BRPI0819551B1 - Process of indentification of a corn plant with tolerance to the foliar gray stain - Google Patents

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BRPI0819551B1
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E. I. Du Pont De Nemours And Company
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Description

“PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO COM TOLERÂNCIA À MANCHA FOLIAR CINZENTA” Referencia Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório U.S. 61/009.697, depositado em 31 de dezembro de 2007, sendo que a descrição do mesmo é aqui incorporada em sua totalidade.
Campo da Invenção [002] A presente invenção se refere às plantas de milho tolerantes à Mancha Foliar Cinzenta (GLS) e a um método de produção das mesmas. Mais particularmente, a presente invenção se refere ao material genético identificável capaz de causar tolerância á GLS em milhos e a introgressão desse material genético nas plantas de milho. Adictonalmente, a presente invenção se refere à introgressão de material genético desejado de uma ou mais plantas genitoras em plantas de progênie com velocidade, precisão e exatidão.
Antecedente da Invenção [003] Historicamente, o milho (milho verde) é uma cultura importante para usos como alimento, para alimentação e industrial. Qualquer fator de estresse ambiental, por exemplo, doenças que afetam o milho, pode causar impacto na disponibilidade do grão de milho para tais usos.
[004] A Mancha Foliar Cinzenta (referida adiante como GLS) adquiriu proeminência nas últimas três décadas e é uma doença foliar significante nos Estados Unidos e em outras áreas principais de produção, como México, Brasil, Europa e África do Sul. A incidência e a gravidade da GLS se mostram em crescimento nos Estados Unidos (Wang et al., Phytopathology 88:1269 a 75 (1998)), possivelmente devido ao aumento de milho em plantios de milho e redução de lavragem. Essas condições podem contribuir para a hibernação do fungo e para uma infecção precoce na estação seguinte (Lateral! e Rossi, Plant Dis. 67:842 a 37 (1983)). Perdas de produção acima de 50% foram relatadas durante as epidemias de GLS nos Estados Unidos (Laterall e Rossi, supra; Lipps, Plant Dis. 71:281 (1987)) e perdas estimadas chegaram a 100% onde as epidemias graves contribuíram para o elevado tombamento de colmos e senescência precoce (Laterall e Rossi, supra).
[005] O patógeno fúngico Cercospora zeae-maydis, que causa GLS, produz de maneira característica lesões foliares longas, retangulares e cinzento-queimadas que seguem em paralelo às nervuras da folha (Tehon e Daniels, Mycologia 17:240 a 49 (1925); Latterell e Rossi, supra; Ward et al., Plant Dis. 83:884 a 95 (1999)). As lesões podem queimar parte ou totalidade da folha e, tipicamente, aparecem primeiramente nas folhas inferiores. A queima devido à GLS está associada com a perda prematura de área fotossintética. O dreno dominante (dominant sink) da planta de milho de pós-florescência é a espiga e a queima induz a planta a transferir fotossíntese a partir do colmo e raízes para a espiga, em altos níveis, assim, causando a senescência prematura e produtividade reduzida.
[006] O desenvolvimento rápido e efetivo de variedades de milho com tolerância à GLS é benéfico. O nível de tolerância à GLS em híbridos comerciais e em endógamos difere entre as variedades. Algumas variedades que exibem forte tolerância foram relatadas. Entretanto, o uso de seleção fenotípica para a introgressão da característica de GLS a partir de uma variedade tolerante em uma variedade suscetível pode ser demorada e difícil. A GLS é sensível às condições ambientais e requer alta umidade e umidade de folha estendida. Essa sensibilidade toma difícil selecionar de maneira confiável para tolerância à GLS, de um ano a outro, com base somente no fenótipo (Lehmensiek et al., Theor. Appl. Genet. 103:797 a 803 (2001)). Os sítios de triagem de doenças especializados podem ter um alto custo de operação e as plantas devem ser cultivadas até a maturidade com a finalidade de classificar o nível de tolerância. Em contrapartida, a seleção através do uso de marcadores moleculares associados com tolerância à GLS tem a vantagem de permitir, ao menos, alguma seleção com base somente na composição genética da progênie. Assim, a tolerância à GLS pode ser medida precocemente no ciclo de vida da planta, até mesmo ainda no estado de semente, A taxa aumentada de seleção que pode ser obtida através do uso de marcadores moleculares associados com a característica de tolerância à GLS significa que a reprodução de planta para tolerância à GLS pode ocorrer em alta velocidade e que plantas tolerantes à GLS comercial mente aceitáveis podem ser desenvolvidas com maior rapidez.
Descrição Resumida da Invenção [007] As modalidades da presente invenção são baseadas no mapeamento fino de locus genéticos correlacionados de maneira significativa com o aumento de tolerância à GLS e a aplicação desse conhecimento à reprodução de planta. Composições e métodos para a identificação de plantas de milho com tolerância à GLS são fornecidos. Os métodos para a produção de plantas de milho que são tolerantes à GLS através da reprodução assistida por marcador são fornecidos, assim como as plantas produzidas através de tais métodos.
[008] As modalidades incluem uma variedade aperfeiçoada de doador PHJEP para uso como uma fonte de germoplasma para a tolerância de íntrogressão à GLS em plantas de milho e progênie derivado do mesmo. Uma amostra representativa da dita variedade foi depositada na American Type Culture Coitection - ATCC, com Número de Acesso PTA-8851.
[009] Um aspecto da presente invenção é uma semente de uma variedade de milho designada PHJEP, em que uma amostra representativa da dita variedade de milho foi depositada com número de acesso ATCC PTA-8851, ou uma semente de progênie derivada da mesma que compreende o locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta e que, quando cultivada, produz uma planta que exibe tolerância à mancha foliar cinzenta. As plantas produzidas a partir de semente de PHJEP ou sementes de sua progenitura, também são de interesse, assim como são de interesse células daquelas plantas.
[0010] As modalidades também incluem o intervalo cromossômico recombinante específico obtido em PHJEP correlacionado com a tolerância melhorada à GLS e a introgressão desse intervalo cromossômico em outras variedades e plantas. Algumas modalidades incluem a introgressão de haplótipos únicos de PHJEP em outras variedades e plantas.
[0011] Em um aspecto, o locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta na semente de progênie está localizada em um intervalo cromossômico derivado de PHJEP que compreende uma região cromossômica de PHJEP definida por UMC1346 e UMC1702. Em outro aspecto, o locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta na semente de progênie é definido por um haplótipo que compreende: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo A em PHM 15534-13, alelo G em PHM 04694-10, alelo T em PHM 01811-32, alelo T em PHM 01963-15, alelo C em PHM 01963-22, alelo T em PHM 05013-12, alelo T em PHM 00586-10, alelo A em PHM 00049-01. Ainda em outro aspecto, o locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta é definido por um haplótipo que compreende: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo C em PHM 01963-22 e alelo T em PHM 05013-12.
[0012] Em outros aspectos, a semente de progênie é uma conversão de retrocruzamento do locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta. Também é de interesse uma semente de progênie que é uma conversão de retrocruzamento produzida com um genitor recorrente selecionado a partir de PHVNV, PHW3Y, PHVRA, PHEWB e PHWRC.
[0013] Em outros aspectos, a semente de progênie é uma variedade híbrida, e, ao menos, um genitor endógamo da variedade híbrida é uma conversão de retrocruzamento do locus de PHJEP de tolerância à mancha foliar cinzenta em um genitor recorrente selecionado a partir de PHVNV, PHW3Y, PHVRA, PHEWB e PHWRC.
[0014] Outras modalidades incluem um processo de identificação de uma primeira planta de milho que compreende um locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, sendo que o dito processo compreende: (a) obter um primeiro perfil genético da dita primeira planta de milho para o intervalo cromossomal no cromossomo 4 entre BNLG1755 e UMC1299, (b) obter um segundo perfil genético a partir de uma segunda planta de milho que compreende o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, em que o locus está localizado no cromossomo 4 entre BNLG1755 e UMC1299 e (c) comparar dito primeiro perfil genético com o dito segundo perfil genético.
[0015] Em outro aspecto da presente invenção, o processo compreende adicionalmente selecionar a dita primeira planta de milho se esta compreender o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta.
[0016] Adicionalmente, o segundo perfil genético pode ser o perfil genético de PHJEP ou uma progênie de PHJEP, ou pode compreender um ou mais alelos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo A em PHM 15534-13, alelo G em PHM 04694-10, alelo T em PHM 01811-32, alelo T em PHM 01963-15, alelo C em PHM 01963-22, alelo T em HM 05013-12, alelo T em PHM 00586-10 e alelo A em PHM 00049- 01.
[0017] O segundo perfil genético pode também compreender um ou mais alelos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo C em PHM 01963-22 e alelo T em PHM 05013-12.
[0018] Em outros aspectos da presente invenção, os perfis genéticos podem ser determinados para o intervalo cromossômico no cromossomo 4 entre BNLG1755 e MMC0371. Adicionalmente, o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta pode ser PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 ou PHM 00586.
[0019] Também são de interesse da presente invenção, plantas de milho identificadas pelo processo e células e sementes daquelas plantas de milho.
[0020] Uma modalidade adicional da presente invenção inclui um processo de identificação de uma primeira planta de milho que compreende um locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, sendo que o dito processo compreende: (a) obter um primeiro perfil genético da dita primeira planta de milho em um intervalo cromossômico no cromossomo 4 delineado por e que inclui a SEQ ID NO:86, ou uma sequência de nucleotídeo que é 95% idêntica a SEQ ID NO:86 com base no método Clustal V de alinhamento e a SEQ ID NO:87, ou uma sequência de nucleotídeo que é 95% idêntica a SEQ ID NO:87 com base no método Clustal V de alinhamento, (b) obter um segundo perfil genético a partir de uma segunda planta de milho que compreende o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, em que o locus está no dito intervalo e (c) comparar o dito primeiro perfil genético com o dito segundo perfil genético.
[0021] Outras modalidades incluem uma semente de milho que compreende um haplótipo de: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo A em PHM 15534-13, alelo G em PHM 04694-10, alelo T em PHM 01811-32, alelo T em PHM 01963-15, alelo C em PHM 01963-22, alelo T em PHM 05013-12, alelo T em PHM 00586-10, alelo A em PHM 00049-01; e uma semente de milho que compreende um haplótipo de: alelo G em PHM 00045-01, alelo A em PHM 00043-01, alelo C em PHM 01963-22 e alelo T em PHM 05013-12Também são de interesse plantas produzidas pelas sementes de milho.
Definições [0022] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se compreender que a presente invenção não está limitada às modalidades particulares, que podem, logicamente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui usada é para o propósito da descrição somente das modalidades particulares e que as mesmas não estão intencionadas a serem limitadoras. Conforme usado nessa descrição e nas reivindicações em anexo, os termos no singular e as formas singulares "um (a)" e "a (o)", por exemplo, incluem o plural referente, a menos que o contexto dite claramente outra forma. Assim, por exemplo, a referência à "planta", "a planta" ou "uma planta", além disso, inclui uma pluralidade de plantas; também, dependendo do contexto, o uso do termo "planta" pode incluir geneticamente progênies idênticas ou similares daquela planta; o uso do termo "um ácido nucleico" inclui opcionalmente, como uma questão de prática, muitas cópias da molécula de ácido nucleico; similarmente, o termo "sonda" opcionalmente (e tipicamente) abrange muitas moléculas de sonda idênticas ou similares.
[0023] A não ser que indicado de outra forma, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5' a 3'. As faixas numéricas relatadas dentro da descrição são, inclusive, dos números que definem a faixa e incluem cada número inteiro ou qualquer fração de número não inteiro dentro da faixa definida. A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado conforme compreendido comumente pelo técnico no assunto que pertence a presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática para o teste da presente invenção, os materiais preferidos e métodos são descritos aqui. Na descrição e reivindicação da presente invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições especificadas abaixo.
[0024] Uma "planta" pode ser uma planta inteira, qualquer parte da mesma ou uma cultura de célula ou de tecido derivada de uma planta. Assim, o termo "planta" pode se referir as quaisquer: plantas inteiras, componentes da planta ou órgãos (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos da planta, sementes, células da planta, e/ou progênies da mesma. Uma célula da planta é uma célula de uma planta, retirada de uma planta ou derivada através da cultura de uma célula retirada de uma planta.
[0025] O termo "planta de milho" inclui plantas de milho inteiras, células de planta de milho, protoplasta de planta de milho, cultura de célula de planta de milho ou de tecido de planta de milho da qual as plantas de milho podem ser regeneradas, calos de planta de milho, moitas de planta de milho e células de planta de milho que são intactas em plantas de milho ou em partes de plantas de milho, como sementes de milho, espigas de milho, flores de milho, cotilédones de milho, folhas de milho, caules de milho, botões de milho, raízes de milho, pontas de raiz de milho e similares.
[0026] O termo "milho" inclui qualquer membro da espécie Zea mays. "Milho" e "milho verde" são usados aqui de forma permutável.
[0027] Uma "semente" é uma planta embriônica pequena confinada em um tegumento protetor. É o produto do óvulo da planta amadurecida gerado após a fertilização.
[0028] "Germoplasma" se refere ao material genético de ou a partir de um indivíduo (por exemplo, uma planta), um grupo de indivíduos (por exemplo, uma linhagem de planta, variedade ou família), ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultura. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula ou pode ser separado do organismo ou da célula. Geralmente, o germoplasma fornece material genético com uma constituição molecular específica que fornece uma estrutura física para algumas ou todas das qualidades hereditárias de um organismo ou cultura celular. Conforme usado na presente invenção, o germoplasma inclui células, semente ou tecidos, a partir dos quais novas plantas podem ser cultivadas ou partes de plantas, como folhas, caules, pólen ou células, que podem ser cultivadas em uma planta inteira.
[0029] "Variedade", quando usada em conjunção com plantas, abrange plantas cultivadas e botânicas, incluindo endógamos e híbridos e significa um agrupamento de plantas dentro de um único táxon botânico da mais baixa classificação conhecida, onde o agrupamento pode ser definido pela expressão de características resultantes de um dado genótipo ou combinação de genótipos.
[0030] O termo "endógamo" significa uma variedade substancialmente homozigota.
[0031] O termo "híbrido" significa qualquer descendência/progênie de um cruzamento entre dois indivíduos geneticamente distintos, incluindo um cruzamento de duas linhagens endógamas diferentes.
[0032] O termo "alelo" se refere a uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um locus específico.
[0033] Um alelo é "associado com” uma característica quando está ligado a ele e quando a presença do alelo é um indicador de que a característica desejada ou forma da característica ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.
[0034] Um "BAC", ou cromossomo bacteriano artificial, é um vetor de clonagem derivado da ocorrência natural de fator F de Escheríchia coli. Os BACs podem aceitar largas inserções de sequência de DNA. Em milhos, uma quantidade de BACs, ou cromossomos bacterianos artificiais, cada uma contendo uma larga inserção de DNA genômico de milho, foram montadas em contigs (sobreposição de fragmentos genéticos contíguos ou "DNA contíguo").
[0035] Um "alelo favorável" é o alelo em um locus particular que concede ou contribui para, um fenótipo desejável de maneira agronômica, por exemplo, tolerância à GLS ou alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas suscetíveis que podem ser removidas de um programa ou plantio de criação. Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que separa com o fenótipo favorável ou alternativamente, separa com fenótipo de planta suscetível, dessa forma, fornecendo o benefício da identificação de plantas com tendência à doença. Uma forma alélica favorável de um segmento de cromossomo é um segmento de cromossomo que inclui uma sequência de nucleotídeo que contribui para um desempenho agronômico superior em uma ou mais localizações genéticas localizadas fisicamente no segmento de cromossomo.
[0036] "Frequência de Alelo" se refere à frequência (proporção ou porcentagem) na qual um alelo está presente no locus dentro de um indivíduo, dentro de uma linhagem ou dentro de uma população de linhagens. Por exemplo, para um alelo "A", indivíduos diploides de genótipo "AA", "Aa" ou "aa" têm frequências de alelo de 1,0, 0,5 ou 0,0, respectivamente. É possível avaliar a frequência de alelo dentro de uma linhagem através da média das frequências de alelo de uma amostra de indivíduos a partir daquela linhagem. Similarmente, é possível calcular a frequência de alelo dentro de uma população de linhagens através da média das frequências de alelo que constituem a população. Para uma população com um número finito de indivíduos ou linhagens, uma frequência de alelo pode ser expressa como uma contagem de indivíduos ou linhagens (ou qualquer outro agrupamento especificado) contendo o alelo.
[0037] Um alelo "positivamente" se correlaciona com uma característica quando está ligado a esse e quando a presença do alelo é um indicador de que uma característica desejada ou forma da característica ocorrerá em uma planta que compreende o alelo. Um alelo "negativamente" se correlaciona com uma característica quando está ligado a esse e quando a presença do alelo é um indicador de que uma característica desejada ou forma da característica não ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.
[0038] Um indivíduo é "homozigoto" se o indivíduo tiver somente um tipo de alelo em um dado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada de dois cromossomos homólogos).
[0039] Um indivíduo é "heterozigoto" se mais de um tipo de alelo estiver presente em um dado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia cada de dois alelos diferentes).
[0040] Um caso especial de uma situação heterozigose é quando um cromossomo tem um alelo de um gene e o outro cromossomo é desprovido totalmente de gene, locus ou região - em outras palavras, tem uma deleção relativa ao primeiro cromossomo. Essa situação é referida como "hemizigose".
[0041] O termo "homogeneidade" indica que membros de um grupo têm o mesmo genótipo em uma ou mais localizações específicas. Em contrapartida, o termo "heterogeneidade" é usado para indicar que indivíduos dentro do grupo diferem em genótipo em uma ou mais localizações específicas.
[0042] Um "locus" é uma região cromossômica onde um ácido nucleico polimórfico, determinante de característica, gene ou marcador está localizado. Assim, por exemplo, um "locus gênico" é uma localização cromossômica específica no genoma de uma espécie onde um gene específico pode ser encontrado. Um locus correlacionado com tolerância à GLS denota uma região no genoma que é relatada diretamente a uma característica de tolerância à GLS fenotipicamente quantificável.
[0043] Um "complemento genético" tem ao menos um conjunto ou ploidia de alelos. Por exemplo, um híbrido de cruzamento único herda dois complementos genéticos, um de cada genitor endógamo.
[0044] O termo "locus de característica quantitativo" ou "QTL" se refere a um locus genético polimórfico com ao menos um alelo que se correlaciona com a expressão diferencial de uma característica fenotípico em ao menos um fundo genético, por exemplo, em ao menos uma população de criação ou progênie. Uma QTL pode agir através de um mecanismo de gene único ou através de um mecanismo poligênico.
[0045] Os termos "marcador", "marcador molecular", "ácido nucleico de marcador" e "locus marcador" se referem a uma sequência de nucleotídeo, ou produto codificado da mesma (por exemplo, uma proteína), usada como um ponto de referência ao identificar um locus ligado. Um marcador pode ser derivado de sequência de nucleotídeo genômica ou de sequências de nucleotídeos expressas (por exemplo, de um RNA combinado ou de um cDNA), ou de um polipeptídio codificado. O termo também se refere às sequências de ácido nucleico complementares a ou ao flanqueamento das sequências de marcador, como ácidos nucleicos usados como sondas ou pares primer capazes de amplificarem a sequência de marcador. Um grande número de marcadores moleculares de milho é conhecido no estado da técnica e são publicados ou disponíveis por várias fontes, como o recurso de internet MaizeGDB e o recurso de internet Arizona Genomics Institute operado pela Universidade do Arizona. Similarmente, inúmeros métodos para a detecção de marcadores moleculares são bem estabelecidos.
[0046] Um "polimorfismo" é uma variação no DNA que é comum demais para ocorrer meramente devido a uma nova mutação (isto é, ocorre em uma frequência de ao menos 1 % em uma população). Qualquer característica polimórfica diferentemente herdada (incluindo polimorfismo de ácido nucleico) que se segregue entre a progênie é um marcador potencial. A variabilidade genômica pode ser de qualquer origem, por exemplo, inserções, deleções, duplicações, elementos repetitivos, mutações de ponto, eventos recombinantes ou a presença e sequência de elementos reversíveis.
[0047] Uma "sonda marcadora" é uma molécula ou sequência de ácido nucleico que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora se refere a uma sonda de qualquer tipo que seja capaz de distinguir (isto é, genótipo) o alelo específico presente em um locus marcador. Os ácidos nucleicos são "complementares" quando eles hibridizam especificamente em solução, por exemplo, de acordo com as regras de pareamento de base de Watson-Crick.
[0048] Um "locus marcador" é um locus que pode ser usado para trilhar a presença de um segundo locus ligado, por exemplo, um locus ligado que codifica ou contribui para a expressão de uma característica fenotípica. Por exemplo, um locus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em locus marcador, como uma QTL, que são ligados genética ou fisicamente a um locus marcador.
[0049] Um "alelo marcador", alternativamente um "alelo de um locus marcador”, é um dentre uma pluralidade de sequências de nucleotídeos polimórficos encontradas em um locus marcador em uma população que é polimórfica para o locus marcador. Em alguns aspectos, a presente invenção fornece loci marcadores correlacionados com tolerância à GLS em milhos. É esperado que cada um dos marcadores identificados esteja perto em proximidade física e genética (resultando em ligação genética e/ou física) com um elemento genético, por exemplo, uma QTL, que contribui com tolerância à GLS.
[0050] "Marcadores genéticos" são ácidos nucleicos que são polimórficos em uma e onde os alelos dos mesmos podem ser detectados e distintos por um ou mais métodos analíticos, por exemplo, RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR e similares. O termo também se refere às sequências de ácido nucleico complementares às sequências genômicas, como ácidos nucleicos usados como sondas. O termo "Marcador Genético" pode se referir a qualquer tipo de marcador de base de ácido nucleioo, incluindo, mas não se limitando a, Polímorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP), Sequência Simples Repetida (SSR), DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente (RAPD), Sequências Polimórficas Amplificadas Partidas (CAPS) (Rafalski e Tingey, 1993, Trends in Genetícs 9:275 a 280), Polímorfismo de Comprimento de Fragmento Amplificado (AFLP) (Vos et a/, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407 a 4414), Polímorfismo de Nucleotídeo único (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234:177 a 186), Região Amplificada de Sequência Caracterizada (SCAR) (Paran e Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet. 85:985 a 993), Sítio de Sequência Rotulada (STS) (Onozaki et a!., 2004, Euphytíca 138:255 a 262), de Polímorfismo de Conformação de Fita Simples (SSCP) (Grita et a/., 1989, Proc Natl Acad Sei USA 86:2766 a 2770), Sequência Simples Repetida Interna (ISSR) (Blair et ai, 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780 a 792), Polímorfismo Amplificado de Inter-Retrotransposão (IRAR), Polímorfismo de Amplificação de Microssatélite-Retrotransposão (REMAP) (Kalendar eí a/., 1999, Theor. Appl. Genet. 98:704 a 711) e um produto de divagem de RNA (como um indicador Lynx) e similares.
[0051] O termo "indel" se refere a uma inserção ou deleção, em que uma linhagem pode ser referida como tendo uma inserção relativa a uma segunda linhagem ou a segunda linhagem pode ser referida como tendo uma deleção relativa à primeira linhagem.
[0052] Os marcadores correspondentes aos polimorfismos genéticos entre os membros de uma população podem ser detectados através de métodos bem estabelecidos no estado da técnica. Esses incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos de sequência de base de PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozima, detecção de polimorfismos de polinudeotídeos através da hibridização de alelo específico (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de replicação de sequência auto-sustentada, detecção de sequências simples repetidas (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs). Os métodos bem estabelecidos também são conhecidos para a detecção de indicadores de sequência expressa (ESTs) e marcadores SSR derivados de sequências EST e de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD). Os Métodos para o mapeamento de um através de sequências polimórficas amplificadas partidas (CAPS) também são bem conhecidos (ver, por exemplo, Konieczny & Ausubel, Plant J. 4:403 a 10 (1993)).
[0053] "Seleção assistida por marcador" (ou MAS) é um processo através do qual fenótipos são selecionados com base em genótipos marcadores.
[0054] "Contra-seleção assistida por marcador" é um processo através do qual genótipos marcadores são usados para identificar plantas que não serão selecionadas, permitindo que sejam removidas de um programa de criação ou plantação.
[0055] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para uma comparação de sequência. A sequência de referência é obtida através de uma genotipagem de uma quantidade de linhagens em um locus, alinhando as sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequência (por exemplo, Sequencher), e, assim, obtendo a sequência de consenso do alinhamento.
[0056] Um "mapa genético" é uma descrição de relações de ligação genética entre localizações em um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) dentro de uma dada espécie, geralmente descrito em forma de tabela ou de diagrama. Os loci são marcos genéticos ou marcadores e para cada mapa genético, as distâncias entre os marcadores são medidas através das frequências de recombinação entre eles. Um mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores usados e do potencial polimórfico de cada marcador entre populações diferentes. A ordem e as distâncias genéticas entre as localizações podem diferir de um para outro mapa genético. Por exemplo, 10 cM no mapa genético internamente derivado (também referido aqui como "PHB" para Pioneer Hi-Bred) é aproximadamente equivalente a 25 a 30 cM no mapa de quadros Neighbors IBM2 2005 (um mapa de alta resolução disponível em MaizeGDB). Entretanto, uma informação pode ser correlacionada de um mapa para outro com o uso de uma estrutura geral de marcadores comuns. O técnico no assunto pode usar a estrutura de marcadores comuns para identificar as posições de marcadores e outras localizações de interesse em cada mapa genético individual.
[0057] "Mapeamento genético" é o processo de definição de relações de ligação de localizações através do uso de marcadores genéticos, segregação de populações dos marcadores e princípios genéticos padrões de frequência de recombinação. Uma "localização de mapa genético" é uma localização em um mapa genético relativo aos marcadores genéticos circundantes no mesmo grupo de ligação onde um marcador especificado pode ser encontrado dentro de uma dada espécie.
