CN108456685B

CN108456685B - 三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因及其应用

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Publication number: CN108456685B
Application number: CN201810389985.XA
Authority: CN
Inventors: 王玲; 黄世文; 刘庆; 刘连盟
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN108456685A

Abstract

三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因及其应用，属于分子生物学领域。本发明一方面公开了三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因序列，另一方面公开了三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因在检测水稻穗腐病菌中的用途。本发明的优点在于，基于产生伏马毒素的三种镰刀菌的基因组序列信息中获得小种特定基因，通过小种特异的核酸序列检测病原菌，检测引物具有很好的特异性，能从目标菌株中扩增出特异大小的条带。本发明的特异基因、引物与检测方法可以用来快速、简便、准确区分引起水稻穗腐病的三种伏马毒素产毒菌株。

Description

三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因及其应用。

背景技术

镰刀菌（Fusarium spp.）属于半知菌亚门瘤座菌目。镰刀菌种的鉴定所依据的显微特征主要包括：1、大孢子的形状、顶细胞和基细胞的特征；2、有无小孢子及其小孢子的形状和着生方式；3、分生孢子梗的特征和瓶梗类型；4、厚垣孢子有无和着生位置；5、菌落的生长速度和颜色等。戴芳澜的《中国真菌总汇》将镰刀菌分为16个组、51个种和45个变种。由于其种类的变化丰富、分类器官较为复杂、采集分类的纯培养物在培养过程中由于培养方法不当很容易发生变异，镰刀菌的形态学鉴定是比较困难的。随着生物技术的发展，镰刀菌的分类研究越来越多的引入分子生物学技术，如限制性内切酶长度多态性（RFLP）、随机扩增多态DNA（RAPD）、限制性长度多态性（AFLP）、序列特异性扩增区（SCAR）、单链构象多态性（SSCP）以及DNA测序技术等。将分子生物学技术应用于镰刀菌分类研究，克服了一些可能在观察评价中存在的困难。

我国引起水稻穗腐病的病原菌有多种，主要有层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、藤仓赤霉菌（Fusarium fujikuroi）。这些菌株还可侵染许多重要作物，如玉米、高粱、水稻、小米、芦笋等。在侵染作物的同时，因产生大量的真菌毒素如伏马毒素、镰刀菌酸、镰刀菌素和白僵菌素等，严重影响食品安全和人畜健康。其中，伏马毒素与神经鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇的结构极为相似，可通过抑制N-脂酰基神经鞘氨醇合成酶，阻断神经鞘氨醇合成，破坏鞘脂类的代谢或影响鞘脂类的功能。伏马毒素已被证明能造成马脑白质软化症、猪肺水肿和老鼠肝癌，与人的食管癌发生可能有关。因此，近十几年，世界各国及有关国际组织对伏马毒素给予了高度关注。

比较基因组学是利用某些基因组图谱和测序获得的信息推测生物基因组的基因数目、位置、功能、表达机制和物种进化的学科。比较基因组学的发展与基因组数据的积累密切相关，目前已经成为研究生物基因组的最主要手段之一。目前，已知拟轮枝镰刀菌、层出镰刀菌、藤仓赤霉菌、尖孢镰刀菌和茄科镰刀菌等镰刀菌全基因组测序工作已经完成，大量的基因组信息为镰刀菌属真菌比较基因组学提供了研究数据。

传统方法检测产生伏马毒素的镰刀菌需进行培养，依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐，时间周期长，而且准确性差。而分子检测手段大多以β-tubulin、ITS、EF和IGS等分类学基因为基础，设计组特异性引物进行PCR扩增检测。但是，由于分类学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，并不能有效直接揭示镰刀菌的小种类型。因此，建立可靠的PCR检测体系是必要的。

本发明通过层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌全基因组的比较，获取各个小种的特异基因及其检测方法，为水稻穗腐病病原菌的快速鉴定提供工作基础，目前国内外尚未见基于病原菌全基因组的差异检测水稻穗腐病的报道。同时，研究结果能为镰刀菌系统学研究提供新的思路，为利用特异序列探讨镰刀菌的系统演化关系、物种分化、生物地理等问题提供理论基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于基于层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌全基因组水平的差异，通过生物信息学手段获取其特异基因，提供层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌小种的检测方法。

本发明目的是这样实现的：

所述的三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因，所述的三种产生伏马毒素镰刀菌小种包括层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌，其特征在于所述的层出镰刀菌的特异基因含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述的拟轮枝镰刀菌的特异基因含有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所述的核苷酸序列，所述的藤仓赤霉菌的特异基因含有SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列。

所述的一种鉴定层出镰刀菌的特异基因的引物，其特征在于鉴定层出镰刀菌SEQID NO.1所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.2所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.3所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.4所示的特异基因的引物为SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

所述的一种鉴定拟轮枝镰刀菌的特异基因的引物，其特征在于鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.5所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.6所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.7所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.8所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.9所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.10所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列。

所述的一种鉴定如权利要求1所述的藤仓赤霉菌的特异基因的引物，其特征在于鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.11所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.12所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.13所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.14所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ IDNO.15所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.16所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.17所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.53和SEQ IDNO.54所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.18所示的特异基因的引物为SEQ IDNO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.19所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.20所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列。

所述的一种鉴定产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定引物，其特征在于该引物为SEQID NO.61和SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列。

所述的一种鉴定产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）鉴定伏马毒素的引物序列分别为SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列；

（2）PCR反应体系为：水稻穗腐病菌菌株基因组DNA 50ng，10μM正反向引物各1μL，2.5mM dNTPs 4μL，10×PCR buffer 2μL，5U/μL Taq聚合酶0.3μL，加ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，54℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min；扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，若凝胶电泳图中有900bp的条带，则判断该水稻穗腐病菌能产生伏马毒素。

所述的一种利用多重PCR扩增技术检测水稻穗腐病菌产生伏马毒素的层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）从感穗腐病的稻穗上采集组织，经分离、筛选和辨别水稻穗腐病菌的菌落；

（2）提取待检测菌株的DNA；

（3）产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定：取鉴定伏马毒素的引物序列SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列对待检测菌株的DNA进行扩增，扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，若凝胶电泳图中有900bp的条带，则判断该水稻穗腐病菌能产生伏马毒素；

（4）多重PCR引物的组合：选取产生伏马毒素镰刀菌小种的层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌特异基因的PCR扩增片段大小两两相差200bp以上的引物进行组合；

（5）多重PCR扩增：以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增；

多重PCR反应体系为：菌株基因组DNA 100ng，三对10μM正反向引物各1μL，三对正反向引物包括层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌的特异基因引物，2.5mM dNTPs4μL，10×PCR buffer 2μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，加ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃复性40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min；

（6）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观测特异基因的DNA条带有无，判断菌株隶属于镰刀菌小种的类型。

