CN107385044B - 球形孢子丝菌str分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。本发明首次提供一套球形孢子丝菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括25个高度多态的微卫星位点(SEQ ID NO:1‑25)。同时，提供了一套能够高效扩增球形孢子菌群体的特导性引物(SEQ ID NO:26‑75)和检测条件。这一套球形孢子丝菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。
背景技术
孢子丝菌病是一种亚急性或慢性的皮下组织真菌感染，主要表现为皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的慢性肉芽肿性病变，可经血液、淋巴系统扩散累及心、肺、脑等脏器，具有一定的致残率和致死率。在我国，孢子丝菌病是仅次于念珠菌病和曲霉病的深部真菌病，主要流行于东三省，但在全国范围均有分布。
引起孢子丝菌病的主要病原真菌包括：申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)、巴西孢子丝菌(Sporothrix brasiliensis)、墨西哥孢子丝菌(Sporothrix mexicana)、白孢子丝菌(Sporothrix albicans)及申克孢子丝菌卢艾里变种(Sporothrix schenckii var.luriei)。各个菌种在地理分布、毒力及对抗真菌药物敏感性等方面存在差异。早期的形态学分析认为，我国孢子丝菌病的病原体主要是申克孢子丝菌，而最新的资料则表明，我国孢子丝菌病的病原体主要是球形孢子丝菌。
目前，用于球形孢子丝菌主要分子标记仍然是ITS、beta-tublin、Calmodulin等，但这些序列的种内多态性较低，无法满足球形孢子丝菌的分子溯源、群体遗传学和分子流行病学研究等工作的需要。因此，本发明所提供的种内高度多态的微卫星位点标记及其扩增方法，具体重要的意义。
微卫星，有时称为SSR(simple sequence repeats)，STR(short tandemrepeats)，VNTR(variable number tandem repeats)，指基因组DNA上的串联重复序列，重复单元一般为1-6bp，重复次数一般为5-40次。此为核心区域，而在其两侧有相对保守的侧翼序列。通过在保守的侧翼序列设计PCR引物，检测PCR产物的长度，可以进行遗传多态性分析。该检测方法具有多态性高，特异性好，共显性遗传，成本低，通量高等优点，因此在分子生态学、分子育种等方面已有着比较广泛的应用。而在病原真菌方面，目前应用相对较少，其中一个重要原在于真菌中的微卫星位点相对较少，获得微卫星位点信息的难度较大。
发明内容
本发明的目的是提供球形孢子丝菌STR分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的球形孢子丝菌STR分子标记，所述STR分子标记为SEQ ID NO:1-25所示序列中的任一个。
本发明还提供球形孢子丝菌STR分子标记组合，所述STR分子标记组合为上述STR分子标记中的任意两个或多个组合。
本发明还提供用于检测上述STR分子标记的引物或试剂盒。
25个STR分子标记对应的引物序列分别如SEQ ID NO:26-75所示。其中，SEQ IDNO:1所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:26-27，SEQ ID NO:2所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:28-29，SEQ ID NO:3所示序列的STR分子标记对应的引物序列为SEQ ID NO:30-31，以此类推。
本发明还提供所述STR分子标记单独或组合使用在球形孢子丝菌的分子分型、分子溯源、分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析中的应用。
本发明还提供所述STR分子标记的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取球形孢子丝菌的基因组DNA；
(2)合成SEQ ID NO:26-75所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR扩增；每个PCR管加入一对引物；
(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。
PCR反应体系为：2×Premix Taq(TAKARA，货号R004Q)10μL，10μM正、反向引物各1μL，纯水7μL，DNA模板1μL。
PCR程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56-62℃(表1)30sec，72℃ 40sec，33个循环；72℃ 5min。
表1球形孢子丝菌的微卫星座位
本发明进一步提供非诊断目的球形孢子丝菌检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:26-75所示的引物进行PCR扩增；每个PCR管加入一对引物；
(3)分析PCR扩增产物。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次提供一套球形孢子丝菌的微卫星位点(STR分子标记)组合，其中共包括25个高度多态的微卫星位点(SEQ ID NO:1-25)。同时，提供了一套能够高效扩增球形孢子丝菌群体的特导性引物(SEQ ID NO:26-75)和检测条件。这一套球形孢子丝菌的微卫星标记，不仅可以用于球形孢子丝菌的遗传背景分析和分子溯源，同时也可应用于球形孢子丝菌的分子流行病学、群体遗传学和系统进化分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1球形孢子丝菌STR位点的筛选/获得及引物设计
基于球形孢子丝菌的基因组测序结果(GenBank：LVYW00000000.1)，利用SciRoKo软件从基因组测序数据中分离出微卫星座位200个。经过筛选后，通过Primer premier 5.0软件设计了微卫星的相关引物共150对，并通过e-PCR对相关引物进行了初步验证。选择一株球形孢子丝菌，通过梯度PCR，对上述引物进行验证(同时判定其合适的退火温度)，其中107对引物能够稳定扩增。任选10株来源不同的球形孢子丝菌，进行遗传多态性检测后，最终得到25个能稳定扩增，且条带清晰的STR位点，具体如表1所示。
实施例2球形孢子丝菌的种群遗传多样性检测
1、球形孢子丝菌的基因组DNA提取
用购自北京康为世纪生物科技有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒(CW0569S)完成22株球形孢子丝菌的基因组DNA提取，操作流程参照试剂盒说明书进行。22株球形孢子丝菌由北京大学真菌和真菌病研究中心提供。
2、微卫星PCR扩增
利用本发明的微卫星位点特异性引物对步骤中所提取的22个球形孢子丝菌样品进行扩增。对球形孢子丝菌的微卫星标记特异引物进行荧光标记，方法为使用荧光染料对正向引物5'端进行FAM标记。
