização das plantas selecionadas por um número suficiente de gerações para obter plantas que são fixadas por um alelo associado a resistência à SBR nas plantas, retrocruzamento das plantas

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39/52 assim produzidas com plantas de soja que têm traços fenotípicos desejáveis por um número suficiente de gerações para obter plantas de soja que são resistentes à SBR e têm traços fenotípicos desejáveis, e coleta das sementes produzidas a partir das plantas que resultam do último retrocruzamento, que quando plantadas, produzem plantas de soja que são resistentes à SBR.

VIII. Outras aplicações

Com o uso desses SNPs para reprodução de novas 10 linhagens de soja, um sistema para o desenvolvimento de germoplasma que tem mais que um modo de ação contra o fungo torna-se possível. O uso desse modo duplo de ação ajudará na inibição do fungo de desenvolver resistência. Adicionalmente, um regime para a inibição de resistência fúngica pode incluir inúmeros modos diferentes de ação. Os diferentes modos de ação em um método de inibição de fungo podem ser através de tratamentos de germoplasma ou semente ou aplicações químicas. Um sistema para a inibição de resistência fúngica inclui germoplasma com um ou mais traços resistentes verticais, e/ou germoplasma com um ou mais traços de tolerância horizontais e com as possíveis opções de inclusão de um tratamento de semente que seja ativo contra o fungo, e/ou um spray antifúngico. Os sprays antifúngicos ou tratamentos podem incluir compostos antifúngicos conhecidos para esse fungo, mas também podem incluir sprays de glufosinato ou glifosato, separados ou em combinação, que também tenham um efeito antifúngico.

O regime para inibir resistência antifúngica é muito importante para a eficácia continuada de resistência de germoplasma e atividade química. Há áreas em que as sojas

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40/52 são atualmente produzidas que têm isolados fúngicos que não são mais negativamente afetados por pelo menos dois dos alelos de resistência Rpp conhecidos. A capacidade desses isolados fúngicos para evoluir tão rapidamente pode tornar

5	as áreas de crescimento de soja inteiras inúteis	a menos
	que as modalidades da matéria aqui	revelada que	fornecem
	sementes de soja	que	são protegidas pelos	traços
	selecionados de SNP	para	um modo	duplo de ação	mais o
	tratamento opcional	da semente, ou aplicações	químicas
10	sejam implementadas.
	EXEMPLOS
	Os Exemplos	a	seguir	fornecem modalidades
	ilustrativas. Em vista da	presente	revelação e do nível
	geral de habilidade	na	técnica,	aqueles habilitados

perceberão que os seguintes exemplos são apenas exemplos e que numerosas alterações, modificações e mudanças podem ser empregadas sem fugir do escopo da matéria aqui reivindicada.

EXEMPLO 1

Análise de SNP

Há marcadores de SSR que são associados a genes qualitativos e quantitativos resistentes à ferrugem da soja Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5. Essa informação de SSR foi empregada para identificar marcadores de SNP que mapeiam as regiões de genes qualitativos e regiões de loci de traço quantitativo (QTL) definidos para cada um dos genes Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5. Os SNPs identificados foram validados em linhagens resistentes e suscetíveis à ferrugem da soja. As análises indicaram que esses SNPs mapearam mais intimamente e mostraram melhores associações ao gene Rpp

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41/52 que os SSRs. A informação de SNPs validados para ferrugem da soja é nova e é usada para programas de reprodução adequados.

EXEMPLO 2

Dados de genotipagem de SNP

Marcadores moleculares foram identificados para os genes Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5, e o gene de resistência primeiramente identificado no cultivar japonês, Hyuuga. Hyten e cols., 2007 usaram PI200492 para mapear

Rpp1 ao grupo de ligação (LG) G entre os marcadores de SSR Sct_187 e Sat_064. Rpp2 foi mapeado em PI230970 à região em LG J entre Sat_255 e Satt620. Rpp4 foi mapeado em PI459025 em LG G entre SSR Satt288 e RFLP marcador A885_1 (Silva e cols., 2008, supra). O cultivar Hyuuga (PI506764) continha

Rpp3 (o gene de resistência contido em PIs 462312 e 459025B), mas acredita-se agora que há 2 genes separados de resistência à ferrugem localizados próximos um do outro em LG C2, flanqueados por SSRs Satt460 e Sat_263. Rpp5 foi recentemente identificado em várias linhagens (PI200487,

PI200526, PI471904, PI200456) por Garcia e cols., 2008, e mapeado a LG N em uma região flanqueada pelos SSRs Sat_275 e Sat_280. As posições aproximadas desses genes e vários marcadores são mostradas nas Figuras 1A-1E.

