CN103184286A - 水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA397a基因位点的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA397a基因位点的应用，属于生物技术领域。所述方法包括：接种待测水稻和感病水稻；分离待测水稻和感病水稻中miRNA基因；检测miRNA397a基因位点的表达；判定待测植株是否抗白叶枯病。所述的miRNA397a基因位点在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。本发明首次利用miRNA397a基因位点的转录鉴定水稻是否具有白叶枯病抗性，并获得了成功，本发明提供的miRNA397a基因位点的转录是建立在表达水平上的检测，避免了由白叶枯病的抗性基因沉默而造成的误判，本发明的鉴定方法未利用常规的DNA连锁标记法，避免了由于DNA连锁不紧密造成的误判，提高检测的准确性，避免了不必要的生产损失。

Description

水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA397a基因位点的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA397a基因位点的应用。

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物，白叶枯病是水稻两大主要病害之一，属世界性病害，以亚洲稻区发生为重。白叶枯病发病率高、传染快，发病稻田减产20-30%，甚至能够达到50%。

培育并利用抗病品种是解决白叶枯病造成的粮食减产最经济、最有效的手段，因此，需要对所栽培的水稻白叶枯病抗性进行鉴定。目前，鉴定水稻白叶枯病的方法通常采用DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)分子标记，利用DNA连锁标记的原理，鉴定水稻是否带有白叶枯病抗性基因，与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有不受季节、环境限制、不存在表达与否及基因组DNA变异及其丰富等优点。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

即便患病的植株中存在抗性基因也不代表该抗性基因具有活性，如果该抗性基因沉默了，那么在生产时依旧会表现为感病，干扰实验人员的判断，若直接投入到生产中，会给粮食生产带来损失。

发明内容

为了解决利用DNA分子标记鉴定水稻是否抗白叶枯病不够准确的缺点，本发明实施例提供了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法及miRNA397a基因位点的应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法，包括以下步骤：

接种待测水稻和感病水稻；

分离所述待测水稻和所述感病水稻中的miRNA基因；

检测所述miRNA基因中的miRNA397a基因位点的表达；

根据所述miRNA397a基因位点的表达检测结果，判定所述待测植株是否抗白叶枯病。

具体地，所述miRNA397a基因位点的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

具体地，将白叶枯菌系P6接种于所述待测水稻和所述感病水稻上。

进一步地，所述接种的部位为所述待测水稻和所述感病水稻的叶片。

具体地，接种后2-6小时，分离所述miRNA基因。

进一步地，采用miRNA基因分离试剂盒分离所述miRNA基因。

具体地，采用液相Northern杂交法检测所述miRNA397a基因位点的表达。

进一步地，所述液相Northern杂交法所用的探针的序列如序列表中SEQ IDNO:2所示，所述探针的5’端标记有荧光素FITC。

具体地，判定所述待测植株是否抗白叶枯病的方法为：若所述感病水稻的miRNA397a基因位点的表达和所述待测水稻的miRNA397a基因位点的表达相等，则所述待测水稻感病；若所述感病水稻的miRNA397a基因位点的表达大于所述待测水稻的miRNA397a基因位点的表达，则所述待测水稻抗病。

另一方面，本发明提供了一种miRNA397a基因位点在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：miRNA基因与普通RNA基因不一样，其序列较短，不容易降解，因此，已经在人类疾病如癌症检测中得到了应用，但利用miRNA基因检测与诊断植物疾病例子很少，主要是因为植物miRNA基因的研究相对落后于人类miRNA基因的研究，通过大量样本的水稻miRNA基因与白叶枯抗性关系的研究，发明人发现miRNA397a基因的表达与白叶枯抗性密切相关，由此，首次提出miRNA397a基因具有检测水稻白叶枯抗性的能力，本发明检测待测水稻和感病水稻中miRNA397a基因位点的表达，通过结果的比对，鉴定待测水稻是否抗白叶枯病，本发明利用miRNA397a基因位点鉴定水稻是否具有白叶枯病抗性，并获得了成功，本发明提供的miRNA397a基因位点的转录是建立在表达水平上的检测，避免了由白叶枯病的抗性基因沉默而造成的误判，本发明未利用常规的DNA连锁标记法，避免了由于DNA连锁不紧密造成的误判，提高了检测的准确性，避免了不必要的生产损失。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的电泳图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明中所用的试剂均为市售试剂。