所述的检测方法，其特征在于所述的步骤（3）中引物通过以下引物组合得到：

鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.1所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.2所示的特异基因的引物为SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.3所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.4所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.5所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.6所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.7所示的特异基因的引物为SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.8所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ IDNO.9所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.10所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.11所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.41和SEQ IDNO.42所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.12所示的特异基因的引物为SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.13所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.14所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.15所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.16所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.17所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.18所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.19所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQID NO.20所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列。

所述的检测方法，其特征在于所述的步骤（3）中PCR反应体系为：待检测菌株的DNA50ng，10μM正反向引物各1μL，2.5mM dNTPs 4μL，10×PCR buffer 2μL，5U/μL Taq聚合酶0.3μL，加ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，54℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。

所述的检测方法，其特征在于所述的步骤（6）若凝胶电泳图中含有该小种特异基因的目标条带，判定鉴定菌株隶属该小种类型。

本发明的优点在于，基于产生伏马毒素的三种镰刀菌的基因组序列信息中获得小种特定基因，通过小种特异的核酸序列检测病原菌，检测引物具有很好的特异性，能从目标菌株中扩增出特异大小的条带。本发明的特异基因、引物与检测方法可以用来快速、简便、准确区分引起水稻穗腐病的三种伏马毒素产毒菌株。

附图说明

图1为层出镰刀菌FPRO_11168基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为层出镰刀菌；

图2为层出镰刀菌FPRO_03917（SEQ ID NO.1）基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为层出镰刀菌；

图3为拟轮枝镰刀菌FVEG_00345基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为拟轮枝镰刀菌；

图4为拟轮枝镰刀菌FVEG_05583（SEQ ID NO.5）基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为拟轮枝镰刀菌；

图5为藤仓赤霉菌FFUJ_09076基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为藤仓赤霉菌；

图6为藤仓赤霉病菌FFUJ_02076（SEQ ID NO.11）基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-14为藤仓赤霉菌；

图7为伏马毒素fum1基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳带M为DNA标准物，1-6为层出镰刀菌；7-10为拟轮枝镰刀菌；11-14为藤仓赤霉菌；

图8为待测菌株伏马毒素fum1基因进行PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA标准物，1-14为待测菌株；

图9为待测菌株小种特异基因进行多重PCR检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA标准物，1-14为待测菌株。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实例1：三种镰刀菌小种全基因组的比较

为了进行镰刀属小种的功能基因组比较，考虑到数据的可得性、代表性和重要性，从NCBI数据库中下载层出镰刀菌ET1菌株（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2434）、拟轮枝镰刀菌7600菌株（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/488）和藤仓赤霉菌58289菌株（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/13188）的全基因组序列，包括基因、蛋白序列及基因注释信息。利用全基因组序列比对mGenomeSubtractor在线分析软件（http://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/mGS/），对这三个镰刀菌全基因组序列进行两两比对（E值设为1e^-5），筛选出每个小种中特异性的基因片段。当基因的蛋白质序列Blastp的覆盖度小于30%，定义为特异基因。

经筛选，获得了在层出镰刀菌中存在，而在拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌中不存在，且有明确基因功能注释的基因8个。GenBank序列号分别为FPRO_05386、FPRO_03917、FPRO_07227、FPRO_11473、FPRO_04096、FPRO_11168、FPRO_15809、FPRO_15979。

经筛选，获得了在拟轮枝镰刀菌中存在，而在层出镰刀菌和藤仓赤霉菌中不存在，且有明确基因功能注释的基因12个。GenBank序列号分别为FVEG_00345、FVEG_00444、FVEG_00525、FVEG_01597、FVEG_01938、FVEG_05583、FVEG_07762、FVEG_08293、FVEG_13508、FVEG_14010、FVEG_14121、FVEG_16307。

经筛选，获得了在藤仓赤霉菌中存在，而在层出镰刀菌和拟轮枝镰刀菌中不存在，且有明确基因功能注释的基因12个。GenBank序列号分别为FFUJ_02076、FFUJ_14407、FFUJ_05322、FFUJ_02091、FFUJ_02099、FFUJ_03591、FFUJ_03592、FFUJ_05363、FFUJ_05430、FFUJ_09076、FFUJ_08896、FFUJ_12659。

实例2：层出镰刀菌小种特异基因的获取

步骤1：供试菌株

所采用的层出镰刀菌来源广泛，菌株采集分离自国内不同省份，基本涵盖了目前水稻穗腐病盛行的区域。

步骤2：形态学鉴定

根据菌株的大孢子和小孢子的形状和着生方式、分生孢子梗的特征、菌落的生长颜色等，经形态学鉴定后确定为层出镰刀菌。

步骤3：菌株培养

将菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（马铃薯200g，葡萄糖18g，琼脂20g，蒸馏水1L，PDA）上，取生长5d的菌块移入100mL 的马铃薯葡萄糖液体培养基（马铃薯200g，葡萄糖18g，蒸馏水1L，PDB），在恒温摇床中28℃、120 r／min 振荡培养7d后，收集菌丝。

步骤4：菌株DNA快速提取

（1）样品的预处理：取20 mg 菌丝放在2 mL离心管中，加入500 µL ExtractionBuffer缓冲液（1 M KCL，100 mM TrisHCl，10 mM EDTA，pH=8）；

（2）研磨：置离心管于快速核酸提取仪中，设60 HZ，研磨1min；

（3）离心：4℃下,12000rpm离心10min；

（4）沉淀：将400µL上清液转移至新离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温静止10min，4℃下，12000rpm离心10min；

（5）洗涤：去除上清液，加入700µL 70%乙醇，震荡混匀，4℃下，12000rpm离心5min，洗涤2次；

（6）溶解：真空干燥10min，将DNA溶于ddH₂O中，于4℃保存。

步骤5：EF基因的分子验证

根据蛋白质翻译延伸因子（EF）基因的保守序列设计特异引物，EF1 (5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’)和 EF2 (5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’) ，对菌株进行PCR扩增。PCR反应体系为：菌株基因组DNA 50ng，正反向引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCR buffer 2μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.3μL，加ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃复性30s，72℃延伸40s，30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物测序后，在镰刀菌TEF序列数据库（FUSARIUM-ID v 1.0）中提交序列进行比对，最终经筛选挑选层出镰刀菌，用于下一步实验。

步骤6：层出镰刀菌特异基因的筛选

利用实例1中8个层出镰刀菌的特异基因设计引物，进行PCR验证。PCR反应体系为：菌株基因组DNA 50ng，正反向引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCR buffer 2μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.3μL，加ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃复性40s，72℃延伸1min/1kb，30个循环；最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观测DNA条带有无。