PCR反应体系为20μL，其中包括2×Premix Taq(TAKARA，货号R004Q)10μL，正、反向引物(10μM)各1μL，纯水7μL，DNA模板1μL。PCR程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56-62℃(具体见表1)30sec，72℃ 40sec，33个循环；72℃ 5min。
3、利用ABI 3730测序仪对扩增出的单色荧光标DNA片段进行多态性检测。检测结束后，使用GeneMarker v2.2进行位点分析。然后，以Cervus 3.0和GenAlEx 6.41对所得的群体数据进行计算，并对25个位点进行评估。结果如表2所示。
表2球形孢子丝菌的微卫星位点的基本信息
注：a，有效等位基因数目；b，多态性信息含量(polymorphic informationcontent)；c，个体识别率(discrimination power)。
其中，25个位点的平均PIC为0.4368，累积个体识别率为1.0000。
依据群体检测结果，球形孢子丝菌遗传多态性偏低，分子分型相对困难，但通过多个微卫星位点的组合，仍可获得比较好的分型效果。以上实验结果表明，本发明的25个STR位点是真实有效的，能够有效用于球形孢子丝菌的分子分型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 球形孢子丝菌STR分子标记及其应用
<130> KHP171114663.0
<160> 75
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcttatttt ttttcctgta ccctgtccaa ggatgatggt cagttcggca tgattctgat 60
caacgaatat ctcgcgactc tttggttccg gtagatcacc aaatcatcaa aacgatcaga 120
acgaaaggca ctatggaatc aacgagtagc gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180
gcacaacggc aatgaacaat gaacaacaac aaggataagg aaatgtagca gtgtgatatt 240
tcgtcgtcag caggtggagc cacggagaac caagaaactc aaaagcggga atacgcactg 300
gttcaacgtg catgattcgt gaccagggga 330
<210> 2
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtaatgca atgcatgtct ctcggtttcg gcatctgttg gcgcaagggg acgggcagct 60
gtgattggaa ggcaaggacc cggaccaagc tagagtggcc aagatgctac tcggacagga 120
ttgggagaag tcttttcgcc tagagagtgt ctctctctct ctctctctct ctctctctct 180
ctctcggtct tttgtgtcgt caaggatgtc cacgacatgc ttgttagtga ctaccgatat 240
gggcacaatt tgttttgttc ggcgttctgg atctcgttgg accgtcttac aaagtgtgtc 300
tggatggcct aaaggctaac ggagtcacta tc 332
<210> 3
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttttgcctg ttgtgctgca tttgaaactg cataaacaga acaagaagtg ctccatagtc 60
gtcaaagaat ctctatagaa cgcagtagtt catcctatct ttttgagacg gggcaagacc 120
aagcctctag cacattacaa cggtctttct gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 180
gtgtgccttt tttattgttt tttattcatt tatctccatg tctacggttc atctgttagc 240
tactaaacat attgcctccg tactccgtac cccgtcattc gcctctttga catttcttca 300
aatagcctgg tccttgtctg ttttgccaca tt 332
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaccgaaaa ccatttgctt ctgcacgatt cgtaagcgca gttacaagca gtggcacaga 60
tacgataatt atgtgacatg tgaacagatg ctgccaagct gtggtggatg gctgtaggat 120
actttttttc tttctttctc tttttctctt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgctg 180
atgtttcagg agaacatagg tacaggaagg atggctggcg agtcaacagt atatagcacg 240
gcgcattaaa gctttatttt tgttattgtc ggttctagat tttcatttct cgtccaggtc 300
ttcaagcgac taagttgata tgat 324
<210> 5
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggagagaaa gtagttccgg agacagaaga actagaaaga gtagaaaata aaatggtggg 60
tatacgtgca tcatgtttcc tcgtcgtgct gtacttcaaa ccaagatgag atggggtggc 120
acgggggagt agaggtagag aggtgaaatg gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180
gaagcgtaga gaaggtgtac aaaggtgaag gatgataagg gctgaaggta agtctggaag 240
ctgaataaca gcggccgtta tttcttttcc ttttctttgt tctcgggcgc gtcattctcc 300
cgggcagcat tgtccatctc gatagccgcc 330
<210> 6
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccacagac gccggcaaca gtctcgccga tagcaaaatc aacgaggtgt cgggcagtct 60
tatccagtcg ctgctcgatg ccatttcaga ccaagagatc gtcgccgatg ccgcgctcaa 120
ctatctttcg gcaggtacgt tgctgtccgt ctctctctct ctctctctct ctctctctct 180
cttcggaaca cctttgctaa cacacgtagg acgtgatacg gtcgcccagg gcctgacctg 240