O mapa de ligação de soja desenvolvido pelos cientistas na USDA e publicamente disponível em 2006 pode ser encontrado através do endereço eletrônico do “United States Department of Agriculture” (USDA) e é discutido em Choi e cols. (2007) Genetics 176:685-696. Esse mapa foi usado para localizar os SSRs flanqueados associados a cada gene de resistência e para selecionar SNPs que foram

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42/52 mapeados próximos e em cada região. A informação de polimorfismo e seqüência genômica em cada lado do SNP foi usada para desenhar ensaios com base em PCR para detectar cada alelo. As seqüências com o SNP indicado foram 5 submetidas aos ensaios baseados em Applied Biosystems Inc. (ABI; Foster City, California, United States of America) “Assay-by-Design service for creation of custom TAQMAN® (Applied Biosystems Inc., Foster City, California, United States of America), ou ensaios foram manualmente desenhados 10 com o uso do programa ABI PRIMER EXPRESS®. De modo similar, ensaios TAQMAN® podem ser desenhados com o uso de programa disponível a partir de “Biosearch Technologies (Novato, California, United States of America).

Um objetivo do ensaio de SNP foi o de ser capaz de 15 determinar qual polimorfismo, ou alelo(s), é/são presente(s) no genoma de qualquer linhagem de soja dada, e finalmente permitir a seleção de alelo(s) preferido(s) (ou seja, genes resistentes à ferrugem), em um programa de reprodução assistida por marcador. Um total de 17 SNPs 20 foram identificados; quatro para Rpp1, cinco para Rpp2, três para Rpp?(Hyuuga), dois para Rpp4, e três para Rpp5. Um total de 18 DNAs de painel de rastreamento isolados de (PI547875; PI200492;

PI230970; PI224270;

PI518772; PI628932; PI506764;

linhagens resistentes PI368039; PI547878;

PI578457A;

PI594538A;

PI462312;

PI547879;

PI459025B; PI200456; PI200526; PI200487; e PI471904) foram usados para os ensaios.

EXEMPLO 3

Ensaios de discriminação alélica

Em ensaios de discriminação alélica, um ensaio de PCR

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43/52 incluiu um iniciador adiante e reverso e um marcador específico, fluorescente, rotulado por corante para cada um de dois alelos para um dado SNP. Os marcadores continham diferentes corantes repórteres fluorescentes (VIC®; Applied

Biosystems, Inc., Foster City, California, United States of America; e 6-carboxifluoresceína-aminohexil amidita (FAM), ou N-TET-6-Aminohexanol (TET) e FAM) para diferenciar a amplificação de cada alelo. Um extintor não fluorescente em cada marcador suprimiu a fluorescência até a amplificação por PCR. Durante PCR, cada marcador anelou especificamente a seqüências complementares entre os sítios de iniciador adiante e reverso. Taq polimerase então clivou os marcadores que foram hibridizados a cada alelo. A clivagem separou o corante repórter do extintor, que resultou em fluorescência aumentada pelo corante repórter.

Assim, os sinais fluorescentes gerados por amplificação de PCR indicaram que um ou ambos os alelos estavam presentes na amostra. Em adição ao extintor não fluorescente, os marcadores também continham um ligante de fenda menor na extremidade 3' que resultou em temperaturas de fusão aumentadas (Tm), assim permitindo alta especificidade com o uso de oligos mais curtos. Esses marcadores exibiram maiores diferenças de Tm quando hibridizados a modelos combinados e não combinados, que forneceram discriminações alélicas mais precisas. Os marcadores desse tipo foram manufaturados em ABI (extintor MGB™) ou Biosearch Technologies (extintor BHQPLUS™). Ao final do ciclo térmico de PCR, a fluorescência dos dois corantes repórteres foi medida em um ABI 7900. Um aumento na fluorescência para apenas um corante indicou

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44/52 homozigosidade para o alelo correspondente. Um aumento em ambos os sinais fluorescentes indicou heterozigosidade.

Linhagens de iniciação de exemplo e haplótipos determinados com o uso desse método são apresentados nas

Tabelas 3-8. Nas Tabelas 3-8, H indica que a linhagem foi heterozigótica naquela posição, e - indica que o nucleotídeo naquela posição não foi determinado.