[0058] Um "mapa físico" do genoma se refere às distâncias absolutas (por exemplo, medido em pares de base ou fragmentos genéticos contíguos ou isolados, por exemplo, contigúes). Um mapa físico do genoma não leva em consideração o comportamento genético (por exemplo, frequências de recombinação) entre pontos diferentes no mapa físico.
[0059] "Recombinação" é uma troca de segmentos de cromossomos homólogos durante a meiose através da qual os genes ligados se tornam recombinados; também se refere ao produto de tal troca.
[0060] Uma "frequência de recombinação genética" é a frequência de um evento de permutação (recombinação) entre duas localizações genéticas. A frequência de recombinação ode ser observada através do acompanhamento da segregação de marcadores e/ou características que seguem a meiose. Uma frequência de recombinação genética pode ser expressa em centimorgans (cM), onde um cM é a distância entre dois marcadores genéticos que mostra uma frequência de recombinação de 1% (isto é, um evento de permutação ocorre entre esses dois marcadores genéticos uma vez em cada 100 divisões celulares).
[0061] "Genoma" se refere ao DNA total ou ao conjunto inteiro de genes, transportado por um cromossomo ou conjunto de cromossomo.
[0062] Conforme usado na presente invenção, o termo "ligação" é usado para descrever o grau com que um locus marcador está "associado com" outros locus marcadores ou algum outro locus (por exemplo, um locus tolerância). As duas localizações marcadoras próximas situam-se no mesmo cromossomo, as mais próximas serão associadas em gametas e as mais próximas ainda aparecerão frequentemente juntas; as localizações marcadoras que são muito próximas não são essencialmente separadas devido ao fato de ser extremamente improvável que um ponto de cruzamento ocorra entre elas.
[0063] Conforme usado na presente invenção, "equilíbrio de ligação" descreve uma situação onde dois marcadores independentemente segregados, isto é, selecionados dentre progênie aleatória. Os marcadores que mostram equilíbrio de ligação são considerados improváveis (querem eles se situem ou não no mesmo cromossomo).
[0064] O termo "desequilíbrio de ligação" se refere a uma segregação não aleatória de locus genético ou características (ou ambos). Em ambos os casos, o desequilíbrio de ligação implica que as localizações relevantes estão dentro de uma proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo de modo que elas se segreguem juntas com uma frequência maior (isto é, não aleatória) do que a frequência aleatória (no caso de características de cossegregação, as localizações que fundamentam as características estão em proximidade suficiente entre si). Os marcadores que mostram desequilíbrio de ligação são considerados ligados.
[0065] O desequilíbrio de ligação é mais comumente avaliado com o uso da medida r2, que é calculada com o uso da fórmula descrita por Hill, W.G. e Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:226 a 231 (1968). Quando r2 = 1, um LD completo existe entre as duas localizações marcadoras, significando que os marcadores não foram separados por recombinação e têm a mesma frequência de alelo. Os valores para r2 acima de 1/3 indicam um LD suficientemente forte para ser usado para mapeamento (Ardlie et ai, Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)). Então, os alelos estão em desequilíbrio de ligação quando valores de r2 entre localizações de marcadores formadas em pares são maiores do que ou iguais a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.
[0066] Conforme usado na presente invenção, a relação de ligação entre um marcador molecular e um fenótipo é dada como uma "probabilidade" ou "probabilidade ajustada". O valor de probabilidade é a possibilidade estatística de que a combinação específica de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador específico seja aleatória. Assim, quanto menor o ganho de probabilidade, maior é a possibilidade de que um fenótipo e um marcador específico sejam cossegregados. Em alguns aspectos, o ganho de probabilidade é considerado "significante" ou "não significante". Em algumas modalidades, um ganho de probabilidade de 0,05 (p=0,05 ou uma probabilidade de 5%) de seleção aleatória é considerado uma indicação significante de cossegregação. Entretanto, a presente invenção não está limitada a esse padrão particular e uma probabilidade aceitável pode ser qualquer probabilidade menor que 50% (p=0,5). Por exemplo, uma probabilidade significante pode ser menor que 0,25, menor que 0,20, menor que 0,15 ou menor que 0,1.
[0067] O termo "ligado fisicamente" é muitas vezes usado para indicar que duas localizações, por exemplo, duas localizações marcadoras, estão presentes fisicamente no mesmo cromossomo.
[0068] Vantajosamente, as duas localizações ligadas estão localizadas em uma grande proximidade tal que a recombinação entre pares de cromossomo homólogos não ocorra entre as duas localizações durante a meiose com alta frequência, por exemplo, tal que as localizações ligadas co-segreguem ao menos em cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,75% ou mais do tempo.
[0069] A frase "ligada proximamente", na presente descrição, significa que a recombinação entre duas localizações ligadas ocorre com uma frequência igual a ou menor que cerca de 10% (isto é, são separadas em um mapa genético por não mais que 10 cM). Ou seja, as localizações ligadas mais próximas cossegregam em pelo menos 90% do tempo. As localizações marcadoras são úteis especialmente na presente invenção quando demonstram uma probabilidade significante de cossegregação (ligação) com uma característica desejada (por exemplo, tolerância patogênica). Por exemplo, em alguns aspectos, esses marcadores podem ser designados marcadores de QTL ligadas. Em outros aspectos, especialmente marcadores moleculares úteis são aqueles marcadores que são ligados ou proximamente ligados.
[0070] Em alguns aspectos, a ligação pode ser expressa como qualquer limite ou faixa desejada. Por exemplo, em algumas modalidades, duas localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menor que unidades de mapa de 50 cM. Em outras modalidades, as localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menos que 40 cM. Em outras modalidades, duas localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menos que 30 cM. Em outras modalidades, duas localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menos que 25 cM. Em outras modalidades, duas localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menos que 20 cM. Em outras modalidades, duas localizações ligadas são duas localizações que são separadas por menos que 15 cM. Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma faixa agrupada de ligação, por exemplo, entre 10 e 20 cM, ou entre 10 e 30 cM, ou entre 10 e 40 cM.
[0071] Quanto mais próximo um marcador estiver ligado a um segundo locus, melhor este marcador será como um indicador para o segundo locus. Assim, em uma modalidade, as localizações proximamente ligadas como um locus marcador e um segundo locus mostram uma frequência de recombinação de inter-locus de 10% ou menos, preferencialmente de cerca de 9% ou menos, ainda com mais preferência de cerce de 8% ou menos, com mais preferência ainda de cerca de 7% ou menos, ainda com mais preferência de cerca de 6% ou menos, com mais preferência ainda de cerca de 5% ou menos, com mais preferência ainda de cerca de 4% ou menos, ainda com mais preferência de cerca de 3% ou menos e com mais preferência ainda de cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferenciais, as localizações relevantes mostram uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente de cerca de 0,5% ou menos ou ainda com mais preferência de cerca de 0,25% ou menos. As duas localizações que estão localizadas no mesmo cromossomo e em tal distância que a recombinação entre as localizações ocorra em uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) também são ditas por estarem proximamente ligadas entre si. Em alguns casos, dois marcadores diferentes podem ter as mesmas coordenadas de mapa genético. Naquele caso, os dois marcadores estão em uma proximidade tão grande entre si que a recombinação acontece entre eles com uma frequência muito baixa a ponto de ser indetectável.
[0072] Ao se referir à relação entre dois elementos genéticos, como um elemento genético que contribui para tolerância e um marcador proximamente ligado, a ligação de fase de "acoplamento" indica o estado onde o alelo "favorável" no locus de tolerância está fisicamente associado na mesma fita de cromossomo como o alelo "favorável" do locus marcador ligado respectivo. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados juntos através da progênie que herda aquela fita de cromossomo. Na ligação de fase de "repulsão", o alelo "favorável" no locus de interesse está fisicamente ligado com um alelo "não favorável" no locus marcador ligado e os dois alelos "favoráveis" não são herdados juntos (isto é, as duas localizações estão "fora de fase" entre si).
[0073] Conforme usado na presente invenção, os termos "intervalo de cromossomo", "intervalo cromossômico", "segmento de cromossomo", ou "segmento cromossômico" designam um trecho linear contíguo de DNA genômico que reside em planta em um único cromossomo, usualmente definido com referência aos dois marcadores que definem os pontos finais do intervalo cromossômico. Os elementos genéticos ou genes localizados em um único intervalo de cromossomo estão fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo de cromossomo não é particularmente limitado.
[0074] Em alguns aspectos, por exemplo, no contexto da presente invenção, geralmente os elementos genéticos localizados dentro de um único intervalo de cromossomo são também geneticamente ligados, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética de, por exemplo, menos que ou igual a 20 cM, ou alternativamente, menor que ou igual a 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um único intervalo de cromossomo se submetem a uma recombinação em uma frequência menor que ou igual a 20% ou 10%.
[0075] Em um aspecto, qualquer marcador da presente invenção está ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que está a ou menor que uma distância de 50 cM. Em outro aspecto, qualquer marcador da presente invenção está proximamente ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro que está em grande proximidade, por exemplo, a uma distância de ou menor que 10 cM. Dois marcadores proximamente ligados no mesmo cromossomo podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos entre si.
[0076] A frase "Mancha Foliar Cinzenta" ou "GLS" se refere a uma doença cereal causada pelo patógeno fungoso Cercospora zeae-maydis, que produz caracteristicamente lesões foliares longas, retangulares, cinzento-queimadas e que seguem em paralelo à nervura da folha.
[0077] "Tolerância recentemente conferida" ou “tolerância melhorada" em uma planta de milho em relação à GLS é uma indicação de que a planta de milho é menos afetada em relação à produtividade e/ou capacidade de sobrevivência ou a outros meios agronômicos relevantes, em vista da introdução dos agentes causadores dessa doença, por exemplo, Cercospora zeae-maydis. A tolerância é um termo relativo, que indica que a planta infectada tem uma produção de milho melhor do que outra, similarmente tratada, planta mais suscetível. Isto é, as condições causam uma diminuição reduzida em sobrevivência de milho e/ou produção em uma planta de milho tolerante, quando comparada a uma planta de milho suscetível.
[0078] O técnico no assunto apreciará que a tolerância de planta de milho à GLS que varia amplamente, pode representar um espectro de fenótipos de maior ou menor tolerância e podem variar dependendo da severidade da infecção. Entretanto, através de uma observação simples, o versado poderá determinar a tolerância relativa ou suscetibilidade de plantas diferentes, linhagens de plantas ou famílias de plantas à GLS, e, adicionalmente, também reconhecerá as gradações fenotípicas de "tolerante". Por exemplo, uma classificação visual de 1 a 9 indica que a tolerância à GLS pode ser usada. As pontuações mais altas indicam uma resistência maior. Os dados devem ser coletados somente quando existir pressão de seleção suficiente no experimento medido.
[0079] O termo "cruzado" ou "cruzar" no contexto da presente invenção significa a fusão de gametas através da polinização para produzir progênies (por exemplo, células, sementes ou plantas). O termo abrange tanto cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) quanto auto-cruzamentos (auto-polinização, por exemplo, quando o pólen e o óvulo são da mesma planta). O termo "cruzamento" se refere ao ato de fusão de gametas através da polinização para produzir progênies.
[0080] O termo "introgressão" se refere à transmissão de um alelo desejado de um locus genético a partir de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgressão de um alelo desejado em um locus especificado pode ser transmitida para, pelo menos, uma progênie através de um cruzamento sexual entre dois genitores da mesma espécie, onde pelo menos um dos genitores tem o alelo desejado em seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer através da recombinação entre dois genomas doadores, por exemplo, em um protoplasta fundido, onde pelo menos um dos protoplastas doadores tem o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um alelo selecionado de um marcador, uma QTL, um transgene, ou similares. Em qualquer caso, a descendência que compreende o alelo desejado pode ser retrocruzada repetidamente para uma linhagem que tem fundo genético desejado e selecionado para o alelo desejado, para resultar no alelo que se torna fixo em um fundo genético selecionado.
[0081] O processo de "introgressão" é frequentemente referido como "retrocruzamento" quando o processo é repetido duas ou mais vezes.
[0082] Uma "conversão de retrocruzamento" é um produto de introgressão de um locus ou característica em uma variedade através de retrocruzamento.
[0083] "Retrocruzamento" se refere ao processo por meio do qual as progênies híbridas são retrocruzadas repetidamente com um dos genitores. Em um esquema de retrocruzamento, o genitor "doador" se refere à planta genitor com o gene ou locus desejado para ser cinzento-queimadas. O genitor "recipiente" (usado uma ou mais vezes) ou genitor “recorrente” (usado duas ou mais vezes) se refere à planta genitor na qual o gene ou locus é introgredido. Por exemplo, consultar Ragot, M. et al. (1995) um retrocruzamento assistido por marcador: um exemplo prático, em Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloquies, Vol. 72, pp. 45 a 56 e Openshaw et al., (1994) Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, pp. 41 a 43. O cruzamento inicial causa a geração F1; o termo "BC1" então, se refere ao segundo uso do genitor recorrente, "BC2" se refere ao terceiro uso do genitor recorrente e assim por diante.
[0084] Uma "linhagem" ou "cepa" é um grupo de indivíduos de parentagem idêntica que é geralmente endógamo para algum grau e que é geralmente homozigoto e homogêneo na maior parte das localizações (isogênico ou quase isogênico). Uma "sub-linhagem" se refere a um subconjunto de endógamos de descendentes que é geneticamente distinto de outro subconjunto similarmente endógamo descendente do mesmo progenitor.
[0085] Uma "linhagem ancestral" é uma linhagem genitora usada como uma fonte de genes, por exemplo, para o desenvolvimento de linhagens de elite. Uma "população ancestral" é um grupo de ancestrais que contribuíram com a maior parte da variação genética que foi usada para desenvolver linhagens de elite. "Progênies" são descendentes de ancestrais e podem ser separadas de seus ancestrais por muitas gerações de criação. Por exemplo, as linhagens de elite são as progênies de seus ancestrais. Uma "estrutura de genealogia" define a relação entre uma progênie e cada ancestral que resultou naquele descendente. Uma estrutura de genealogia pode atravessar uma ou mais gerações, descrevendo relações entre as progênies e seus pais, avós, bisavós, etc.
[0086] Uma "linhagem elite" ou "cepa elite" é uma linhagem agronomicamente superior que é resultante de muitos ciclos de criação e seleção para desempenho agronomicamente superior. Inúmeras linhagens elites estão disponíveis e conhecidas daqueles técnicos no assunto de criação de milho. Uma "população elite" é uma classificação de indivíduos ou linhagens elites que pode ser usada para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de cultivo, como milho. Similarmente, um “germoplasma elite" ou cepa elite de germoplasma é um germoplasma agronomicamente superior, tipicamente derivado de e/ou capaz de resultar em uma planta com desempenho agronomicamente superior, como uma linhagem elite recentemente desenvolvida ou de existência de milho.
[0087] Em contrapartida, uma "cepa de milho exótica" ou um "germoplasma de milho exótico" é uma cepa ou germoplasma derivado de milho que não pertence a uma linhagem ou cepa elite de milho de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou cepas de germoplasma, um germoplasma exótico não está proximamente relatado pela descendência para o germoplasma elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem elite de milho conhecida, mas especialmente é selecionado para introduzir elementos genéticos novos (tipicamente alelos novos) em um programa de criação.
[0088] O termo "amplificação" no contexto de amplificação de ácido nucleico é qualquer processo pelo qual cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma forma transcrita do mesmo) são produzidas. Métodos típicos de amplificação incluem vários métodos de replicação com base em polimerase, incluindo a reação de cadeia de polimerase (PCR), métodos mediados por ligase como reação de cadeia por ligase (LCR) e métodos de amplificação com base em polimerase de RNA (por exemplo, através de transcrição).
[0089] Um "amplicon" é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido por amplificação de um ácido nucleico de molde através de qualquer método de amplificação disponível (por exemplo, PCR, LCR, transcrição ou similares).
[0090] Um "ácido nucleico genômico" é um ácido nucleico que corresponde a uma sequência para um ácido nucleico hereditário em uma célula. Exemplos comuns incluem DNA genômico nuclear e amplicons do mesmo. Um ácido nucleico genômico, em alguns casos, diferentes de um RNA combinado, ou um cDNA correspondente, no qual o RNA ou cDNA combinante é processado, por exemplo, através do mecanismo de combinação, para remover íntrons. Os ácidos nucleicos genômicos compreendem opcionalmente sequências não- transcritas (por exemplo, sequências estruturais de cromossomo, regiões promotoras ou regiões de melhoria) e/ou sequências não traduzidas (por exemplo, íntrons), enquanto que RNA/cDNA combinados tipicamente não têm sequências não transcritas ou íntrons. Um "ácido nucleico de molde" é um ácido nucleico que serve como um molde em uma reação de amplificação (por exemplo, uma reação de amplificação baseada em polimerase como PCR, uma reação de amplificação mediada por ligase como LCR, uma reação de transcrição, ou similares). Um ácido nucleico de molde pode ser genômico em origem, ou alternativamente, pode ser derivado de sequências expressas, por exemplo, um cDNA ou um EST.
[0091] "Sequência de Nucleotídeo", "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico" são usados de maneira variável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de filamento único ou duplo, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Um "nucleotídeo" é uma unidade monomérica da qual polímeros de DNA ou RNA são construídos e consiste de uma base de pirimidina ou purina, a pentose e um grupo de ácido fosfórico. Os nucleotídeos (usualmente encontrados em sua forma de 5'-monofosfato) são referidos pela designação de letra única conforme segue: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato, "G" para guanilato ou deoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para deoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), Ύ" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, Ή" para A ou C ou T, T para inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.
[0092] Um "ácido nucleico exógeno" é um ácido nucleico que não é nativo para um sistema especificado (por exemplo, um germoplasma, planta ou variedade), com relação à sequência, posição genômica ou ambos. Conforme usado na presente invenção, os termos "exógenos" ou "heterólogos" como aplicados aos polinucleotídeos ou polipeptídeos tipicamente se referem às moléculas que foram artificialmente supridas para um sistema biológico (por exemplo, uma célula vegetal, um gene vegetal, uma espécie vegetal específica ou variedade ou um cromossomo vegetal sob estudo) e não são nativas para aquele sistema biológico específico. Os termos podem indicar que o material relevante originado de uma fonte que não fonte de ocorrência natural, ou podem se referir às moléculas que têm uma configuração não natural, localização genética ou disposição de partes.
[0093] Em contrapartida, por exemplo, um gene "nativo" ou "endógeno" é um gene que não contém elementos de ácido nucleico codificados por fontes que não elemento genético ou o cromossomo em que é normalmente encontrado na natureza. Um gene, uma transcrição ou polipeptídio endógeno é codificado por seu locus cromossômico natural e não é artificialmente fornecido para a célula.
[0094] O termo "recombinante" em referência a um ácido nucleico ou polipeptídio indica que o material (por exemplo, um ácido nucleico, gene, polinucleotídeo, ou polipeptídio recombinante) foi alterado por invenção humana. Geralmente, a disposição de partes de uma molécula recombinante não é uma configuração nativa, ou a sequência primária do polinucleotídeo ou polipeptídio recombinante foi de alguma maneira manipulada. A alteração para produzir o material recombinante pode ser executada no material dentro ou removido de seu ambiente ou estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico de ocorrência natural se torna um ácido nucleico recombinante se for alterado, ou se for transcrito de DNA que foi alterado, por meio de intervenção humana executada dentro da célula a qual foi originada. Um quadro de leitura aberto de sequência de gene é recombinante se aquela sequência de nucleotídeo foi removida de seu contexto natural e clonada em qualquer tipo de vetor de ácido nucleico artificial. Os protocolos e reagentes para produzir moléculas recombinantes, ácidos nucleicos especialmente recombinantes, são comuns e rotineiros no estado da técnica. Em uma modalidade, um cromossomo artificial pode ser criado e inserido em plantas de milho por qualquer método conhecido no estado da técnica (por exemplo, processos de transferência direta, como, por exemplo, percepção de DNA induzida por PEG, fusão de protoplasta, microinjeção, eletroporação e bombardeamento de microprojétil). Um cromossomo artificial é um pedaço de DNA que pode replicar com estabilidade e segregar ao longo de cromossomos endógenos. Tem a capacidade para acomodar e expressar genes heterólogos inseridos no mesmo. A integração de DNA heterólogo na região megareplicadora (sítio de iniciação de replicação primária de centrômeros) ou em grande proximidade do mesmo, inicia uma amplificação de larga escala de segmentos cromossômicos de tamanho de megabase, que leva a uma nova formação de cromossomo. Ver, por exemplo, pedido de patente de U.S. 6.077.697, incorporada aqui por referência.
[0095] O termo recombinante pode também se referir a um organismo que abriga material recombinante, por exemplo, uma planta que compreende um ácido nucleico recombinante é considerada uma planta recombinante. Em algumas modalidades, um organismo recombinante é um organismo transgênico.
[0096] O termo "introduzido" quando se referindo ao translocamento de um ácido nucleico heterólogo ou exógeno em uma célula se refere à incorporação do ácido nucleico na célula com o uso de qualquer metodologia. O termo abrange métodos de introdução de ácido nucleico como "transfecção", "transformação" e "transdução".
[0097] Conforme usado na presente invenção, o termo "vetor" é usado em referência a um polinucleotídeo ou outras moléculas que transferem segmento(s) de ácido nucleico em uma célula. O termo "veículo" é algumas vezes usado de maneira variável com "vetor". Um vetor compreende opcionalmente partes que mediam a manutenção do vetor e permitem seu uso intencionado (por exemplo, sequências necessárias para replicação, droga de transmissão de genes ou resistência antibiótica, um sítio de clonagem múltipla, ou elementos melhorados/ promotores ligados de modo operável que permitem a expressão de um gene clonado). Os vetores são frequentemente derivados de plasmídeos, bacteriófagos ou vírus vegetal ou animal. Um "vetor de clonagem” ou "vetor ponte" ou "vetor de subclonagem" contém partes ligadas de maneira operável que facilitam etapas de subclonagem (por exemplo, um sítio de clonagem múltipla contendo sítios de endonucleases de restrição múltipla).
[0098] O termo "vetor de expressão", conforme usado na presente invenção se refere a um vetor que compreende sequências de polinucleotídeos ligadas de maneira operável que facilitam a expressão de uma sequência de codificação em organismos hospedeiros particulares (por exemplo, um vetor de expressão bacteriano ou um vetor de expressão vegetal). As sequências de polinucleotídeos que facilitam a expressão em procariotos incluem tipicamente, por exemplo, um promotor, um operador (opcional) e um sítio de ligação de ribossomo, frequentemente junto com outras sequências. As células eucarióticas podem usar sinais promotores, melhorados, de terminação e poliadenilação e outras sequências que são geralmente diferentes daquelas usadas por procariotos.
[0099] O termo "planta transgênica" se refere a uma planta que compreende dentro de sua célula um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado com estabilidade dentro do genoma tal que o polinucleotídeo é passado por sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado sozinho no genoma ou como partes de uma de um cassete de expressão recombinante. "Transgênico" é usado aqui para se referir a qualquer célula, linhagem de célula, calos, tecido, parte da planta ou planta, cujo genótipo foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo, incluindo aqueles organismos transgênicos ou células inicialmente alteradas de tal modo, bem como aquelas criadas por cruzamentos ou propagação assexuada a partir do organismo ou célula inicial transgênico. O termo "transgênico" conforme usado aqui não inclui a alteração do genoma (cromossômica ou extra-cromossômica) por métodos de criação de planta convencionais (por exemplo, cruzamentos) ou por eventos de ocorrência natural como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante, ou mutação espontânea.
[00100] "Clonagem posicionai" é um procedimento de clonagem no qual um ácido nucleico alvo é identificado e isolado por sua proximidade genômica ao ácido nucleico marcador. Por exemplo, um clone de ácido nucleico genômico pode incluir uma parte ou ambas de mais duas regiões cromossômicas que estão proximamente ligadas uma a outra. Se um marcador puder ser usado para identificar o clone do ácido nucleico genômico a partir de uma biblioteca genômica, métodos padrão como a subclonagem ou o sequenciamento podem ser usados para identificar e/ou isolar subsequências do clone que estão localizadas próximas ao marcador.
[00101] Um ácido nucleico especificado é "derivado de" um dado ácido nucleico quando é construído com o uso da sequência do dado ácido nucleico, ou quando o ácido nucleico especificado é construído com o uso do dado ácido nucleico. Por exemplo, um cDNA ou EST é derivado de um mRNA expresso.
[00102] O termo "elemento genético" ou "gene" refere-se a uma sequência hereditária de DNA, isto é, uma sequência genômica, com significação funcional. O termo "gene" também pode ser usado para se referir a, por exemplo, um cDNA e/ou um mRNA codificado por uma sequência genômica, bem como para esta sequência genômica.
[00103] O termo "genótipo" é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em uma ou mais localizações genéticas, como contrastado com a característica observável (o fenótipo). O genótipo é definido pelo alelo(s) de uma ou mais localizações que o indivíduo herdou de seus pais. O termo genótipo pode ser usado para se referir à constituição genética de um indivíduo em um único locus, em múltiplas localizações, ou, mais geralmente, o termo genótipo pode ser usado para se referir à constituição genética de um indivíduo para todos os genes em seu genoma.
[00104] Um "haplótipo” é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de localizações genéticas. Tipicamente, as localizações genéticas descritas por um haplótipo são ligadas fisicamente e geneticamente, isto é, no mesmo segmento de cromossoma. O termo "haplótipo" pode se referir a polimorfismo em um locus particular, como um locus marcador único, ou polimorfismos em múltiplas localizações ao longo de um segmento cromossômico. Também se pode referir ao anterior como "haplótipos marcadores” ou "alelos marcadores”, enquanto pode-se referir ao último como "haplótipo de longo alcance”.