经鉴定，FPRO_05386、FPRO_11473、FPRO_11168、FPRO_15809基因的特异序列不能在所有菌株中扩增出条带，如图1为FPRO_11168基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。FPRO_03917（编码蛋氨酸-tRNA连接酶，SEQ ID NO.1）、FPRO_07227（编码酪氨酸酶，SEQ IDNO.2）、FPRO_04096（编码异戊酰辅酶A脱氢酶，SEQ ID NO.3）、FPRO_15979（编码非核糖体肽合成酶，SEQ ID NO.4），这4个基因的引物序列可以稳定的扩增出层出镰刀菌的特异片段（表1），如图2为FPRO_03917基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

根据实例2的结果可以确定，如果鉴定出的待测菌株中存在SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列，则该菌株为层出镰刀菌。

表1 三个镰刀菌小种的特异基因序列及其引物序列

。

实例3：拟轮枝镰刀菌小种特异基因的获取

步骤1：供试菌株

所采用的拟轮枝镰刀菌来源广泛，菌株采集分离自国内不同省份，基本涵盖了目前水稻穗腐病盛行的区域。

步骤2-5：同实例2，经形态学鉴定和EF基因的分子鉴定，筛选的拟轮枝镰刀菌用于小种特异基因的分析。

步骤6：拟轮枝镰刀菌特异基因的筛选

利用实例1中12对特异基因设计引物，进行PCR验证。PCR反应体系为：菌株基因组DNA 50ng，正反向引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCR buffer 2μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.3μL，加ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃复性40s，72℃延伸1min/1kb，30个循环；最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观测DNA条带有无。

经鉴定，FVEG_00345、FVEG_00444、FVEG_00525、FVEG_01597、FVEG_01938、FVEG_14010均不能在所有菌株中使用，如图3为FVEG_00345基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。FVEG_05583（编码细胞色素b5还原酶，SEQ ID NO.5）、FVEG_07762（编码β-葡糖苷酶，SEQ ID NO.6）、FVEG_08293（编码水杨酸羧化酶，SEQ ID NO.7）、FVEG_13508（编码dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶，SEQ ID NO.8）、FVEG_14121（编码过氧化物酶体多功能β-氧化蛋白，SEQID NO.9）、FVEG_16307（编码CMGC蛋白激酶，SEQ ID NO.10）这6个基因的引物序列可以稳定的扩增出拟轮枝镰刀菌的特异片段（表1），如图4为FVEG_05583基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

根据实例3的结果可以确定，如果鉴定出的待测菌株中存在SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的序列，则该菌株为拟轮枝镰刀菌。

实例4：藤仓赤霉菌小种特异基因的获取

步骤1：供试菌株

所采用的藤仓赤霉菌来源广泛，菌株采集分离自国内不同省份，基本涵盖了目前水稻穗腐病盛行的区域。

步骤2-5：同实例2，经形态学鉴定和分子鉴定，挑选了藤仓赤霉菌的菌株用于筛选小种的特异基因。

步骤6：藤仓赤霉菌特异基因的筛选

经鉴定，经PCR扩增，FFUJ_05322和FFUJ_09076均不能在所有菌株中使用，图5为FFUJ_09076基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。FFUJ_02076（编码MFS转运蛋白，SEQID NO.11）、FFUJ_14407（编码反转录转座子hobase，SEQ ID NO.12）、FFUJ_02091（编码转座酶，SEQ ID NO.13）、FFUJ_02099（编码凝集素核心蛋白AGA 1，SEQ ID NO.14）、FFUJ_03591（编码天冬氨酸转氨酸，SEQ ID NO.15）、FFUJ_03592（编码2，4-二羟基-2-烯-1，7-二酸醛缩酶，SEQ ID NO.16）、FFUJ_05363（编码α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶II的前体，SEQ ID NO.17）、FFUJ_05430（编码金属-β-内酰胺酶结构域蛋白，SEQ ID NO.18）、FFUJ_08896（编码阿拉伯呋喃糖酶，SEQ ID NO.19）、FFUJ_12659（编码β-内酰胺酶，SEQ ID NO.20）这10个基因的引物序列均可以稳定扩增出藤仓赤霉菌的特异片段（表1），图6为FFUJ_02076基因特异引物扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

根据实例4的结果可以确定，如果鉴定出的待测菌株中存在SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示的序列，则该菌株为藤仓赤霉菌。

实例5：产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定

步骤1：检测菌株为层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌。

步骤2：镰刀菌伏马毒素合成基因通用引物设计：根据伏马毒素合成基因fum1序列，比对层出镰刀菌（FPRO_13593）、拟轮枝镰刀菌（FVEG_00316）和藤仓赤霉菌（FFUJ_09241），设计通用引物SEQ ID NO.61（5’-TCAGGGCAACATCTTCAA-3’）和SEQ ID NO.62（5’-GACGAGGTCGGTGTCATT-3’），扩增片段大小900bp左右。

步骤3：产生伏马毒素镰刀菌的特异扩增：PCR反应体系为：菌株基因组DNA 50ng，正反向引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCR buffer 2μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.3μL，加ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，54℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观测DNA条带有无。如图7所示，所有菌株均能扩增出900bp左右的片段。说明层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌均能产生伏马毒素。

实例6：水稻穗腐病菌多重PCR检测

步骤1：水稻穗腐病菌株的分离：从水稻感穗腐病稻穗上采集组织，并且将采集的组织切成2mm³左右的小块，接种在水琼脂（琼脂20g，蒸馏水1L）培养基上生长48h后，挑取顶端菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中，作为水稻穗腐病菌菌株样品。

步骤2：提取待检测菌株的DNA：同实例2的步骤3和步骤4。

步骤3：产生伏马毒素镰刀菌的鉴定：通过伏马毒素fum1基因特异引物SEQ IDNO.61和SEQ ID NO.62的扩增，筛选出产伏马毒素的镰刀菌。如图8所示，待测菌株样品6号-14号的凝胶电泳图中有900bp的条带，表明这9个菌株能产生伏马毒素。

步骤4：产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定：

（1）PCR引物的组合：选取层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌特异基因的PCR扩增片段大小两两相差200bp以上的引物进行组合，以便于PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中的辨别。本实例中选取SEQ ID NO.1（FPRO_03917）、SEQ ID NO.5（FVEG_05583）和SEQ IDNO.11（FFUJ_02076）。

（2）多重PCR扩增：以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增。多重PCR反应体系为：菌株基因组DNA 100ng，三对正反向引物（10μM）各1μL（包括层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌），dNTPs（2.5mM）4μL，10×PCR buffer 2μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.4μL，加ddH₂O补足20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃复性40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

（3）1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，观测DNA条带大小。如图9所示，待测菌株样品中有5个菌株（6号、9号、11号、13号和14号）含有1015bp的目标条带，表明其为层出镰刀菌；2个菌株（7号和10号）含有687bp的目标条带，表明其为拟轮枝镰刀菌；2个菌株含有307bp（8号和12号）的目标条带，表明其为藤仓赤霉菌。如果需要还可以通过对电泳得到的目的条带进行回收测序来进一步判断。

