CN101831422B - 适于pcr反应的快速提取食用菌基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，该方法包括：取材；研磨；加缓冲液振荡后水浴；加乙酸铵溶液后放置沉淀；离心后取上清液口加冰预冷异丙醇，混匀，放置沉淀；离心；洗涤沉淀，风干；溶解沉淀，保存等步骤。用本发明方法提取食用菌的基因组DNA时间短、速度快、操作简单、成本低、提取效率高，对环境无污染，提取的DNA质量稳定，适于PCR反应。

Description

适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种快速提取食用菌基因组DNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，随着食用菌产业的迅速发展，对于食用菌的基础研究已深入到分子水平。一方面各种DNA分子标记技术已应用到食用菌的分类鉴定和遗传多样性研究中，另一方面食用菌基因工程的研究日益深入，从各种食用菌中快速提取基因组DNA是这些工作的前提。

食用菌的细胞壁及染色体上结合有复杂的多糖和丰富的蛋白质，且其菌丝体通常会产生色素，致使制备的基因组DNA中含有不同数量的多糖、蛋白质、色素以及成分不明的胞壁物质，这些物质的存在会影响后续实验。

目前已有多种从食用菌的菌丝体及子实体中提取DNA方法的报道，提取方法步骤大体相似，区别在于破壁方法的不同。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、石英砂或玻璃珠机械破壁法、CTAB法和氯化苄法等。最初用于细菌基因组DNA的提取的CTAB法，利用在一定的盐浓度下，DNA与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。自将CTAB法引入植物分子系统学研究领域，并在其后的研究中被逐步改进。但是改方法步骤多，操作繁琐，费时费力。此后改进了的CTAB法由于大都不能避免液氮研磨这一步骤，在处理的样品多的时候不占优势。国内多采用建立的氯化苄提取法，这一方法具有简便易行的优点，但也存在提取DNA质量不够稳定，对分散性不好的材料提取效果不好等不足。近年来，很多研究者针对如何快速提取食用菌的基因组做了大量的研究，孙立夫等(菌物学报，2009年28卷第2期299-302)采用带有无菌塑料钻头的小型手动电钻来研磨成功提取了蜜环菌总DNA，该方法虽然避开了使用液氮，但仍然有费时的缺点；赵春喜等(安徽农业科学，2008年36卷第28期：12122-12200)尝试采用改进的TRIS饱和酚一步法从各种食用菌子实体中提取高质量DNA的简捷方法，获得的食用菌DNA质量较好，能够满足PCR等后续分子生物学试验，但此方法中仍然采用了可能对人和环境产生影响的酚仿抽提的方法；杨同文等(生物技术，2009年19卷第1期：32-34)探索出一种简捷、高效CTAB结合DNA凝胶试剂盒的方法，省去了苯酚-氯仿的抽提，免去了DNA的晾干和再溶解等步骤将CTAB的裂解功能与胶回收试剂盒的纯化功能有机结合，优化组合操作步骤，成功提取了平菇、香菇、金针菇子实体DNA，但该方法，成本较高。

总之，目前提取食用菌基因组DNA的提取方法普遍存在操作繁琐、提取时间长、成本较高、毒性较大等不足之处。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取食用菌基因组DNA的方法，用该方法提取食用菌的基因组DNA时间短、速度快、操作简单、成本低、提取效率高，对环境无污染，提取的DNA质量稳定，适于PCR反应。

本发明提供的技术方案是：一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)取材：取菌丝体或子实体于离心管中；

(2)加入少量石英砂或玻璃珠后，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；

(3)加入抽提缓冲液，涡旋振荡1-3min；

(4)水浴10-15min；

(5)加入乙酸铵溶液，冰中放置8-10min；

(6)离心：10,000-13,000r/min离心10-15min；

(7)取上层水相至另一离心管中，加入冰预冷的异丙醇或无水乙醇，颠倒混匀，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；

(8)离心：10,000-13,000r/min离心10-13min；

(9)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干；

(10)加入ddH₂O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。

上述第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝；子实体取菌盖部位，将取好的材料置于1.5mL离心管中。

上述第(3)步中，加入0.5mL的抽提缓冲液，所述抽提缓冲液为200mmol/L Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA和2％SDS的混和液，涡旋振荡2min。

所述Tris-HCl的pH值为8.5。

上述第(4)步中，水浴温度为65℃。

上述第(5)步中，水浴后立即加入浓度为10mol/L的乙酸铵溶液200μL。

上述第(7)步中，加入异丙醇或无水乙醇的体积为上层水相体积的0.5-0.6倍，温度为0-4℃。

上述第(7)步中，放置沉淀的温度为0℃以下，例如：-20℃。

根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(9)步中，用70％乙醇洗涤沉淀两次。

所述食用菌为黑平王、美味牛肝菌、香菇、金针菇、血红铆钉菇、紫花脸香蘑。

本发明从食用菌菌丝和子实体中快速提取基因组DNA的方法，是用研磨杵结合石英砂研磨的破壁方法、乙酸铵沉淀获得DNA样品，此方法有如下优点：

(1)所需用于提取总DNA的材料的量少、容易获得，既可以是斜面或平皿上的菌丝，也可以是子实体，省去了菌丝的活化及培养时间，也为现有栽培品种的快速鉴定及野生食用菌资源分子水平上的多样性的研究提供了新思路，为食用菌的分子生物学研究提供一种高效可行的分子技术途径。