[00105] Os termos "fenótipo", ou "característica fenotípica" ou "característica" referem-se a um ou mais características de um organismo. O fenótipo pode ser observável a olho nu, ou por outros meios de avaliação conhecidos no estado da técnica, por exemplo, microscopia, análise bioquímica, análise genômica, ou um ensaio para a tolerância a uma doença particular. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um único gene ou locus genético, isto é, uma "característica de gene único” em outros casos, um fenótipo é o resultado de vários genes.
[00106] Um "fenótipo molecular" é um fenótipo detectável em nível de uma população de (um ou mais) moléculas. Tais moléculas podem ser ácido nucleicos como DNA ou RNA genômicos, proteínas, ou metabolitas. Por exemplo, um fenótipo molecular pode ser um perfil de expressão para um ou mais produtos de gene, por exemplo, em um estágio específico do desenvolvimento da planta, em resposta a uma condição ou tensão ambiental, etc. Perfis de expressão são tipicamente avaliados em nível de RNA ou proteína, isto é, em uma disposição ou “lasca” de ácido nucleico ou com o uso de anticorpos ou outras proteínas aglutinantes.
[00107] Uma "amostra representativa" é uma amostra que abrange a composição e as características relevantes da população coletada para amostra.
[00108] Um "centrômero" é o sítio único em cada cromossomo para a montagem do cinetócoro e segregação de cromossomo apropriada na mitose e meiose.
[00109] O termo "produção" refere-se à produtividade por unidade de área de um produto vegetal particular de valor comercial. Por exemplo, a produção de milho é comumente medida em bushels de semente por acre ou toneladas métricas de semente por hectare por estação. A produção é afetada por ambos os fatores genéticos e ambientais.
[00110] "Agronômicos", "características agronômicas" e "desempenho agronômico" referem-se às características (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribui para a produção ao longo do curso da estação de crescimento. Características agronômicas individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância à tensão, resistência ou tolerância à doença, resistência ao herbicida, ramificação, florescência, configuração da semente, tamanho da semente, densidade da semente, resistência ao tombamento, capacidade de debulhamento e similares. A produção é, portanto, a culminação final de todas as características agronômicas.
[00111] Um "conjunto" de marcadores ou sondas se refere a uma coleção ou grupo de marcadores ou sondas, ou os dados derivados destes, usados para um fim comum, por exemplo, identificando plantas de milho com uma característica desejado (por exemplo, tolerância à GLS). Frequentemente, os dados correspondentes aos marcadores ou sondas, ou os dados derivados de seu uso, são armazenados em um meio eletrônico. Enquanto cada um dos membros de um conjunto possui utilidade em relação ao fim especificado, os marcadores individuais selecionados a partir do conjunto assim como os subconjuntos que incluem alguns, mas não todos, dos marcadores também são eficazes em alcançar o fim especificado.
[00112] Um "perfil genético" é uma identificação e caracterização de diagnósticos de sequências para uma característica ou locus particular.
[00113] Uma "tabela para consulta" é uma tabela que correlaciona uma forma de dados à outra, ou uma ou mais formas de dados com um resultado previsto para o qual os dados são relevantes. Por exemplo, uma tabela de consulta pode incluir uma correlação entre dados de alelo e uma característica prevista que uma planta que compreende um dado alelo tenha alta probabilidade de exibir. Estas tabelas podem ser e tipicamente são, multidimensionais, por exemplo, levando alelos múltiplos em consideração simultaneamente, e, opcionalmente, levando outros fatores em consideração também, como um fundo genético, por exemplo, ao fazer uma previsão genética.
[00114] Um "contig" refere-se a um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma única fonte genética. Um mapa de contig descreve a ordem relativa de uma biblioteca ligada de contigs que representam um segmento cromossômico estendido. Um "contig público" é um conjunto publicamente disponível de segmentos de DNA sobrepostos derivado de uma única fonte genética. Exemplos de fontes públicas incluem o Projeto de Mapeamento de Milho (Universidade de Missouri - Columbia, Universidade de Geórgia e Universidade do Arizona), o Instituto de Genômica do Arizona, o site da internet MaizeGDB e o site da Internet Maize Sequence. Alinhamentos de sequência ou contigs também podem ser usados para encontrar sequências a montante ou ajusante dos marcadores específicos listados aqui. Estas novas sequências, próximas aos marcadores descritos aqui, são, então, usadas para que se encontre e desenvolva marcadores funcionalmente equivalentes. Por exemplo, mapas genéticos e/ou físicos diferentes são alinhagem dos para localizar marcadores equivalentes não descritos nesta descrição, mas que estão em regiões similares. Estes mapas podem estar incluídos na espécie de milho, ou mesmo em outras espécies que foram geneticamente ou fisicamente alinhagem das com milho, como arroz, trigo, cevada, ou sorgo.
[00115] Alinhamentos de sequência e cálculos de similaridades percentuais podem ser determinados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Alinhamentos múltiplos das sequências são executados com o uso do método de alinhamento Clustal (Higgins e Sharp, CABIOS 5:151 a 153 (1989)) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Os parâmetros padrão para Alinhamentos em pares e o cálculo da porcentagem de identidade de sequências de proteína com o uso do método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, estes parâmetros são GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10, KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Uma "porção substancial” de um aminoácido ou sequência de nucleotídeo compreende o suficiente da sequência de aminoácido de um polipeptídio ou da sequência de nucleotídeo de um gene para fornecer uma identificação aproximada daquele polipeptídio ou gene, ou por avaliação manual da sequência por um técnico no assunto, ou por comparação e identificação de sequência mecanizadas por computador com o uso de algoritmos como BLAST (Altschul, S. F. et a/., J. Mol. Biol. 215:403 a 410 (1993)) e Gapped Blast (Altschul, S. F. et ai, Nucleic Acids Res. 25:3389 a 3402 (1997)). Pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, contagem=100, comprimento de palavra=12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína das modalidades. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, contagem=50, comprimento de palavra=3, para obter sequências de aminoácido homólogas a uma proteína ou polipeptídio das modalidades. Para obter Alinhamentos espaçados para fins comparativos, o Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (in BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma busca reiterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) acima. Ao utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeo, BLASTX para proteínas) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.
[00116] Um "meio legível por computador” é um meio de armazenamento de informação que pode ser acessado por um computador com o uso de uma interface disponível ou customizada. Os exemplos incluem memória (por exemplo, ROM, RAM, ou memória flash), meio de armazenamento óptico (por exemplo, CD-ROM), meio de armazenamento magnético (disco rígido de computador, disquete, etc.), cartões perfurados e muitos outros que são comercialmente disponíveis. Informações podem ser transmitidas entre um sistema de interesse e o computador, ou de ou para o computador e o meio legível por computador para o armazenamento ou acesso das informações armazenadas. Esta transmissão pode ser uma transmissão elétrica, ou pode ser feita por outros métodos disponíveis, como uma ligação IR, uma conexão sem fio, ou similares.
[00117] "Instruções do sistema" são conjuntos de instruções que podem ser executadas parcialmente ou totalmente pelo sistema. Tipicamente, os conjuntos de instruções estão presentes como software de sistema.
Breve Descrição Das Figuras e da Listagem de Sequências [00118] A presente invenção pode ser mais bem compreendida a partir da descrição detalhada e dos desenhos acompanhantes e da Listagem de Sequência a seguir, que formam uma parte deste pedido. A Listagem de Sequência contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos, conforme definido em conformidade com os padrões da lUPAC-lUBMB descritos em Nucleic Acids Research 13:3021 a 3030 (1985) e em Biochemical Journal 219 (No. 2): 345 a 373 (1984), que estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Os símbolos e formato usados para os dados de sequência de aminoácidos e nucleotídeo cumprem as regras expostas em 37 C.F.R. § 1,822.
[00119] A Figura 1 mostra a localização final da QTL de GLS de PHJEP no mapa Neighbors IBM2 2004 do cromossomo 4. As distâncias estão em cM.
[00120] A Figura 2 mostra uma vista aproximada da QTL do GLS no mapa do cromossomo 4 Neighbors IBM2 2004 após a segunda rodada de mapeamento. Os marcadores em caixas foram usados na segunda rodada de mapeamento de QTL. A seta mostra a região de QTL depois da segunda rodada de mapeamento de QTL. As caixas preenchidas de preto mostram a localização final de QTL após um mapeamento fino.
[00121] A Figura 4A a F mostra a disposição do mapa físico de BACs sequenciados (obtidos a partir do Maize Genome Browser, que é disponível publicamente na internet; http://www.maizesequence.org) na região do cromossomo 4 que contém o QTL de GLS.
[00122] A Figura 5 mostra a introgressão o QTL de GLS em PHN46. Cinza-escuro indica a origem PH14T. Linhagens horizontais indicam origem PHN46. Linhagens diagonais indicam a região de recombinação, a localização para UMC1299 tirada a partir do mapa de quadros Neighbors IBM2 - em concordância com a localização de mapa físico.
[00123] A Figura 6 mostra os níveis de resistência à doença para GLS em PHN46 (esquerda), PH14T (meio) e PHJEP (direita).
[00124] A Figura 7 mostra os níveis de resistência à doença para GLS em A) um híbrido Pioneer com a introgressão de QTL, criado por um cruzamento entre endógamos PHP38 e PHJEP e em B) híbrido Pioneer 3394 sem introgressão de QTL.
[00125] A figura 8 mostra introgressão adicional da QTL de GLS nos materiais elite. Cinza-escuro indica origem PH14T. Linhagens horizontais indicam origem PHN46. Linhagens diagonais indicam a recombinação entre PHJEP e o novo germoplasma elite. Pontos indicam a recombinação entre PH14T e PHN46. Não sombreado indica o novo germoplasma elite PHVNV, PHEHG, PHW3Y, PHEWB ou PHWRC.
[00126] A Tabela A mostra a localização de mapa da QTL de GLS após o mapeamento fino.
[00127] A Tabela B fornece uma tabela que lista marcadores SSR e genômicos, incluindo aqueles marcadores que demonstraram desequilíbrio de ligação com o fenótipo de tolerância à GLS (diretamente ou por extrapolação a partir do mapa genético). A tabela fornece as sequências dos primer de PCR, da esquerda e direita, usados na análise de genotipagem de locus marcador SSR. Também se mostra o número de nucleotídeos em elementos repetitivos em tandem em SSR.
[00128] A Tabela C fornece uma tabela listando os marcadores SNP que demonstraram desequilíbrio de ligação com o fenótipo tolerante à GLS. A tabela fornece as sequências dos primer de PCR usados para gerar uma SNP-contendo amplicon.
[00129] As descrições de sequência e a Listagem de Sequência anexadas neste documento estão de acordo com as regras que governam as descrições de sequências de aminoácido e/ou nucleotídeo em pedidos de patente conforme apresentado em 37 C.F.R. §1,821 a 1,825. A Listagem de Sequência contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeo e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido em conformidade com os padrões da IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13:3021 a 3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (2):345 a 373 (1984) que estão aqui incorporados a título de referência. Os símbolos e formatos usados para dados de sequência de aminoácido e nucleotídeo estão de acordo com as regras apresentadas em 37 C.F.R. §1,822.
[00130] A SEQ ID NO:1 e a SEQ ID NO:2 são os primer projetados a amplificar a extremidade bacm2.pk027.h10.f de BAC.
[00131] A SEQ ID NO:3 e a SEQ ID NO:4 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm.pk098.d7 de BAC.
[00132] A SEQ ID NO:5 e a SEQ ID NO:6 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm.pk106.j3 de BAC.
[00133] A SEQ ID NO:7 e a SEQ ID NO:8 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm.pk018.h15 de BAC.
[00134] A SEQ ID NO:9 e a SEQ ID NO:10 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm.pk040.o17 de BAC. O par de primer representa um marcador CAPs referido aqui como PHM 00045.
[00135] A SEQ ID NO:11 e a SEQ ID NO:12 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm2.pk065.b22.f de BAC.
[00136] A SEQ ID NO:13 e a SEQ ID NO:14 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0333.o19 de BAC. O par de primer representa um marcador CAPs referido aqui como PHM 00043.
[00137] A SEQ ID NO:15 e a SEQ ID NO:16 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacc.pk0267.m12.f de BAC.
[00138] A SEQ ID NO:17 e a SEQ ID NO:18 são primer projetados para amplificar a sonda overgo EST cl33021_1.
[00139] A SEQ ID NO:19 e a SEQ ID NO:20 são os primer projetados para amplificara extremidade bacb.pk0241.h17.f de BAC.
[00140] A SEQ ID NO:21 e a SEQ ID NO:22 são os primer projetados para amplificar o clone chp2.pk0007.d2.
[00141] A SEQ ID NO:23 e a SEQ ID NO:24 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacc.pk0530.f13.f de BAC.
[00142] A SEQ ID NO:25 e a SEQ ID NO:26 são os primer projetados para clonar p0094.csstg88.
[00143] A SEQ ID NO:27 e a SEQ ID NO:28 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0269.n19 de BAC.
[00144] A SEQ ID NO:29 e a SEQ ID NO:30 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0009.b21 .f de BAC.
[00145] A SEQ ID NO:31 e a SEQ ID NO:32 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pkOI 17.i09.f de BAC.
[00146] A SEQ ID NO:33 e a SEQ ID NO:34 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacc.pk0280.n12 de BAC.
[00147] A SEQ ID NO:35 e a SEQ ID NO:36 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0219.j20 de BAC.
[00148] A SEQ ID NO:37 e a SEQ ID NO:38 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacc.pk0132.b16.f de BAC.
[00149] A SEQ ID NO:39 e a SEQ ID NO:40 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0221.o22 de BAC.
[00150] A SEQ ID NO:41 e a SEQ ID NO:42 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0544.j18 de BAC.
[00151] A SEQ ID NO:43 e a SEQ ID NO:44 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacb.pk0540.c18.f de BAC.
[00152] A SEQ ID NO:45 e a SEQ ID NO:46 são os primer projetados para amplificar a extremidade bacm.pk022.b8 de BAC. O par de primer representa um marcador CAPs referido aqui como PHM 00049.
[00153] A SEQ ID NO:47 e a SEQ ID NO:48 são os primer para o locus marcador PHM 7245.
[00154] A SEQ ID NO:49 é a sequência de nucleotídeo detalhada de um gene R putativo do tipo classificado como uma proteína quinase similar a LRR.
[00155] A SEQ ID NO:50 é a sequência de aminoácido da proteína codificada pela SEQ ID NO:49.
[00156] A SEQ ID NO:51 é a sequência do primer direto (forward primer) PHM 15534-13.
[00157] A SEQ ID NO:52 é a sequência do primer reverso (reverse primer) PHM 15534-13.
[00158] A SEQ ID NO:53 é a sequência da sonda 1 PHM 15534-13.
[00159] A SEQ ID NO:54 é a sequência da sonda 2 PHM 15534-13.
[00160] A SEQ ID NO:55 é a sequência da sequência de referência PHM 15534.
[00161] A SEQ ID NO:56 é a sequência do primer direto PHM 04694-10.
[00162] A SEQ ID NO:57 é a sequência do primer reverso PHM 04694-10.
[00163] A SEQ ID NO:58 é a sequência da sonda 1 PHM 04694- 10.
[00164] A SEQ ID NO:59 é a sequência da sonda 2 PHM 04694- 10.
[00165] A SEQ ID NO:60 é a sequência da sequência de referência PHM 04694-10.
[00166] A SEQ ID NO:61 é a sequência do primer direto PHM 01811 -32.
[00167] A SEQ ID NO:62 é a sequência do primer reverso PHM 01811 -32.
[00168] A SEQ ID NO:63 é a sequência da sonda 1 PHM 01811-32.
[00169] A SEQ ID NO:64 é a sequência da sonda PHM 01811-32.
[00170] A SEQ ID NO:65 é a sequência da sequência de referência PHM 01811 -32.
[00171] A SEQ ID NO:66 é a sequência do primer direto PHM 01963-15.
[00172] A SEQ ID NO:67 é a sequência do primer reverso PHM 01963-15.
[00173] A SEQ ID NO:68 é a sequência da sonda 1 PHM 01963-15.
[00174] A SEQ ID NO:69 é a sequência da sonda 2 PHM 01963-15.
[00175] A SEQ ID NO:70 é a sequência da sequência de referência PHM 01963-15.
[00176] A SEQ ID NO:71 é a sequência do primer direto PHM 01963-22.
[00177] A SEQ ID NO:72 é a sequência do primer reverso PHM 01963-22.
[00178] A SEQ ID NO:73 é a sequência da sonda 1 PHM 01963- 22.
[00179] A SEQ ID NO:74 é a sequência da sonda 2 PHM 01963- 22.
[00180] A SEQ ID NO:75 é a sequência da sequência de referência PHM 01963-22.
[00181] A SEQ ID NO:76 é a sequência do primer direto PHM 05013-12.
[00182] A SEQ ID NO:77 é a sequência do primer reverso PHM 05013-12.
[00183] A SEQ ID NO:78 é a sequência da sonda 1 PHM 05013- 12.
[00184] A SEQ ID NO:79 é a sequência da sonda 2 PHM 05013- 12.
[00185] A SEQ ID NO:80 é a sequência d sequência de referência PHM 05013-12.
[00186] A SEQ ID NO:81 é a sequência do primer direto PHM 00586-10.
[00187] A SEQ ID NO:82 é a sequência do primer reverso PHM 00586-10.
[00188] A SEQ ID NO:83 é a sequência da sonda 1 PHM 00586- 10.
[00189] A SEQ ID NO:84 é a sequência da sonda 2 PHM 00586- 10.
[00190] A SEQ ID NO:85 é a sequência da sequência de referência PHM 00586-10.
[00191] A SEQ ID NO:86 é a sequência do primer esquerdo para o marcador bnlg1755.
[00192] A SEQ ID NO:87 é a sequência do primer direito para o marcador bnlg1755.
[00193] A SEQ ID NO:88 é a sequência do primer esquerdo para o marcador umc156a.
[00194] A SEQ ID NO:89 é a sequência do primer direito para o marcador umc156a.
[00195] A SEQ ID NO:90 é a sequência do primer esquerdo para o marcador umc1142.
[00196] A SEQ ID NO:91 é a sequência do primer direito para o marcador umc1142.
[00197] A SEQ ID NO:92 é a sequência do primer esquerdo par ao marcador umc1346.
[00198] A SEQ ID NO:93 é a sequência do primer direito para o marcador umc1346.
[00199] A SEQ ID NO:94 é a sequência do primer esquerdo para o marcador umc1702.
[00200] A SEQ ID NO:95 é a sequência do primer direito para o marcador umc1702.
[00201] A SEQ ID NO:96 é a sequência do primer esquerdo para o marcador mmc0371.
[00202] A SEQ ID NO:97 é a sequência do primer direito para o marcador mmc0371.
[00203] A SEQ ID NO:98 é a sequência do primer esquerdo para o marcador bnlg 1621 a.
[00204] A SEQ ID NO:99 é a sequência do primer direito para o marcador bnlg 1621 a.
[00205] A SEQ ID NO: 100 é a sequência do primer esquerdo para o marcador umc1299.
[00206] A SEQ ID NO:101 é a sequência do primer direito para o marcador umc1299.
[00207] A SEQ ID NO:102 é a sequência da sequência de referência PHM 00045.
[00208] A SEQ ID NO:103 é a sequência da sequência de referência PHM 00049.
Descricão Detalhada oa Invenção [00209] A identificação e a seleção de plantas de milho que exibem tolerância à GLS com o uso de MAS pode fornecer uma abordagem efetiva e inofensiva ao meio ambiente para superar as perdas causadas por esta doença. A presente invenção fornece localizações de marcadores de milho que demonstram uma cossegregação com tolerância à GLS estatisticamente significativa. A detecção destas localizações ou localizações ligadas adicionais pode ser usada em programas de criação de milho assistidos por marcador para produzir plantas tolerantes, ou plantas com tolerância melhorada à GLS. Os marcadores SSR e SNP ligados identificados aqui são fornecidos abaixo e nas figuras. Estes marcadores incluem PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586 {Tabela C).
Tabela C - Marcadores SNP
[00210] Cada marcador do tipo SSR exibe uma pluralidade de alelos que podem ser visualizados como amplicons de PCR de tamanhos diferentes. Os primer de PCR que são usados para gerar os amplicons de marcador SSR são fornecidos na Tabela B. Os alelos de marcadores tipo SNP são determinados com o uso de um protocolo de hibridização de alelo específico, conforme conhecido no estado da técnica. Os primer de PCR usados para amplificar o domínio SNP são fornecidos na Tabela C.
Tabela B - Marcadores SSR
[00211] Conforme reconhecido no estado da técnica, qualquer outro marcador que esteja ligado a um marcador QTL (por exemplo, um marcador tolerante à doença) também é útil para o mesmo fim. Exemplos de marcadores adicionais que são ligados aos marcadores de tolerância à doença recitados aqui são fornecidos. Por exemplo, um marcador ligado pode ser determinado a partir dos marcadores proximamente ligados fornecidos na Tabela 3. Não se tem como intenção, entretanto, que os marcadores ligados úteis para a presente invenção sejam limitados àqueles recitados na Tabela 3.
[00212] A presente invenção também fornece intervalos de QTL cromossômícos que se correlacionam com tolerância à GLS. Estes intervalos estão localizados no grupo de ligação 4. Qualquer marcador localizado com estes intervalos é útil como marcadores para tolerância à GLS. Estes intervalos incluem: (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (ví) UMC156A e BNLG1621A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) ü MC 1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) U MC 1346 e UMC1702.
[00213] A presente invenção fornece, ainda, uma região de DNA contígua ligada e que inclui PHM 00043 (SEQ ID NO:102) e PHM 00049 (SEQ IO NO: 103), que abriga localizações de marcador que cossegregam com tolerância à GLS (Figura 4). Qualquer locus marcador dentro de um trecho contíguo de DNA entre e incluindo SEQ ID NO: 102, ou uma sequência de nucleotídeo que seja 95% idêntica à SEQ ID NO: 102 baseada no método Clustal V de alinhamento e SEQ ID NO: 103, ou uma sequência de nucleotídeo que seja 95% idêntica à SEQ ID NO:103 baseada no método Clustal V de alinhamento, pode ser útil como um marcador para tolerância à GLS.
[00214] Métodos para a identificação de plantas de milho ou germoplasma que carrega alelos de locus marcador de tolerância preferíveis são uma característica da presente invenção. Nestes métodos, qualquer um de uma variedade de protocolos de detecção de marcador pode ser usado para a identificação de alelos no locus marcador, dependendo do tipo de locus marcador. Métodos típicos para detecção incluem ASH, detecção de SSR, análise de RFLP e muitos outros.
[00215] Embora alelos marcadores particulares possam mostrar cossegregação com uma tolerância à doença ou fenótipo de susceptibilidade, é importante notar que o locus marcador não é necessariamente parte do locus da QTL responsável pela tolerância ou suscetibilidade. Por exemplo, não é uma exigência que a sequência de polinucleotídeo marcadora seja parte de um gene que transmita tolerância à doença (por exemplo, ser parte do quadro de leitura aberto do gene). A associação entre um alelo marcador específico com o fenótipo de tolerância ou susceptibilidade acontece devido à fase de ligação de “acoplamento” original entre o alelo marcador e o alelo de QTL de tolerância ou susceptibilidade na linhagem de milho ancestral a partir da qual o alelo de tolerância ou suscetibilidade originou. Em algum momento, com recombinação repetida, eventos de permutação entre o marcador e o locus QTL podem mudar essa orientação. Por esta razão, o alelo marcador favorável pode mudar dependendo da fase de ligação que existe no pai tolerante usado para criar populações segregadas. Isso não muda o fato de que o marcador genético pode ser usado para monitorar a segregação do fenótipo. Muda apenas qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população segregada.
[00216] A identificação de plantas de milho ou germoplasma que contenha alelos marcadores associados com a tolerância melhorada fornece uma base para executar a seleção de milho assistida por marcador. Plantas de milho que compreendem alelos marcadores favoráveis são selecionadas para esta característica, enquanto plantas de milho que compreendem alelos marcadores que são negativamente correlacionados com tolerância podem ser selecionadas contra a mesma. Alelos marcadores desejados podem ser introgredidos no milho que tem um fundo genético desejado (por exemplo, elite ou exótico} para produzir uma planta de milho ou germoplasma introgredido tolerante. Em alguns aspectos, contempla-se que uma pluralidade de marcadores de alelos marcadores de tolerância são sequencial ou simultaneamente selecionados e/ou introgredidos. As combinações de marcadores de tolerância que podem ser usadas para selecionar para tolerância em uma única pianta não são limitadas e podem incluir a combinação de marcadores recitados na Tabela A, quaisquer marcadores ligados aos marcadores recitados na Tabela A, ou quaisquer marcadores localizados nos intervalos de QTL definidos aqui.
Tabela A - Localização de Mapa de QTL de GLS
[00217] Como alternativa aos métodos de criação padrões de introduzir as trações de interesse no milho (por exemplo, introgressão), abordagens transgênicas também podem ser usadas. Nestes métodos, ácidos nucleicos exógenos que controlam as características de interesse, por exemplo, tolerância à doença, podem ser introduzidos em plantas alvo ou germoplasma. A verificação de tolerância pode ser executada por protocolos de tolerância disponíveis (conforme descrito, por exemplo, acima). Ensaios de tolerância são úteis para verificar se a característica de tolerância ainda segrega com o marcador em alguma planta ou população particular, e, é claro, para medir o grau de melhora de tolerância alcançado pela introgressão ou introdução transgênica da característica em um fundo desejado. Uma planta que compreende alelos favoráveis de uma QTL de mancha foliar cinzenta pode ter um ganho de tolerância de pelo menos 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, ou 1,7 pontos maior, em uma escala de um a nove, quando comparado a uma planta quase isogênica que não compreende os alelos favoráveis da QTL de mancha foliar cinzenta. Em um sistema de avaliação visual de 1 a 9, uma pontuação mais alta indica uma resistência maior. Os dados devem ser coletados apenas quando pressão de seleção o suficiente existir na experiência medida.