gactttttat atgctcatga agcaccccga cgttgtcgac aagatccgtc acgaggtcca 300
gggtgtgctg cttgcaggcg acgacggcag cg 332
<210> 7
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcctctacg gcagatgcct ccacggctga cgccagtgag gccgcaaagg agggcgaggc 60
tgcgggcgag ccgttgagcg ccgccgatgc tacggctctg cgcaaggacc ttgagaccaa 120
gaccaaggag gctctcgagt ggaaggtaag ctctctctct ctctctctct ctctctctct 180
gatacatact acccactcgc ctctcacttt cctatgtact gaccatcccg ttaggacaaa 240
ttcctccgct ccgtcgccga cttccgcaac ctgcaggagc gcacacagcg cgagatccgg 300
tcggcacgcg actttgccat taccggcttc 330
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagcgtccaa ataggagcgg cgatggggga tggggatgag gaacagagga agttggtaga 60
tcgaggaagt ggcgtccgga aagacaaggc ctcatgcctg gctggtcgac cttcgccatc 120
tgtgtttgat gttagcaacg gaactgaaaa cacacacaca cacacacaca cacacacaca 180
cacacacggt attgttcaaa aaggacaaca tacatgataa aggctgcagc agcggcacat 240
gccacggcgc cgagggccac gtaaaggctc gtgcggtcgg cggcgggttc ttcgctcttg 300
gggaaggcaa ggctgggagt cgtggcggcc tcggcc 336
<210> 9
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggcgaccgt aagagggatt ttaggtttca caacgtagag ggcagaccaa aggggggaat 60
agcggacaga aagagggggc agtgattaaa ggcacggaat gaaatgggca ggaggatgca 120
acgaagcgtg cggctcattg cttcttgctc ggtggtggtg gtggtggtgg tggtggtggt 180
gttggcatca gctgttattg gtggcatcaa tcataatgac gggcagcaga tgttcatagg 240
cacaacccgg gacatgtgac ttgagcatct tcttcccacc cttctactgg gtatatattg 300
tcacccaata atctttgcca aaatggtaca 330
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttggtcgacc ggggcccgga aatgtttgac ggcatccggc cgccgcaccg agagcgcgaa 60
cggcggcaac agcgccgcgg cattggtagc ggcggaggtg gtggaggtgg tggtggagga 120
ggcagactcg gtggcggagg cgggggcagt ggtggtggtg gtggtggtgg tggcgccagc 180
ggccgtcgtc gcagacgcaa taggagaggc ggaggcggcg ggcggaagta cgacgactac 240
cggccaggac gcgacagtcg ggatgaccgt ggtggtgacc gtggtggtga ccgtggtggt 300
gaccgtggtg gtgaccgtcg g 321
<210> 11
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaaggaatgg caagaaaaac aaaaacgcca aaactcgcaa gcaaactata ggcaacacac 60
caccaaccca atcatctgct tgtcggcaga ggtggcactg gtggtgttgc cgtaccattt 120
gcattcgcat tcgcattgcc atttccttca tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg 180
gccatgtcct caatctcttc cgagtggccc aggaaccgcg ccacattgcg catctcgtag 240
tgcttcttgc gcatggcctc gaaccgtagg tgcttctcgc gctcctcggc gttcatgccg 300
gccatcgggt cgtcgccgtc gtgcacgctg 330
<210> 12
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcggggctg tgtcgtatcc agggggagga gggggaggcg gtggaccgcc attcccacca 60
gcaccacggg cactatacgc aaccgaaggc ggcggcggtg cgtcatcgat tggtcgaggc 120
cgcggcggta cggagaagcg cggaggagcc tgttgttgtt gttgttgttg ttgttgttgt 180
tgttgttgtt gttgttgttg ctgttgttgc tgctgctgcg gctgcacagg tccctgctgg 240
tgctggtgct gtggcggagg cggctggggt cctccttgcg gacctggcgg gtggccaagg 300
ccgatgcggt ttcgatcagg cgactcgtat ggcgacggac cacccgag 348
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcgacttcgg cagctgcagg aagccgatgc ggccgaggag gccagtgaca gccttgctgc 60
gcgagcgcgt gcgcgtgcga tcgaggccga ggaccatcac gtcatggaca gcctgcctct 120
gcaacaacag caacaacagc aactgttaga ggaggaggag gaggaggagg agggagaaga 180
agatccagag aatgtgccag acgcattgca gacggttacg gccctgccgc ttcggccggc 240
gcccccgact tccggcccgc agacccaact gggccgccca gacttctggt ccttgtccat 300
gtttggcttg ctgggctttg t 321
<210> 14