本发明中的多重PCR反应体系能够同时快速特异检测三种引起水稻穗腐病的层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌、藤仓赤霉菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异基因及其应用

<160> 62

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2463

<212> DNA

<213> 层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)

<400> 1

atggagagta gaagaatcag ttcgaacgtc gaacttttgc gcaggcagac caatcctcta 60

ccaacccctg gccagcgaaa tgtactggtg acgagcgccc tcccttacgt caacaatgtc 120

ccccatctag gtaatatcat tggcagtgtt cttagcgcag acgtctttag tcgatataac 180

aaagcccgga accgtactac cctgtatgtt agtggaacag acgagtacgg aaccgcggcc 240

gagacgagag cattgcagga gggcgtcacg cctcaggagc tctgcgacaa gtatcatagc 300

cttcaccgtc agatatatga ttggttcgat atcgacttcg actattttgg ccgcactgct 360

accccgaagc agactgagat ctcgcaacat atctttacca gccttcatcg caatagcctt 420

ctcgaggagc aggcggcact gcaaccctac tgtccggaac acaatgcatt ccttgccgat 480

aggttcattg aaggaacttg cccacgttgt cagtatgaag atgcgagagg ggatcagtgc 540

gataagtgtg gcaatctcct cagcgcattg gagttggtca acccgcgttg caagctcgat 600

ggcgctgccc ccgctccaag ggagacaaga caccagtatc tacgcttaga caagcttgag 660

gagcgagtcg cgaactggtt ttctgcatcg gtcaaggctg gaggctggtc caaaaatggt 720

gctcgtataa cagagacgtt gctgaaagaa ggcttgattc cccgccccat cacacgagac 780

ctcaaatggg gaaccccagt acctcttccg ggatacgaga gcaaggtact ctacgtctgg 840

tttgacgcgt gcattggata catatccatt acagctagtc acacccctga ttgggaactt 900

tggtggagaa gtcctgacga ggtgaagctg tatcagttca tgggtaagga taacgttcct 960

ttccattcca tcgtttttcc atcgactctt attggaaccg gggagacatg gaccaagtgt 1020

cactacctcg acgcgacaga ctacctcaac tatgaggatg gcaagttctc caagtcacgg 1080

ggcattggag tctttggcaa cgatgccgcg gctactggtc taagtgcctc tgtgtggaga 1140

tgctatcttc tctcaactcg tccggaaact ggcgacacac gatttgattg gacatcgttt 1200

atgttcaaga acaactcgga actcttgtcc aatctcggta acttggccaa ccgcttgatc 1260

aagttcacca tcaagcactt caacggtcgt gtcccggatt atccacccga aatcaacaac 1320

gaatctttct cgtctctgag ccaagatgtc aaccagctcc tggccaaata cctcgacagt 1380

atggaagctg tgcgcctacg ttctggttta gaaatagcaa tgggcatttc aacccgtggc 1440

aatcaatacc tcactgagaa tgcttttggc tcggcattag tggctgatga cttcgatcga 1500

gctgcttctg tggtagccca tgggctcaat cttgtgtacc ttctttctgc attgatctac 1560

ccatatatgc cctctacagc cgcagatatc acggctcaac tcaatgcacc cctacgtgct 1620

atccccgagc agtggaatgg ccaggactta cttccggggc accagattgg cgaacccaga 1680

cacctcttcc ggaaaattga taagaagcag attgaggaat ggcgccaacg ctttggtgga 1740

actgccgaac tctctggcaa caacagcatc ccaggcaacg ccaactcagc gaaggtgagg 1800

cagcagcaga aagagccaaa gggaggtcca ggagaagcca tgaggtcttt tttgccaggg 1860

atgattgatc tgagagtcgg caaaatatta cgtgcagttg aacatccaaa tgctgactct 1920

ctatacgttt cgaccattaa ctgtggcgat ctccctggta cagccaacac agcctgggat 1980

gaggagtatg gaaccacagt gcggactgtc tgctctggtc tgaacgggaa gattccactt 2040

gtcgacctcc aaggacgacc agtcgtggtc gtggccaacc tgaagcctgt caacatgaga 2100

ggcgtcaggt cagcagcaat gcttctggcc gccgagcctc gagatagccg tgatggaggg 2160

tcctgcatcg agctagttga accacctact gatgctagga ccggggagcg attgcatttc 2220

gaaggatggg agagctgcac gcctgaccca gtgttgaagc ctaaggaaaa gctttgggat 2280

atcttgcaag tggcactatc gactaattct aagcgagagg tcgtcatcct ttcggacaag 2340

attattgcaa acgtggcacc ttcatctttc aacggagtgt cagggtcaag cgacagtaga 2400

ttggtgagca acaatggttt gtcctgctcc gtcacgagct tagaccacgc cattgtgagg 2460

taa 2463

<210> 2

<211> 1503

<212> DNA

<213> 层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)