Tabela 3

Painel de rastreamento de SNP

Linhagem	Nome	Origem	Fonte da semente	Resistência
PI547875	L85-2378	Desenvolvido em Illinois, USA	GRIN1	Rppl
PI200492			GRIN	Rppl
PI594538A			GRIN	Rppl -b
PI368039	Tainung No. 4		GRIN	Rppl
PI547878	L86-1752	Desenvolvido em Illinois, USA	GRIN	Rpp2
PI230970			GRIN	Rpp2
PI224270			GRIN	Rpp2
PI462312	Ankur		GRIN	Rpp3
PI578457A			GRIN	Rpp3
PI 518772			GRIN	Rpp3
PI 628932			GRIN	Rpp3
PI5067 64			GRIN	Rpp ? (Hyuuga)

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PI547879	L87-0482	Desenvolvido	GRIN	Rpp4
em	Illinois, USA
PI459025B	(Bing			GRIN	Rpp4
	nan)
PI200456			GRIN	Rpp5
PI200526			GRIN	Rpp5
PI200487	Kinoshita		GRIN	Rpp5
PI471904	L85-2378	Desenvolvido	GRIN	Rpp5
		em	Illinois,
			USA

¹Germplasm Resources Information Network, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, United States of America.

Tabela 4

Dados de genotipagem de SNP- Detalhados para Rppl

	Id. de Seq. N° : 1	Id. de Seq. N°: 2a	Id. de Seq. N° : 2b	Id. de Seq. N°: 3
	Grupo de	ligação	G	G	G	G
	Posição	do mapa	100,921	101,849	101,849	103,63
	(cM)
ID de	ABBRC	LÓCUS	Rppl	Rppl	Rppl	Rppl
Material
SPIRIT
PI547875	L85-2378	Rppl	A	G	T	T
PI200492		Rppl	A	G	T	T
PI594538A		Rppl -b	A	G	T	T

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PI368039	Tainung No. 4	Rppl	A	G	T	T
PI547878	L86-1752	Rpp2	G	A	C	C
PI230970		Rpp2	G	G	C	C
PI224270		Rpp2	G	G	C	C
PI462312	Ankur	Rpp3	G	A	C	C
PI578457A		Rpp3	A	-	T	C
PI 518772		Rpp3	G	A	C	C
PI 628932		Rpp3	G	A	C	C
PI506764		Rpp ? (Hyuuga)	G	G	C	C
PI547879	L87-0482	Rpp4	G	A	C	C
PI459025B	(Bing nan)	Rpp4	G	G	T	C
PI200456		Rpp5	G	G	T	C
PI200526		Rpp5	H	G	T	C
PI200487	Kinoshita	Rpp5	A	G	T	C
PI471904		Rpp5	A	G	T	C

Tabela 5

Dados de genotipagem de SNP- Detalhados para Rpp2

	Id. de Seq. N° : 4a	Id. de Seq. N° : 4b	Id. de Seq. N°: 5a	Id. de Seq. N°: 5b	Id. de Seq. N°: 6
	Grupo de	ligação	J	J	J	J	J
	Posição	do mapa	49,858	49,858	57,697	57,697	60,927
	(cM)
ID de
Material			Rpp2	Rpp2	Rpp2	Rpp2	Rpp2
SPIRIT	ABBRC	LÓCUS

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PI547875	L85-2378	Rppl	G	G	C	T	G
PI200492		Rppl	G	G	C	T	A
PI594538A		Rppl-b	G	G	C	T	A
PI368039	Tainung No. 4	Rppl	G	G	C	T	A
PI547878	L86-1752	Rpp2	G	G	C	T	G
PI230970		Rpp2	G	G	A	T	A
PI224270		Rpp2	G	G	A	A	A
PI462312	Ankur	Rpp3	G	G	C	T	H
PI578457A		Rpp3	G	G	C	T	A
PI 518772		Rpp3	G	G	H	T	A
PI 628932		Rpp3	G	G	C	T	H
PI5067 64		Rpp ? (Hyuuga)	G	G	A	A	A
PI547879	L87-0482	Rpp 4	G	G	C	T	G
PI459025B	(Bing nan)	Rpp 4	G	G	C	T	A
PI200456		Rpp 5	G	G	A	T	G
PI200526		Rpp 5	G	G	H	H	A
PI200487	Kinoshita	Rpp 5	G	G	A	A	A
PI471904		Rpp 5	G	G	A	A	A