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaagccata gagaccgtcg ctgctggaac ccccgccact tccgtcacca tggggagcac 60
tggtggccgt gttgccatca acgctcatcg gtatggggtc aaagtcgacc agcatatcgt 120
tgaggtcgac tgggccctgt tggcccgttt gctgctgctg ctgctgttgt tgctgttgct 180
ggtgctgttg ctgttgctgg tgctgttgct gctgctcatt cggaaggttg ctaccccagg 240
cgagcacagg atggccggcg gttggcgacg aaaggaggtc gtacgagacg ggcaccgtgc 300
tggcgccgga gtcga 315
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagggagaat ggtcgccagg acaccgtcgc aaaaacaacc aaactgatca aacgaacctc 60
attgctttct gaaggtggaa ggtgtcaaac ctagcctgct gctcgaccac atacacactc 120
agcgagctgg tcctgcggcg cgcgcgcgcg ctctctctct ctctctctct ctctctctct 180
ctctctttct ctctctttct ctctctttct ctctctgcct ctctctgtgt ctctcgccgc 240
gcgtcccggt atcttcactc caggccacgc gcctgctgct cgtctgcttc tctcgtattc 300
ttcttctatt cccctattcc ctcttttcgc agaaaa 336
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcagcaagct gcaccgcaaa tggtactggg tgcgcgtctt gccgcctatt ctgtggcact 60
acacagcctc gccttctgac gacgccgccg gtgccaccac cagcaacagc gccgtgtcga 120
cgcccgagag tagcattctt acacattccc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 180
agaacaagcg cgttgtcaag tggtctggct tcgccgagct gattggcatc attaagaacc 240
atgccgacct gctgtcgctc ggccacgacg tcgacattgc cgcgctcaac ggcggccgcg 300
cttttgcgcc cgactctgac ttctcgtcct 330
<210> 17
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctggtggtgt ctcgtctgca tcggtcctct cgagctcagc aagcgacgtc tttagtaacg 60
gcaaaaagac accaacggcc gaatctgcag caggaattat cggttcgacg gccgacaacg 120
gcaaaaccct cggtcaggaa caggcgacac agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 180
agcaggacgg atctgaaccg gtcgcatcgt ccagccttct cgaccctcag ctggtgtccc 240
aagagcttgg cgacctttcc ggaacacaga atgccgcaga agaggcaatg gtcgactcca 300
tgttcccaga caactttgac tggtcgtcgc tgc 333
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aggctcctgg ctgctacgac tttaagcgcg tagctgccat gcttgtctct gtggacgatg 60
tccacgccac agcctccggc acaccttccg aaccgtccat gtctgcgcct gcccgccgcc 120
cgtctccgag tggctcgcaa cggaagggtc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 180
agcagcagca acagcacttc tctcttggtc ggcacaacag tgccagcatg agtgagacgg 240
acctcctcgt tcagcaggag aagctgcgcc gcatgaccat gcctgtcgtt ggcgctgccg 300
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<210> 19
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<400> 19
ttatgttggt ttcttccttt tcaactcacg ttgttatcgc ttgtctctcc cgttagtgtg 60
tcgtcttact ttctcgcttt cttgcttctt ttacagcgct ttctattaat cgagacagtc 120
gagacgagac agaaacgggg ctccacggac tcctcctcct cctcctcctc ctcctcctcc 180
tccgtgggct caagcggaca caaccgccgc cagccaaatt cgaacccacc tatgcgcaac 240
cccagatcca gctccagctt ccagaaccag gcgtcaggca cctgagcccc agacatcgac 300
ccgacttccg cctcacacca ccaccctctc gct 333
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgtaccgccg agatgttctt ttaccgcgaa ggtgtcacgg ccgctgttgg cgaagaggcc 60
ggtcggagtc ttgtggcgga gtggctgtcc gagtggcggg atcgggtcgt ggccagtgat 120
aaggccgcag ccgaggctga cagcagtagc accaccacca ccaccaccac cacgagcaaa 180
gaacgcgagg agcgccgcat ccgcgccatg aaagccgtta accccaattt tgtgccccgc 240
ggttgggtgc tggacgaggt cattcgtcgc gtcgagcgcg acggcgagcg cgacgtgctg 300
cgccgcatta tgcacatggc g 321
<210> 21
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
taccgttcga cggcgagcgg acaacggcgt cggggatggc gctgtgattc atgcgattgg 60
