CN102220320B - 一种草菇v23菌株的特异分子标记及其获得方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种草菇V23菌株的特异分子标记及其获得方法与应用，其PCR扩增引物对序列为：GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC和TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA；获得方法，包括：(1)基因组DNA的提取；(2)PCR扩增反应；(3)琼脂糖凝胶电泳检测；用于鉴别草菇V23菌株和区分其单孢分离菌株。本发明的方法具有检测时间短，准确性高的优点。

Description

一种草菇V23菌株的特异分子标记及其获得方法与应用
技术领域
本发明属草菇菌属鉴别技术领域，特别是涉及一种草菇V23菌株的特异分子标记及其获得方法与应用。
背景技术
草菇(Volvariella volvacea)栽培起源于中国，迄今已有300多年的栽培历史，在我国南方地区广泛栽培。草菇味道鲜美，不仅具有丰富的营养价值，而且还具有重要的医疗保健作用，深受广大消费者喜爱。草菇作为一种高温栽培食用菌，同其它食用菌相比，其显著的特点是生长速度极快，从播种到收获一般只需要2周的时间，其年产量在我国食用菌产业中一直位居前十位。
草菇菌丝不具有锁状联合，多数单核菌丝自行交配就能完成整个生活史，在经典遗传学研究中，草菇是食用菌中唯一的被认定为属于初级同宗结合繁殖模式的担子菌，但是目前对草菇的遗传学研究特别是繁殖模式的研究仍旧存在着很多争议，这些基础理论研究的不足制约了草菇杂交育种工作的开展，为草菇新品种的选育带来了很多困难，从而极大地限制了草菇栽培业的发展。
面对这种局势，迫切需要加快草菇菌种鉴定技术的研究，开发更为有效的菌种鉴定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇V23菌株的特异分子标记及其获得方法与应用，该方法具有检测时间短，准确性高的优点。
本发明的一种草菇V23菌株的特异分子标记，其PCR扩增引物对序列为GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC和TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA。
上述的特异分子标记为分子量为4430bp和6224bp的两条条带；其中长度6224bp的序列见序列表no.3；长度为4430bp见序列表no.4。
本发明的一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，包括：
(1)草菇V23菌株(市售)的基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增反应
引物序列如下：(引物序列通过比对草菇菌株V23的单孢分离菌株交配型A位点的序列获得)
VVF11：GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC
VVR13：TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测。
所述这步骤(1)中的草菇V23菌株从上海市农业科学院食用菌研究所购买。
所述步骤(1)基因组DNA的提取方法为：将草菇V23菌株(上海市农业科学院食用菌研究所保藏)接种在PDA平板培养基上，30-32℃培养5-7d，之后刮取表面菌丝装入无菌容器中，-70℃保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA-20℃贮藏备用。
所述的改进的CTAB法具体为：将冷冻干燥的草菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液(2％CTAB；1.4M NaCl；100mM Tris.Cl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0)，65℃保温至少45min，然后12000rpm，室温离心20min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀，15min后室温离心20min(12000rpm)。取上清液移入新离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，室温离心10min(8000rpm)，弃上清液，沉淀用75％乙醇(含10mmol/L NaAC)洗涤3次，最后用预冷的95％乙醇洗涤一次，晾干后加入适量TE buffer溶解DNA沉淀，DNA溶液加入1μLRNase(10mg/mL)，37℃水浴1h，去除RNA。
所述的步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系总体积为：25μL，10×LA PCR bufferII(Mg2+ Plus)2.5μL，dNTP(各2.5mM)4uL，5U/μL TaKaRa LA Taq DNA酶0.25μL，10μmol/L草菇菌株检测引物对各0.5μL，模板DNA(浓度50ng/μL)0.5μL，ddH2O16.75μL；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃6min 30s，30个循环；72℃10min。
所述步骤(2)草菇V23菌株同时扩增出分子量约为5000bp和6000bp的两条条带；其中长度6224bp的序列见序列表no.3；长度为4430bp见序列表no.4。
所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取步骤(2)中的PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％(W/V)蔗糖水溶液)混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
本发明的原理：通过比较草菇V23菌株不同单孢分离菌株交配型A位点的基因序列，分析序列的保守性，建立以交配型基因为分子标记的快速鉴别V23菌株及其单孢菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对草菇菌株进行PCR扩增，草菇V23菌株同时扩增出分子量约为5000bp和6000bp的两条条带，分别对应于交配型基因A2和A1，而单孢分离菌株只能扩增出一条条带，其它草菇菌株不能扩增出特异条带。
有益效果
本发明的检测方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的优点；利用所获得的分子标记鉴别草菇V23菌株和区分其单孢分离菌株，有利于草菇杂交育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作。
附图说明
图1为草菇菌株特异条带扩增图；
图2为草菇V23菌株及其单孢分离菌株特异条带扩增图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，包括：
(1)基因组DNA的提取
草菇V23菌株(上海市农业科学院食用菌研究所购买)接种PDA平板培养基，32℃培养5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，-70℃冰箱保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA-20℃冰箱贮藏备用；其中改进的CTAB法具体为：将冷冻干燥的草菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液(2％CTAB；1.4M NaCl；100mM Tris.Cl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0)，65℃保温至少45min，然后12000rpm，室温离心20min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀，15min后室温离心20min(12000rpm)；取上清液移入新离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，室温离心10min(8000rpm)，弃上清液，沉淀用75％乙醇(含10mmol/L NaAC)洗涤3次，最后用预冷的95％乙醇洗涤一次，晾干后加入适量TE buffer溶解DNA沉淀，DNA溶液加入1μL RNase(10mg/mL)，37℃水浴1h，去除RNA；
(2)PCR反应体系及条件
引物序列通过比对草菇菌株V23的单孢分离菌株交配型A位点的序列获得：
引物序列
VVF11：GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC
VVR13：TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA
扩增体系总体积为：25μL，10×LA PCR buffer II(Mg2+ Plus)2.5μL，dNTP(各2.5mM)4uL，5U/μL TaKaRa LA Taq DNA酶0.25μL，10μmol/L草菇菌株检测专用引物对各0.5μL，模板DNA(浓度50ng/μL)0.5μL，ddH2O 16.75μL；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃6min 30s，30个循环；72℃10min；
草菇V23菌株同时扩增出分子量约为5000bp和6000bp的两条条带(见图1所示)，其中长度6224bp的序列见序列表no.3；长度为4430bp见序列表no.4。
(3)电泳检测
取上述PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％(W/V)蔗糖水溶液)混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
图1为草菇菌株特异条带扩增图；其中M：1Kb Marker；1：草菇菌株D9；2：草菇菌株3564；3：草菇菌株3561；4.草菇菌株3562；5：草菇菌株V23。
应用实例
实验对草菇V23菌株及分离获得的多株V23单孢菌株，通过PCR鉴定交配型基因A的类型，发现草菇V23菌株能扩增出分子量约为4400bp和6200bp的两条条带，说明其同时具有交配型基因A1和A2；而单孢分离菌株只能扩增出一条条带，有的单孢菌株仅具有交配型基因A1，有的单孢菌株仅具有交配型基因A2，部分电泳图见图2所示。
图2为草菇V23菌株及其单孢分离菌株特异条带扩增图，其中：1：VS2；2：VS18；3：V23；4.VS3；5.VS5；M：1Kb Marker。
Figure IDA0000065651800000011
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Figure IDA0000065651800000121
Figure IDA0000065651800000131
Figure IDA0000065651800000141