<400> 2

atggccaaag tcgtcaccag aaaaaacatc cggaccatgc cggctaacga gcgcgatgac 60

cttgtcagag cgttcgcagg tatccagaag cttgacccta ctaaccccaa ctcctttttt 120

atgattgctg gctatcatgg cgaacctttc cgtggtgctg gttggggtaa tcctcaatgg 180

tggggaggat actgtaacca tggcaatgtt ctctttccta cctggcaccg tgcttacctc 240

caccggcttg agaaggctct ccagtccatt gttcccggtg tcgctatggc atattgggat 300

gagacggagg aagagtctct caagtacgga atcccggaat acttcctgac acccacgtac 360

acttgccaga acaaggaagt cattgatccc aatccgcttt actcttacaa gttccaagca 420

aacatcacag atcatctgtc ccccatccct gatgctaatt actccaaggc cgctggttat 480

cagacagtgc gctacccatt ctcaggtctc gttggcaccg agaaggaccg ggcgaagact 540

aaggtccata acgacacgct caatgacttg ggcatagcca agacgaacca gatgctcaat 600

gggaacattg tcacctggct caacgaggtt acatttgaca atgacgaggg tacgaccatc 660

aaggccaatg tcaggtacaa gtacggagct tgcttgaatg cacccaacta tactgtcttc 720

tccaacacca cttctgccca gcagtggaat gacgatagag ccggtacaga tggctatgtt 780

cccattgttc ctcttgaatc cccgcacaac tcgatccatc tggccgttgg aggtttccag 840

cttgagaaga tcgatgcgga ctttaaccag tacaccggag ccaatggcga tatgggtgag 900

aatgatactg ccgcctttga tcccatcttc ttcttccacc actgcttcgt cgatcttgtc 960

ttctatgagt ggcagaggaa gaacaacgcc cttcagtcaa ttgacatcat tcagggttac 1020

ccaggtacca actctgttga cagccaaggc ccaacccccg gtgtcgccgg cggaacttgg 1080

ttgaccctcg acagtgctct cgatccgttc aagaagcctg gtagtgagac tgaccccatg 1140

acgtcccgag atgttgtcaa tcccgagagc ctgggctaca actaccagta caactacaac 1200

acacccaacg atttcaacgc cggcgatccc gccctcttcg ttcccaagca cgaagaaacc 1260

cccatccttg ctgtcagtaa cattaaccgc gcggcaatcg gcggctcgtt catgattact 1320

gcatttgtta agaataagaa cacgggagcg atgcagcttg ctggtactga agcagtgctg 1380

agccgttggc atgtcgctgg ttgcgcgaac tgccagaacc atttggaagt caggactcat 1440

atcccgcttc atggatggag caaggaaaag gccgataaag caacagcaga ttccaagctt 1500

tag 1503

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)

<400> 3

atgtcacaat caaccgcaag ggcactacaa cgtgtcaagg gtagttgcag cccctccttg 60

tggcgaagtc cgccccatgg attcgccagg cgctcatttt ctgccacctg ctcgagacgc 120

ctcatggaca cgagcggctt ctcagatacg caattgactg ttcgagaagc tgtcagtcag 180

ctgtgttcca attttcccaa tacctactgg caggaaagag atcaggccga acaggatcct 240

caagacttcc atgctgccct tgccaaggac ggttggctag gcatagccct ccccgaggcc 300

ctcggcggtt caggcctagg catctccgag gcggtcatga tgatgcaaac cattaccgag 360

agcggcgcgg gcatggcagg cgcccaggcg attcatgcga atgtctatgc cacgcagccc 420

ttagcaaaat tcggcacaga gaagcagctg caaagcacaa tacccaacat cattcaaggc 480

aaatggcggg tttgttttgg tgtcacagag cctaatagtg gtctcgatac attacggctg 540

accaccacgg ctaccaaaca accagatggc tcctatcgcg ttagcggcca aaagatctgg 600

atcacctgcg cccaagtcgc atctaagatg attctgttgg cgcgaactgc tccattggat 660

ccgaagaagc cgagccatgg attatctctt ttctgtatcg atctcaacag agaccagcaa 720

ggcctagacc tgcgcaagat cagaaagatg ggagggaaag ctgtcgatgc aaatgaggtc 780

ttctttgaca attatagcat tcctgctgac agccttatcg gagatgaagg acagggcttc 840

aagattatcc tgcatggcat gaatgccgag cgttgtcttt tggctggcga ggctcttggt 900

cttgggtacg cagctttaaa caaggcggcc gagtatgcta gggaccgaac tgtcttccag 960

cgtcccatcg gccaaaatca ggctatagca cacccacttg cagatgcata tatgaagctt 1020

gaagccgcca agcttatgac ctaccatgcc gccagactct acgacgacag cagcaaagaa 1080

ggctcctccg ctgatgccaa gataagccct gcttctgtgg gcgtcgcatg taacagtgcc 1140

aagtatatgg cagctgaggc ggccttcaca gcctgcgaac gagctgtcct gacgcatggt 1200

ggtatgggat acgcggctga gtacgacgtg gaacgatggt tcagagagtg ccttgtccct 1260

cgcatcgccc ctgttagccg cgaaatgatt cttaactaca tcagcgagaa ggttctggcg 1320

cttcctcgta gctattag 1338

<210> 4

<211> 13074

<212> DNA

<213> 层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)