[00218] Sistemas, incluindo sistemas mecanizados para selecionar as plantas que compreendem um marcador de interesse e/ou para correlacionar a presença do marcador com tolerância também são uma característica da presente invenção. Estes sistemas podem incluir sondas relevantes para a detecção de locus marcador, detectores para detectar etiquetas nas sondas, elementos de tratamento de fluido apropriados e controladores de temperatura que misturam sondas e molde e/ou molde de amplificação e instruções de sistemas que correlacionam a detecção de etiqueta à presença de um alelo ou locus marcador particular.
[00219] Os kits também são uma característica da presente invenção. Por exemplo, um kit pode incluir primer apropriados ou sondas para a detecção de localizações de marcadores associados à tolerância e instruções sobre o uso de primer ou sondas para a detecção de localizações de marcador e correlacionar as localizações com tolerância à GLS previsível. Os kits também podem incluir materiais empacotamento para empacotar as sondas, os primer ou instruções, os controles, como reações de amplificação de controle que incluem sondas, primer ou ácidos nucleicos molde para amplificações, marcadores de tamanho molecular, ou similares.
Marcadores de Tolerância e Alelos Favoráveis [00220] Em análise de ligação tradicional, nenhum conhecimento direto acerca da relação física de genes em um cromossomo é exigido. A primeira lei de Mendel é que fatores de pares de caracteres são segregados, o que significa que os alelos de uma característica diploide separado em dois gametas e então em descendentes diferentes. Pode-se ver a análise de ligação clássica como uma descrição estatística das frequências relativas da cossegregação de características diferentes. A análise de ligação é a estrutura descritiva bem caracterizada de como as características são agrupadas juntas com base na frequência com a qual eles segregam juntos. Isto é, se dois características não alélicos são herdados juntamente com uma frequência maior que aleatória, diz-se que estão “ligados”. A frequência com a qual as características são herdadas juntas é a medida primária do quão fortemente as características são ligadas, isto é, as características que são herdadas juntas com uma frequência mais alta são mais fortemente ligadas do que características que são herdadas juntas com uma frequência mais baixa (mais ainda acima de aleatória). As características são ligadas porque os genes que caracterizam as características residem no mesmo cromossomo. Quanto mais longe um do outro no cromossomo os genes residirem, é menos provável que eles segreguem juntos, porque cromossomos homólogos recombinam durante a meiose. Portanto, quanto mais longe um do outro em um cromossomo residirem os genes, é mais provável que haja um evento de permutação durante a meiose que irá resultar em dois genes segregando separadamente em progênie.
[00221] Uma medida comum de ligação é a frequência com a qual as características cossegregam. Isto pode ser expresso como uma porcentagem de cossegregação (frequência de recombinação) ou, também comumente, em centiMorgans (cM). O cM é nomeado em homenagem ao geneticista pioneiro Thomas Hunt Morgan e é uma unidade de medida de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a uma probabilidade de 1% que uma característica em um locus genético será separada de uma característica em outro locus devido à permutação em apenas uma geração (o que significa que as características segregam juntos em 99% do tempo). Porque a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à frequência de eventos de permutação entre características, existe uma distância física aproximada que correlaciona com a frequência de recombinação.
[00222] Localizações de marcadores são, em si, características e podem ser avaliados de acordo com a análise de ligação padrão ao rastrear o locus marcador durante a segregação. Portanto, no contexto da presente invenção, um cM é igual a uma probabilidade de 1 % que o locus marcador será separado de outro locus (que pode ser de qualquer outra característica, por exemplo, outro locus marcador que codifique uma QTL), devido à permutação em uma única geração. Os marcadores aqui inclusos, conforme vistos na Tabela A, por exemplo, PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586, assim como qualquer um dos intervalos de cromossomo (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702, correlacionam com tolerância recém-conferida, tolerância melhorada, ou susceptibilidade à GLS em milho. Isto significa que os marcadores estão suficientemente proximamente ligados a uma característica de tolerância de modo que eles possam ser usados como estimadores para a característica de tolerância. Isto é extremamente útil no contexto de seleção assistida por marcador (MAS), discutida mais detalhadamente aqui. Resumindo, plantas de milho ou germoplasma podem ser selecionadas para alelos marcadores que correlacionam positivamente com tolerância, sem de fato produzir milho e medir a tolerância recém-conferida ou tolerância melhorada (ou, ao contrário, plantas de milho podem ser selecionadas contra se elas possuem marcadores que correlacionam negativamente com tolerância recém-conferida ou tolerância melhorada). A MAS é um atalho poderoso para selecionar fenótipos desejados e para introgredir características desejadas em culturas de milho (por exemplo, introgredir características desejadas em linhagens elite). A MAS é facilmente adaptada a métodos de análise molecular de alto rendimento que podem rapidamente realizar triagens em grandes quantidades de material genético ou germoplasma de planta para os marcadores de interesse e tem um melhor custo-benefício do que produzir e observar plantas à procura de características visíveis.
[00223] Em algumas modalidades, os marcadores de QTL são um subconjunto dos marcadores fornecidos na Tabela A, por exemplo, os marcadores designados para bacb.pk0333.o19 (por exemplo, PHM 00043), bacc.pk0267.ini 2.f, cl33021_1, bacb.pk0241.h17.f, chp2.pk0007.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb.pk0009.b21 .f, bacb.pk0117.iO9.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc.pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.b8 (por exemplo, PHM 00049).
[00224] Quando se refere à relação entre dois elementos genéticos, como um elemento genético que contribui para a tolerância e um marcador proximamente ligado, a ligação da fase do "acoplamento" indica o estado em que o alelo "favorável" em um locus de tolerância está associado fisicamente no mesmo filamento de cromossomo que o alelo “favorável” do respectivo locus marcador ligado. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados juntos por progenia que herda aquele filamento de cromossomo. Na ligação da fase "repulsão", o alelo "favorável" no locus de interesse (por exemplo, uma QTL para tolerância) é fisicamente ligado com um alelo "desfavorável" no locus marcador proximamente ligado e os dois alelos "favoráveis" não são herdados juntos (isto é, as duas localizações estão "fora de fase" uma com a outra).
[00225] Um alelo favorável de um marcador é o alelo do marcador que cossegrega com um fenótipo desejado (por exemplo, tolerância à doença). Conforme usado aqui, uma QTL de marcador tem um mínimo de um alelo favorável, apesar de ser possível que o marcador possa ter dois ou mais alelos encontrados na população. Qualquer alelo favorável daquele marcador pode ser usado vantajosamente para a identificação e construção de linhagens de milho tolerantes. Opcionalmente, um, dois, três ou mais alelo(s) favorável(is) de marcadores diferentes são identificados em, ou introgredidos em uma planta e podem ser selecionados para ou contra durante MAS. Desejavelmente, plantas ou germoplasma são identificados que têm pelo menos o tal alelo favorável que correlaciona positivamente com tolerância recém-conferida ou melhorada.
[00226] Alternativamente, um alelo marcador que é associado com suscetibilidade à doença também é útil para a presente invenção, uma vez que este alelo pode ser usado para identificar e contra-selecionar plantas suscetíveis à doença. Tal alelo pode ser usado para fins exclusivos durante a criação para identificar plantas ou germoplasma que têm alelos que correlacionam negativamente com tolerância, para eliminar plantas ou germoplasma suscetíveis de rodadas de criação subsequentes.
[00227] Em algumas modalidades da presente invenção, uma pluralidade de alelos marcadores é simultaneamente selecionada positivamente em uma única planta ou uma população de plantas. Nestes métodos, as plantas que são selecionadas contêm alelos favoráveis à tolerância à GLS, ou os alelos favoráveis à tolerância à GLS são introgredidos em um germoplasma de milho desejado. O técnico no assunto reconhece que é provável que a seleção simultânea de alelos favoráveis à tolerância à GLS na mesma planta tem resulte em um efeito protetor aditivo (ou até sinergético) para a planta.
[00228] O técnico no assunto reconhece que, em alguns casos, a identificação de alelos marcadores favoráveis é específica ao germoplasma. A determinação de que alelos marcadores correlacionam com tolerância (ou suscetibilidade) é determinada para o germoplasma particular sob estudo. O técnico no assunto reconhece que métodos para a identificação de alelos favoráveis são rotineiros e bem de conhecimento geral no estado da técnica e, além disso, que a identificação e uso de tais alelos favoráveis está dentro do escopo da presente invenção. Mais adicionalmente, a identificação de alelos marcadores favoráveis em populações de milho que não sejam as populações usadas ou descritas aqui está dentro do escopo da presente invenção.
[00229] Primer de amplificação para amplificar as localizações de marcadores do tipo SSR são uma característica da presente invenção. Outra característica da presente invenção são primer específicos para a Amplificação de domínios SNP (marcadores SNP) e as sondas que são usadas para a genotipagem das sequências SNP. As Tabelas B e C fornecem primer específicos para a amplificação de locus marcador e sondas para a detecção de localizações de marcador amplificadas. Entretanto, o técnico no assunto irá imediatamente reconhecer que outras sequências para qualquer um dos lados dos dados primer podem ser usadas no lugar dos dados primer, contanto que os primer possam amplificar uma região que inclui o alelo a ser detectado. Além disso, será apreciado que a sonda precisa a ser usada para a detecção pode variar, por exemplo, qualquer sonda que possa identificar a região de um amplicon marcador a ser detectada pode ser substituído por aqueles exemplos fornecidos aqui. Além disso, a configuração dos primer de amplificação e das sondas de detecção pode, é claro, variar. Portanto, a presente invenção não é limitada aos primer e às sondas especificamente recitadas aqui.
[00230] Em alguns aspectos, os métodos da presente invenção utilizam uma etapa de amplificação para detectar/genotipar o locus marcador. Entretanto, será apreciado que a amplificação não seja uma exigência para a detecção do marcador - por exemplo, um indivíduo pode detectar diretamente DNA genômico não amplificado simplesmente por executar um Southern blot em uma amostra de DNA genômico. Procedimentos para executar os métodos de Southern blot, a amplificação (PCR, LCR, ou similares) e muitos outros métodos de detecção de ácido nucleico são bem estabelecidos e são ensinados, por exemplo, em Sambrook et ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2000 ("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et ai., eds., Current Protocols, uma iniciativa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementos até 2002) ("Ausubel") e PCR Protocols A Guide to Methods e Applications (Innis et ai. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"). Detalhes adicionais a respeito da detecção de ácidos nucleicos em plantas também podem ser encontrados, por exemplo, em Plant Molecular Biology (1993) Cray (ed.) BIOS Scientific Publishers, Inc. ("Cray").
[00231] Sondas separadas também podem ser omitidas em métodos de amplificação/detecção, por exemplo, ao executar uma reação de amplificação em tempo real que detecta a formação de produto por modificação do primer de amplificação relevante mediante a incorporação em um produto, incorporação de nucleotídeos etiquetados em um amplicon, ou pelo monitoramento de mudanças em propriedades de rotação molecular de amplicons se comparado a precursores não amplificados (por exemplo, por polarização de fluorescência).
[00232] Tipicamente, marcadores moleculares são detectados por qualquer método estabelecido disponível no estado da técnica, incluindo, sem limitação, hibridização de alelo específico (ASH) ou outros métodos para a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP), detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), detecção de sequência de variável amplificada, detecção de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de replicação de sequência auto sustentada, detecção de repetição de sequência simples (SSR), detecção de polimorfismos de conformação de fita único (SSCP), detecção de sequências polimórficas amplificadas partidas (CAPS), detecção de marcadores de isozima, ou similares. Enquanto os marcadores exemplificadores fornecidos nas figuras e tabelas aqui são marcadores SSR ou SNP (ASH), qualquer um dos tipos de marcador supramencionados pode ser empregado no contexto da presente invenção para identificar segmentos de cromossomo que abrangem o elemento genético que contribui para um desempenho agronômico superior {por exemplo, tolerância recém-conferida ou tolerância melhorada).
Intervalos pe QTL pe Cromossomo [00233] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece intervalos de QTL de cromossomo, onde uma ou mais QTL associada com tolerância à GLS são contidas nestes intervalos. Uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica está disponível para a identificação de intervalos de cromossomo (descritos detalhadamente nos Exemplos abaixo), Qs limites de tais intervalos de cromossomo são delineados para incluir marcadores que serão ligados um ao outro ou mais QTL. Em outras palavras, o intervalo de cromossomo é delineado de modo que qualquer marcador que esteja naquele intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem os limites do intervalo) pode ser usado como um marcador para a tolerância à doença. Cada intervalo compreende uma um QTL de GLS e, além disso, pode, de fato, compreender mais do que uma QTL, Grande proximidade de múltiplas QTL no mesmo intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador particular com uma QTL particular, assim como um marcador pode demonstrar ligação a mais de uma QTL, Inversamente, por exemplo, se dois marcadores com grande proximidade mostram cossegregação com a característica fenotípica desejada, não fica ciara, às vezes, se cada um daqueles marcadores identifica a mesma QTL ou duas QTL diferentes, [00234] A presente invenção fornece intervalos de cromossomo de milho, em que os marcadores naquele intervalo demonstram cossegregação com tolerância à GLS (ver Tabela 1), Tabela 1 [00235] Cada um dos intervalos descritos acima contém um agrupamento de marcadores que podem cossegregar com tolerância à GLS. Este agrupamento de marcadores ocorre em domínios relativamente pequenos no cromossomo e pode ser ligado a uma ou mais QTL naquelas regiões de cromossomo. Os intervalos de QTL foram delineados para incluir os marcadores que cosseg regam com tolerância. Os intervalos são definidos pelos marcadores em seus términos, onde o intervalo inclui todos os marcadores que mapeiam no intervalo assim como os marcadores que definem o término, [00236] Em alguns casos, um intervalo pode ser definido por ligação a um marcador preferido. Por exemplo, um intervalo no cromossomo 4 é definido por qualquer marcador que seja ligado ao marcador PHM 01811 em certa distância, fazendo referência a qualquer mapa de ligação genética adequada. Por exemplo, como usado aqui, a ligação é definida como qualquer marcador que esteja em 25 cM do PHM 01811, conforme definido pelo mapa de quadros Neighbors IBM2 2004 encontrado no site da Internet MaizeGDB. Este intervalo no cromossomo 4 é ainda mais ilustrado na Tabela 3. Estes marcadores são mostrados em ordem genética. Cada um dos marcadores listados, incluindo os marcadores de terminal BNLG1755 e UMC1299, são membros do intervalo. Os marcadores BNLG1755 e UMC1299 são conhecidos no estado da técnica.
[00237] Conforme descrito acima, um intervalo (por exemplo, um intervalo de cromossomo ou um intervalo de QTL) não precisa depender de uma medida absoluta de tamanho de intervalo como um valor de centimorgan. Um intervalo pode ser descrito pelos marcadores terminais que definem os pontos finais do intervalo e tipicamente o intervalo irá incluir os marcadores terminais que definem a extensão do intervalo. Por exemplo, o mapa físico na Figura 4 descreve a região física do cromossomo delimitado por e incluindo PHM 00045 e PHM 00049. Um intervalo pode incluir qualquer marcador localizado no domínio daquele cromossomo, se estes marcadores são atualmente conhecidos ou desconhecidos. A presente invenção fornece uma variedade de meios para que se defina um intervalo de cromossomo, por exemplo, nas listas de marcadores ligados da Tabela 3 e em referências citadas aqui.
Mapas Genéticos [00238] Conforme o técnico no assunto irá reconhecer, as frequências de recombinação (e, como consequência, posições de mapa genético) em qualquer população particular não são estáticas. As distâncias genéticas que separam dois marcadores (ou um marcador e uma QTL) podem variar dependendo de como as posições de mapa são determinadas. Variáveis como os pais selecionados, as populações de mapeamento usadas, o software usado no mapeamento de marcador ou mapeamento de QTL e os parâmetros fornecidos pelo usuário do software de mapeamento podem contribuir com as relações do mapa genético de marcador/QTL Por exemplo, distâncias cM podem variar enormemente dependendo do número de ciclos de recombinação usados para criar a população de mapeamento (por exemplo, IBM2 = oito ciclos de recombinação, enquanto BC1 aqui é um ciclo de recombinação; portanto, as distâncias IBM2 de 5 cM são diferentes das distâncias BC 1 de 5 cM). Entretanto, não é intenção que a presente invenção seja limitada a qualquer população de mapeamento particular, ao uso de qualquer software particular, ou qualquer conjunto particular de parâmetros de software para determinar a ligação de um marcador particular ou intervalo de cromossomo com o fenótipo de tolerância à GLS. Está na habilidade de um técnico no assunto extrapolar as novas características descritas aqui para qualquer mistura de gene de milho ou população de interesse, com o uso de qualquer software particular e parâmetros de software. De fato, observações a respeito de marcadores de tolerância e intervalos de cromossomo em populações além das descritas aqui são prontamente feitas com o uso dos ensinamentos da presente revelação.
Software de Mapeamento [00239] Uma variedade de software comercial está disponível para mapeamento genético e estudos de associação de marcador (por exemplo, mapeamento de QTL). Este software inclui, mas não limitado ao software listado na Tabela 2.
Tabela 2 Mapas Genéticos Unificados [00240] Mapas genéticos '‘unificados", "consenso", ou "integrado" foram criados que incorporam dados de mapeamento de duas ou mais fontes, incluindo fontes que usaram populações de mapeamento diferentes e modos de análise estatística diferentes. A fundição de informações de mapa genético aumenta a densidade de marcador no mapa. Estes mapas melhorados podem ser vantajosamente usados em seleção assistida por marcador e clonagem à base de mapa e fornece uma estrutura melhorada para posicionar marcadores moleculares recém-identificados. Os mapas melhorados também auxiliam na identificação de intervalos de QTL de cromossomo e grupos de marcadores ligados vantajosa mente.
[00241] Em alguns aspectos, um mapa consenso é derivado ao simplesmente sobrepor um mapa em cima de outro. Em outros aspectos, vários algoritmos, por exemplo, análise JoinMap®, permitem a combinação de dados de mapeamento genético a partir de fontes múltiplas e reconciliam discrepâncias entre dados de mapeamento e as fontes originais. Consultar, Van Ooijen e Voorrips (2001) "JoinMap 3.0 software for the calculation of genetic linkage maps", Plant Research International, Wageningen, Países Baixos; Stam (1993) "Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new Computer package: JoinMap", The Plant Journal 3(5):739 a 744.
Marcadores Ligados [00242] A partir da presente revelação e amplamente reconhecido no estado da técnica, está claro que qualquer marcador genético que tenha uma probabilidade significativa de cossegregação com uma característica fenotípica de interesse (por exemplo, no presente caso, uma característica de tolerância recém-conferida ou tolerância melhorada) pode ser usado como um marcador para aquela característica. Uma lista de marcadores de QTL úteis fornecidos pela presente invenção é fornecida na Tabela A.
[00243] Além dos marcadores de QTL indicados na Tabela A, marcadores adicionais ligados aos (mostrando desequilíbrio de ligação com) marcadores de QTL também podem ser usados para prever a característica de tolerância recém-conferida ou de tolerância melhorada em uma planta de milho. Em outras palavras, qualquer outro marcador que mostra menos de 50% de frequência de recombinação (separado por uma distância genética de menos de 50 cM) com um marcador de QTL da presente invenção (por exemplo, os marcadores fornecidos na Tabela A) também é uma característica da presente invenção. Qualquer outro marcador que seja ligado a um marcador de QTL também pode ser usado vantajosamente na seleção assistida por marcador para a característica particular.
[00244] Marcadores genéticos que são ligados à QTL (por exemplo, marcadores de QTL fornecidos na Tabela A) são particularmente úteis quando eles estão suficientemente proximamente ligados a uma dada QTL que eles exibem uma baixa frequência de recombinação. Na presente invenção, tais marcadores proximamente ligados são uma característica da presente invenção. Conforme definido aqui, marcadores proximamente ligados exibem uma frequência de recombinação de cerca de 10% ou menos (o dado marcador está dentro da faixa de 10 cM da QTL). Ou seja, estas localizações proximamente ligadas cossegregam em pelo menos 90% do tempo. De fato, quanto mais próximo um marcador está de um marcador de QTL, mais efetivo e vantajoso esse marcador se toma como um indicador para a característica desejada.
[00245] Portanto, em outras modalidades, localizações proximamente ligadas como o locus marcador de QTL e um segundo locus exibem uma frequência de permutação de interlocus de cerca de 10% ou menos, preferivelmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 8% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 7% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 6% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 5% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 4% ou menos, ainda mais preferivelmente, cerca de 3% ou menos e ainda mais preferivelmente, cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferíveis, as localizações relevantes (por exemplo, um locus marcador e um locus alvo como uma QTL) exibem uma recombinação uma frequência de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferivelmente, cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferivelmente, cerca de 0,25% ou menos. Portanto, as localizações são cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos separadas. Ou seja, diz-se que duas localizações que estão localizadas no mesmo cromossomo e em tal distância que a recombínação entre as duas localizações ocorrem em uma frequência de menos de 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos) proximamente ligadas uma à outra.
[00246] Em alguns aspectos, marcadores ligados (incluindo marcadores proximamente ligados) da presente invenção são determinados pela revisão de um mapa genético, por exemplo, os mapas genéticos integrados encontrados no site da Internet MaizeGDB. Por exemplo, é mostrado aqui que os marcadores do grupo de ligação 4 PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586; e os marcadores designados a bacb.pk0333.o19 (PHM 00043), bacc.pk0267.m12.f, cl33021_1, bacb.pk0241.h17f, chp2.pk0007.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb. pk0009.b21 .f, bacb,pk0117,iO9.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc. pk0132,b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.bS (PHM 00049) correlacionam com pelo menos um GTL de tolerância à GLS. Os marcadores que são ligados aos marcadores supra mencionados podem ser determinados, por exemplo, a partir da Tabela 3. Tabela 3: Marcadores Dentro de 25 cM de PHM 01811 em Mapa Neighbors IBM2 2004 [00247] Similarmente, os marcadores ligados (incluindo os marcadores ligados de forma próxima) da presente invenção podem ser determinados pelo estudo de qualquer mapa genético de milho adequado. Por exemplo, os mapas genéticos integrados podem ser encontrados no site de recurso MaizeGDB, [00248] A intenção não é que a determinação de marcadores ligados ou ligados de forma próxima seja limitada para o uso de qualquer mapa genético de milho particular. Realmente, um número grande de mapas genético de milho está disponível e são conhecidos dos técnicos no assunto. Alternativamente, a determinação de marcadores ligados e ligados de forma próxima pode ser realizada através da geração de um conjunto de dados experimental e de análise de ligação.
[00249] Também não é tencionado que a identificação de marcadores que são ligados (por exemplo, dentro de cerca de 50 cM ou dentro de cerca de 10 cM) aos marcadores QTL com tolerância GLS identificados na presente invenção seja limitada a qualquer metodologia ou mapa em particular. Os mapas genéticos integrados fornecidos pelo site MaizeGDB servem apenas como exemplo para a identificação de marcadores ligados. Realmente, os marcadores ligados, conforme definido na presente invenção, podem ser determinados a partir de qualquer mapa genético conhecido no estado da técnica (um mapa experimental ou um mapa integrado) ou, alternativamente, podem ser determinados a partir de qualquer conjunto de dados de mapeamento novo.
[00250] Nota-se que as listas de marcadores ligados e ligados de forma próxima podem variar entre mapas e metodologias devido a diversos fatores. Primeiramente, os marcadores que são dispostos em qualquer um dos mapas podem não ser idênticos e, além disto, alguns mapas podem ter uma densidade de marcador maior do que a de outro mapa. Ainda, as populações, metodologias e algoritmos de mapeamento usados na construção de mapas genéticos podem ser diferentes. Um técnico no assunto reconhece que um mapa genético não é necessariamente mais ou menos preciso do que outro e, além disso, reconhece que qualquer mapa genético de milho pode ser usado para determinar marcadores que são ligados e ligados de forma próxima aos marcadores QTL da presente invenção.
TÉCNICASPARAâDíTECÇÃODEMARCADORES
[00251] A presente invenção fornece marcadores moleculares que têm uma probabilidade significativa de cossegregação com QTL que transmitem um fenótipo com tolerância GLS, Esses marcadores QTL são úteis na seleção assistida por marcadores para características desejadas (tolerância melhorada ou tolerância conferida recentemente) e também têm outros usos. A intenção não é que a presente invenção seja limitada em qualquer método particular para a detecção desses marcadores.
[00252] Os marcadores que correspondem a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por diversos métodos estabelecidos no estado da técnica (por exemplo, Amplificação especifica de sequência baseada em PCR, polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição (RFLPs), marcadores de isozima, hibridização de alelo específico (ASH), sequências variáveis ampliadas do genoma da planta, réplica de sequência auto-sustentável, repetição de sequência simples (SSR), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), D NA polimórfico aleatório ampliado ("RAPD"), sequências polimórficas ampliadas clivadas (CAPS) ou polimorfismos de comprimento do fragmento ampliado (AFLP)). Em uma modalidade adicional, a presença ou falta de um marcador molecular é determinada simplesmente através do sequenciamento do nucleotídeo da região do marcador polimórfica. Esse método é pronta mente adaptado a análise de rendimento alto, assim como são os outros métodos apontados acima, por exemplo, com o uso de métodos de sequencíamento de resultados altos disponíveis, como sequenciamento por hibridização.
[00253] Em geral, a maioria dos marcadores genéticos conta com uma ou mais propriedades de ácidos nucleicos para a detecção deles. Por exemplo, algumas técnicas de detecção de marcadores genéticos utilizam a hibridização de um ácido nucleico de sonda em ácidos nucleicos que correspondem ao marcador genético (por exemplo, ácidos nucleicos ampliados produzidos com o uso de DNA de milho genômico como um molde). Os formatos de hibridização que incluem, mas não se limitam a, fase de solução, fase sólida, fase misturada ou ensaios de hibridização in situ, são úteis para a detecção de alelo. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier, Nova York; assim como em Sambrook and Ausubel (na presente invenção); e Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger").