实施例

本发明通过将水稻的miRNA基因与标记好miRNA397a基因的探针混合杂交，并通过非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测结果，并将待测水稻和感病水稻的结果进行比对，进而判断待测水稻是否抗白叶枯病，其具体实验过程如下。

感病水稻：选取生长正常且表面没有明显病虫害的，标号为9311的不抗白叶枯病的水稻种子。

待测水稻：选取标号为9311的抗白叶枯病的水稻种子。

其中，抗白叶枯病的水稻种子中具有抗性基因Xa23。

种子的前处理：用浓度为70%的酒精浸泡2分钟，再用去离子水洗2次，在30℃的水中浸泡过夜，在30℃的温度下对种子进行催芽，待芽长出来后，播种于秧田中，秧田管理与普通栽培习惯相同，待秧苗长到4-5个叶片时，移栽至大田中，大田管理与普通栽培习惯相同。

白叶枯菌系培养：选用对水稻具有强致病性的白叶枯菌系P6（Xanthomonasoryzae pv.oryzae Philippine race6），该白叶枯菌系P6来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所，将白叶枯菌系P6于培养温度为30℃的条件下，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato-Dextrose-Agar，PSA）培养基上进行培养，培养基的成份如下：质量体积比为1%的蔗糖、质量体积比为1%的蛋白胨、质量体积比为0.1%的谷氨酸盐和质量体积比为1.5%的琼脂。培养时间为2-5天，将白叶枯菌系P6培养至肉眼可以观察到的菌浓为止。

白叶枯菌浓度测定：在接种水稻的叶片前，将白叶枯菌系P6溶解于水中，利用分光光度计（美国Quawell公司生产，型号为Q5000）测定600nm处的吸光OD600值，并将菌液稀释到OD600值为0.5，此时菌液的浓度大约为5×10⁸cfu/ml左右，用于接种水稻的叶片。

白叶枯菌系接种：在待测水稻和感病水稻抽穗前，分别接种白叶枯菌系P6，接种方法为剪叶接种，具体地，将剪刀浸入OD600值为0.5的白叶枯菌系P6的菌液中1-2秒，再用沾有菌液的剪刀从距叶片顶部1-2cm处剪去叶片，此时，计为接种0小时，在接种2-6小时后，分别取待测水稻和感病水稻接种部位的叶片各0.5克左右，分别装入容积为1.5ml的离心管中，并立即投入液氮中保存，且待测水稻和感病水稻至少分别取3份样本材料做重复实验。

miRNA基因的提取：利用miRNA基因分离试剂盒（miRNA基因分离试剂盒为市售，货号：R6727，生产公司：Omega，该试剂盒具体包括：RNA离心柱、基因组DNA去除离心柱、收集管、MCL裂解缓冲液、XD结合缓冲液、RNA洗脱液II、DEPC水）分离待测水稻和感病水稻叶片中的miRNA基因，具体操作方法如下：从液氨中分别取出待测水稻和感病水稻的叶片，并将两组叶片分别置于两个研钵中，立即向研钵中倒入液氮，并充分研磨，各取大约100mg研磨好的粉未置于1.5ml的离心管中，加700μL的裂解液，涡旋30秒以混匀样品，55°C保温30分钟，在离心力为12000×g的室温条件下离心5分钟，将上清液转移至离心柱中离心，用于去除基因组中的DNA，12000×g室温离心2分钟，并将流出的液体转移至一个新的1.5mL的离心管中，向液体中加入该液体体积1.1倍的无水乙醇并涡旋20秒混匀，将液体转移至RNA离心柱中12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入500μL浓度为96-100%的乙醇到RNA离心柱中，再12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入500μL XD结合缓冲液到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入750μL RNA洗脱液II到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液，再加入750μL RNA洗脱液II到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液。将RNA离心柱在大于12000×g的最大速度下，室温离心2分钟，向RNA离心柱中加入30-50μL DEPC水，室温下放置5分钟，大于12000×g的最大速度下，室温，离心1分钟，离心获得的液体即为miRNA基因溶液，将该溶液保存于-70℃。

miRNA基因定量：利用分光光度计（美国Quawell公司生产，型号为Q5000）测定获得的miRNA基因的浓度。

miRNA397a基因位点的序列:5’-ucauugagugcagcguugaug-3’。

miRNA397a基因位点的杂交探针：设计miRNA397a基因位点的DNA探针为5’-catcaacgctgcactcaatga-3’，其中，该探针的5’端标记有荧光素FITC。该探针标记与合成由上海Invitrigen公司完成。