<400> 4

atgtcaacat ctcctgagct gtacatctcc tacctcgcca ttctcaaagc tggcctcgca 60

ttctccccac tgcccacgga cgctcctctc gaacgaattc gcgagctcct ggaggacatt 120

gcgcctccta tcgtgctcgg tatcggtggg aaaccggatg tatgggccag ccagggtatc 180

cagactccct ggattgatgt cactgaggta tctcgatgga acctcttgtc aaaccaaggc 240

acgtcaagtg aagatacagg atgcaccttt cagccacgcc ctattgccaa taatgcgttg 300

gcttatttgc tcttcactag cgggtctact ggaaagccca agggtgtcca agtgtctcat 360

tcatcagcca cttgctcgat agcatcccac tcaacagcta tttctcttcc ggataggaac 420

gatggcggtt tccgctggtt tcagtttgca gcgccaacct ttgacccttc catcatggaa 480

atcttcgtca ccttgagcaa cggagggacc ctatgcgccg cgccaagagc tttgaccttg 540

acagaccttg aaggttcaat caatgaaact ctcaagtctc tgtggtgcat gggtgaaaag 600

ctcaatcgaa cagtgattga taactttggc acgcgatcac cagataaccc atacacccta 660

gccaatttct acggaccaac tgaggctgcc atcaactgca cggttctgtc gcctgtcaag 720

tactcagtcc gaggatcaat cattggcgaa gccctcccaa catgttctat gtttatactg 780

gatcatgaga gccaagtacc gaagctagtc ccggctggat ttgttggaga gcttgccatt 840

ggtggccagc aagtcagcga agggtacatg caccgacccg aagagacggc cagagcctat 900

gtatcaagtg aggaatatgg tcgactgtat cggactggtg atatggcccg cattgtttgg 960

gataagtctg gccgacagct tatagagttc cttgggcgga tcagcttgga tcaagtcaaa 1020

ctgagcggac gtcgtgtaga actaggcgag atcgagtcgg ttctctccac tgtctctggg 1080

gtgactgagc tagtcgctac aattgccaaa gcaggtggta gtcgagaggg aattgagcat 1140

attgttgctt gcattgtggc gaatgtgcag tcatcagatc aaaggcagaa gcttgttgac 1200

agttgctgtc aaaaaagcga cagcttcttg ccttcctaca tgcgaccctc gagatacacc 1260

ttcctcgaca gtctgccgcg atcaagctct ggcaaagttg atcgtaagaa agtccactcc 1320

gagatactgg catcagatgt atctcaatct ttcagtgctt ctagtgagaa tcagtgtcta 1380

ctcaccacgg aggacgagct tgagtcgaac tgtgaagctt tgcagagctc gactctgact 1440

ctcctcatga cagcgattgg cgagaccgtc ggtgaaacaa gctctgccat cagcccagag 1500

atgtcgcttg catcggctgg actggacagt ctcggagcag tgcgtctcct tcagaaattg 1560

agagatcatt cgatcacggg gctggaggtc ggagatgtcc tccaatctgg cactataaaa 1620

gctttgatag ccaaagtagc gctcaccact cgaccccaag tctcaatctc aaagggcgcc 1680

gaggatgaag tggaacttcg gagggttctt ggtgctttcg ccgagagaaa cttgccggtc 1740

tgcgccgagc aacttggggt ccatgaggat cgaattcaga ctgtgttgcc aactacagcg 1800

actcaatctg gaatgcttgc cagctttctg cgaagctcaa acaagccagt tggttcaact 1860

ccagcttatg tctatcattc agtcatgcca gtccgtaacg gcatagatat tgaaagattt 1920

aaacgagtct gggacattgt gatcagtagc tatgactctt tcaggacggt cttctgcccc 1980

atggatgatg acatgtctcc tttcgctcag tgcatcctca agacaaggga tgacttcgcc 2040

gaacctactt ggagcacata tagccatggc ctggaacatg acgattataa tagcacggtt 2100

gagctggcct gtcgaaacgc cgaagccaaa attgatattg gctcgaaccc ctcgcacatt 2160

tctctcatct cctccgagac ccagtccact gttttactga gcatgttcca tggtatattt 2220

gatggtggct ctctgcaaat tctcctgcaa gatgtgacag aagcttatgg aggacggcct 2280

ttgccgaagc gtacgccctt ggagcacatt gtctatcatc acttctcagt cgaccctaag 2340

gcgactgcgc tgttctggaa taaacatcta gaaggccatt cgccagtcgc gttcccatca 2400

ctcactccac ttcgcccact ctcaagcatc aagacgcata tgatcgaggt cagctccctt 2460

atcgggcaca gggagctgaa aacggcatgc aagagcatgg gcgtgacgcc tctctccgta 2520

cttcaagcag cgtgggcttc gatattactg gcgtattctg gaacttcgga acaagatgtt 2580

gtgattggaa gtgtagtctc tgggagactg gatcctcgaa ctgagaactg catcggccct 2640

acattcacca ctatacctat ccgcctcaca caggaggacc attaccacgg tagagccgag 2700

tggaccaacc gttccgtcgc agagtctctc gtatcatcaa acgccgcagc actgtcacat 2760

cttcagcctc gccttggctc agtagtcaca gctgacggcc gacttcccta cgacacacta 2820

ttatcttacc aggacttcaa tgtcgggtct gaatctgagg gtatatggac ttcaattcat 2880

catcctccta tggcaaacga cttcaaagtc atgttggaag tctggccagg acatgactcg 2940

cggctattac tcagggctac tttcaacgat gagtgtatgg attgtgaggc tgctgagctg 3000

atgctccgtg agatgagttg gaccatatct aacatcctca aaaatccgga tgagagcttc 3060

tcgggaaact cttttattgg tgatgcgtca ctacgatcct gcatttatcc agctcagcct 3120

caagagtttg ctccaaacac actcattcat tctcagttcg aagcccacgc agtatcgaat 3180

cctgacgacc acgctttaat tttcagaagc aatctactcg acgaggatag tccagccaac 3240

atctgctgga cttatgcaga cctcaatgcc aaggctcaat cccttgcgga ccacatggta 3300

tccatcctgg gaccattgac aggaaccgtt gttcctgtcc atatcgagaa gagcccggca 3360

ctatacgtgg ccatcctggg tactctgaag gctggtgctg cttggtgtcc tatcgatgtc 3420

ttttctccgg cccagcgtcg ccaagaactc atcgttcgaa ccgaagggca actagtttta 3480

gtttcatctg ccgattctat tgggatggag ggagctttgc cagatggcgt tatacccatc 3540

gatgtgttgc ctttcacgcg aaattctaag tatgatgtga acttccaagc caacgagcca 3600

cgcatcaccg atccaacgaa gatggcatat atgatctgga ccagtggtac cactggtgct 3660

cccaagggcg tacctatcaa ccattcttct gcttatactg ctatcaatgc tctgattgaa 3720

gccattcccg gaacgcgaga tgggcagccc gttcggtgcc tccagttttc acagcccaca 3780

ttcgacgtgt tcattcagga cctgtttttc acatggagct ctggcggcgt gttgatctct 3840

gcgccacgag aggtgatgct tggttcgttt gcggagctcg ccaacgtgac cggtgcgact 3900

catgctcatc ttacccccac attctcggct ggacttcaga gggctgattt caagactcta 3960

cagacaatca ccatgattgg cgagaagctt ccgcagcccg ttgctgacga ctggggacag 4020

aacatgagag ctttcaacac gtatggtccg gctgaggcaa caattgtttc tacgcttcgc 4080

gagtttggaa acgagcacaa gagtgtcaag agcggaaaca ttggctggcc cttgaagtcg 4140

gtctctgtat tcgtaactcg cgagaggaaa ctcgttatga agcatgccgt tggagagctt 4200

gcgttaggtg gcccccagct gtctcctggc tatttgaaac agtccgaaac aaacaagcag 4260

aagtatgtgt ggaacgggga agtaaatgag gtcctctatt ataccggaga ccttgttcga 4320

atgctttcag atggttcgct ggaatatatc agccgaacag atgatcttgt caagcttggc 4380

ggtattcgcg ttgaacttag tgagatcagt ttctctctgc gccattgtca ccctttagcc 4440

gaaggtatcg aaaccatggt tctcaatcgt cctgaccgac caaatgacgc tgttgtggct 4500

ttcatcgctg caccacaagc tgtcaaattg ggtcaagaag taccgaccat tctcttgaac 4560

gacactgcga ttagcattgc tcgcgccgca atcagggaag catctatgtc tttgcccgat 4620

cacatgaaac catcaacctt cgttgttgtt ccgagcatcc ccaaaacgca gtcagccaag 4680

gcagatcgac gcgcgcttca ggctctgtat acggacttgg atgttgatgg ctgggagaaa 4740

gcttgcaatg tcccaaatga ggatctcaaa gggccagccg ttgagattga ttgcgaggta 4800

aaggatagtg tcatacagaa tatttcgctt ttgtcccaca tcgagccaac ctcttttacc 4860

gagtcaagca ggctccgtag tttgggcatc gactccatta gagctattcg tctcgcgtca 4920

cgattgaacg aagctggcta tcgtctcccc gtcgttgatg tcctccagtg cgaaactgtc 4980

agagatcttg cccttttggc cagttcggga tccaaagctt cgcaggcaaa gaacttggtt 5040

gatctcgagg aatttaatca gaaatggcac cgacagttgt cagccttgat tccggggggg 5100

ttctttgttt gccccgcaaa gaccattcag gaaggttttc tcagtgaaac attgaccact 5160

tcagcaatgt attggagcca tcactctttc gctcttcact cagatgtcga cattggcaaa 5220

ctcaagcagg cgtggcagac tgtctgtcgg agtaacgagg ctcttagagc ctgtttcctt 5280

ccagttgccg cccttcaaaa gcaggcatat ggccacgaaa acgattcaga tatccttcag 5340

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<213> 拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)