[00254] Por exemplo, os marcadores que compreendem polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição (RFLP) são detectados, por exemplo, através da hibridização de uma sonda, que é tipicamente um sub-fragmento (ou um oligonucleotídeo sintético ou correspondente a um sub-fragmento) do ácido nucleico que será detectado por DNA genômico digerido por restrição. A enzima de restrição é selecionada para proporcionar fragmentos de restrição de pelo menos dois comprimentos alternativos (ou polimórficos) em populações ou pessoas diferentes. A determinação de uma ou mais enzimas de restrição que produzem fragmentos informativos para cada cruzamento é um procedimento simples, conhecido no estado da técnica. Após a separação por comprimento em uma matriz apropriada (por exemplo, agarose ou poliacrimalida) e a transferência para uma membrana (por exemplo, nitrocelulose, nylon, etc.), a sonda etiquetada é hibridizada sob condições que resultam em ligação em equilíbrio da sonda no alvo seguido da remoção do excesso da sonda por lavagem.
[00255] As sondas de ácido nucleico nos locais do marcador podem ser clonadas e/ou sintetizados. Qualquer etiquetamento adequado pode ser usado em uma sonda da presente invenção. As etiquetas detectáveis adequadas para o uso com sondas de ácido nucleico incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos. Etiquetas úteis incluem biotina para colorir com conjugado de estreptavidina etiquetado, esferas magnéticas, corantes fluorescentes, etiquetados por rádio, enzimas e etiquetas colorimétricas. Outras etiquetas incluem ligantes que se ligam a anticorpos etiquetados com fluoroforos, agentes quimiluminiscentes e enzimas. Uma sonda pode, também, constituir primer de PCR etiquetados por rádio que são usados na geração de um amplicon etiquetado por rádio. Estratégias de etiquetamento para a etiquetação de ácidos nucleicos e estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition by Molecular Probes, Inc. (Eugene OR); ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eighth Edition by Molecular Probes, Inc. (Eugene OR) (disponível em CD ROM). Métodos de Detecção com Base em Amplificação [00256] PCR, RT-PCR e LCR são, particularmente, usados amplamente como amplificação e métodos para a detecção de amplificação a fim de ampliar ácidos nucleicos de interesse (por exemplo, aqueles que compreendem os locais do marcador), facilitando a detecção dos marcadores. Os detalhes com respeito ao uso desses e de outros métodos de amplificação podem ser encontrados em qualquer um dentre diversos textos padrões, incluindo, por exemplo, Sambrook, Ausubel, Berger e Cray, na presente invenção. Muitos textos de biologia disponíveis também têm discussões maiores em relação a PCR e métodos de amplificação relacionados. Um técnico no assunto apreciará que, essencialmente, qualquer RNA pode ser convertido em um DNA de cadeia dupla adequado para a digestão por restrição, sequenciamento e expansão de PCR com o uso de transcriptase reversa e uma polimerase ("PCR de transcrição reversa ou "RT-PCR"). Consulte também, Ausubel, Sambrook e Berger, acima.
Amplificação/Métodos de Detecção em Tempo Real [00257] Em um aspecto, o LCR ou PCR em tempo real é executado nas misturas de Amplificação descritas na presente invenção, por exemplo, com o uso de sinais moleculares ou sondas de TaqMan™. Um sinal molecular (MB) é um oligonucleotídeo ou PNA que, sob condições de hibridização apropriadas, se híbridiza para a formação de uma estrutura em grampo de cabelo. O MB tem uma etiqueta e um diminuidor de fluorescência nos términos do oligonucleotídeo ou PNA; desse modo, sob condições que permitem a hibridização intra-molecular, a etiqueta tem, tipicamente, a fluorescência diminuída (ou pelo menos alterada) pelo diminuidor de fluorescência. Sob condições onde o MB não apresenta a hibridização intra-molecular {por exemplo, quando atado a um ácido nucleico alvo, por exemplo, a uma região de um amplicon durante a Amplificação), a etiqueta de MB tem o processo de diminuição de fluorescência revertido. Os detalhes em relação aos métodos padrões de produção e uso de MBs são bem estabelecidos na literatura e MBs estão disponíveis a partir de uma quantidade de fontes reagentes comerciais. Consulte também, por exemplo, Leone et al. (1995) "Sinal molecular probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-tíme detection of RN A", Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Tyagi e Kramer (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14:303-308; Blok and Kramer (1997) "Amplifiable hybrídization probes containing a molecular switch" Mol Cell Probes 11:187- 194; Hsuih et a/. (1997) "Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum" J Clin Microbiol 34:501 -507; Kostrikis ef al. (1998) "Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles" Science 279:1228- 1229; Sokol ef al. (1998) "Real time detection of DNA:RNA hybridization in living cells" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 95:11538-11543; Tyagi et al. (1998) "Multicolor molecular beacons for allele discrimination" Nature Biotechnology 16:49-53; Bonnet et al. (1999) "Thermodynamic basis of the Chemical specificity of struetured DNA probes" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 96:6171 - 6176; Fang et al. (1999) "Designing a novel sinal molecular for surface- immobilized DNA hibridização studies" J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922; Marras et al. (1999) "Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons" Genet. Anal. Biomol. Eng. 14:151 -156; and Vet et al. (1999) "Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 96:6394-6399. Detalhes adicionais em relação à construção e uso de MB são encontrados na literatura de patente, por exemplo, Patente de número U.S. 5.925.517, 6.150,097 e 6.037.130.
[00258] A detecção e quantificação de PCR com o uso de sondas de oligonucleotídeo fluorogênicos com duas etiquetas, comumente chamados de sondas de "TaqMan™”, pode ser executada, também, de acordo com a presente invenção. Essas sondas são compostas por (por exemplo, base 20 a 25) oligodeoxinucleotídeos curtos que são etiquetados com dois corantes fluorescentes diferentes. No término 5' de cada sonda está um corante repórter e no término 3’ de cada sonda, um corante diminuidor de fluorescência é encontrado. A sequência de sonda de oligonucleotídeo é complementar a uma sequência alvo interna presente em um amplicon de PCR. Quando a sonda está intacta, a transferência de energia ocorre entre os dois fluoroforos e a emissão a partir do repórter tem a fluorescência diminuída pelo diminuidor de fluorescência por FRET. Durante a fase de extensão de PCR, a sonda é clivada pela atividade de nuclease 5’ da polimerase usada na reação, liberando através desse o repórter a partir do diminuidor de fluorescência do oligonucleotídeo e produzindo um aumento em uma intensidade de emissão do repórter. Consequentemente, as sondas de TaqMan™ são oligonucleotídeos que têm uma etiqueta e um diminuidor de fluorescência, onde a etiqueta é liberada durante a Amplificação, através da ação de exonuclease da polimerase usada na Amplificação. Isso proporciona uma medição em tempo real da Amplificação durante a síntese. Diversos reagentes de TaqMan™ estão disponíveis comercial mente, por exemplo, a partir do Applied Bío systems {Division Headquarters in Foster City, CA) assim como a partir de uma variedade de fabricantes especializados como Bíosearch Technologies (por exemplo, sondas de diminuidor de fluorescência de buraco negro), Detalhes Adicionais em Relação Sequências Variáveis Ampliadas, SSR. AFLP, ASH, SN Ps e Marcadores de Isqzima [00259] As sequências variáveis ampliadas referem-se às sequências ampliadas do genoma da planta, que exibe alta variabilidade de resíduo de ácido nucleíco entre membros das mesmas espécies. Todos os organismos têm sequências genômicas variáveis e cada organismo (com a exceção de um clone) tem um conjunto diferente de sequências variáveis. Uma vez identificada, a presença da sequência variável específica pode ser usada para a previsão de características fenotípicas. Com preferência, o DNA da planta serve como um modelo para Amplificação com primer que flanqueiam uma sequência variável de DNA. A sequência variável é ampliada e, então, sequenciada.
[00260] Alternativa mente, a réplica de sequência auto-sustentável pode ser usada para identificar marcadores genéticos. A réplica de sequência auto-sustentável refere-se a um método de Amplificação de ácido nucleico com o uso de sequências de ácido nucleico alvo, que são replicados de forma exponencial in vitro sob condições substancialmente isotérmicas através do uso de três atividades enzimáticas envolvidas em réplica retroviral: (1) transcriptase reversa, (2) RNase H e ¢3) uma Polimerase de RN A dependente de DNA (Guatelli et ai. (1990) Proc Natl Acad Sei USA 87:1874). Através da imitação da estratégia retroviral de réplica de RNA por meios de intermediários cDNA, essa reação acumula cópias de cDNA e RNA do alvo original.
[00261] Os polimorfismos de comprimento do fragmento ampliado (AFLP) podem, também, ser usados como marcadores genéticos (Vos et al. (1995) nucleic acids Res 23:4407). A frase "polimorfismo de comprimento de fragmento ampliado" refere-se aos fragmentos de restrição selecionados, que são ampliados antes ou após a divagem através de uma endonuclease de restrição. A etapa de Amplificação permite a detecção mais fácil de fragmentos de restrição específicos. A AFLP permite a detecção de um grande número de marcadores polimórficos e foi usada para o mapa genético de plantas (Becker et al. (1995) Mol Gen Genet 249:65: and Meksem et al. (1995) Mol Gen Genet 249:74).
[00262] A hibridização de alelo específico (ASH) pode ser usada para identificar os marcadores genéticos da presente invenção. A tecnologia ASH é baseada na hibridização estável da sonda de oligonucleotídeo cadeia única e pequeno em um ácido nucleico alvo de cadeia única e completamente complementar. A detecção acontece através de uma etiqueta isotópica ou não isotópica anexada à sonda.
[00263] Para cada polimorfismo, dois ou mais sondas de ASH diferentes são designados para terem sequências de DNA idênticas, excetos nos nucleotídeos polimórficos. Cada sonda terá a homologia exata em relação à sequência de alelo, de forma que a faixa de sondas possa distinguir todas as alternativas conhecidas de sequências de alelo. Cada sonda é hibridizada ao DNA alvo. Com o desenho de sonda e condições de hibridização apropriada, uma combinação mal-sucedida com uma única base entre a sonda e o DNA alvo irá evitar a hibridização. Dessa forma, apenas um dentre as sondas alternativos irá hibridizar a uma amostra alvo que é homozigota ou homogênea para um alelo. As amostras que são heterozigotas ou heterogêneas para dois alelos irão hibridizar em ambos dentre as duas sondas alternativas.
[00264] Os marcadores de ASH são usados como marcadores dominantes onde a presença ou falta de apenas um alelo é determinada a partir da hibridização ou falta de hibridização através de apenas uma sonda. O alelo alternativo pode ser inferido a partir da falta de hibridização. A sonda de ASH e moléculas alvo são, opcionalmente, RNA ou DNA; as moléculas alvo são qualquer comprimento de nucleotídeos além da sequência que é complementar à sonda; a sonda é desenhada para hibridizar com qualquer uma das cadeias de um alvo de DNA; a sonda tem uma faixa de tamanho para conformar diversas condições de hibridização limitadas, etc.
[00265] O PCR permite que a sequência alvo para ASH seja ampliada a partir de concentrações baixas de ácido nucleico em volumes relativamente pequenos. De outra forma, a sequência alvo a partir de um DNA genômico é digerida por uma endonuclease de restrição e separada por tamanho através de eletroforese em gel. A hibridização ocorre, tipicamente, com a ligação da sequência alvo à superfície de uma membrana ou, como descrito na Patente de número U.S. 5.468.613, a sequência de sonda de ASH pode ser ligada a uma membrana.
[00266] Em uma modalidade, os dados de ASH são obtidos, tipicamente, através da Amplificação de fragmentos de ácido nucleico (amplicons) a partir de um DNA genômico com o uso de PCR, da transferência do amplicon DNA alvo para uma membrana em um formato dot-blot, da hibridização de uma sonda de oligonucleotídeo etiquetado a um alvo amplicon e da observação dos pontos de hibridização através de autoradiografia.
[00267] Os polimorfismos de nucleotídeo únicos (SNP) são marcadores que consistem em uma sequência compartilhada diferenciada em base de um nucleotídeo único. A distinção pode ser detectada através dos padrões de migração diferenciais de um amplicon que compreende o SNP em, por exemplo, um gel de acrilamida. Os modos alternativos de detecção, como hibridização, por exemplo, análise de RFLP ou ASH também são apropriados. Os marcadores de SNP detectam as substituições de nucleotídeo em pares com uma única base. Dentre todos os tipos de marcador molecular, os SNPs são os mais abundantes, tendo o potencial, dessa forma, de fornecer a maior resolução de mapa genético (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547). Os SNPs podem ser analisados em um nível ainda mais alto de resultado do que os SSRs, em uma forma chamada de 'resultado ultra alto', já que eles não exigem quantidades grandes de DNA e a mecanização do ensaio pode ser direta. Os SNPs também prometem ter um sistema de custo relativamente baixo. Esses três fatores combinados tornam os SNPs altamente atraentes para o uso em MAS. Diversos métodos estão disponíveis para a caracterização de genótipos de SNP, que inclui, mas não se limita a, hibridização, inicialização de extensão, ligação de oligonucleotídeo, divagem de nuclease, esferas codificadas e de mini sequenciamento. Tais métodos têm sido estudados em: Gut (2001) Hum Mutat 17 pp. 475-492; Shi (2001) Clin Chem 47, páginas 164 a 172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, páginas 95 a 100; Bhattramakki e Rafalski (2001) Discovery and application ofa single nucleotide polymorphism markers in plants. In: R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Uma grande quantidade de tecnologias disponíveis comercialmente utiliza esses e outros métodos para apurar os SNPs incluindo Masscode™ (Qiagen), Invader.RTM. (Third Wave Technologies), Snapshot. RTM. (Applied Biosystems), Taqman.RTM. (Applied Biosystems) e Beadarrays™ (lllumina).
[00268] Diversos SNPs juntos em uma sequência, ou em sequências ligadas, podem ser usados na descrição de um haplótipo para qualquer genótipo particular (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), supra). Os haplótipos podem ser mais informativos do que SNPs sozinhos e podem ser mais descritivos sobre qualquer genótipo em particular. Por exemplo, um SNP sozinho pode ser o alelo T para PHM 01811-32, mas o alelo T pode ocorrer também na população para criação de milho sendo usada para os genitores atuais. Nesse caso, um haplótipo, por exemplo, uma série de alelos nos marcadores de SNP ligados, pode ser mais informativo. Uma vez que um haplótipo único foi designado para uma região cromossômica do doador, esse haplótipo pode ser usado nessa população ou quaisquer subconjuntos do mesmo para determinar se um indivíduo possui um gene particular. Consulte, por exemplo, W02003054229. O uso de plataformas de detecção de marcador de resultado altamente automatizado conhecidas pelos técnicos no assunto torna esse processo altamente eficiente e eficaz.
[00269] Os marcadores de isozima podem ser empregados como marcadores genéticos, por exemplo, para localizar marcadores que não os marcadores de tolerância na presente invenção, ou para localizar marcadores de isozima ligados aos marcadores na presente invenção. As isozimas são formas múltiplas de enzimas que se diferem umas das outras em suas sequências de aminoácidos e, portanto, suas sequências de ácido nucleico. Algumas isozimas são enzimas multiméricas que contém subunidades levemente diferentes. Outras isozimas ou são multiméricas ou monoméricas, porém foram clivadas a partir da proenzima em sítios diferentes na sequência de aminoácido. As isozimas podem ser caracterizadas e analisadas no nível da proteína ou, alternativamente, as isozimas que diferem em nível de ácido nucleico podem ser determinadas. Nesses casos, qualquer um dos métodos baseados em ácido nucleico descritos na presente invenção pode ser usado na análise de marcadores de isozima.
Detalhes Adicionais em Relação à Amplificação de Ácido Nucleico [00270] Conforme explicitado, as técnicas de Amplificação de ácido nucleico como PCR e LCR são conhecidas no estado da técnica e podem ser aplicadas na presente invenção para ampliar e/ou detectar ácidos nucleicos de interesse, como ácidos nucleicos que compreendem locais do marcador. Os exemplos de técnicas suficientes para orientar pessoas versadas através de tais métodos in vitro, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), Amplificação de replicase de Οβββ outras técnicas mediadas de polimerase de RNA (por exemplo, NASBA), são encontrados nas referências apontadas acima, por exemplo, Innis, Sambrook, Ausubel, Berger e Cray. Os detalhes adicionais são encontrados em MulMs et al. (1987) Patente de número U.S. 4.683.202; Arnheim & Levinson (1 de outubro de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81 -94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077 a 1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291 a 294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; Barhnger et al. (1990) Gene 89:117; e Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563 a 564. Os métodos melhorados para a Amplificação de ácidos nucleicos grandes por PCR, que é útil no contexto de clonagem posicionai, são resumidos, adicionalmente, em Cheng et al. (1994) Nature 369:684 e as referências na presente invenção, na qual amplicon de PCRs de até 40 kb são gerados.
Detecção de Marcadores para Clonagem Posicional [00271] Em algumas modalidades, uma sonda de ácido nucleico é usada na detecção de um ácido nucleico que compreende uma sequência de marcador. Tais sondas podem ser usadas, por exemplo, em clonagem posicionai para isolar as sequências de nucleotídeo ligadas à sequência de nucleotídeo do marcador. A intenção não é de que as sondas de ácido nucleico da presente invenção sejam limitadas por qualquer tamanho particular. Em algumas modalidades, uma sonda de ácido nucleico é de, pelo menos, 20 nucleotídeos em comprimento ou, alternativa mente, pelo menos, 50 nucleotídeos em comprimento ou, alternativa mente, pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento ou, alternativamente, pelo menos 200 nucleotídeos em comprimento.
[00272] Uma sonda hibrídizada é detectada com o uso de autoradiografia, fluorografia ou outras técnicas de detecção similares, dependendo da etiqueta que será detectada. Os exemplos de protocolos de hibridização específicos estão amplamente disponíveis no estado da técnica, consulte, por exemplo, Berger, Sambrook e Ausubel, todos na presente invenção. Métodos de Síntese de Sonda/Primer [00273] Em geral, métodos sintéticos para a produção de oligonucleotídeos, incluinda sondas, primer, sinais moleculares, PNAs, LNAs {ácidos nucleicos bloqueados), etc., são conhecidos. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados, de acordo com o método de triéster fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers (1981), Tetrahedron Letts, 22(20):1859-1862, Por exemplo, com o uso de um sintetizador automatizado disponível comercialmente, por exemplo, conforme descrito em Needham-VanDevanter et aL (1984), nucleic acids Res. 12:6159-6168. Os oligonucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos modificados, podem, também, ser encomendados a partir de diversas fontes comerciais conhecidas pelos técnicos no assunto. Existem diversos fornecedores comerciais de serviços de síntese de oligo e, dessa forma, essa é uma tecnologia amplamente acessível. Qualquer ácido nucleico pode ser encomendado de forma customizada de qualquer uma das variedades de fontes comerciais, como The Midland Certified Reagent Company, The Great American Gene Company, ExpressGen Inc., Operon Technologies Inc. {Alameda, CA) e muitos outros. Similarmente, os PNAs podem ser encomendados de forma customizada de diversas fontes, como PeptidoGenic, HTI Bio-Products, Inc., BMA Biomedicals Ltd (U.K.),Bio-S!rntese, Inc. e muitos outros, DeteccAo de Marcador em Siuco [00274] Em modalidades alternativas, métodos em sílico podem ser usados para detectar os locais do marcador de interesse. Por exemplo, a sequência de um ácido nucleico que compreende o local do marcador de interesse pode ser armazenada em um computador. A sequência do local do marcador desejado ou homólogos dos mesmos pode ser identificada com o uso de um algoritmo de procura de ácido nucleico apropriado, conforme fornecido por, por exemplo, em programas prontamente disponíveis como BLAST, ou até mesmo processadores de palavras simples.
Primer de Amplificação para a Detecção de Marcadores [00275] Em algumas modalidades preferenciais, os marcadores moleculares da presente invenção são detectados com o uso de um método de detecção com base em PCR adequado, onde o tamanho ou sequência do Amplicon de PCR é um indicativo da ausência ou presença de um a leio marcador particular. Nesses tipos de métodos, os prímer de PCR são hibridizados às regiões conservadas flanqueado a região do marcador polimórfica. Conforme usado no estado da técnica, os prímer de PCR usados para ampliar um marcador molecular são, às vezes, chamados de "Marcadores de PCR1' ou, simplesmente, "marcadores1'.
[00276] Será apreciado que, embora muitos exemplos específicos de primer sejam fornecidos na presente invenção (consulte, por exemplo, Tabela A, Tabela B e Tabela C), os primer adequados que serão usados com a presente invenção podem ser desenhados com o uso de qualquer método adequado. A intenção não é de que a presente invenção seja limitada a qualquer primer em particular ou par de prímer. Por exemplo, os prímer podem ser desenhados com o uso de qualquer programa de software adequado, como LASERGENE®.
[00277] Em algumas modalidades, os primer da presente invenção são radioetiquetados ou etiquetados através de qualquer meio adequado (por exemplo, com o uso de um identificador fluorescente radioativo), para permitir a visualização rápida dos amplicons de diferentes tamanhos seguindo uma reação de Amplificação e separação por tamanho, por exemplo, através de eletroforese em gel de agarose. Em algumas modalidades, os primer não são etiquetados e os amplicons são visualizados seguindo a resolução do tamanho dos mesmos com, por exemplo, marcação por brometo de etídeo.
[00278] A intenção não é de que os primer da presente invenção sejam limitados na geração de um amplicon de qualquer tamanho em particular. Por exemplo, os primer usados para ampliar os locais do marcador e os alelos na presente invenção não são limitados na amplificação da região completa do local relevante. Os primer podem gerar um amplicon de qualquer comprimento adequado. Em algumas modalidades, a Amplificação do marcador produz um amplicon de pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento ou, alternativamente, de pelo menos 50 nucleotídeos em comprimento ou, alternativamente, de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento ou, alternativamente, de pelo menos 200 nucleotídeos em comprimento.
Seleção Assistida por Marcadores e Cultivo de Plantas [00279] Uma motivação principal para o desenvolvimento de marcadores moleculares em espécies de cultivo é o potencial do aumento da eficácia no cultivo de plantas através da seleção assistida por marcadores (MAS). Os marcadores genéticos são usados para identificar plantas que contém um genótipo desejado em um ou mais locais e que são supostos para transferir o genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado, para a progênie dos mesmos. Os marcadores genéticos podem ser usados para identificar plantas que contêm o genótipo desejado em um local, ou em diversos locais ligados ou não-ligados (por exemplo, um haplótipo) e é esperado que esse aspecto transfira o genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado para a progênie dos mesmos. A presente invenção fornece os meios para identificação de plantas, particularmente plantas de milho, que têm tolerância conferida recentemente ou tolerância melhorada em, ou são suscetíveis a, GLS através da identificação de plantas que têm alelo especificado em um desses locais, por exemplo, PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586; e marcadores desenhados para bacb.pk0333.o19 (PHM 00043), bacc.pk0267.m12.f, cl33021__1, bacb.pk0241.h17.f, chp2.pk0007.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb.pk0009.b21.f, bacb.pkOI 17.i09.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc.pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.b8 (PHM 00049).
[00280] Similarmente, através da identificação de plantas que não têm o local do marcador desejado, as plantas suscetíveis ou menos tolerantes podem ser identificadas e, por exemplo, eliminadas de cruzamentos subsequentes. Similarmente, esses locais do marcador podem ser introgredidos em qualquer fundo genômico, germoplasma, planta, linhagem, variedade, etc., desejadas como parte de um programa de cultivo de MAS completo desenhado para aperfeiçoar a produção de milho.
[00281] A presente invenção fornece, ainda, intervalos QTL de cromossomos que são igualmente úteis em MAS na seleção de plantas que demonstram tolerância a GLS aprimorada ou recém conferida. Similarmente, os intervalos QTL podem, ainda, ser usados para contra-selecionar plantas que são suscetíveis ou têm tolerância reduzida a GLS. Qualquer marcador que delineia mapas no interior do intervalo QTL (incluindo o término dos intervalos) é útil na presente invenção. Esses intervalos são definidos pelos seguintes pares de marcadores: (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702.
[00282] Em geral, o MAS utiliza marcadores polimórficos que foram identificados como tendo uma probabilidade significativa de cossegregação com uma característica de tolerância. Tais marcadores são presumidos para delinear mapas próximos a um gene ou genes que fornecem à planta o fenótipo de tolerância da mesma e são considerados indicadores para a característica desejada e são chamados de marcadores de QTL. As plantas são testadas para a presença de um alelo desejado no marcador de QTL. Os marcadores com maior preferência (ou marcadores de alelo) são aqueles que têm a associação mais forte com a característica de tolerância.
[00283] A análise de ligação é usada para determinar qual marcador de alelo polimórfico demonstra uma probabilidade estatística de cossegregação com o fenótipo de tolerância (desse modo, um "marcador de alelo de tolerância"). Seguindo a identificação de um alelo marcador para cossegregação com o fenótipo de tolerância, é possível o uso desse marcador para a varredura rápida e precisa das linhagens de planta para o alelo de tolerância sem a necessidade do cultivo de plantas através do ciclo de vida das mesmas e aguardar as avaliações fenotípicas e, além disso, permite a seleção genética para o alelo de tolerância particular, mesmo quando a identidade molecular do QTL de tolerância real é conhecida. As amostras de tecido podem ser tiradas, por exemplo, a partir da primeira folha da planta e classificadas com o marcador molecular apropriado e determina-se de forma rápida qual progênie irá avançar. Os marcadores ligados removem, ainda, o impacto de fatores ambientais que podem influenciar, muitas vezes, a expressão fenotípica.
