CN103740815B - 一种针对镰刀菌的多重pcr检测的引物及其应用 - Google Patents
一种针对镰刀菌的多重pcr检测的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物及其应用，所述引物由三组引物对组成，够一次性通过多重PCR扩增体系快速准确鉴定引起玉米穗腐病的三种镰刀菌：禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，检测引物具有很好的特异性，仅能从目标菌中扩增到特异大小的条带，不能从近源种或其他病原真菌中检测到条带；而且整个PCR和电泳过程仅耗时2h，快速、简便、准确区分引起玉米穗腐的三种不同镰刀菌。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种鉴定镰刀菌的引物序列及其应用。
背景技术
玉米是重要的粮食作物和饲料来源，穗腐病是玉米生长后期最常见的病害之一，在各玉米产区均有发生，由多种病原菌引起。镰刀菌是引起玉米穗腐病的主要病原菌，不仅给玉米生产造成巨大的经济损失，镰刀菌在致病过程中积累的真菌毒素还降低玉米的品质，给食品安全和饲料安全造成严重威胁。
在不同气候带的玉米产区中，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群结构不同。在欧洲中东部，玉米穗腐病的主要致病菌是禾谷镰刀菌Fusarium graminearum，轮枝镰刀菌F. verticillioides则遍布整个欧洲，其他的一些镰刀菌也会引起玉米穗腐病，包括F. subglutinans, F. proliferatum和F. culmorum。在中国，引起玉米穗腐病的镰刀菌种群主要包括禾谷镰刀菌F. graminearum，轮枝镰刀菌F. verticillioide和层出镰刀菌F. proliferatum，其中轮枝镰刀菌F. verticillioide为优势种群，禾谷镰刀菌F. graminearum其次，层出镰刀菌F. proliferatum也经常有检出。由于不同的镰刀菌产生的真菌毒素的种类不一样，再加上传统的形态学检测方法耗时费事，因此，急需通过多重PCR检测的引物建立一种快速简便且能一次准确区分这三种不同镰刀菌的检测方法对于玉米穗腐病的种群分布和动态分析奠定理论基础，为该病害的综合治理提供科学依据。
此外，禾谷镰刀菌F. graminearum还是引起麦类作物赤霉病的主要病原菌，因此多重PCR检测的引物还可以直接用于检测引起麦类作物赤霉病的病原菌。
发明内容
本发明的目的在于，为同时检测禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，基于不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的ILV5基因和编码甾醇24-C还原酶的ERG24B基因的碱基差异，提供一种用于多重PCR检测的引物及其应用。
本发明目的是这样实现的：
一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物，其特征在于：多重PCR检测的引物由三组引物对组成，它们分别是序列号为SEQ ID No.1的Fg-F和序列号为SEQ ID No.2的Fg-R，序列号为SEQ ID No.3的Fv-F和序列号为SEQ ID No.4的Fv-R，以及序列号为SEQ ID No.5的Fp-F和序列号为SEQ ID No.6的Fp-R。
本发明中，所述多重PCR检测的引物在针对禾谷镰刀菌（F. Graminearum）、轮枝镰刀菌（F. Verticillioide）和层出镰刀菌（F. Proliferatum）检测中的应用。
本发明中，所述的应用，其具体步骤为：
a) 提取待检测菌株的DNA；
b) 多重PCR扩增：以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增；
多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，4.5U Taq酶、dNTPs 0.2 μM、MgCl2 2 mM、DNA模板2 μl、引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6各0.07 μM，最后加灭菌双蒸水至25μl；
多重PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性25 s、60℃退火25 s、72℃延伸25 s，共30个循环；72℃延伸10 min，10℃保存；
c）1.5%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经含有1%（w/v）的EB染色液染色后，观测凝胶中DNA条带大小，扩增得到885-bp DNA条带为禾谷镰刀菌，扩增得到416-bp DNA条带为轮枝镰刀菌，扩增得到220-bp DNA条带为层出镰刀菌。
本发明的优点在于，所提供的三组引物及其多重PCR方法能够一次性通过多重PCR扩增体系快速准确鉴定引起玉米穗腐病的三种镰刀菌（禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌），检测引物具有很好的特异性，仅能从目标菌中扩增到特异大小的条带，不能从近源种或其他病原真菌中检测到条带；而且整个PCR和电泳过程仅耗时2h，因此，本发明的引物与检测方法可以用来快速、简便、准确区分引起玉米穗腐的三种不同镰刀菌。
附图说明
图1a为采用引物组SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图1b为采用引物组SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
图1c为采用引物组SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6进行PCR特异性检测样品扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；