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<213> 拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)

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gctcagattg ttgcttccac tggagtcgat gcggtcatta ttgattgcga gcatggccac 180

attagagatg actccatgca tgacgccacc gccgccatcg ccgctgcggg tgtctcgccg 240

cttgtccgtc taagaatgac ccatcctgac cttatcaaga gagctctgga cagtggtgca 300

catggcataa ttctacctca agtccacact gcccaagaag caaccgaggt agtaaagtac 360

tccaagttcc caccgcaagg tctccgggga caaggatcac catttgcggg ttttgctcac 420

aacgtcgata tcgcgacata cgtcaagaca gcaaacgaaa caactatcgt gtgtgttcag 480

attgaatcga ggcaaggagt cgataacgtg gatgcaatct gtgctgtccc aggcgttgat 540

atggccttta tcggacccaa tgatctggcc ttttctcttc tcggctatat acccgccaag 600

ggtgacgagc ccgagtttct agatgcgatt gacaaaatcg tcgcagcggc ccggaaacac 660

ggaaagtggg tggcccgatt atcaaactct ggcgctttat gtaaggagca tttggatgtg 720

tttgatacgg tggctttgag ctatgatgtt agggcgattc agaattggta tgctgcagaa 780

ctcaaggctg caaggggcta g 801

<210> 17

<211> 1044

<212> DNA

<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)

<400> 17

atgaatttcc tcatcaattt tggagtcctc ctgggcactc tttatgctgc tagggttgaa 60

gccttccata atcccatccg taaacctggt ccagatcctt cagtcgtctt tgcaaacggc 120

ttctatcatt taacatacac ttcctatgat cacatagaga ttacgcgatc tatgacactg 180

ggaggtctgt tgaatggaga aacgaagacg atatggaccg acaagaacac cactcgcaat 240

gccaatatgt gggctccaga aatccaccgc attgataacg tgtggcatat gttctactca 300

agctgcgact catctcttcc ctgttgcgat agctgccaca ctcgcgttct tagaggatgc 360

aataaggcaa ccccattcga ctgcacctac acgcacttgg cagatttagt ccctcccact 420

ggctcacaag gtggtcccaa gtcggatttt gccttcagca ttgacgggac atatcttgag 480

atcccaggaa agggaaggta tcatgtgttg agcattatta acaaggacga gctacagtct 540

atcgctatta caaaactcga tacaacgaaa tggaccgttg atggttggca tgttatttct 600

gttcctgagc agccctggga gaaaaacaca accaactcga atccgaacag tattaccgct 660

gtcaacgagg cgcctcatcc tctctatcac aatggacaaa tctggctctc ttactcagct 720

tcatactgcg gaacgcccaa ctattcgctc gggttactgc actacaacgg tggcgatcca 780

ttacaggctt catcatggga taagaaaggt cctgtattct cgcaagccaa tggcaactat 840

ggaaccggtc ataactgttt ctttacgtct ccggatggac acgaaacctg gaatgctttt 900

catgccacga gcaaccccaa gggatcctgc ggtaccgaca gattcactct cgcacagaaa 960

gtaacattca catcgaataa ctcgccgcag tttggcatcc cgcagccgtt gtctgctgtc 1020

ttgcaaccgc cgagtggaga gtaa 1044

<210> 18

<211> 933

<212> DNA

<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)

<400> 18

atggcgacta cacagcttcg agtcgtaacc cgcatcaacc atggcattgc tcaagacatg 60

gtatcctctt tgatcgtggg tagtcaagca gccgtactcg ttgatgtacc cttgaccatc 120

ccccaagcaa aagagcttgt cccatggatc cgatccaacg ccagcgtgcc attagtggcg 180

atatttgcca cgcacttcca tccagatcat tatctcgctg ctcacatcat cttagagagc 240

tttcctgaag ccgagctata tgctactgag aagacagtgg ctttgatcaa tgaaatcgtc 300

gaggacaaaa cagccttttg gaagtcggca ttagggggcg aaaacattgc caactcgcca 360

agaatcccga aggttttccc gtcaaccttc tttttgcttc caggaaacga tatcgtccat 420

cttcttggac ctgtcaacgg agacagccct gagcagacca tgttctggat cccctccatt 480

aaaacactga ttgccggcga tgtcgtatac ggcagtggaa tgcatatgtg gctcgctgac 540

cttgacgacc cgttaatgac ggaagcatgg ctcagctctt tgcgactcat cgactctctc 600

ggtgcagaga ggattattcc aggacatgca cttagtgatc aagacggttt cagtggaaat 660

aaggatacgg accacacacg agcgtacgtt cgcttcttcc agaaagagat cgagtcgaaa 720

ccgagggata ccttcacgcc agatgaaatc accgctatgt ttgatcaagc ttttccagag 780

ttggcagaga tggaagaagg ttcgacctcg aagcttttgc tccagatcaa cgctcagcat 840

tttggcaagg gaggccagcg acaaaaacac gacgccgatc tagtttcact tcaaaagtct 900

tatacctcag cctgggactt tagtaagaac taa 933

<210> 19

<211> 1008

<212> DNA

<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)

<400> 19

atggccaaaa ttcccgccct tattactaaa aggctgactg ccgacccatc cgcccatgtc 60

tttcaaggca agcttttcct ctatgtatct cacgactatg atgcggggat tcctctgaac 120

ttggagggcg atcattttgc catgaaagac tattatgttt attccatgga agatatctac 180

ggttccgagc cagttaccga tcatggcctg gccctttctg tagaggatgt tccttgggtc 240

tctcgacagt tgtgggcgcc tgatgctgcc tacaaggatg ggaagtacta tctctacttt 300

cctgctaggg ataaagaaaa catcttccga atcggcgtag ctgtttctga agaccctggt 360

ggtccattca aagctgatga gagttacatt cctggcactt ttagcattga cccagcgagc 420

ttcactgatt tcgatcaaaa gacataccta gcatggggcg gacttcatgg cggacagctt 480

cagtgctggc agaataagac ccagtttgac ggttcttggt ctgggcaaaa ggagccagat 540

gataacgagt atgctctgag ccctcagatc gctctattaa gcgacgatat gcatacgttg 600

gctgaagctc cgcgagacat ggttatcctg gcacccgaga ctggtcaacc tatcatttcg 660

agtgataaag accgtcgcta tttcgaagga ccttggatac atagacgagg tgatatctat 720

tacctgagct attctactgg taccactcgt tactatgtct acgctactgc cgacaattct 780

tatggcccat acacctatca gggcagacta cttgagccgg tctcgggctg gacaacccat 840

ggtagcatcg tcgaatataa aggccaatgg tggctctttt accacgatag cgagacgaac 900

aacggcgtgg attggctccg acaatccaaa gcgaagaaga tttggtatga tagccaagcc 960

aagatcgttt ttgaggatcc atctgagaca aactatgtct gcgcatga 1008

<210> 20

<211> 1203

<212> DNA

<213> 藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)