[00284] Um local de marcador de QTL polimórfico pode ser usado para selecionar plantas que contém o alelo marcador (ou alelos) que se correlaciona com o fenótipo de tolerância desejado. Resumidamente, um ácido nucleico que corresponde ao alelo de ácido nucleico do marcador é detectado em uma amostra biológica de uma planta a ser selecionada. Essa detecção pode ter a forma de hibridização de um ácido nucleico de sonda a um alelo marcador ou amplicon do mesmo, por exemplo, com o uso de hibridização de alelo específico, análise Southern, análise Northern, hibridização in situ, hibridização de primer seguida de Amplificação de PCR de uma região de marcador ou similares. Uma variedade de procedimentos para a detecção de marcadores é descrita na presente invenção, por exemplo, na seção intitulada "TÉCNICAS PARA A DETECÇÃO DE MARCADORES". Após a verificação da presença (ou ausência) de um alelo marcador particular na amostra biológica, a planta é selecionada (por exemplo, usada na produção de plantas de progênie através do cultivo seletivo).
[00285] Os cultivadores de planta de milho desejam combinações de locais de tolerância com genes para a alta produção e outras características desejáveis para o desenvolvimento de variedades de milho aprimoradas. A varredura de um número grande de amostras através de métodos não-moleculares (por exemplo, a avaliação das características em plantas de milho) pode ser cara, demorada e imprecisa. O uso de marcadores polimórficos descrito na presente invenção, quando ligados geneticamente ao local de tolerância, fornece um método eficaz para a seleção de variedades tolerantes nos programas de cultivo. Por exemplo, uma vantagem da seleção assistida pelo marcador nas avaliações de campo para tolerância é que o MAS pode ser feito em qualquer época do ano, independente da época de safra. Ademais, os efeitos do ambiente são altamente irrelevantes para a seleção assistida por marcador.
[00286] Quando uma população está sendo segregada para diversos locais, afetando um ou diversas características, por exemplo, locais múltiplos envolvidos em tolerância ou locais múltiplos, sendo que cada um é envolvido em tolerância a diferentes doenças, a eficácia do MAS comparada à varredura fenotípica se torna ainda maior, porque todos os locais podem ser avaliados no laboratório juntamente a partir de uma amostra única do DNA. Na ocorrência presente, o PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586; e marcadores desenhados para marcadores bacb.pk0333.o19 (por exemplo, PHM 00043), bacc.pk0267.m12.f, cl33021_1, bacb.pk0241.h17.f, chp2.pk0007.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb. pk0009.b21.f, bacb.pkOI 17.i09.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc. pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.b8 (por exemplo, PHM 00049), assim como qualquer um dos intervalos de cromossomos (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702, pode ser analisada de forma simultânea ou sequencial a partir de uma única amostra ou de uma população de amostras.
[00287] Outro uso de MAS no cultivo de plantas é o auxílio do genótipo genitor recorrente através do cultivo de retrocruzamento. O cultivo de retrocruzamento é o processo de cruzar a progênie de volta com um dos precursores da mesma ou das linhagens precursoras. O retrocruzamento é feito, normalmente, com o propósito de introgredir um ou alguns locais a partir de um pai doador (por exemplo, um pai que compreende locais do marcador de tolerância desejável) em um fundo genético desejável de outra maneira a partir do pai recorrente (por exemplo, uma linhagem de alta produção de milho de outra forma). Quanto mais ciclos de retrocruzamento forem feitos, maior será a contribuição genética do pai recorrente para a variedade introgressão de resultado. Isso é necessário, muitas vezes, porque plantas tolerantes podem ser indesejáveis de outra forma, por exemplo, devido ao baixo rendimento, baixa fecundidade ou similares. Em contrapartida, estirpes que são o resultado de programas de cultivo intensos podem ter excelente rendimento, fecundidade ou similares, sendo deficientes somente em uma característica desejada, como tolerância a GLS.
[00288] A presença e/ou falta de um marcador genético ou alelo particular, por exemplo, PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586; e marcadores desenhados para marcadores bacb.pk0333.o19 (por exemplo, PHM 00043), bacc.pk0267.m12.f, cl33021_1, bacb.pk0241.h17.f, chp2.pk0007.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb. pk0009.b21.f, bacb.pk0117.i09.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc. pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.b8 (por exemplo, PHM 00049, assim como qualquer um dos intervalos de cromossomos (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621 A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702, no genoma de uma planta é produzido por qualquer método apresentado na presente invenção. Se os ácidos nucleicos da planta forem positivos para um alelo de marcador genético desejado, a planta pode ser auto-fertilizada para a criação de uma linhagem de cultivo verdadeira com o mesmo genótipo, por a mesma pode ser cruzada com uma planta com o mesmo marcador ou com outras características desejadas a fim de criar uma geração híbrida sexualmente cruzada.
INTROGRESSÃO DE ALELOS FAVORÁVEIS- RETROCRUZAMENTO EFICAZ DE
Marcadores de Tolerância em Linhagens de Elite [00289] Uma aplicação de MAS, no contexto da presente invenção,é para o uso da tolerância conferida recentemente ou marcadores de tolerância melhorada para o aumenta da eficácia de um esforço de introgressão ou retrocruzamento dirigido para a introdução de QTL de tolerância em um fundo desejado (tipicamente de alto rendimento). No retrocruzamento assistido do marcador de marcadores específicos (e QTL associado) a partir de uma fonte doadora, por exemplo, em um fundo genético exótico ou de elite, um seleciona entre a progênie do retrocruzamento para a característica do doador e, então, usa o retrocruzamento repetido na linhagem de elite ou exótica a fim de reconstituir o máximo do possível dos genomas do fluido de elite/exótico.
[00290] Dessa forma, os marcadores e métodos da presente invenção podem ser utilizados para guiar a seleção assistida por marcadores ou cultivo de variedades de milho com o complemento desejado (conjunto) de formas alélicas de segmentos de cromossomos associado com desempenho agronômico superior (tolerância, juntamente com quaisquer outros marcadores para rendimentos disponíveis, etc.). Qualquer um dos alelos marcadores apresentados pode ser introduzido em uma linhagem de milho através de introgressão, por cultivo tradicional (ou introduzido através de transformação ou ambos), para produzir uma planta de milho com desempenho agronômico superior. O número de alelos associados à tolerância que pode ser introduzida ou estar presente em uma planta de milho da presente invenção está em uma faixa de um a um número de alelos apresentado na presente invenção, cujo cada número inteiro está incorporado na presente invenção como relatado explicitamente.
[00291] A presente invenção se estende, ainda, para um método de produção de uma planta de milho de progênie e essas plantas de milho de progênie, per se. O método compreende o cruzamento de uma primeira planta de milho genitor com uma segunda planta de milho e o cultivo da planta de milho fêmea sob condições para o cultivo de plantas a fim de render progênies da planta de milho. Os métodos de cruzamento e cultivo de plantas de milho estão dentro da capacidade dos técnicos no assunto. Tal progênie da planta de milho pode ser analisada por alelos associados com a tolerância e, através disso, ocorre à seleção da progênie desejada. Tais plantas ou semente de progênie podem ser entendidas comercialmente para a produção de milho, usadas para alimentação, processadas para a obtenção de um constituinte desejado do milho, ou utilizadas, adicionalmente, em ciclos subsequentes de cultivo. Pelo menos uma dentre a primeira e a segunda planta de milho é uma planta de milho da presente invenção, já que a mesma compreende, pelo menos, uma das formas alélicas dos marcadores da presente invenção, de forma que a progênie é capaz de herdar o alelo.
[00292] Um método da presente invenção pode ser aplicado a pelo menos uma planta de milho relacionada, como a partir de uma linhagem de progenitor ou descendente na genealogia das plantas de milho do assunto, de forma que a herança do alelo de tolerância desejado possa ser traçada. A quantidade de gerações que separam as plantas de milho sendo submetidas aos métodos da presente invenção será, em geral, de 1 a 20, comumente de 1 a 5 e, tipicamente, de 1, 2 ou 3 gerações de separação e muitas vezes um descendente ou pai direto de uma planta de milho será submetido ao método {isto é, uma geração de separação).
IntrogressAo de Alelos Favoráveis-Incorporacão de Germoplasma '‘Exótico" Enquanto o Processo de Cultivo é Mantido.
[00293] A diversidade genética é importante para o ganho genético em longo prazo em qualquer programa de cultivo. Com a diversidade limitada, o ganho genético írã, eventualmente, estagnar quando todos os alelos favoráveis forem fixados dentro da população de elite. Um objetivo é incorporar a diversidade em uma mistura elite sem perder o ganho genético que já foi feito e com o mínimo de investimento possível. O MAS fornece uma indicação de quais regiões genômicas e quais alelos favoráveis dos ancestrais originais foram selecionados para e conservados ao longo do tempo, facilitando os esforços para a incorporação de variações favoráveis a partir de fontes de germoplasma exóticas (pais que não são relacionados à mistura de gene) com a esperança de encontrar alelos favoráveis que não existem normalmente na mistura elite de gene, [00294] Por exemplo, os marcadores da presente invenção podem ser usados para o MAS em cruzamentos que envolvem linhagem de milhos exótica x elite submetendo a progênie segregadora ao MAS a fim de manter alelos de rendimento maiores, juntamente com o marcador de alelo de tolerâncias na presente invenção.
Clonagem Posicional [00295] Os locais do marcador molecular e alelos da presente invenção, por exemplo, PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586; e marcadores desenhados para marcadores bacb.pk0333,o19 (por exemplo, PHM 00043), bacc.pk0267,m12,f, cl33021_1, bacb.pk0241.h17f, chp2,pk00G7.d2, p0094.csstg88, bacb.pk0269.n19, bacb. pk0009.b21.f, bacb.pkOI 17.i09.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc. pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18, bacb.pk0540.c18.f e bacm.pk022.b8 (por exemplo, PHM 00049), assim como qualquer um dos intervalos de cromossomos (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e UMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621 A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viii) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702, podem ser usados, como indicado previamente, na identificação de um QTL de tolerância, que pode ser clonado por procedimentos bem estabelecidos, por exemplo, conforme descritos em detalhes em Ausubel, Berger e Sambrook, na presente invenção.
[00296] Esses clones de tolerância são primeiramente identificados através da ligação genética deles aos marcadores da presente invenção. O isolamento de um ácido nucleico de interesse é alcançado por qualquer quantidade de métodos, conforme discutido em detalhe em referências como Ausubel, Berger e Sambrook, na presente invenção e Clark, Ed. (1997) Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual Sprinqer-Verlaq, Berlin.
[00297] Por exemplo, a "clonagem de gene posicionai" utiliza a proximidade de um marcador de tolerância a fim de definir fisicamente um fragmento cromossomal isolado que contém um gene QTL de tolerância. O fragmento cromossomal isolado pode ser produzido por tais métodos conhecidos como um DNA cromossomal de digestão com uma ou mais enzimas de restrição, ou através da Amplificação de uma região cromossomal em uma reação em cadeia da polimerase (PCR), ou qualquer reação de Amplificação alternativa adequada. Os fragmentos digeridos ou ampliados são tipicamente ligados a um vetor adequado para a réplica e, por exemplo, expressão, do fragmento inserido. Os marcadores que são adjacentes a uma estrutura de leitura aberta (ORF) associada a uma característica fenotípica pode se hibrídizar a um clone de DNA (por exemplo, um clone de uma livraria de DNA genômico), identificando, através disto, um clone no qual uma ORF {ou um fragmento de uma ORF) é localizado. Se o marcador está mais distante, um fragmento que contém a ORF é identificado através de ciclos sucessivos de varredura e isolamento dos clones, que juntos compreendem uma sequência de DNA contínua, um processo chamado “caminhar no cromossomo" (chromosome walking), resultando em um "contíg"1 ou "mapa de contig". Os protocolos suficientes para guiar um técnico no assunto através da isolação dos clones associados com os marcadores ligados são encontrados em, por exemplo, Berger, Sambrook e Ausubel, todos na presente invenção.
Geração de Plantas e Células Transgênicas [00298] A presente invenção relaciona-se, ainda, aos organismos e células hospedeiras, que são transformadas em ácidos nucleicos que correspondem a um QTL de tolerância identificado de acordo com a presente invenção. Por exemplo, tais ácidos nucleicos incluem intervalos de cromossomos (por exemplo, fragmentos genômicos), ORFs e/ou cDNAs que codificam uma característica de tolerância conferida recentemente ou tolerância melhorada. Adicionalmente, a presente invenção proporciona para a produção de polipeptídios, que proporciona a tolerância conferida recentemente ou tolerância melhorada através de técnicas de recombinantes.
[00299] Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares para a clonagem e manipulação de ácidos nucleicos e produção de polipeptídios codificados incluem Berger, Sambrook e Ausubel supra. Esses textos descrevem mutagênese, o uso de vetores, promotores e outros tópicos muito relevantes relacionados à, por exemplo, geração de clones que compreendem ácidos nucleicos de interesse, por exemplo, locais do marcador, provas do marcador, QTL que segrega os locais do marcador, etc.
[00300] As células hospedeiras são projetadas geneticamente (por exemplo, transduzido, trasfectado, transformado, etc.) com os vetores da presente invenção (por exemplo, vetores, como vetores de expressão que compreendem uma ORF derivada de ou relacionada a um QTL de tolerância) que pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem, um vetor ponte ou um vetor de expressão. Tais vetores têm, por exemplo, a forma de um plasmídeo, um fagemídeo, uma agrobactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu (linear ou circular), ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores podem ser introduzidos no interior de uma bactéria, especialmente com o propósito de propagação e expansão. Os vetores são, também, introduzidos no interior dos tecidos vegetais, células vegetais cultivadas ou protoplasta da planta por diversos métodos padrões conhecidos no estado da técnica, que inclui, mas não se limita a, eletroporação (From et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824), infecção por vetores virais, como vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Hohn et al. (1982) Molecular Biology of Plant Tumrs (Academic Press, Nova York), páginas 549 a 560; Patente de número U.S. 4.407.956), penetração balística de alta velocidade através de partículas pequenas com o ácido nucleico tanto no interior da matriz de pequenas esferas quanto de partículas, ou sobre a superfície (Klein et al. (1987) Nature 327:70), uso de pólen como vetor (WO85/01856), ou uso de Agrobacteríum tumefaciens ou Arhlzogenes que carrega um plasmídeo de T-DNA no qual os fragmentos de DNA são clonados. O plasmídeo de T-DNA é transmitido para as células vegetais através de infecção por Agrobacteríum tumefaciens e uma porção é integrada com estabilidade no interior do genoma da planta (Horsch et al. (1984) Science 233:496; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803). Detalhes adicionais em relação aos métodos de introdução de ácido nucleico são encontrados em Sambrook, Berger e Ausubel, supra. O método de introdução de um ácido nucleico da presente invenção dentro de uma célula hospedeira não é crucial para a presente invenção imediata e a intenção não é de que a presente invenção seja limitada em qualquer método particular para a introdução de material genético exógeno no interior de uma célula hospedeira. Dessa forma, qualquer método adequado, por exemplo, que inclui, mas não se limita a, os métodos fornecidos na presente invenção, que proporciona a introdução eficaz de um ácido nucleico no interior da célula ou protoplasta pode ser empregado e útil na presente invenção.
[00301] As células hospedeiras projetadas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para tais atividades como, por exemplo, a ativação dos promotores ou seleção dos transformantes. Essas células podem, opcionalmente, ser cultivadas no interior de plantas transgênicas. Em adição a Sambrook, Berger e Ausubel, supra, a regeneração da planta a partir de protoplastas cultivados é descrita em Evans et al. (1983) "Protoplast Isolation and Culture", Handbook of plant cell Cultures 1, 124 a 176 (MacMillan Publishing Co.), New York; Davey (1983) "Recent Developments in the Culture e Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts, pp. 12-29, (Birkhauser, Basel); Dale (1983) "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereais and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts páginas 31 a 41, (Birkhauser, Basel); Binding (1985) "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, pp. 21 a 73, (CRC Press, Boca Raton, FL). Detalhes adicionais em relação ao cultivo e regeneração de célula vegetal incluem Payne et al. (1992) A célula vegetal e Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg e Phillips (eds) (1995) plant cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Plant Molecular Biology (1993) R.R.D.Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6. Os meios de cultura de célula são, em geral, também expostos em Atlas e Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Informações adicionais para a cultura de célula são encontradas em literatura comercialmente disponível como Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) de Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") e, por exemplo, the Plant Culture Catalogue and supplement (por exemplo, 1997 ou depois) também de Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) ("Sigma-PCCS").
[00302] A presente invenção relaciona-se também à produção de organismos transgênicos, que pode ser uma bactéria, fermento, fungo, animais ou plantas, transduzidos com os ácidos nucleicos da presente invenção (por exemplo, ácidos nucleicos que compreendem os locais do marcador e/ou QTL apresentado na presente invenção). Uma discussão completa sobre as técnicas relevantes ao cultivo de células e eucariotos unicelulares e bactérias é encontrada em referências enumeradas na presente invenção e são brevemente esquematizadas como segue. Diversos métodos amplamente conhecidos de introdução de ácidos nucleicos alvo no interior de células bacterianas estão disponíveis, sendo que qualquer um pode ser usado na presente invenção. Nestes são incluídos: a fusão das células recipientes com protoplastas bacterianos que contém o DNA, tratamento das células com lipossomos que contém o DNA, eletroporação, bombardeamento de projétil (biolítica), entrega de fibra de carbono e infecção com vetores finais (discutidos adicionalmente abaixo), etc. As células bacterianas podem ser usadas para ampliar o número de plasmídeos que contêm construções de DNA da presente invenção. As bactérias são cultivadas para fase de logaritmo e os plasmídeos dentro da bactéria podem ser isolados por diversos métodos conhecido no estado da técnica (consulte, por exemplo, Sambrook). Além disso, uma pletora de kits está disponível comercialmente para a purificação de plasmídeos de uma bactéria. Para o uso apropriado, siga as instruções do produtor (consulte, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos da Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; e, QIAprep™ de Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são, então, manipulados adicionalmente para produzirem outros plasmídeos, usados para transfectar células vegetais incorporadas em vetores relacionados à Agrobacterium tumefaciens para infectar plantas. Os vetores típicos contêm terminadores de transcrição e translação, sequências de iniciação de transcrição e translação e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucleico alvo particular. Os vetores compreendem, opcionalmente, cassetes de expressão genérica que contêm, pelo menos, uma sequência de terminador independente, sequências que permitem a réplica do cassete em eucariotos ou procariotos ou ambos, (por exemplo, vetores ponte) e os marcadores da seleção tanto para o sistema procarioto quanto para o sistema eucarioto. Os vetores são adequados para a réplica e integração em procariotos, eucariotos ou, com preferência, ambos. Consulte, Giliman & Smith (1979) Gene 8:81; Roberts etal. (1987) Nature 328:731; Schneider etal. (1995) Protein Expr. Purif. 6:10; Ausubel, Sambrook, Berger (all supra). Um catálogo de bactéria e bacteriófagos útil para a clonagem é fornecido, por exemplo, pela American Type Culture Collection (ATCC), por exemplo, o ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado pela ATCC. Os procedimentos básicos adicionais para o sequenciamento, clonagem e outros aspectos de biologia molecular e considerações teóricas base também são encontradas em Watson et al. (1992) Recombinant DNA, Second Edition, Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico (e virtualmente quaisquer ácidos nucleicos etiquetados, seja padrão ou não-padrão) pode ser customizado ou encomendado na forma padrão de qualquer variedade de fontes comerciais, como o Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.
Introdução de Ácidos Nucleicos no Interior de Plantas.
[00303] As modalidades da presente invenção pertencem à produção de plantas transgênicas que compreende ácidos nucleicos clonados, por exemplo, ORFs e cDNAs isolados que codificam genes de tolerância. As técnicas para a transformação de células vegetais com ácidos nucleicos estão amplamente disponíveis e podem ser pronta mente adaptadas para a presente invenção, Em adição a Berger, Ausubel e Sambrook, all supra, referências gerais úteis para a clonagem de célula vegetal, cultivo e regeneração incluem Jones (ed) (1995) Piant Gene Transfer e Expression Protocols- Methods in Molecular Biology, Volume 49 Humana Press Towata NJ ('Jones’1); Payne et ai (1992) Piant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY ("Payne'·); e Gamborg and Phillips (eds) (1995) Piant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Sphnger-Verlag (Berlin Heidelberg New York) ("Gamborg"). Uma variedade de meio de cultura de célula é descrita em Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL ("Atlas"). Informações adicionais para o cultivo de célula vegetal é encontrado em literatura comercialmente disponível como Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) de Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, por exemplo, Piant Culture Catalogue and supplement (1997) também de Sigma-Aldhch, Inc, (St Louis, MO) (Sigma-PCCS). Detalhes adicionais em relação ao cultivo de célula vegetal são encontrados em Croy.
[00304] A construção de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais, polinucleotídeos de DNA e RNA são introduzidos dentro de uma célula vegetal, tanto em cultivo quanto em órgãos de uma planta através de diversas técnicas convencionais. Onde a sequência é expressa, a sequência é combinada, opcionalmente, com sequências reguladoras de iniciação transcricional e translacional, que direcionam a transcrição ou translação da sequência a partir do DNA exógeno nos tecidos pretendidos da planta transformada.
[00305] Os ácidos de ácido nucleico isolados da presente invenção podem ser introduzidos no interior de plantas de acordo com qualquer uma das variedades conhecidas no estado da técnica. As técnicas para a transformação de uma ampla variedade de espécies de planta mais altas são conhecidas, também e descritas em literatura de patentes, científicas e técnicas disponíveis amplamente. Consulte, por exemplo, Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477.
[00306] A construção de DNA da presente invenção, por exemplo, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, polinucleotídeos de DNA conjugados de diversas formas, nu ou fago (por exemplo, DNA conjugado por polilisina, DNA conjugado por peptídeo, DNA conjugado por lipossoma), ou cromossomos artificiais, pode ser introduzida diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal com o uso de técnicas, como eletroporação e micro injeção de protoplastos de célula vegetal ou a construção de DNA pode ser introduzida diretamente nas células vegetais com o uso de métodos de balística, como bombardeamento de partículas de DNA.
[00307] As técnicas de micro injeção para a injeção de plantas, por exemplo, células, embriões, calo e protoplastos, são conhecidas no estado da técnica e descritas na literatura de patente e científica. Por exemplo, diversos métodos são descritos em Jones, assim como em outras referências apontadas na presente invenção e estão disponíveis na literatura.
[00308] Por exemplo, a introdução de construções de DNA com o uso de precipitação polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717 (1984). Técnicas de electroporação são descritas em Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824 (1985). Técnicas de transformação balística são descritas em Klein et al., Nature 327:70 a 73 (1987). Detalhes adicionais são encontrados em Jones e Gamborg, supra e na patente n° U.S. 5.990.387.
[00309] Alternativa e em alguns casos, preferencialmente, emprega-se transformação mediada por Agrobacterium para gerar plantas transgênicas. Técnicas de transformação mediada por Agrobacterium, incluindo desarme e uso de vetores binários, também são bem descritas na literatura científica. Vide, por exemplo, Horsch, et al. (1984) Science 233:496; Fraley et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803: e analisado em Hansen e Chilton (1998) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 21 e Das (1998) Subcellular Biochemistry 29: Plant Microbe Interactions, pp. 343 a 363.
[00310] Construções de DNA são, opcionalmente, combinadas por regiões flanqueantes de T-DNA adequadas e intoduzidas em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens irão direcionar a inserção da construção e marcador adjacente no DNA da célula da planta quando a célula está infectada pela bactéria. Vide, Patente n° U.S. 5.591.616. Embora a Agrobacterium seja primariamente útil em dicotiledôneos, certas monocotiledôneas podem ser transformadas pela Agrobacterium. Por exemplo, Transformação de Agrobacterium de milho é descrita na Patente n° U.S. 5.550.318.
[00311] Outros métodos de transfecção ou transformação incluem (1) Transformação mediada por Agrobacterium rhizogenes (vide, por exemplo, Lichtenstein e Fuller (1987) em: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed., Londres, Academic Press; e Lichtenstein e Draper (1985) em: DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press; WO 88/02405, publicado em 07 de abril de 1988, descreve o uso de Cepa de A. rhizogenes A4 e seu plasmídeo Ri junto com vetores A. tumefaciens pARC8 ou pARC16), (2) absorção de DNA mediada por lipossoma (vide, por exemplo, Freeman et al. (1984) Célula vegetal Physiol. 25: 1353) e (3) o método vortex (vide, por exemplo, Kindle (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87: 1228).
[00312] DNA também pode ser introduzido em plantas através de transferência de DNA direta em pólen conforme descrito por Zhou et al. (1983) Meth. Enzymol. 101: 433; D. Hess (1987) Intern Rev. Cvtol. 107: 367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Rep. 6: 165. Expressão de genes por codificação de polipeptídeo pode ser obtida através de injeção do DNA em órgãos reprodutivos de uma planta conforme descrito por Pena et al. (1987) Nature 325: 274. DNA também pode ser injetado diretamente em células de embrião imaturo e o embrião dissecado reidratado conforme descrito por Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30: e Benbrook et al. (1986) em Proceedings Bio Expo Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54. Diversos vírus de planta que podem ser empregados como vetores são conhecidos no estado da técnica e incluem vírus do mosaico de couve-flor (CaMV), geminivírus, vírus do mosaico do capim bromo e vírus do mosaico do tabaco.