在图1a图1b图1c中：泳道M为DNA标准物，泳道Y为阴性对照，泳道1-3为禾谷镰刀菌F. graminearum、泳道4-6为轮枝镰刀菌F. verticillioides、泳道7-9为层出镰刀菌F. proliferatum、泳道10-15依次分别为亚洲镰刀菌F. asiaticum、水稻恶苗病菌F. fujikuroi、尖孢镰刀菌F. oxysproum、稻瘟病菌M. oryzea、灰葡萄孢B. cinerea和油菜菌核病菌S. Sclerotiorium。
图2为1-10个待测玉米样品的多重PCR检测扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 DNA的提取
实施例所涉及试剂：CTAB提取液：含有20 mM EDTA、100 mM Tris-HCl、1.4 M NaCl以及体积比为2% CTAB。
实施例所涉及菌株：3株禾谷镰刀菌（F. graminearum）、3株轮枝镰刀菌（F. verticillioide）、3株层出镰刀菌（F. proliferatum）、1株亚洲镰刀菌（F. asiaticum）、1株水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）、1株尖孢镰刀菌（F. oxysproum）、1株稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea）、1株灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和1株油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorium）。上述菌株均为常见的植物病原真菌，可以通过常规的分离纯化方法获得，即：取植物感病样品的病健交界处，无菌操作条件下使用70%乙醇消毒5s，再在无菌水中清洗3次，置于含有杀细菌的链霉素的PDA平板上培养，然后通过已有报道的形态学特征和分子检测方法进行验证，后保存在4℃冰箱。
分别对上述菌株通过以下方法提取DNA：
用无菌的接种针从PDA平板上刮取约100 mg的新鲜菌丝，置于1.5 ml的离心管中，加500 μl的CTAB提取液，用电钻驱动玻璃棒充分研磨，震荡均匀，在室温静置10 min后13200 rpm离心10 min；取上清液到1.5ml的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，在-20℃冰箱放置20 min后13200 rpm离心10 min，弃上清，将沉淀用1 ml的70%乙醇洗涤，室温放置干燥后溶解于100 μl的灭菌双蒸水，放于-20℃冰箱备用。
实施例2 引物设计及合成
根据不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的ILV5基因和编码甾醇24-C还原酶的ERG24B基因的碱基差异，设计了三组等位专化PCR引物Fg-F + Fg-R、Fv-F + Fv-R和Fp-F + Fp-R，引物序列如下表1。
上述引物均委托上海生物工程股份有限公司合成。
实施例3 引物特异性分析
以实施例1所述的9种真菌的DNA为模板，用实施例2所述三组引物对SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6分别进行PCR扩增，按照下述PCR反应体系及反应条件进行扩增，每次反应设一个阴性对照（用灭菌双蒸水代替DNA模板），PCR反应产物用凝胶电泳检测并EB染色拍照。
PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，1.5U Taq酶、dNTPs 0.2 μM，MgCl2 2 mM，DNA模板2 μl以及实施例2所述引物Fg-F 、 Fg-R各0.2 μM或Fv-F 、 Fv-R各0.2 μM或Fp-F 、 Fp-R各0.2 μM，加灭菌双蒸水至25 μl。
所述Taq酶及其相应的反应buffer均购自上海博彩生物科技有限公司。
PCR反应条件: 94℃预变性5 min；94℃变性25 s、60℃退火25 s、72℃延伸25 s，共30个循环；72℃延伸10 min，10℃保存。
PCR产物的凝胶电泳检测：1.5% (w/v) 琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至45℃，倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有含有1×TAE缓冲溶液的电泳槽中；再将10 μl PCR 扩增产物与 1 μl的10×Loading Buffer的混合液依次加入加样孔内；120V 恒压电泳30min ；切断电源，取出琼脂糖凝胶，置于含有1%（w/v）EB的染色液中染色30 min，取出使用天能紫外凝胶成像系统拍照。
图1a为采用引物组SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2扩增所得电泳图，如图1a所示，仅能从1-3泳道的3株禾谷镰刀菌中检测到885-bp DNA条带，其他8种真菌中不能扩增到条带。
图1b为采用引物组SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4扩增所得电泳图，如图1b所示，仅能从4-6泳道的3株轮枝镰刀菌中检测到451-bp DNA条带，其他8种真菌中不能扩增到条带。
图1c为采用引物组SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6扩增所得电泳图，如图1c所示，仅能从7-9泳道的3株层出镰刀菌中检测到220-bp DNA条带，其他8种真菌中不能扩增到条带。
由此可见，上述三组引物仅对目标特异，未见非特异性条带，因此能很好地区分三种引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌。
实施例4 多重PCR检测未知混合样品