Claims (6)

1.一种草菇V23菌株的特异分子标记，其PCR扩增引物对序列为：
GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC和TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA；
所述的特异分子标记为长度为4430bp和6224bp的两条条带；其中长度6224bp的序列如SEQ ID NO:3所示；长度4430bp的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，包括：
(1)草菇V23菌株的基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增反应
引物序列如下：
VVF11:GTGACTGCTATGGAACACATTGGAC
VVR13:TCGGAGGAAGCGGGTCCACTACA；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述的一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)基因组DNA的提取方法为：将草菇V23菌株接种在PDA平板培养基上，30-32℃培养5-7d，之后刮取菌丝装入无菌容器中，-70℃保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA-20℃贮藏备用。
4.根据权利要求2所述的一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系总体积为：25μL，10×LA PCR buffer II 2.5μL，dNTP 4uL，5U/μL TaKaRa LA Taq DNA酶0.25μL，10μmol/L草菇菌株检测引物对各0.5μL，模板DNA0.5μL，ddH2O 16.75μL；PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 6min 30s，30个循环；72℃ 10min。
5.根据权利要求2所述的一种草菇V23菌株的特异分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取步骤（2）中的PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
6.如权利要求1所述的一种草菇V23菌株的特异分子标记在鉴别草菇V23菌株和区分其单孢分离菌株中的应用。
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