Geracão/Regeneracão de Plantas Transgênicas [00313] Células de planta transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, dessa forma, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração dependem de manipulação de determinados fitohormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, dependendo tipicamente em um marcador de biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. Regeneração de planta derivada de protoplastas cultivadas é descrita em Payne; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York); Evans et al. (1983) Protoplast Isolation e Culture, Handbook of Vegetal Cells Culture pp. 124 a 176, Macmillian Publishing Company, New York; e Binding (1985) Plant regeneration, Plant Protoplast pp. 21 a 73, CRC Press, Boca Raton. A regeneração também pode ser obtida a partir de calo de planta, explantes, embrião somático (Dandekar et al. (1989) J. Tissue Cult. Meth. 12: 145; McGranahan et aí. (1990) Vegetal Cell Rep. 8: 512) órgãos ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas, forma geral, em Klee et al. (1987) Ann. Rev. Plant Phvs. 38: 467 a 486. Detalhes adicionais são encontrados em Payne e Jones, ambos supra e Weissbach e Weissbach, eds. (1988) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, Inc., San Diego, CA. Essa regeneração e esse processo de cultivo incluem as etapas de seleção de células e brotos transformantes, enraizar os brotos transformadores e cultivo de plântulas em solo. Esses métodos são adaptados a presente invenção para produzir plantas transgênicas que sustentam QTL e outros genes isolados de acordo com os métodos da presente invenção.
[00314] Ademais, a regeneração de plantas que contêm polinucleotídeos da presente invenção e introduzida através de Agrobacterium em células de explantes de folha pose der alcançada conforme descrito por Horsch et al. (1985) Science 227:1229 a 1231. Nesse procedimento, transformantes crescem na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos na espécie da planta que está sendo transformada conforme descrito por Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S. A.) 80: 4803. Esse procedimento produz, tipicamente, brotos no período de duas a quarto semanas e esses brotos transformantes são, então, transferidos para um meio para indução de broto apropriado, que contém o agente de seleção e um antibiótico para prevenir crescimento bacteriano. As plantas transgênicas da presente invenção podem ser férteis ou estéreis.
[00315] Não se pretende que a transformação da planta e expressão de polipeptídeos que fornecem tolerância à doença, conforme fornecida pela presente invenção, seja limitada a espécies de milho s. De fato, contempla-se que os polipeptídeos que fornecem a tolerância desejada em milho também podem fornecer tal tolerância quando transformados e expressados em outras espécies importantes agronomicamente e horticulturalmente. Por exemplo, tais espécies incluem: soja, canola, alfalfa, trigo, girassol e sorgo.
[00316] Na construção de cassetes de para localizar recombinantes da presente invenção, que inclui, por exemplo, plasmídeos ajudantes que compreendem funções de virulência e plasmídeos ou vírus que compreendem sequências de DNA exógenas como genes estruturais, um fragmento promotor de planta é opcionalmente empregado, que direciona a expressão de um ácido nucleico em qualquer ou todos os tecidos de uma planta regenerada. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação da transcrição 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor 1’- ou 2’ derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens e outras regiões de iniciação de diversos genes de planta conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Alternativamente, o promotor de planta pode direcionar a para localizar do polinucleotídeo da presente invenção em um tecido específico (promotores específicos por tecido) ou pode estar, de outra forma, sob controle ambiental mais preciso (promotores induzíveis). Exemplos de promotores específicos por tecido sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição apenas em alguns tecidos, como frutas, sementes ou flores.
[00317] Qualquer um entre vários promotores que direciona a transcrição direta em células de planta pode ser adequado. O promotor pode ser tanto constitutivo quanto induzível. Ademais para os promotores notados acima, os promotores de origem bacteriana que operam em plantas incluem promotor de síntese octopino, o promotor de síntese neopalino e outros promotores derivados de plasmídeos Ti nativos. Vide, Herrara-Estrella et al. (1983) Nature 303:209. Promotores virais que incluem os promotores de RNA 35S e 19S de vírus de mosaico de couve-flor. Vide, Odell et ai. (1985) Nature 313: 810. Outros promotores de planta incluem promotor inibidor de tripsina Kunitz (KTI), SCP1, SUP, UCD3, o promotor de subunidade pequena de ribulose-1,3-bifosfato carboxilase e o promotor faseolina. A sequência de promotor do gene E8 e outros genes também pode ser usada. A isolação e sequência do promotor E8 são descritas detalhadamente em Deikman e Fischer (1988) EMBO J. 7: 3315. Muitos outros promotores estão em uso corrente e podem ser acoplados a uma sequência de DNA exógena para localizar direta do ácido nucleico.
[00318] Se a expressão de um polipeptídeo de um cDNA for desejada, uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação é tipicamente incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada de um gene natural, de outros diversos genes de planta, ou, por exemplo, do T-DNA.
[00319] O vetor que compreende as sequências (por exemplo, regiões de promotores ou de codificação) dos produtos de expressão de codificação de genes e transgenes da presente invenção irá incluir, tipicamente, uma subsequência de um ácido nucleico, um gene marcador que concede um fenótipo selecionável, ou, alternativamente, projetável em células de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar tolerância a biocida, particularmente tolerância a antibiótico, como tolerância à canamicina, G418, belomicina, higromicina, ou tolerância a herbocida, como tolerância à clorosulforona, ou fosfinotiricina (o ingrediente ativo nos herbicidas bialafos ou Basta). Vide, por exemplo, Padgette et ai (1996) In: Herbcide-Resistant Crops (Duke, ed.), pp 53 a 84, CRC Lewis Publishers, Boca Raton. Por exemplo, a seletividade da semeadura para herbicidas específicos pode ser concedida por genes de engenharia em semeaduras que codificam enzimas de metabolização de herbicida adequadas de outros organismos, como micróbio. Vide, Vasil (1996) In: Herbicide-Resistant Crops (Duke, ed.), PP 85 a 91, CRC Lewis Publishers, Boca Raton).
[00320] O técnico no assunto irá reconhecer que após o cassete de para localizar recombinante é incorporado, com estabilidade, em plantas transgênicas e confirmado ser operável, o mesmo pode ser introduzido em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma das diversas técnicas de criação padrão pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas. Em semeaduras propagadas de maneira vegetal, plantas transgênicas maduras podem ser propagadas através da utilização de cortes ou através de técnicas de cultura de tecido para produção de plantas idênticas múltiplas. Faz-se a seleção de transgênicos desejáveis e novas variedades são obtidas e propagadas de forma vegetal para uso comercial. Em semeaduras propagadas por sementes, plantas transgênicas maduras podem ser auto cruzamento para produção de uma planta endógama de homozigoto. A planta endógama produz semente que contém o ácido nucleico heterólogo recém introduzida. Essas sementes podem ser cultivadas para a produção de plantas que poderiam produzir o fenótipo selecionado. Partes obtidas a partir da planta regenerada, como flores, sementes, folhas, galhos, frutas e similares, são incluídas na presente invenção, desde que essas partes compreendam células que compreendem o ácido nucleico isolado da presente invenção. Progênie e variantes e mutantes das plantas regeneradas, também estão incluídas no escopo da presente invenção, desde que essas partes compreendam as sequências de ácido nucleico introduzidas.
[00321] Plantas transgênicas ou introgredidas que expressam um polinucleotídeo da presente invenção podem ser triadas para transmissão do ácido nucleico da presente invenção através, por exemplo, de métodos de detecção de ácido nucleico padrão ou através de protocolos de imunoblot. A para localizar no nível de RNA pode ser determinada para identificar e quantizar plantas de para localizar positiva. Técnicas padrão para análise de RNA podem ser empregadas e incluem ensaios de amplificação de RT-PCR com o uso de oligonucleotídeos primer designados para amplificar apenas moldes de RNA heterólogo ou introgredido e ensaio de hibridização de solução com o uso de marcador ou sonda específico de QTL. As plantas também podem ser para expressão de proteína, por exemplo, através de análise de imunoblot com o uso de anticorpos que reconhecem os polipeptídeos codificados. Ademais, hibridização e imunocitoquímica in situ e de acordo com os protocolos padrões podem ser feitas com o uso de pontos de prova e anticorpos de polinucleotídeo específico de ácido nucleico heterólogo, respectivamente, para localizar sítios de expressão em tecido transgênico. Em geral, diversas linhagens transgênicas são, normalmente, são tríadas para o ácido nucleico incorporado para identificar e selecionar as plantas com o perfil de expressão mais apropriado.
[00322] Uma modalidade da presente invenção é uma planta transgênica que é homozigota para o ácido nucleico heterólogo adicionado; por exemplo, uma planta transgênica que contém duas cópias de sequência de ácido nucleico adicionado, por exemplo, um gene no mesmo locus em cada cromossomo de um par de cromossomos homólogos.
[00323] Uma planta transgênica de homozigoto pode ser obtida através de acasalamento sexual (auto-fertilização) de uma planta transgênica heterozigota que contém um único ácido nucleico heterólogo adicionado, que germine algumas das sementes produzidas e que analise as plantas resultantes produzidas por expressão alterada de um polinucleotídeo da presente invenção relativo a uma planta de controle (por exemplo, uma planta nativa não transgênica).
[00324] O retrocruzamento para uma planta genitor e o cruzamento não relacionado (outcrossing) com uma planta não transgênica podem ser usados para introgressar o ácido nucleico heterólogo em um fundo selecionado (por exemplo, uma linhagem de milho de elite ou exótica).
Métodos para Avaliar e Produzir Plantas de Milho Tolerantes à GLS
[00325] Criadores de plantas experientes podem reconhecer plantas de milho tolerantes no campo e podem selecionar as plantas individuais ou a população de planta tolerantes para criação ou para propagação. Nesse contexto, o criador de planta reconhece plantas de milho "tolerantes" e "não tolerantes", ou "suscetíveis".
[00326] Tais profissionais de criação de planta irão apreciar que a tolerância da planta seja um espectro de fenótipo que consiste em extremos de tolerância e suscetibilidade assim como uma sequência contínua de fenótipos de tolerância intermediária. A tolerância também varia varies devido os efeitos ambientais e à gravidade de infecção patogênica. A avaliação de fenótipos com o uso de ensaios reproduzíveis e métodos para pontuação de tolerância são válidos para os cientistas que procuram identificar o que locus genético transmite tolerância, seleção assistida por marcador de condução para populações tolerantes e características de tolerância à criação em linhagens de milho de elite através de técnicas de introgressão, por exemplo.
[00327] Em contraste com observações de campo fortuitas que classificam as plantas tanto como "tolerantes" quanto "suscetíveis", diversos sistemas são conhecidos por ganhar o grau de tolerância ou suscetibilidade da planta. Essas técnicas podem ser aplicadas em campos diferentes em ocasiões diferentes e fornecem pontuações de tolerância aproximadas que podem se usadas para caracterizar uma determinada cepa sem levar em consideração as condições de cultura ou a localização.
[00328] A presente invenção também é direcionada para métodos para produção de uma planta de milho através do cruzamento de uma primeira planta de milho genitor com uma segunda planta de milho genitor em que tanto a primeira quanto a segunda planta de milho genitor é uma planta de milho endógama da linhagem de PHJEP. Adicionalmente, ambas a primeira e a segunda plantas de milho genitoras podem ser provenientes linhagem de PHJEP de milho endógamo. Ainda adicionalmente, a presente invenção também é direcionada para métodos para produção de uma planta de milho derivada da linhagem de PHJEP de milho endógamo através do cruzamento da linhagem de PHJEP de milho endógamo com uma segunda planta de milho, do cultivo de semente progenitora e da repetição das etapas de cruzamento e cultivo com a planta derivada da linhagem de PHJEP de milho endógamo de 0 a 5 vezes. Dessa forma, qualquer um dos métodos que use a linhagem de PHJEP de milho endógamo é parte da presente invenção: autocruzamentos, retrocruzamentos, produção híbrida, cruzamentos para populações e similares. Todas as plantas produzidas com o uso de linhagem de PHJEP de milho endógamo como um genitor estão no escopo da presente invenção, incluindo plantas derivadas de linhagem de PHJEP de milho endógamo. Vantajosamente, a linhagem de milho endógamo é usada em cruzamentos com outros milhos endógamos diferentes para produção as sementes e plantas híbridas de milho de primeira geração com características superiores.
[00329] Deve-se compreender que o endógamo pode, através de manipulação de rotina de citoplasma ou outros fatores, ser produzido em uma forma masculina estéril. Tais modalidades também estão contempladas no escopo das reivindicações presentes.
[00330] Conforme usados na presente invenção, o termo planta inclui células de planta, protoplastas de planta, culturas de tecido de célula de planta nas quais plantas de milho podem ser regeneradas, calo de planta (plant calli), moitas de planta e células de planta que estão completas em plantas ou partes de plantas, como, pólen, óvulos, flores, núcleos de semente, corpo da espiga, sabugos, folhas, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras, inflorescência feminina e similares.
[00331] Duncan et ai, Plant (1985) 165:322-332 reflete que 97% das plantas cultivadas que produziram calos tiveram a capacidade de regeneração de planta. Experimentos subsequentes com ambas as endógamas e híbridas produziram 91% de calos regeneráveis que produziram plantas. Em um estudo adicional em 1988, Songstad et al., em Célula vegetal Relata (1988), 7: 262 a 265 relata diversas adições de meios que acentuam a regenaribilidade do calo de duas linhagens endógamas. Outro relatório publicado também indicou que tecidos “não tradicionais” são capazes de produzir embriogênese somática e regeneração de planta. K. P. Rao, et al., Maize Genetics Cooperation Newsletter, 60: 64 a 65 (1986), refere-se à embriogênese somática de culturas de calo de gluma e B. V. Conger, et al., Célula vegetal Reports, 6: 345-347 (1987) aponta embriogênese somática dos segmentos de folha de milho de cultura de tecido, dessa forma, está claro, no ponto de vista da literatura, que o estado da técnica é tal que esses métodos para obter plantas são e foram, "convencionais" no sentido de que eles são usados rotineiramente e têm alta taxa de sucesso.
[00332] Cultura de tecido de milho é descrita no Pedido de Patente Europeu, publicação 160.390, incorporado no presente documento a título de referência. Procedimentos de cultura de tecido de milho também são descritos em Green e Rhodes, "Plant regeneration in Tissue Culture of Maize", Maize for Biological Research (Plant Molecular Biology Association, Charlottesville, Va. 1982, at 367-372) e in Duncan, et al., "The Production of Callus Capable of Plant Regeneration from Immature Embyous of Numerous Zea Mays Genotypes," 165 Plant 322 a 332 (1985), dessa forma, outro aspecto da presente invenção é fornecer células que sob crescimento e diferenciação produzem plantas de milho que têm as características fisiológicas e morfológicas da linhagem de PHJEP endógama.
[00333] A utilidade da linhagem de PHJEP de milho endógamo extende-se também a cruzamentos com outras espécies. Frequentemente, espécies adequadas serio da família Graminaceae e especialmente do gênero Zea, Tripsacum, Coix, Schierachne, Polytoca, Chionachne e Thlobachne, da tribo Maydeae. Diversas variedades de grão de sorgo, Sorghum bicolor (L.) Moench podem ser potencialmente adequados para cruzamentos com PHJEP.
Sistemas de Deteccão/Correlacão Automatizados da invenção [00334] Em algumas modalidades, a presente invenção inclui um sistema automatizado para detecção de marcadores da presente invenção e/ou correlação dos marcadores com um fenótipo desejado (por exemplo, tolerância). Dessa forma, sistema típico inclui um conjunto de pontos de provas de marcador ou primar configurados para detectar pelo menos um a leio favorável de uma ou mais localizações de marcador associada com tolerância recém-concedida ou tolerância a GLS acentuada. Esses pontos de provas ou primar estão configurados para detectar alelos marcadores apontados nas tabelas e exemplos do presente documento, por exemplo, com o uso de qualquer formato de detecção de alelo disponível, por exemplo, detecção baseada em disposição de fase líquida ou sólida, detecção de amostra baseada em mícrofluído, etc.
[00335] Por exemplo, em uma modalidade, o locus marcador é PHM 15534, PHM 04694, PHM 01811, PHM 01963, PHM 05013 e PHM 00586, ou qualquer combinação dos mesmos, assim como qualquer um dos intervalos de cromossomo (i) BNLG1755 e UMC1299, (ii) BNLG1755 e BNLG1621A, (iii) BNLG1755 e MMC0371, (iv) BNLG1755 e ÜMC1702, (v) UMC156A e UMC1299, (vi) UMC156A e BNLG1621 A, (vii) UMC156A e MMC0371, (viií) UMC156A e UMC1702, (ix) UMC1142 e UMC1299, (x) UMC1142 e BNLG1621A, (xi) UMC1142 e MMC0371, (xii) UMC1142 e UMC1702, (xiii) UMC1346 e UMC1299, (xiv) UMC1346 e BNLG1621A, (xv) UMC1346 e MMC0371 e (xvi) UMC1346 e UMC1702, ou qualquer combinação dos mesmos e o conjunto de sonda está configurado para detectar o locus.
[00336] O sistema típico inclui um detector que está configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal do conjunto de pontos de provas de marcador ou primer, ou amplicon dos mesmos, assim, identificando a presença ou ausência do alelo. Uma vasta variedade de aparelhos para detecção de sinal está disponível, incluindo tubos multiplicadores de foto, espectrômetros, disposições de CCD, varredura de disposições e disposição, detectores de varredura, fototubos e fotodiodos, estação de microscópio, varreduras por sistema galvânico, ferramentas para detecção de amplificação de ácido nucleico microfluído e similares. A configuração precisa do detector irá depender, em partes, do tipo de etiquetamento usada para detector os alelos marcadores, assim como a instrumentação que é o que há de mais convenientemente obtido para o usuário. Detectores que detectam fluorescência, fosforescência, radioatividade, pH, carga, absorvância, luminescência, temperatura, magnetismo ou similares podem ser usados. Modalidades de detector típicas incluem detectores de luz (por exemplo, fluorescência) ou detectores de radioatividade. Por exemplo, detecção de uma emissão de luz (por exemplo, uma emissão de fluorescência) ou outro etiquetamento de sonda é um indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. Detecção de fluorescente é especialmente preferível e, em geral, é usada para detecção de ácidos nucleicos amplificados (entretanto, operações montantes e/ou ajusantes podem ser executadas em amplicons, que pode envolver outros métodos de detecção). Em geral, o detector detecta uma ou mais emissões de etiquetamentos (por exemplo, luz) de um etiquetamento de sonda, que é um indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador.
[00337] 0(s) detector(es) opcionalmente monitora(m) um ou diversos sinais de uma reação de amplificação. Por exemplo, o detector pode monitorar sinais ópticos que correspondem a resultados de ensaios sobre amplificação em "tempo real".
[00338] Instruções do sistema que correspondem à presença ou ausência do alelo favorável com a tolerância prevista também são uma característica da presente invenção. Por exemplo, as instruções podem incluir pelo menos uma tabela para consulta que inclui uma correlação entre a presença ou ausência do alelo favorável e a tolerância prevista recém-concedida ou a tolerância acentuada. A forma precisa das instruções pode variar de acordo com os componentes do sistema, por exemplo, elas podem estar presentes como software do sistema em uma ou mais unidades integradas do sistema (por exemplo, um microprocessador, computador ou meio legível para um computador), ou podem estar presentes em uma ou mais unidades (por exemplo, computadores ou meio legível para um computador) acoplados de forma operável ao detector. Conforme notado, em uma modalidade típica, as instruções do sistema incluem pelo menos uma tabela para consulta que inclui uma correlação entre a presença ou a ausência do alelo favorável e a tolerância recém-concedida prevista ou a tolerância acentuada. As instruções também incluem, tipicamente, instruções que fornecem uma interface de usuário com o sistema, por exemplo, para autorizar um usuário visualizar os resultados de uma análise de amostra e inserir parâmetros no sistema.
[00339] O sistema tipicamente inclui componentes para armazenar ou transmitir dados legíveis do computador que representam ou designam os alelos detectados pelos métodos da presente invenção, por exemplo, em um sistema automatizado. O meio legível para um computador pode incluir memória de cache, principal e de armazenamento e/ou outros componentes de armazenamento de dados eletrônicos (discos rígidos, disquetes, discos de armazenamento, etc.) para armazenamento do código do computador. Dados que representam alelos detectados pelo método da presente invenção também podem ser transmitidos eletrônica, óptica, ou magneticamente em um sinal de dados do computador embutido em um meio de transmissão sob uma rede como uma intranet ou internet ou combinação das mesmas. O sistema pode também ou alternativamente transmitir dados através de transmissões sem fio, IR, ou outras transmissões alternativas disponíveis.
[00340] Durante a operação, o sistema compreende, tipicamente, uma amostra que sede ser analisada, como um tecido de planta, ou um material isolado do tecido como DNA genômico, DNA genômico amplificado, cDNA, cDNA amplificado, RNA, RNA amplificado, ou similares.
[00341] A frase "detecção de alelo / sistema de correlação" no contexto da presente invenção refere-se a um sistema no qual os dados que entram em um computador correspondem a objetos físicos ou processos externos ao computador, por exemplo, um alelo marcador e um processo que, em um computador, causa uma transformação física dos sinais de entrada para os sinais de saída. Em outras palavras, os dados de entrada, por exemplo, a amplificação de um alelo marcador particular é transformada para um dado de saída, por exemplo, a identificação da forma alélica de um segmento de cromossomo. O processo no computador é um conjunto de instruções, ou "programa", pelo qual amplificação positiva ou sinais de hibridização são reconhecidos pelo sistema integrado e atribuído a amostras individuais como um genótipo. Programas adicionais correlacionam à identidade de amostras individuais com valores de fenótipo ou alelos marcadores, por exemplo, métodos estatísticos. Ademais, há diversos programas C/C++ para computação, programas Delphi e/ou Java para interfaces de GUI e ferramentas de produtividade (por exemplo, Microsoft Excel e/ou SigmaPlot) para mapear ou criar tabelas para consultas de correlações de características de alelo relevantes. Outras ferramentas de software úteis no contexto dos sistemas integrados da presente invenção incluem pacotes estatísticos como SAS, Genstat, Matlab, Mathematica e S-Plus e pacotes de modelagem genética como QU-GENE. Além disso, línguas para programação adicionais como visual são basicamente empregadas de forma adequadas nos sistemas integrados da presente invenção.
[00342] Por exemplo, os valores de alelos marcadores de tolerância determinado para uma população descendente de cruzamentos entre linhagens de elite são gravados em um meio legível para um computador, então, estabelecendo uma base de dados que correspondem a alelos de tolerância com identificadores únicos para membros de uma população de progênie. Qualquer pasta ou arquivo, tanto feito de forma personalizada quanto disponível comercialmente (por exemplo, de Oracle ou Sybase), adequado para gravar dados em um meio legível para um computador é aceitável como uma base de dados com contexto da presente invenção. Os dados que dizem respeito ao genótipo para um ou mais marcadores moleculares, por exemplo, ASH, SSR, RFLP, RAPD, AFLP, SNP, CAPS, marcadores de isozimas ou outros marcadores conforme descritos no presente documento são gravados similarmente em uma base de dados acessível para um computador. Opcionalmente, os dados de marcador são obtidos como o uso de um sistema integrado que automatiza um ou mais aspectos do ensaio (ou ensaios) usado para determinar o genótipo do marcador(es). Em tal sistema, dados de entrada correspondentes a genótipos para marcadores moleculares são restabelecidos de um detector, por exemplo, um banco de dados, um scanner, um CCD, ou outro dispositivo para detecção diretamente para arquivos em um meio legível para um computador acessível para a unidade de processamento central. Um conjunto de instruções do sistema (tipicamente embutido em um ou mais programas) codificam as correlações entre a tolerância e os alelos da presente invenção é, então, executado através do dispositivo computacional para identificar as correlações entre os alelos marcadores e os fenótipos de características previstos.
[00343] Tipicamente, o sistema também inclui um dispositivo de entrada de usuário, como um teclado, um mouse, uma tela sensível ao toque, ou similares (para, por exemplo, selecionar arquivos, recuperação de dados, análise de tabelas de informação do criador) e um dispositivo de saída (por exemplo, um monitor, uma impressora) para análise ou recuperação do produto da análise estatística.
[00344] Dessa forma, em um aspecto, a presente invenção fornece um sistema integrado que compreende um computador ou um meio legível para um computador que compreende um conjunto de arquivos e/ou uma base de dados com pelo menos um conjunto de dados que corresponde a alelos marcadores da presente invenção. O sistema também inclui uma interface de usuário que permite um usuário visualizar seletivamente uma ou mais destas bases de dados. Ademais, o software de manipulação de texto padrão tal como o software de processamento de palavra (por exemplo, Microsoft Word™ ou Corel WordPerfect™) e software de base de dados ou planilha eletrônica (por exemplo, software de planilha eletrônica tal como Microsoft Excel™, Corel Quattro Pro™ ou programas de base de dados tal como Microsoft Access™ ou Paradox™) podem ser usados juntamente com uma interface de usuário (por exemplo, uma GUI em sistema operacional padrão tal como um sistema Windows, Macintosh, Unix ou Linux) para manipular strings de caracteres correspondentes aos alelos ou outros recursos da base de dados.
[00345] Os sistemas opcionalmente incluem componentes para manipulação de amostras, por exemplo, que incorporam dispositivos robóticos. Por exemplo, uma armação robótica para controle de líquido para transferir soluções (por exemplo, extratos de célula vegetal) de uma fonte para um destino, por exemplo, a partir de uma placa de microtitulação para um substrato de disposição, é opcionalmente ligada de modo operável ao computador digital (ou a um computador adicional no sistema integrado). Um dispositivo de entrada para inserir dados no computador digital para controlar transferência de líquido com alto rendimento através da armação robótica de controle de líquido e, opcionalmente, para controlar a transferência pela armação para o suporte sólido é frequentemente uma característica do sistema integrado. Muitos de tais sistemas de manipulação de fluido robóticos automatizados estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, uma variedade de sistemas automatizados está disponível junto à Caliper Technologies (Hopkinton, MA, EUA), os quais utilizam vários sistemas Zymate que, tipicamente, incluem, por exemplo, módulos de manipulação de fluídos e robóticos. Semelhantemente, o robô comum ORCA®, que é usado em uma variedade de sistemas laboratoriais, por exemplo, para manipulação de bandeja de microtitulação, também está disponível comercialmente, por exemplo, junto à Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA, EUA). Como uma alternativa para robóticos convencionais, os sistemas microfluídicos para execução de manipulação e detecção de fluido estão no presente momento amplamente disponíveis, por exemplo, junto à Caliper Technologies Corp. (Hopkinton, MA, EUA) e Agilent Technologies (Paio Alto, CA, EUA).