agggcgcgga tgcagcagca gaggcagcgg ccgcaatcga agcgttgtat tggtacggat 120
aagaaggatg aggaggggga gaatacagtt gctgctgctg ctgctgctgc tgctgttgct 180
ggtgttgctg cttcttctga tgctgatatt gctgatagtc ggccgtgagg aactcgccgc 240
caggtaggtt gggcgagggg ttcgagagcg acggggtgcc tgcagagggc agatggcgcg 300
gcgacgagga cgtggacgag gacg 324
<210> 22
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccagcagcct ctcgacgaca tcgacagccc cggctatcct ccgctttcca atccagccag 60
cgcgacaagc tttggctaca cacaaacgca acagctcccg cagcagggcc agctgactta 120
ccagcaacaa caaccgtacc cgtcgcaaca gcagcagcag cagcagcagc ctcacaacaa 180
gagccacggc cgctacagac aaaacgacga caaagcatcc aagtcctcca acttcttctt 240
ccactttggc aagtcgtcat ccgctgccaa atcttctgaa aggctcgcat ccagcagcac 300
ggctccggtc aactccac 318
<210> 23
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgagaatga gactttctac gcagtcgctt gcacgcgctg ctgcgctccg gggctgccaa 60
cgggcatcat cggctgcacc gttttcgaga gctgcatgcg ccggcgtgcg gcgatttgcc 120
acagcccagt cgacggccag cgaggcccaa gcagcagcag cagcagcagc agcagcctcc 180
gacaaccacg tgcacattgt cgaggttggc ccgcgtgatg gcctccagaa cgagaagcgg 240
gcgatcccac tggcgaccaa gatcgagctg attgagcggc tagccaagac gggtctgggg 300
accatagagg ccggctcgtt tgtg 324
<210> 24
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cccgcacatc aacaacccga atgcgccgcc cgttggcgtc ggtgtcggcg gcatgacaat 60
ggacccggcc gcgtttatgg ccgcgaacca ggcccagttc aatcccgttg cgggcaaccc 120
gtacgccagt ccacaacagt tgatggcgat gcagcagcag cagcagcagc agcagcaaca 180
gggcggcacc accaatggcg ggccgatgcg caacgcgtcg ccctccttcc agaaccccat 240
gtaccagacc aactcggtca ttccatcaaa acggccgcgt ccacgcgagg acagcattgc 300
cgcgtcacct cgccagaatg ccggcat 327
<210> 25
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtcacaccac gacccgaact cggcgctggc ccgcgacatg ggccacgagc ccatcgagcc 60
caccaccccg cacaagccag tggcgccatc tgccgtggcc cagcgcacac ctcaccacga 120
cacatccagc caggccacgc cgcgccagat gcagcagcag cagcagcagc agcagcttgc 180
caaggaaaat ataccaccct acgacccgaa cgatttcgcg cccgttccgc acgacccata 240
ccctctggat ggcatgacca tgctctgccg cacaaacaat ggcgggccgc agtcggacct 300
ggggtcccag ctcagctcca acag 324
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
accctgtcca aggatgat 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cctgctgacg acgaaata 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggacaggatt gggagaag 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
taagacggtc caacgaga 18
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
agaagtgctc catagtcgt 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gctaacagat gaaccgtag 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
caagcagtgg cacagatac 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agacctggac gagaaatga 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tgcatcatgt ttcctcgtc 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agcccttatc atccttcac 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ggtgtcgggc agtcttatc 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acctcgtgac ggatcttgt 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tctacggcag atgcctccac 20
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttgtcctaac gggatggtc 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gggatgagga acagaggaa 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gaccgcacga gcctttacg 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cggcgaccgt aagagggat 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