Tabela 6

Dados de genotipagem de SNP- Detalhados para Rpp3

	Id. de Seq. N° : 7	Id. de Seq. N° : 8a	Id. de Seq. N° : 8b
Grupo de
ligação	C2	C2	C2

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Posição do mapa (cM)	115,71	117,9	117,9
ID de			Rpp 3 e	Rpp 3 e	Rpp 3 e
Material			Rpp ?	Rpp ?	Rpp ?
SPIRIT	ABBRC	LOCUS	(Hyuuga)	(Hyuuga)	(Hyuuga)
PI547875	L85-2378	Rppl	T	T	G
PI200492		Rppl	C	T	G
PI594538A		Rppl-b	C	T	G
PI368039	Tainung	Rppl
	No. 4		C	T	G
PI547878	L86-1752	Rpp2	T	T	G
PI230970		Rpp2	C	T	G
PI224270		Rpp2	C	C	A
PI462312	Ankur	Rpp3	C	T	G
PI578457A		Rpp3	C	T	G
PI 518772		Rpp3	T	C	A
PI 628932		Rpp3	C	T	G
PI5067 64		Rpp ?
		(Hyuuga)	C	C	A
PI547879	L87-0482	Rpp 4	T	T	G
PI459025B	(Bing	Rpp 4
	nan)		c	T	G
PI200456		Rpp 5	c	T	G
PI200526		Rpp 5	c	H	G
PI200487	Kinoshita	Rpp 5	c	T	G
PI471904		Rpp 5	c	T	G

Tabela 7

Dados de genotipagem de SNP- Detalhados para Rpp4

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49/52

	Grupo de Posição do	ligação mapa (cM)	Id. de Seq. N° : 9	Id. de Seq. N°: 10
G	G
75, 83	76,246
ID de Material SPIRIT	ABBRC	LÓCUS	Rpp4	Rpp4
PI547875	L85-2378	Rppl	C	A
PI200492		Rppl	T	C
PI594538A		Rppl -b	T	C
PI368039	Tainung No. 4	Rppl	T	C
PI547878	L86-1752	Rpp2	C	A
PI230970		Rpp2	T	C
PI224270		Rpp2	C	A
PI462312	Ankur	Rpp3	T	A
PI578457A		Rpp3	T	C
PI 518772		Rpp3	T	C
PI 628932		Rpp3	C	A
PI5067 64		Rpp ? (Hyuuga)	C	C
PI547879	L87-0482	Rpp4	T	C
PI459025B	(Bing nan)	Rpp4	T	C
PI200456		Rpp5	T	A
PI200526		Rpp5	C	H
PI200487	Kinoshita	Rpp5	T	C
PI471904		Rpp5	T	C

Tabela 8

Petição 870180138580, de 08/10/2018, pág. 58/67

50/52

Dados de genotipagem de SNP- Detalhados para Rpp5

Grupo de ligação Posição do mapa (cM)	Id. de Seq. N° : 11	Id. de Seq. N°: 12	Id. de Seq. N°: 13
N	N	N
34.26	34.27	38.8
ID de Material SPIRIT	ABBRC	LÓCUS	Rpp5	Rpp5	Rpp5
PI547875	L85-2378	Rppl	A	T	A
PI200492		Rppl	G	A	G
PI594538A		Rppl -b	A	T	G
PI368039	Tainung No. 4	Rppl	A	T	G
PI547878	L86-1752	Rpp2	A	T	G
PI230970		Rpp2	A	T	A
PI224270		Rpp2	A	T	G
PI462312	Ankur	Rpp3	G	A	G
PI578457A		Rpp3	-	H	G
PI 518772		Rpp3	H	H	H
PI 628932		Rpp3	A	T	A
PI5067 64		Rpp ? (Hyuuga)	A	T	G
PI547879	L87-0482	Rpp4	A	T	G
PI459025B	(Bing nan)	Rpp4	A	T	A
PI200456		Rpp5	A	T	G
PI200526		Rpp5	G	H	G

Petição 870180138580, de 08/10/2018, pág. 59/67

51/52

PI200487	Kinoshita	Rpp5	A	T	G
PI471904		Rpp5	A	T	A

EXEMPLO 4

Validação de TAQMAN®

Para validar ensaios de discriminação alélica TAQMAN® para associação com resistência ou tolerância à doença, as plantas foram selecionadas com base em seu estado fenotípico conhecido e comparadas ao genótipo na localização de SNP específica. DNA isolado de tecido de folhas de brotos de 7-10 dias depois do plantio foi diluído em tampão TE e estocado a 4°C até ser usado em reações de

PCR como descrito abaixo.