[00346] Os sistemas para análise de marcador molecular da presente invenção podem, dessa forma, incluir um computador digital com um ou mais software de controle de líquido com alto rendimento, software para análise de imagem para analisar dados de etiquetas de marcador, software para interpretação de dados, uma armação robótica de controle de líquido para transferir soluções de uma fonte para um destino ligado de modo operável ao computador digital, um dispositivo de entrada (por exemplo, um teclado de computador) para inserir dados no computador digital para controlar a transferência de líquido com alto rendimento através da armação robótica de controle de líquido e, opcionalmente, uma varredura de imagem para digitalizar sinais de etiqueta de pontos de provas hibridizados etiquetados, por exemplo, para marcadores em um suporte sólido ligado de modo operável ao computador digital. As interfaces de scanner de imagem com o software para análise de imagem para fornecer uma medição de, por exemplo, intensidade de etiqueta de sonda de ácido nucleico mediante a hibridização para uma população de ácido nucleico de amostra exibida (por exemplo, que compreende um ou mais marcadores), em que a medição da intensidade da etiqueta de sonda é interpretada através do software de interpretação de dados para mostrar se e a qual grau a sonda etiquetada hibridiza um marcador de ácido nucleico (por exemplo, alelos marcadores amplificados). Os dados derivados dessa forma são, então, correlacionados com a identidade de amostra para determinar uma identidade de uma planta com um genótipo particular para marcadores ou alelos particulares, por exemplo, para facilitar a seleção assistida de marcador de plantas de milho com formas alélicas favoráveis de segmentos cromossômicos envolvidas em desempenho agronômico (por exemplo, tolerância recém-concedida ou tolerância acentuada).
[00347] As imagens ópticas, por exemplo, padrões de hibridização visualizados (e, opcionalmente, gravados) através de uma câmera ou outro dispositivo de gravação (por exemplo, um dispositivo para armazenamento de dados e fotodiodo) são opcional e adicionalmente processados em qualquer uma das modalidades no presente documento, por exemplo, pela digitalização da imagem e/ou armazenamento e análise da imagem em um computador.
Uma variedade de equipamento periférico e softwares disponíveis comercialmente estão disponíveis para digitalização, armazenamento e análise de um vídeo digitalizado ou imagem óptica digitalizada, por exemplo, com o uso de PC (por exemplo, máquinas baseadas em DOS™, OS2™, WINDOWS™, WINDOWS NT™, WINDOWS 95™, WINDOWS 97™, WINDOWS 2000™, WINDOWS XP™ ou WINDOWS VISTA™ compatíveis com Intel x86 ou Pentium), computadores MACINTOSH™, LINUX, ou com base em UNIX (por exemplo, estação de trabalho SUN™).
Exemplos [00348] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitam a presente invenção reivindicada. Deve ficar compreendido que os exemplos e modalidades descritas no presente documento possuem somente propósitos ilustrativos e os elementos técnicos no assunto irão reconhecer que vários reagentes ou parâmetros podem ser alterados sem se afastar do espírito da presente invenção ou do escopo das reivindicações em anexo.
Exemplo 1 Mapeamento de uma QTL de Grande Efeito para Tolerância A GLS
[00349] A Fonte de tolerância à GLS é incomum no germoplasma norte-americano (NA). Para criar uma linhagem elite para uso como uma fonte doadora para tolerância à GLS, uma PH14T de linhagem tolerante à GLS (patente n° US5.942.670) foi cruzada com PHN46 (patente n° US5.567.861) a fim de gerar uma população F1. Os indivíduos da população F1 foram, posteriormente, retrocruzados com PHN46 para gerar uma população de retrocruzamento BC5 de aproximadamente 190 indivíduos.
[00350] As populações F1 foram fenotipadas no campo para a tolerância à GLS. Os dados do marcador foram coletados em cada progênie individual com o uso de marcadores SSR com boa cobertura de genoma para gerar um mapa de marcador molecular para a população. A análise de QTL dos dados da população F1 identificou uma QTL para tolerância à GLS no Cromossomo 4, bín 5, entre os marcadores UMC1791 e UMC1346.
[00351] A população BC5 também foi fenotipada no campo para resistência à GLS. Os dados do marcador foram coletados em cada progênie individual com o uso de marcadores SSR, com boa cobertura de genoma para gerar um mapa de marcador molecular para a população. A população de mapeamento BC5 confirmou a lolização da QTL para tolerância à GLS e, mais precisamente, identificou a QTL para tolerância à GLS como estando proximamente ligada a BNLG1755. Esta QTL mostrou um efeito grande e consistente e explicou de 8 a 44% da variação fenotípica total (tabela 4).
Tabela 4 Tabela 4. Mapeamento de QTL de Regressão de Marcador Único de TolerAncia à GLS da População BC5 (Todos os Marcadores no Cromossomo 4 Exemplo 2 Mapeamento Fino da QTL para Tolerância A GLS
[00352] O mapa genético e físico integrado do milho foi usado para identificar todos os cotings de BAC localizados na região. As sequências finais de BAC de baixo número de cópias e os marcadores PHM destes contigs foram usados para desenvolver marcadores CAPs. Determinou-se que bacm2.pkO27.h10.f e bacm.pk098.d7 flanquearam o locus de GLS em um lado e bacm.pk022.b8 e PHM 7245 flanqueou no outro lado.
Exemplo 3 Desenvolvimento de PHJEP
[00353] Uma progênie individual derivou da geração BC4 que teve a região de QTL, um fenótipo mais parecido a PHN46 e um fenótipo de boa resistência foi selecionado. O indivíduo foi autofecundado para assegurar um genoma de homozigoto abundante. O endógamo resultante foi designado como PHJEP. A introgressão da QTL da GLS resultou em uma pontuação de resistência à doença para PHJEP de 4 (em uma escala de 1 a 9) em comparação a 1 ou 2 para PHN46. A Figura 6 demonstra a diferença fenotípica entre PHN46 e PH14T após a inoculação com Cercospora zeae-maydis.
[00354] A QTL foi adicionalmente retrocruzada formando PHN46. Uma progênie individual derivada da geração de BC7 (dose 8) foi selecionada, a qual teve a região de QTL recém-definida e um segmento menor de doador na região que flanqueia imediatamente a QTL. O indivíduo foi autofecundado para assegurar um genoma de homozigoto grande. Os endógamos resultantes foram PHW6N e PHW6M codificados. Estes endógamos foram encontrados para ter níveis de tolerância à GLS equivalentes a PH14T e PHJEP. Uma vez que a PHJEP foi desenvolvida primeiramente e não exibiu resistência à ligação ou outros efeitos deletérios devido à introgressão de QTL, PHJEP foi selecionado como o doador primário do QTL para a tolerância à GLS sobre PHW6N e PHW6M.
Exemplo 4 Haplótipo Exclusivo em PHJEP
[00355] A região doadora tropical em PH14T tem nucleotídeos SNP A e A em PHM 00045-01 e PHM 00043-01, respectivamente. O genitor recorrente PHN46 tem nucleotídeos G e G nestes mesmos locais marcadores. A introgressão do QTL de GLS do PH14T no PHN46 e a seleção subsequente para QTL sobre múltiplas gerações BC, enquanto seleciona-se um genitor recorrente em uma região de flanco, resultaram em uma recombinação logo acima do QTL de GLS e os nucleotídeos em PHJEP foram G (alelo PHN46) e A (alelo PH14T) para PHM 00045-01 e PHM 00043-01, respectivamente. O do QTL de GLS está localizado próximo ao centrômero do cromossomo 4 em uma região com baixa frequência de recombinação, A recombinação logo acima do locus de GLS em PHJEP é considerada como um evento de recombinação raro. Na criação subsequente, as populações entre PHJEP e outros endógamos, este padrão de nucleotídeo ou haplótipo, foram mantidas. Durante múltiplas introgressões de região doadora de GLS de PHJEP nos materiais elite, esta recombinação foi mantida. Um haplótipo que define a recombinação rara é: PHM 00045-01; G; PHM 00043-01: A; PHM 15534-13: A; PHM 04694-10: G; PHM 01811-32: T; PHM 01963-15: T; PHM 01963-22: C; PHM 05013-12: T; PHM 00586-10: T; e PHM 00049-01: A (vide Tabela 5). Uma inspeção de endógamos proprietários ou públicos determinou que este haplótipo fosse exclusivo para PHJEP. Esta combinação alélica é exclusiva no germoplasma do depositante.
Tabela 5: Haplótipos para Endógamos PH14T. PHN46 e PHJEP em Região de Cromossomo 4 que Contém a QTL oe GLS
1 =A, 2=C, 3=G, 4=T
Example 5 Análise de GLS de FH14T. FHN46 e PHJEP
[00356] Os PH14T, PHN46 e PHJEP foram cultivados em 4 localizações com 8 reproduções por local. As plantas de milho foram avaliadas para GLS em uma escala de 1 a 9, com um sendo "fraco" e 9 sendo "bom", [00357] As pontuações de GLS médias, com base em uma escala de 1 a 9, para PH14T, PHN46 e PHJEP foram 5,4, 3,6 e 5,3, respectivamente. O endógamo PHJEP teve um aumento de 1,5 em resistência à doença (em uma escala de 1 a 9} em comparação ao endógamo PHN46 e esta diferença foi significante em um valor p < 0,05. O endógamo PHJEP e a linhagem tolerante ã GLS PH14T tiveram pontuações similares para GLS.
Exemplo 6 Conversões de Outros Endógamos de Elite com PHJEP
[00358] O PHJEP foi usado como um doador para converter mais 40 endógamos diferentes para ter resistência à GLS. A Tabela 6 mostra uma comparação entre três destes híbridos e três híbridos produzidos a partir de fontes não-PHJEP.
Tabela 6 [00359] O rendimento (bu/a) é o rendimento (bushels/acre), ou seja, o rendimento do grão na colheita em peso ou volume (bushels) por área de unidade (acre) ajustada para 15% de umidade. Stagrn é a permanência verde, ou seja, a medição de saúde vegetal próxima ao tempo de formação de camada preta (maturidade fisiológica). Uma alta pontuação indica melhor saúde vegetal na fase tardia. GLFSPT é mancha foliar cinzenta, ou seja, uma classificação visual de 1 a 9 que indica a resistência à mancha foliar cinzenta. Uma pontuação mais alta indica uma resistência superior. CV% é o coeficiente de variância (expressado como uma porcentagem). SED é erro padrão da diferença.
Exemplo 7 Uso de QTL para Selecionar Plantas Tolerantes à GLS
[00360] Os marcadores SSR PHI026 [PHI079 ou GPC1 ou GAPC1 ou NC005], LGI145183 [BNLG1937], LGI455751 [BNLG1265], LG1135263 [BNLG1755], EST337321 [UMC1175], LGM 23864 [BNLG1189] e U MC 1346 foram usados para selecionar a região QTL doadora de PH14T durante retrocruzamento sucessivo. A fenotipagem também foi executada em gerações BC3 (270 indivíduos) e BC4 (110 indivíduos) de modo que a QTL pode ser adicionalmente validada e o local adicionalmente refinado.
[00361] Na população BC4, a QTL foi localizada em uma região definida por BNLG1755 e UMC1346 (Figura 2); uma distância de 4,4 cM no mapa de quadro Neighbors IBM2 2004. O QTL de GLS foi encontrado para explicar 55,1 % da variação ferotípica total. O efeito fenotípico médio do QTL foi maior que 2 na escala de doença GLS de 1 a 9.
Example 8 Eficácia em Híbridos [00362] PHJEP, PHW6N, PHW6M e o endógamo quase isogênico PHN46 que carece do GTL de GLS foram cruzados em sonda para PHP38, PH705 e PH05F, Os híbridos resultantes foram comparados em 16 locais de sonda de rendimento com 3 a 4 replicações por local. Os locais focalizaram sobre as regiões de cinturão de milho verde do leste. Catorze locais fornecidos renderam dados e 13 locais forneceram dados de tolerância à GLS. As versões tolerantes à GLS tolerante dos híbridos tiveram uma vantagem de rendimento consistente e tolerância à doença aumentada em comparação às versões não-tolerantes (Tabela 7), Na Tabela 7, 3394 é o híbrido formado através do cruzamento entre endógamos PHP38 e PHN46.
Tabela 7 [00363] Por exemplo, os híbridos com PHJEP tiveram entre 20,9 e 43,5 bu/acre de vantagem de rendimento e 1,7 a 2,7 de aumento em resistência à doença (em uma escala de 1 a 9). A Figura 7 demonstra o efeito do QTL de GLS em resistência híbrida.
Exemplo 9 Análise Baseada em Mapa do QTL de Tolerância à GLS
[00364] Os marcadores BNLG1755 e UMC1346 foram usados para identificar os cotings B73 4022, 4023 e 4024 subjacentes à região de QTL. Três marcadores CAPs (Polimorfismo Amplificado Clivado) foram projetados para BACs bacm.pk040.o17 (marcador PHM 00045), bcb.pk0333.o19 (PHM 00043) e bacm.pk022.b8 (PHM 00049) através do projeto de primer para as sequências finais de BAC e divagem dos amplicons resultantes (vide Tabela A). As mesmas sequências finais BAC foram usadas para projetar ensaios de marcador SNP invasor para aplicação em criação molecular com alto rendimento. Uma população BC7 de 4.464 RI indivíduos foi gerada e os marcadores CAPs foram usados para identificar progênie individuais com recombinantes na região. Esta progênie foi fenotipada para resistência à GLS no campo e também autofecundado para gerar adicionalmente progênie e permitir a fenotipagem mais precisa. Os dados fenotípicos e de marcador combinados foram usados para localizar a QTL para contig 4024. Os marcadores adicionais foram desenvolvidos para BACs (bacm2.pk065.b22.f, bacc.pk0267.m12.f, bacb.pk0241.h17.-f, chp2.pk0007.d2, bacc.pk0530.f13.f, bacb.pk0269.n19, bacb.pk0009.b21.f, bacb.pkOI 17.i09.f, bacc.pk0280.n12, bacb.pk0219.j20, bacc.pk0132.b16.f, bacb.pk0221.o22, bacb.pk0544.j18 e bacb.pk0540.c18.f) e uma EST percorre sonda (cl33021_1) neste contig. Estes marcadores CAPs adicionais foram usados para auxiliar no mapeamento fino e na clonagem com base em mapa.
[00365] Durante o processo de mapeamento fino, foi iniciado um projetado para sequencíar ESTs e BACs na região QTL com o uso de tecnologia de sequenciamento 454 de alto rendimento da Life Sciences. Vinte e cinco clones B73 BAC sobrejacentes que cobrem o intervalo entre bcb. pk0333.o19 e p0094.csstg88 foram reunidos e sequenciados por 454 Life Sciences. As leituras de sequência curta significaram que as sequências puderam não ser montadas para criar uma trajetória de cobertura, mas a sequência de amostragem profunda dos clones BAC {cobertura média 20 X) sugeriram que a região foi completa mente sequenciada. A anotação de sequência falhou na identificação de uma sequência que se assemelha á resistência à doença gene neste intervalo.
[00366] Durante este período, os marcadores CAPs adicionais na região foram usados para localizar adicionalmente a QTL para uma região entre a EST cl33021_1 e a bacb.pkQ009.b21.f terminação BAC. Isto é ilustrado na Tabela 8, onde o número de coluna de recombinantes descreve o número de plantas fora de 4.464 progêníes individuais que tiveram uma recombinação entre o marcador correspondente e a QTL. Os recombinantes zero mostraram que o marcador está muito próximo ao gene que causa o fenótipo de tal modo que a recombinação não pode quebrar a ligação forte entre o fenótipo (e, portanto, o gene) e o marcador. Os recombinantes zero fora das 4464 progêníes representam uma distância de recombinação menor que 0,02 cM.
Tabela 8 - Mapeamento Fino de QTL oe GLS com 4.464 Indivíduosoi Progêníes e Marcadores Desenvolvidos para Sequências de Terminação BAC
[00367] Dois clones BAC adicionais; bacb.pk0269.n19 e bacb.pk0009.b21 .f, foram sequenciados com o uso de uma técnica de sequenciamento aleatório por shotgun com filamento duplo (Bodenteich et a/., In "Automated DNA sequencing and analysís techiques" (ed. Adams et a/.), págs. 42 a 50, Academic Press, Londres, Reino Unido (1994)). Brevemente, após cada BAC ser isolada através de protocolo de lisato clareado de duplo acetato, os clones foram cisalhados por nebulízação e os fragmentos resultantes tiveram a extremidade reparada e subclonada formando pBluescript II SK(+). Após a transformação em DH-10B electro-competent Escherichia coli cells (InVitrogen) através da electroporation, as colônias foram colhidas com um colhedor de colônia automático Q-Bot (Genetix) e armazenadas a - 80°C em meio congelante que contém 6% de glicerol e 100 pg/ml de ampicilina.
[00368] Para sequenciamento, os clones foram recuperados a partir de culturas de glicerol arquivadas cultivadas/congeladas em placas de meio congelante com 384 cavidades e replicadas com um replicador estéril com 384 pinos (Genetix) em placas de microtitulação de 384 cavidades que contêm LB + 100 pg/ml de ampicilina (placas replicadas). Os plasmídeos foram, então, isolados com o método do kit de amplificação de molde de sequenciamento de DNA Templiphi (Amersham Biosciences). Brevemente, o método Templiphi usa polimerase de DNA de bacteriófago φ29 para amplificar DNA de cadeia dupla ou circular de cadeia única através da amplificação do círculo de laminação isotérmica (Dean et al., Genome Res. 11:1095 a 99 (2001); Nelson et al., Biotechnicals 32:S44 a S47 (2002); Reagin et al., J. Biomol. Tech. 14:143 a 148 (2003)). As células foram adicionadas a 5 pl de tampão de diluição e parcialmente lisadas a 95°C por 3 min para liberar o molde desnaturado. 5 μΙ de pré-mistura Templiphi foram, então, adicionados a cada amostra e a mistura de reação resultante foi incubada a 30° por 16 horas, então, a 65°C por 10 min para inativar a atividade de polimerase φ29 DNA. A quantificação de DNA com o PicoGreen(R) dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Pontos de provas) foi executada após a diluição das amostras amplificadas 1:3 em água destilada. Os produtos amplificados foram, então, desnaturados a 95°C por 10 min e foram submetidas ao sequenciamento da extremidade em placas com 384 cavidades, com o uso do M13 preparado por vetor de oligonucleotídeos e a versão ABI BigDye 3.1 Prism sequencing kit. Após a limpeza à base de etanol, produtos de reação do sequenciamento de ciclo foram convergidos e detectado no ABI 3730x1 sequenciador automatizado e sequenciadores individuais foram montados nos domínios públicos dos pacotes Phred/Phrap/Consed. Enquanto Phred lê os arquivos de características de sequenciamento de DNA, bases de chamado, assina o valor da qualidade para cada chamada base e escreve os chamados da base e valores de qualidade para arquivos de saída, Phrap usa base arquivos de sequenciamento à base Phred para montagem de dados de sequência de DNA por shotgun (vide o laboratório do site da Internet de Phil Green, Departamento de Ciências de Genoma, Universidade de Washington). Consed é uma ferramenta para exibição, edição e término de montagens de sequências geradas com Phred e Phrap (Gordon et al., Genome Res. 8:195 a 202 (1998)). Pedido de Contig foi exibido e confirmado por Exgap (A. Hua, Universidade de Oklahoma, comunicação pessoal), uma ferramenta de gráfico local que usa informação lida a par para pedir contigs gerados por Phred, Phrap e Consed e confirma a exatidão das montagens à base de Phrap.
[00369] A sequência montada que continha um gene de código de proteína explicado que parecia um gene R putativo do tipo classificado como uma cinase de proteína como LRB. A sequencia explicada é apresentada na SEQ ID NO:49 (com a sequência de aminoácido traduzida mostrada na SEQ ID NO:50). Os marcadores CAPs para bacb.pk0269.n19 foram encontrados para presidir na extremidade 3' do gene R putativo.
REI MVI Dl C AÇÕES

Claims (3)

1. PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO COM TOLERÂNCIA Â MANCHA FOLIAR CINZENTA, que compreende um locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter um primeiro perfil genético da dita primeira planta de milho para um intervalo cromossomal no cromossomo 4 entre BNLG1755 e UMC1299; (b) obter um segundo perfil genético a partir de uma segunda planta de milho que compreende o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, em que o locus está localizado no cromossomo 4 entre BNLG1755 e UMC1299; e (c) comparar dito primeiro perfil genético com o dito segundo perfil genético e compreender adicionalmente selecionar a dita primeira planta de milho se a mesma compreender o locus correlacionado com a tolerância à mancha foliar cinzenta, em que o segundo perfil genético compreende um ou mais alelos marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em: um nucleotideo A na posição 205 na SEQ ID NO: 55; um nucleotideo G na posição 263 na SEQ ID NO: 60; um nucleotideo T na posição 190 na SEQ ID NO: 65; um nucleotideo T na posição 71 na SEQ ID NO: 70; um nucleotideo C na posição 185 na SEQ ID NO: 75; um nucleotideo T na posição 107 na SEQ ID NO: 80; e um nucleotideo T na posição 114 na SEQ ID NO; 85,
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (i) o segundo perfil genético compreende: um nucleotídeo A na posição 205 na SEQ ID NO: 55; um nucleotídeo G na posição 263 na SEQ ID NO: 60; um nucleotídeo T na posição 190 na SEQ ID NO: 65; um nucleotídeo T na posição 71 na SEQ ID NO: 70; um nucleotídeo C na posição 185 na SEQ ID NO: 75; um nucleotídeo T na posição 107 na SEQ ID NO: 80; e um nucleotídeo T na posição 114 na SEQ ID NO: 85; ou (ii) o segundo perfil genético compreende: um nucleotídeo C na posição 185 na SEQ ID NO: 75; e um nucleotídeo T na posição 107 na SEQ ID NO: 80.
3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro perfil genético e o segundo perfil genético são adicionalmente definidos como sendo um intervalo cromossomal no cromossomo 4 entre BNLG1755 e MMC0371.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2476763A3 (en) 2007-08-29 2013-03-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for breeding for preferred traits
US8367899B2 (en) * 2007-12-31 2013-02-05 E I Du Pont De Neumours And Company Gray leaf spot tolerant maize and methods of production
US8237035B1 (en) * 2008-04-15 2012-08-07 Pioneer Hi Bred International Inc Maize variety PHVNV
US10897862B2 (en) * 2013-09-04 2021-01-26 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plant resistant to Helminthosporium turcicum
BR112016014568A2 (pt) * 2013-12-20 2017-10-24 Pannar Seed Pty Ltd método para identificar e/ou selecionar uma planta, método de introgressão de um alelo de locus, método para identificar uma planta
CN104094837B (zh) * 2014-06-20 2016-08-17 湖北省农业科学院粮食作物研究所 绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法
WO2018013323A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of making gray leaf spot resistant maize
CN107385044B (zh) * 2017-07-31 2020-10-27 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 球形孢子丝菌str分子标记及其应用
CN108739402A (zh) * 2018-06-24 2018-11-06 合肥扬扬农业科技有限公司 一种提高玉米杂交种子生产效率的方法
CN109705202B (zh) * 2019-03-04 2022-05-10 中国农业大学 一种培育抗灰斑病植物的方法
CN110246133B (zh) * 2019-06-24 2021-05-07 中国农业科学院农业信息研究所 一种玉米籽粒分类方法、装置、介质及设备
US20230295650A1 (en) * 2020-08-18 2023-09-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Multiple disease resistance genes and genomic stacks thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407956A (en) 1981-03-13 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle
EP0160692A1 (en) 1983-11-03 1985-11-13 DE WET, Johannes Martenis Jacob Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
EP0160390A3 (en) 1984-04-16 1987-04-08 Sandoz Ltd. Embryogenic callus and cell suspension of inbred corn
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
IL84066A0 (en) 1986-10-01 1988-03-31 Plant Cell Res Inst Genetic transformation and controlled regeneration of cucumis sp.plants in vitro
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5567861A (en) * 1990-06-20 1996-10-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred corn line PHN46
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5574210A (en) * 1995-06-06 1996-11-12 Zeneca Limited Gray leaf spot resistant corn and the production thereof
US6077697A (en) 1996-04-10 2000-06-20 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
EP0892808B1 (en) 1996-04-12 2008-05-14 PHRI Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
US5942670A (en) * 1998-03-10 1999-08-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred maize line PH14T
US6037130A (en) 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
FR2833615A1 (fr) 2001-12-14 2003-06-20 Genoplante Valor POLYMORPHISMES DU GENE CCoAOMT2 DE MAIS, ET LEURS UTILISATIONS POUR AMELIORER LA DIGESTIBILITE DES PLANTES
EP1874935B2 (en) * 2005-04-04 2023-10-18 E. I. du Pont de Nemours and Company Polynucleotides and methods for making plants resistant to fungal pathogens
CN101730748A (zh) 2006-09-28 2010-06-09 孟山都技术有限公司 玉米中对灰色叶斑病的抗性
EP2476763A3 (en) * 2007-08-29 2013-03-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for breeding for preferred traits
US8367899B2 (en) * 2007-12-31 2013-02-05 E I Du Pont De Neumours And Company Gray leaf spot tolerant maize and methods of production

Also Published As

Publication number Publication date
EP2653549A1 (en) 2013-10-23
WO2009088756A1 (en) 2009-07-16
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US9150933B2 (en) 2015-10-06
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US20090172845A1 (en) 2009-07-02

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