<400> 20

atggctttgg caactcaaac cgttactcaa ctagagtccg ttattgataa gtcggtgaat 60

gaccccaaag ggattcccgg tgttgctgtt gtcgttgttg ggcggaatgg cgagctcttc 120

tcccatgcgg cgggcaagcg agggctcgac tcgtcggagc caatgacggt cgataatgtc 180

ttctggctcg cctcttctac caagatggtt actggtattg ccattatgca tcttgtagag 240

catggaggtc tcaatcttga cgatgctgat caactcgaga gcctgatacc cgagctaaag 300

gatatccagg tcgcacaatc agacggcaca cttgccccta aaacgagcag aattacgctg 360

agaatgcttc taacccatac atcgggtttc ggatatagta tattcaacaa acttcttctt 420

ccttatgctg aggagattgg gagtgacgag gcatctcctc aatttccatt tctcaagatg 480

ccgcttgctt tcaaccctgg agaggacttt gcatatggct ctggaattga tgtagccgcc 540

atcgccctcg agcgagcgag tggcttggcc cttggtgggt acctggataa gcacgtattc 600

gggccgctag gcataaagga tatttctttc gttccaagcc agtcaatgcg cggtcgccta 660

gcctccatgc accagcgaga ctccaacgga aaccttttag ttcgggatag cccattcaag 720

gctaacgctg aagtcgatct gaactcggct gaggcagtgg ctgcggttga acatagcggc 780

ggtggcggct tgtttgccac accgcaagag tatgcaaact cacgcacggg aaagcaagtg 840

ctgagtaagt cgatcatcga tgacatgttc acaaaccaaa tcccccaatt tcccaatttc 900

gcacgcgcgg gactgcaaag tgcgcggcca gacttgacac atgaaatccc tgaattttat 960

cccgtcccag gtaacccgcc tcagggttgg ggtcttacct tcttgatgag caatggtggt 1020

gccacaggca gatcaaccaa gacaggtcac tgggcaggac taccgaatgt atggtggtgg 1080

tgcgacccag agactggtgt tgcaggcatt gttgcaacgc agattttgcc atttggcgat 1140

cccaaggttc tcgaactttg gggcacggtt gaggcagtag tgacagcagc catgaaagat 1200

taa 1203

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 21

tcatgggtaa ggataacg 18

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 22

ggagatcgcc acagtta 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 23

tgatactgcc gcctttg 17

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 24

cgctcccgtg ttcttatt 18

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 25

caccacggct accaaac 17

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 26

cgtatcccat accaccat 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 27

gactccctgg attgatgt 18

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 28

cgactaccac ctgcttt 17

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 29

ctcgatcctc gggttgc 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 30

gtgattcggt cgccttc 17

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 31

atgagcgagg agcgtac 17

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 32

ccattacagc gtgagaaag 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 33

tctgttgtag ggtgagttg 19

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 34

tggtgtagcc ttgatgag 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 35

tctcaacggt tcaaatgg 18

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 36

tcgccgagaa cactcat 17

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 37

atcttgcgtg atgtgagc 18

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 38

atcctttcga cctttcc 17

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 39

cccctcacaa agcccgtat 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 40

agccaccaag caaggaact 19

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 41

atttccacct ccctcca 17

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 42

gttgccacag cagtccc 17

<210> 43

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 43

atgtggagtg gcgaaag 17

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 44

cgaatctgaa ctgggtgtat 20

<210> 45

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 45

tatgcttcgt cccacag 17

<210> 46

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 46

atcagtccac ccgttag 17

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 47

gttacacgga aacagtcg 18

<210> 48

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 48

aggaagccag gtaggat 17

<210> 49

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 49

tgttcggaca agagtgc 17

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 50

ggattgaggc tgaggtat 18

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 51

aagcaaccga ggtagtaaa 19

<210> 52

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 52

gctcaaagcc accgtat 17

<210> 53

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 53

aagccttcca taatccc 17

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 54

ctgccaagtg cgtgtag 17

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 55

tggaagtcgg cattagg 17

<210> 56

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 56

aagtcccagg ctgaggt 17

<210> 57

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 57

gcctgatgct gcctaca 17

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 58

atcttcttcg ctttgga 17

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 59

tgtcgttgtt gggcggaatg 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 60

tgaggcgggt tacctgggac 20

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 61

tcagggcaac atcttcaa 18

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 62

gacgaggtcg gtgtcatt 18

Claims

1.三种产生伏马毒素镰刀菌小种的特异引物组，其特征在于所述的层出镰刀菌四组特异性引物对，其分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；SEQID NO.27和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；所述的拟轮枝镰刀菌的六组特异性引物对，其分别为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.35和SEQID NO.36所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；SEQ IDNO.39和SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；所述的藤仓赤霉菌的十组特异性引物对，其分别为SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；SEQID NO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列。

2.一种利用多重PCR扩增技术检测水稻穗腐病菌产生伏马毒素的层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）提取待检测菌株的DNA；

（3）产生伏马毒素镰刀菌小种的鉴定：取鉴定伏马毒素的引物序列SEQ ID NO.61和SEQID NO.62所示的核苷酸序列对待检测菌株的DNA进行扩增，扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，若凝胶电泳图中有900bp的条带，则判断该水稻穗腐病菌能产生伏马毒素；

多重PCR引物通过以下引物组合得到：鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.1所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.2所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.3所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；鉴定层出镰刀菌SEQ ID NO.4所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.5所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.6所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.7所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.8所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.9所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；鉴定拟轮枝镰刀菌SEQ ID NO.10所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.11所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.12所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQID NO.13所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.14所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.15所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.49和SEQID NO.50所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.16所示的特异基因的引物为SEQID NO.51和SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.17所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ IDNO.18所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.19所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；鉴定藤仓镰刀菌SEQ ID NO.20所示的特异基因的引物为SEQ ID NO.59和SEQ IDNO.60所示的核苷酸序列；

多重PCR反应体系为：菌株基因组DNA 100ng，三对10μM正反向引物各1μL，三对正反向引物包括层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和藤仓赤霉菌的特异基因引物，2.5mM dNTPs 4μL，10×PCR buffer 2μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，加ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃复性40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min；

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的步骤（3）中PCR反应体系为：待检测菌株的DNA 50ng，10μM正反向引物各1μL，2.5mM dNTPs 4μL，10×PCR buffer 2μL，5U/μLTaq聚合酶0.3μL，加ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，54℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的步骤（6）若凝胶电泳图中含有该小种特异基因的目标条带，判定鉴定菌株隶属该小种类型。