aagggtggga agaagatgct 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cggaaatgtt tgacggcatc c 21
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tcgcgtcctg gccggtagt 19
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ggcagaggtg gcactggt 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gcatgaacgc cgaggagc 18
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ggaccgccat tcccacc 17
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gccatacgag tcgcctg 17
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
cagcctgcct ctgcaaca 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
aaagcccagc aagccaaa 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
cgccacttcc gtcaccat 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ctcctttcgt cgccaacc 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tgctttctga aggtggaa 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
cctggagtga agataccg 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cgcaaatggt actgggtg 18
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
caggtcggca tggttctt 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
cgtctgcatc ggtcctct 18
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
cttctgcggc attctgtg 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tcctggctgc tacgactt 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
agcttctcct gctgaacg 18
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ctcacgttgt tatcgcttgt 20
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tgcctgacgc ctggttct 18
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
cggagtcttg tggcggagtg 20
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
atgacctcgt ccagcaccc 19
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
cgctgtgatt catgcgattg g 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tacctggcgg cgagttcctc 20
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
cggctatcct ccgctttcc 19
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ctgctggatg cgagcctt 18
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
actttctacg cagtcgcttg ca 22
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
atcgcccgct tctcgttct 19
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gcgtttatgg ccgcgaacc 19
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
cggcattctg gcgaggtga 19
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
ccacgagccc atcgagccca cc 22
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tccgactgcg gcccgccatt 20
Claims (3)
1.检测球形孢子丝菌STR分子标记的试剂在球形孢子丝菌的分子分型、分子溯源、群体遗传学和系统进化分析中的应用；
其中，所述球形孢子丝菌STR分子标记为SEQ ID NO:1-25所示序列中的任一个。
2.非诊断目的球形孢子丝菌STR分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取球形孢子丝菌的基因组DNA；
(2)合成SEQ ID NO:26-75所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5'端进行标记，获得荧光标记的引物组；
(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用步骤(2)荧光标记的引物组进行PCR扩增；
(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行多态性检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用的PCR反应体系为：2×PremixTaq 10μL，10μM正、反向引物各1μL，纯水7μL，DNA模板1μL；
PCR程序为：95℃5min；95℃30sec，56-62℃30sec，72℃40sec，33个循环；72℃5min。
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