取10份不同的待测玉米粒样品各每份10g，分别粉碎研磨，各称取0.1g的粉末，分别采用实施例1所述的DNA提取方法提取各自的DNA，并按照以下多重PCR反应体系和条件进行扩增；每次反应设一个阴性对照（用灭菌双蒸水代替DNA模板），多重PCR反应产物用凝胶电泳检测并EB染色拍照。
多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl、4.5U Taq酶、dNTPs 0.2 μM，MgCl2 2 mM，未知样品DNA模板2 μl以及实施例2所述引物Fg-F、 Fg-R、Fv-F、 Fv-R、Fp-F、 Fp-R各0.07 μM，最后加灭菌双蒸水至25 μl；多重PCR扩增中设一个阴性对照（用灭菌双蒸水代替DNA模板），PCR反应产物用上述的凝胶电泳检测方法检测并EB染色拍照。
所述 Taq酶及反应bufffer购自上海博彩生物科技有限公司。
多重PCR反应条件: 94℃预变性5 min；94℃变性25 s、60℃退火25 s、72℃延伸25 s，共30个循环；72℃延伸10 min，10℃保存。
多重PCR产物的凝胶电泳检测：1.5% (w/v) 琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至45℃，倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有含有1×TAE缓冲溶液的电泳槽中；再将10 μl PCR 扩增产物与1 μl的10×Loading Buffer的混合液依次加入加样孔内；120V 恒压电泳30min ；切断电源，取出琼脂糖凝胶，置于含有1% (w/v) EB的染色液中染色30 min，取出使用天能紫外凝胶成像系统拍照。
如图2所示，泳道M为DNA标准物，泳道Y为阴性对照，待测样品1的凝胶电泳图自上而下依次为885-bp、451-bp和220-bp的条带，表明待测样品1同时含有禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌；待测样品2-4的凝胶电泳图分别含有两条目的条带，表明它们含有两种镰刀菌，其中：待测样品2同时含有禾谷镰刀菌和轮枝镰刀菌，待测样品3同时含有禾谷镰刀菌和层出镰刀菌；待测样品4同时含有轮枝镰刀菌和层出镰刀菌；待测样品5-7的凝胶电泳图分别含有一条目的条带，表明它们含有一种镰刀菌，其中：待测样品5含有禾谷镰刀菌；待测样品6含有轮枝镰刀菌；待测样品7含有层出镰刀菌；待测样品8-10的凝胶电泳图未见任何特异条带，表明这3个待测样品中不含有禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌。本发明中的多重PCR反应体系能够同时快速特异检测三种引起玉米穗腐病禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物及其应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgtcctggg aagtcacgag g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttgttgggat ctttgcggaa a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
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<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tcagcagcga actttcgttg cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tcggcacgct ctgtagaata cc 22
Claims (3)
1.一种针对镰刀菌的多重PCR检测的引物，其特征在于：所述多重PCR检测的引物是基于不同镰刀菌编码的酮酸-还原异构酶的ILV5基因和编码甾醇24-C还原酶的ERG24B基因的碱基差异设计的，由三组引物对组成，它们分别是序列号为SEQ ID No.1的Fg-F和序列号为SEQ ID No.2的Fg-R，序列号为SEQ ID No.3的Fv-F和序列号为SEQ ID No.4的Fv-R，以及序列号为SEQ ID No.5的Fp-F和序列号为SEQ ID No.6的Fp-R。
2.一种如权利要求1所述多重PCR检测的引物在针对禾谷镰刀菌（F. Graminearum）、轮枝镰刀菌（F. Verticillioide）和层出镰刀菌（F. Proliferatum）检测中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其具体步骤为：
a) 提取待检测菌株的DNA；
b) 多重PCR扩增：以待检测菌株的DNA为模板进行多重PCR扩增；
多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，4.5U Taq酶、dNTPs 0.2 μM、MgCl2 2 mM、DNA模板2 μl、引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6各0.07 μM，最后加灭菌双蒸水至25μl；
多重PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性25 s、60℃退火25 s、72℃延伸25 s，共30个循环；72℃延伸10 min，10℃保存；
c）1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，经含有1%的EB染色液染色后，观测凝胶中DNA条带大小，扩增得到885-bp DNA条带为禾谷镰刀菌，扩增得到416-bp DNA条带为轮枝镰刀菌，扩增得到220-bp DNA条带为层出镰刀菌。
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