(3)提取过程中，避免了使用苯酚，减少了对人体和环境造成危害。

(4)避免了使用液氮研磨，降低了成本。

(3)只需在离心管中用研磨杵研磨结合石英砂漩涡振荡研磨即可，在提取大量样品的基因组时占优势，省时省力，可以在1个半小时内完成DNA提取。

(4)提取的基因组DNA效率高、完整，糖和蛋白含量低，可直接用于PCR反应，足以满足PCR扩增。

(5)相对其他方法而言，所用的设备和药品相对较少，经济节约。

(6)本发明方法不仅应用于食用菌基因组的提取，也适用于其他丝状真菌菌丝体基因组DNA的提取，例如木霉、曲霉等的基因组DNA的提取。

附图说明

图1为本发明方法提取的黑平王的基因组的电泳图，其中，M：1kb plusDNA marker；1：以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA；2：以黑平王菌丝体为材料提取的基因组DNA。

图2为ITS片段的扩增检测黑平王基因组DNA为模板的质量电泳图，其中，M：1kb plus DNA marker；1：以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物；2：以黑平王菌丝体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

提取平菇的基因组DNA的方法如下：

一、材料

平菇(Pleurotus ostreatus，黑平王)为北京市农林科学院植物保护环境保护研究所食用菌研究室保存菌种。

二、试剂

抽提缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.5)，250mmol/L NaCl，25mmol/LEDTA，2％SDS；10mol/L乙酸铵；异丙醇；70％乙醇；10mg/mL RNaseA。

三、提取基因组DNA

提取基因组DNA的具体步骤如下：

(1)取材：取菌丝体或子实体于1.5mL的离心管中。取菌丝体材料：刮取斜面或平皿培养基上的少量菌丝，尽量多取气生菌丝；取子实体材料：直接取少量子实体，尽量取菌盖部位。

(2)加入少量石英砂后用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状。

(3)加入0.5mL的抽提缓冲液，涡旋振荡2-3min。

(4)65℃水浴10min。

(5)加入200μL的乙酸铵溶液，冰中放置8min。

(6)12,000r/min离心10min。

(7)取上层水相至另一离心管中，加入0.5-0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min。

(8)12,000r/min离心10min。

(9)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次，风干。

(10)加入20μL的ddH₂O和1μL的RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。

四、对上述提取的DNA质量进行电泳检测

1、琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的菌丝体和子实体的基因组DNA样品各3μL进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳20min，EB染色，凝胶成像系统中观察提取DNA的质量并照相记录。结果如图1所示，所提取的DNA样品大小均在10kb以上，条带明亮清晰，无明显后拖尾现象，说明通过本发明方法能较完整地从食用菌的菌丝体和子实体中分离获得完整基因组DNA，且提取产物中含多糖或蛋白较少。整个提取时间短，简便易行。

2、用ITS-PCR扩增检测所提取的DNA质量

选取ITS1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和ITS4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)为引物，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增：95℃5min(预变性)；30个循环(95℃30s，58℃1min，72℃30s)；72℃10min；降至4℃结束。反应体系为50μL。然后进行电泳检测。结果如图2所示，所得产物片段大小700bp左右，提取的DNA完整，糖和蛋白含量低，与预期结果相一致，表明该方法提取获得的食用菌DNA质量较好，能够满足基于PCR反应的后续分子生物学试验。

图2ITS片段的扩增检测黑平王基因组DNA为模板质量。M：1kb plusDNA marker；1：以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物；2：以黑平王菌丝体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物。

Claims (6)

1.一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取材：取菌丝体或子实体于离心管中；

(2)加入少量石英砂后，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；

(3)加入抽提缓冲液，涡旋振荡2min；

(4)水浴10min；

(5)加入乙酸铵溶液，冰中放置8-10min；

(6)离心：10,000-13,000r/min离心10-15min；

(7)取上层水相至另一离心管中，加入冰预冷的异丙醇或无水乙醇，颠倒混匀，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；

(8)离心：10,000-13,000r/min离心10-13min；

(9)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干；

(10)加入ddH₂O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存；

其中，所述食用菌为黑平王；

第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝，子实体取菌盖部位；

第(3)步中，加入0.5mL的抽提缓冲液，所述抽提缓冲液为200mmol/LTris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA和2％SDS的混合液；

第(4)步中，水浴温度为65℃；

第(5)步中，水浴后立即加入浓度为10mol/L的乙酸铵溶液200μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(1)步取材，将取好的材料置于1.5mL离心管中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Tris-HCl的pH值为8.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(7)步中，加入异丙醇或无水乙醇的体积为上层水相体积的0.5-0.6倍，温度为0-4℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(7)步中，放置沉淀的温度为-20℃至0℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(9)步中，用70％乙醇洗涤沉淀两次。

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