配制杂交缓冲液：其成份如下：30mM pH8.0的磷酸钠缓冲液，0.3M NaCl溶液和10mM EDTA，配制好后，用浓度为0.1%的DEPC（diethyl pyrocarbonate；焦碳酸二乙酯）37℃处理12小时后，120℃灭菌20分钟待用。

液相Northern杂交：用两个PCR管，分别取5μg的待测水稻和感病水稻的叶片的miRNA溶液、5μl的杂交缓冲液和1ul10pM/ul的miRNA397a基因位点的杂交探针，混合均匀，制成液相Northern杂交液，在42℃保温1小时后加入5ul2000U/ml的核酸外切酶I（由NEB公司生产，商品货号为M0303）消化2小时。其中，采用液相Northern杂交法，在探针的5’端有一个FITC标记，该标记在紫外照射下即可发光，所以，电泳完成后，直接放在紫外线下照射即可看到条带，并不需要放射自显影这些麻烦的步骤，也不需要3’端进行标记，其方法简单。另外，那些在液体中没有被杂交上的探针被DNA酶消化掉了，并不影响最后的结果。

浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶的制备：取20mL ACT:Bis=29:1的浓度为30%的非变性聚丙稀酰胺凝胶母液（武汉谷歌生物科技有限公司生产），加浓度为1倍的TBE缓冲液（上海迪申生物技术有限公司生产，货号为B1610733）80mL，配制成浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶溶液，取配制好的浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶溶液16mL，加16μL浓度为10%的过硫酸铵和160μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)，其中TEMED的浓度>99.0%，将上述溶液混合均匀后，迅速灌胶于胶板之中（灌胶装置由北京六一仪器设备厂生产，型号为DYCZ-24DN），并室温于放置2小时后即可使用。

电泳检测：将上述液相Northern杂交液加上2ul10×的电泳缓冲液（美国Lifetechnology公司生产，商品货号为AM8556），利用浓度为6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶在100V的电压下电泳30分钟，于紫外线下观察并照相，结果见附图1。

由图1可知，图中左侧的条带为感病水稻，右侧的条带为待测水稻，其中，左侧的条带宽度大于右侧的条带的宽度，所以，感病水稻的miRNA397a基因位点的表达大于待测水稻的miRNA397a基因位点的表达，则待测水稻抗病。

按前述的方法接种P6白叶枯菌的感病水稻和待测水稻的在大田中继续生长15天后，测量枯萎叶片长度，结果表明感病水稻枯萎叶片长度分别大于10cm，而待测水稻的枯萎叶片长度分别小于1cm，表明栽种的感病水稻表现为感病，栽种的待测水稻检测出来为抗病，与实验结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水稻的白叶枯病抗性的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

接种待测水稻和感病水稻；

分离所述待测水稻和所述感病水稻中的miRNA基因；

检测所述miRNA基因中的miRNA397a基因位点的表达；

根据所述miRNA397a基因位点的表达检测结果，判定所述待测植株是否抗白叶枯病。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miRNA397a基因位点的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将白叶枯菌系P6接种于所述待测水稻和所述感病水稻上。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述接种的部位为所述待测水稻和所述感病水稻的叶片。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，接种后2-6小时，分离所述miRNA基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用miRNA基因分离试剂盒分离所述miRNA基因。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用液相Northern杂交法检测所述miRNA397a基因位点的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相Northern杂交法所用的探针的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述探针的5’端标记有荧光素FITC。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，判定所述待测植株是否抗白叶枯病的方法为：若所述感病水稻的miRNA397a基因位点的表达和所述待测水稻的miRNA397a基因位点的表达相等，则所述待测水稻感病；若所述感病水稻的miRNA397a基因位点的表达大于所述待测水稻的miRNA397a基因位点的表达，则所述待测水稻抗病。

10.一种miRNA397a基因位点在鉴定水稻的白叶枯病抗性中的应用。

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