PCR foi estabelecido em 5 pl de volumes finais de acordo com a seguinte fórmula:

Reagente	Concentração de estoque	Por rxn (μΝ	Para 96 amostras (μΝ	Concentração Final
2X Master Mix*	2X	2,5	296,88	1X
Iniciador AbD /mistura de marcador (80x)	40x	0,0625	6	0,5x
H2O de qualidade de PCR		2,44	234,24
DNA (seco em 384)	4,5 ng/pl	4	--	3,6 ng/μl (18 ng)
Volume Final (μ-l)		5,00	357,44

Petição 870180138580, de 08/10/2018, pág. 60/67

52/52 *O Master Mix foi JUMPSTART™ Taq READYMIX™ (Catálogo Sigma No. 2893; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, United States of America) , um premix de todos os componentes, incluindo nucleotídeos e Taq polimerase (mas não iniciadores e/ou marcadores) necessários para realizar uma reação de PCR. Antes do uso, 1.375 ml de 1,0 M MgCl2

250 ml de 300 mM

(Catálogo Sigma	No. M1028)	e	250
Sulforrodamina 101	(Catálogo	Sigma	No.
adicionados a um	frasco de	125	mL
READYMIX™.
As placas de	PCR foram	colocada

Taq thermal cycler” e o programa seguinte foi ativado: uma desnaturação inicial de 50°C por 2 minutos seguida por 95°C por 10 minutos; 40 ciclos de 95°C por 15 segundos/60°C por 1 minuto; e um alongamento final de 72°C por 5 minutos. Depois do ciclo, as amostras foram incubadas a 4°C até necessário.

O sistema de detecção de seqüência ABI 7900 (ou TAQMAN®) foi usado para visualizar os resultados de um ensaio de discriminação alélica (SNP). Com o uso do programa de “Sequence Detection System” (SDS), a detecção de alelo foi feita com base na fluorescência pelos dois corantes medida em cada amostra.

Deve-se entender que vários detalhes da matéria aqui revelada podem ser modificados sem fugir do escopo da matéria aqui revelada. Além disso, a descrição anterior é para o objetivo de ilustração apenas, e não para o objetivo de limitação.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem da soja (SBR) compreendendo pelo menos um alelo que confere resistência a SBR, o método

   5 caracterizado por compreender:

   (a) genotipar uma ou mais plantas de soja com relação a um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), em que pelo menos um alelo de resistência é associado com um alelo possuindo uma T na posição 147 da SEQ ID NO: 9 e/ou

   10 uma C na posição 205 da SEQ ID NO: 10; e (b) selecionar uma planta de soja que inclui pelo menos um alelo de resistência associado com um ou mais SNPs, desse modo selecionando uma planta de soja resistente à SBR.

   15 2. Método para a seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem da soja (SBR) compreendendo pelo menos um alelo que confere resistência a SBR, o método caracterizado por compreender:

   (a) isolar um ou mais ácidos nucléicos de várias

   20 plantas de soja;

   (b) detectar nos referidos ácidos nucléicos isolados a presença de uma ou mais moléculas do marcador associado a resistência à SBR, em que as referidas uma ou mais moléculas do marcador compreendem uma T na posição 147 da

   25 SEQ ID NO: 9 e/ou uma C na posição 205 da SEQ ID NO: 10 ou qualquer molécula do marcador mapeada em 1 centiMorgan ou menos de qualquer uma das referidas moléculas do marcador;

   e (c) selecionar uma planta de soja que compreende as

   30 referidas uma ou mais moléculas do marcador, desse modo

   Petição 870190029420, de 27/03/2019, pág. 10/14
2. 2/2 selecionando uma planta de soja resistente à SBR.
3. 3. Composição caracterizada por compreender um par de iniciador de amplificação compreendendo as sequências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 62 e 63 e/ou as sequências de nucleotídeos das SEQ ID NO: 66 e 67, em que o par de iniciadores de amplificação é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA polimerase em um modelo de ácido nucléico de Glycine max para gerar um amplicon de marcador de Glycine max, em que o amplicon de marcador de Glycine max corresponde ao marcador de Glycine max que compreende a seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 9 e/ou SEQ ID NO: 10.